1er curso de ENFERMEDADES METABÓLICAS HEREDITARAS
Actualización del diagnóstico.Actualización del diagnóstico de las Enfermedades Metabólicas Hereditarias en el laboratorio
Dra. Celia Pérez-Cerdá. Centro de Diagnóstico de Enfermedades
Moleculares (CEDEM)Universidad Autónoma de Madrid
Cómo se diagnostican las EMHs desde elCómo se diagnostican las EMHs desde el punto de vista de laboratorio
El clínico
El diagnóstico de las EMHs depende de su reconocimiento (sospecha) por parte del médico y de la estrecha colaboración
con los laboratorios de Genética Bioquímica y Molecular
Laboratorios de Genética Bioquímica y Molecular
Definición de Enfermedad Metabólica Hereditaria
Enfermedad causada por mutaciones en el DNA que dan lugar a proteínas anómalas en su estructura y/o función
T i ió RNATranscripción a RNA(Transcriptoma)
TraducciónProcesamiento post‐traducción e intervención de factores celularesTraducción
a polipéptido
DNA(Genoma)
intervención de factores celulares(Complexoma)
( )
Efectos ambientales(“Enviroma”)
Producto génico(Proteoma)
Vias/Productos metabólicos(Metaboloma)
Fenotipo(Fenoma)
Nivel I: Sospecha de EMH basada en los síntomas clínicos
SÍNTOMASALTERACIÓNMETABÓLICA POSIBLE DEFECTO
Intoxicación aguda Acumulación de AminoacidopatíasIntervalos libres metabolitos tóxicos Enf. ciclo de la urea
de síntomasRelación con ingesta Acidemias orgánicas
Hipotonía generalizada; Defecto en la Def. b‐oxidación de
Relación con ingesta Acidemias orgánicase intercurrencias Galactosemia
Hipotonía generali ada; efecto en la ef. b oxidación deMiopatía; Cardiomiopatía producción o ácidos grasosMiopatía; Cardiomiopatía utilización de GlucogenosisHipoglucemia; energía Acidosis Láctica ALC (PC, PDH)
Def. Cadena respiratoria
Progresivos Síntesis y/o Enf LisosomalesProgresivos Síntesis y/o Enf. LisosomalesIndependientes de degradación Enf. Peroxisomalesingesta e intercurrencias moléculas complejas Síndrome CDG
DismorfiasDismorfias
Nivel II: ALTERACIONES BIOQUÍMICAS Y HEMATOLÓGICAS
Acidosis metabólica ( pH< 7.2, HCO3< 10 mmol, pCO2< 25 mmHg
Cetonuria (muy significativa en el R.N.)
Hiperamonemia (> 100 mmol/l, pH 7.45; urea )
Acidemia láctica (> 4 mmol/l)
Hipoglucemia (< 2 mmol/l)
Hiperuricemia (>7mg/dl) ó hipouricemia (<2 mg/dl)
Leuco trombo ó pancitopenia AnemiaLeuco, trombo ó pancitopenia. Anemia
Nivel III, IV y V: Análisis específicos de metabolitos, enzimas y genes
HPLCCIOGC/MSMS‐MSESPECTROFOMETRÍA
Laboratorio de Genética H
‐ ico
a rno
Ác. Metilcítrate
(2 peaks)
ESPECTROFOMETRÍAIEF, SDS‐PAGECultivo celularTécnicas enzimáticas
Bioquímica
Ác. 3
‐OH
Prop
ióni
Prop
ionilglicina
Tiglilglicina
Patrón
Inter
éc cas e át casradiactivas
HIGH RESOLUTION Exón 7 E390KMELTINGDGGESECUENCIACIÓNPCR
Laboratorio de Genética
PCRMLPA Array‐CGH
Molecular
GAA AAAGlu Lys
TGCCAARCCCCCA
www.cbm.uam.es/cedem/
Glu Lys
Genética Bioquímica y Molecular
• Es la disciplina del laboratorio centrada en la evaluación y diagnóstico depacientes y familias con enfermedades metabólicas hereditarias así comopacientes y familias con enfermedades metabólicas hereditarias, así comoen la monitorización de tratamientos, estudios de portadores ydiagnóstico prenatal, mediante el estudio en fluidos fisiológicos y tejidosd t b lit d t é i ( i t t í )de metabolitos, productos génicos (enzimas y otras proteínas) y genes.
• Los especialistas en genética bioquímica informan interpretando losresultados obtenidos en el análisis del paciente y actúan comoconsultores para los clínicos en relación al diagnóstico de laboratorio.
• Requiere experiencia y conocimiento en Enfermedades MetabólicasHereditariasHereditarias
• Los laboratorios requieren infraestructura y tecnologías sofisticadas,incluyendo instalación radiactiva, laboratorio de cultivos, banco de célulasy de DNA etc
• Sometido a exigencias de calidad muy elevadas, ya que de un erroranalítico o de interpretación de resultados o de un diagnóstico tardíop gpuede depender la vida del paciente o su calidad de vida.
PROGRAMAS DE EVALUACIÓN EXTERNA DE CALIDAD
European Research Network for Evaluation and Improvement of Screening, Diagnosis and treatment of Inherited Metabolic Disease ERNDIM
Cuantitativo de aminoácidos en suero y orinade ácidos orgánicos en orinade purinas y pirimidinas en orina
Ensayos especiales en orina de ác.5‐OH‐Indolacético (5HIAA), Carnitina libre, Creatina, Creatinina, Guanidinoacetato, ác. Homovaníllico (HVA), ác. Láctico, Mucopolisacaridos, ác.Orotico, ác.Pipecólico, ác. Siálico and Succinilacetona
Ensayos especiales en suero de 3 OH Butirato, 7‐Dehidrocolesterol, ác. Grasos de cadena muy larga (C22/24 and 26:0), Carnitina libre, Creatina, Galactosa, ác. Guanidinoacético, Homocisteina, ác. Láctico, ác. metilmalónico, ác. fitánico, ác. Pipecólico, ác. Pristánico y ác. Pirúvico.
Cuantitativo de enzimas lisosomales en leucocitos o linfoblastos Cuantitativo de cistina en células blancas
Cualitativo de ácidos orgánicos en orinade transferrina glicosilada (CDG) en suerode acilcarnitinas en sangre en papel
“Proficiency” o de competencia en orina
European Molecular genetics Quality Network EMQN
A) GENÉRICO : ‐ Secuenciación
B) ESPECÍFICO de ENFERMEDAD: Hiperplasia Adrenal Congénita, Fenilcetonuria, Porfiria, Enf de Wilson
INFORMACIÓN PARA EL LABORATORIO É Í
INFORMACIÓN PARA EL LABORATORIO É Í
Diagnóstico postnatal
DE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARDE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
Breve historia clínica Antecedentes personales y familiares
Diagnóstico postnatal
Antecedentes personales y familiares Alimentación Medicación C d h d l Cuando se han tomado las muestras
Nivel de dx del caso índice (metabolitos, enzimático, genético)Diagnóstico prenatal
Confirmación de condición de portadores heterozigotos en los padres (imprescindible si el dx es genético)
F h d t d t ti d t Fecha de toma de muestra y tipo de muestra
MUESTRAS PARA EL DX DE LAS EMHs EN EL LABORATORIOÉ Í
MUESTRAS PARA EL DX DE LAS EMHs EN EL LABORATORIOÉ Í
Diagnóstico postnatal
DE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARDE GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
• Sangre total con anticoagulante
• Linfocitos o linfoblastos• Eritocitos
Diagnóstico postnatal
• Sangre impregnada en papel• Plasma o suero • Orina 24 horas
Eritocitos• Biopsia de piel o fibroblastos
(24‐48H postmortem)Orina 24 horas• LCR • Biopsia/necropsia hígado, músculo
Bi i i l él l l i d d ll i l
Diagnóstico prenatal
• Biopsia corial o células cultivadas de vello corial• Líquido amniótico o amniocitos• DNADNA
VIA DE OXIDACIÓN DEL PROPIONATO
ValinaCLÍNICA DE ACIDEMIA ORGÁNICA: Vómitos, cetoacidosis metabólica,
IsoleucinaTreoninaMetionina
AG de cadena impar
hiperamonemia, hipotonía, fallo de medro.
AG de cadena imparColesterol
Propionil‐CoA ACIDEMIA PROPIÓNICA
‐ Enzima multimérica dependiente de Propionil‐CoA
Carboxilasa (PCC)
D M ill l il C A
pBIOTINA
‐ 2 genes implicados: PCCA and PCCBBIOTINA
D‐Metillmalonil‐CoA
L‐Metillmalonil‐CoA ACIDEMIA METILMALÓNICA (aislada)E i d di t d it i B
Succinil‐CoA
Metilmalonil‐CoA Mutasa
‐ Enzima dependiente de vitamina B12
‐ 4 genes implicados MUT, MMAA, MMAB, MMADHC
Vitamina B12
Succinil CoA
Ciclo de Krebs
NIVEL III: Perfil metabólico de Ac. Propiónica y ac. MetilmalónicaCROMATOGRAFÍA DE GASES‐ESPECTROMETRÍA DE MASAS
Ác. Metilcítrico
Propionil CoA
OH‐
ónico
a rno
(2 picos)Propionil‐CoA
Ác. 3
‐OProp
ió
Prop
ionilglicina
Tiglilglicina
Patrón
Inte
Metilmalonil‐CoAÁc MetilmalónicoÁc. Metilmalónico
terno
Ác. Metilcítrico
(2 picos)
c. 3‐OH‐
ropión
ico Patrón
In
Succinil‐CoA
Ác Pr
1e5
Intensity,cps
C3Perfil de acilcarnitinas en un plasma de
Acidemia PropiónicaESPECTROMETRÍA DE MASAS EN
8e4
9e4 TANDEM (MS-MS)
6e4
7e4
4 4
5e4
3e4
4e4
1e4
2e4
C2*
*** *
C0
* C4* * * *C6 C8
C10* C12 C14
C16 C18
220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580m/z, amu
* ** C4* C5 C10 *C16 C18
Cromatograma de aminoácidos en plasma de Acidemia PropiónicaAutoanalizador de aminoácidosAutoanalizador de aminoácidos
BIOCHROM 30(cromatografía de intercambio iónico)
Nivel IV: DIAGNÓSTICO ENZIMÁTICO PRENATAL Y POSTNATAL de ACIDEMIA PROPIÓNICA
PCCpmoles/min/mg prot %PCC
FIBROBLASTOSCaso Índice <5 <1Padre 352 31Padre 352 31Madre 426 38Controles n=43 1123 ± 450 100
BIOPSIA CORIALProbando 1 3307 95Probando 2 2113 61Probando 2 2113 61Probando 3 54 1.5Controles n=8 3485 ± 1187 100
LINFOCITOSProbando 1 1236 109P b d 2 803 70Probando 2 803 70Controles n=32 1196 ± 405 100
DIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LAS EMHsDIAGNÓSTICO GENÉTICO DE LAS EMHs
1) Mutaciones puntuales de sustitución de un nucleótido:TIPOS DE MUTACIONES
1) Mutaciones puntuales de sustitución de un nucleótido:Cambio de aa (missense)Cambio por un codón de parada (nonsense)
2) Pequeñas deleciones o inserciones que cambian la fase de lectura (frameshift)) q q ( )Cambio por un codón de paradaInserción o deleción de un aminoácido
3) Mutaciones puntuales, pequeñas deleciones o inserciones que afectan al procesamientodel mRNA (mutaciones de splicing)del mRNA (mutaciones de splicing)
4) Grandes deleciones o duplicaciones genómicas
MÉTODOS basados en el RASTREO DEL GEN
GE
GE
CP
CP
PCR product
normal mutated
DG
GD
GG
SSC
SSC Heat and Cool
Gel electrophoresis
RM
RMPL
CPL
C
HR
HR
dHP
dHP
ANÁLISIS DE MUTACIONES ESPECÍFICAS
SECUENCIACIÓN
ARRAY DEDISCRIMINACIÓN
ALÉLICA A
SECUENCIACIÓN “SANGER”
ARRAY DE MUTACIONES TIEMPO REAL
Reordenamientos genómicos
RAY
RAY
LONG-PCRSNP ARRAY
Whole genome SNP‐array
GH
AR
RG
H A
RR g y
CG
CG
MLPAwww mlpa com
CONTROLCC
CC
CC
C
C C
C
7
8 1 2 9
3
10 4 11 5 12
6
13
1
MLP
AM
LPA www.mlpa.com
Patient DNA EXON 5
C
MM
MULTIPLEX LIGATION PROBE AMPLIFICATION
Secuenciación directa (Sanger)
IDENTIFICACIÓN DE UN CAMBIO (mutación) en el cDNA o gDNA
gDNAg
Cr. 3q13.3-q22PCCB
cDNA
C>T heterozigotoHomozigoto gg
A A A T G T C A G C A A A T G T C A G C
DELECIONES EN ACIDEMIA PROPIÓNICA/c.483_484insT/wt wt/wt
T
c.373-?_543+?
c 483 484insTc 483 484insT/ c 373-? 543+?c.483_484insTc.483_484insT/ c.373-?_543+?
Gran deleción en heterocigosis
135976819-135989453 (hg19)( g )
de 12634 pb en el gen PCCB
ARRAY-CGHARRAY CGH
DELECIONES EN ACIDEMIA PROPIÓNICAMECANISMOS DE LA DISOMÍA UNIPARENTAL (UPD)MECANISMOS DE LA DISOMÍA UNIPARENTAL (UPD)
RESCATE TRISÓMICO
DISOMÍA UNIPARENTAL EN EMHs
Molecular Genetics Metabolism. 2012. Feb;105(2):270-1
SECUENCIACIÓN DE DNASECUENCIACIÓN DE DNA
1990-2005SANGER
Fluorescencia capilar
Desde 2005Secuenciación de nueva generación (Next Generation Sequencing –NGS)p
Millones pb/día( q g )
Billones pb/día
PLATAFORMAS PARA SECUENCIACIÓN MASIVA
RocheApplied
Biosystems Illumina GARoche454-FLX
BiosystemsSOLID
Illumina GASolexa
EL EXOMA (~20.000 GENES; 30 megabases)
• ~18.000 variantes• ~8-9. 000 variantes podrían estar influenciando la función génica8 9. 000 variantes podrían estar influenciando la función génica• ~95% de las variantes son frecuentes en la población.• ~500-1000 genes contienen variantes nuevas potencialmente
patogénicaspatogénicas.
EL GENOMA (~3.000 megabases)
• 3-4 millones de sustituciones nucleotídicas• ~0.5 millones de pequeñas inserciones y deleciones, ‘indels’ (1-0.5 millones de pequeñas inserciones y deleciones, indels (1
100pb)• ~5,000 grandes deleciones, duplicaciones e inserciones (>100pb)
NGS como herramienta DIAGNÓSTICA
1) Captura de genes candidatos implicadoscandidatos implicados en enfermedad (glucogenosis, enf.
i l fperoxisomales, enf. lisosomales etc…)
2) Captura del exoma(región codificante, 176.266 exones de 18.409 genes)
ESTRATEGIA para la detección de mutaciones/genes mediante SECUENCIACIÓN MASIVA del EXOMA celularSECUENCIACIÓN MASIVA del EXOMA celular
“Filtro genetico”g• Presencia en Human Genome Mutation Database (HGMD)• Presencia en otras bases de datos: • SNPdb, 1000 Genome Project, HapMap, etc…• Presencia en otras muestras del lab. (in-house data)
Análisisfuncional( )
• Presencia en controles• Presencia de una o dos mutaciones en el gen candidato• Segregación con el fenotipo de la enfermedad
Secuenciación exoma
Detección de variantes
Variantes o genes candidatos
Variantes o genes candidatos
Aplicación diagnóstica
“Filtro funcional”
exoma gg g
Filtro funcional• Predicción de la naturaleza de la variante:
Nonsense, frameshift…• Expresión del gen en el tejido diana• Análisis de conservación evolutiva
SecuenciacióndirectaAnálisis de conservación evolutiva
• Predicción de patogenicidad “in silico”:PolyPhen2, SIFT, MutPred
SECUENCIACIÓN MASIVA EN EL DIAGNÓSTICO DE EMHEN EL DIAGNÓSTICO DE EMH
1. Panel de 45 genes relacionados con CDG
CAPTURA DE GENES CANDIDATOS CONOCIDOS
2. Panel de 4 genes cuyo defecto causa hiperfenilalaninemia. 3. Panel de 110 genes cuyo defecto causa diferentes EMHs
1. Panel de 16 genes cuyo defecto causa un trastorno peroxisomaldel espectro Zellweger
2 P l d 22 d f l i2. Panel de 22 genes cuyo defecto causa glucogenosis
SECUENCIACION DEL EXOMA CELULAR PARA IDENTIFICAR GENES
Y MUTACIONES EN PACIENTES CDGY MUTACIONES EN PACIENTES CDG
MEDICINA PREVENTIVA: Cribado neonatal
Técnicas tradicionales
• FenilcetonuriaHi i idi é i
Un análisis‐ un metabolito‐ una enfermedad
• Hipotiroidismo congénito• Deficiencia de Biotinidasa
Espectrometría de Masas en Tándem (ESI‐MS/MS)
Un análisis‐varios metabolitos‐varias enfermedades
• Más de 30 enfermedades simultáneamente partiendo de la misma muestra
• rapidez y automatización: 500 muestras/ día, 2 min/ análisis
• seguridad: alta sensibilidad especificidad y precisión• seguridad: alta sensibilidad, especificidad y precisión
ENFERMEDADES DETECTABLES POR MS/MS
Cit li i• Ac. propiónica
AA: Aminoacidopatías AO: Acidemias orgánicas
• Citrulinemia• Aciduria argininsuccínico• Argininemia• PKU/HFA
• Ac. metilmalónica• Defectos de cobalaminas• Ac. glutárica tipo IA i lé i
/• Tirosinemia tipo I‐tipo II• MSUD• HipermetioninemiaH i ti i
• Ac. isovalérica• Def. HMGCoA liasa• Def. múltiple de carboxilasas• Metilcrotonilglicinuria• Homocistinuria Metilcrotonilglicinuria• Ac. metilglutacónica• Def. cetotiolasa
FAO: Defectos en la ‐oxidación de ácidos grasos
• LCHAD/Proteína Trifuncional• VLCAD
FAO: Defectos en la ‐oxidación de ácidos grasos y ciclo de la carnitina.
VLCAD• MCAD• SCAD• MADD• Def. transportador de carnitinaDef. transportador de carnitina• CPT I• CPT II/ carnitina‐acilcarnitina traslocasa
FLUJO DE INFORMACIÓN ENTRE CENTRO DE CRIBADO, DE CONFIRMACIÓN Y UNIDAD CLÍNICA
MATERNIDADSangre en papel de ≥ 48 hr de vida
CENTRO DE DETECCIÓN o CRIBADOCENTRO DE DETECCIÓN o CRIBADOAnálisis mediante MS/MS
Marcador alterado:Ph T F/T Xl SA il iti
Marcador NO alterado:Phe,Tyr, F/T, Xle, SA y acil‐carnitinas
FUERA de los límites normales
Phe,Tyr, F/T, Xle, SA y acil‐carnitinas
DENTRO d l lí it l FUERA de los límites normales
Informe resultado
UNIDAD CLÍNICA DE REFERENCIA
DENTRO de los límites normales
Informe de normalidad a UNIDAD CLÍNICA DE REFERENCIALOCALIZACIÓN DEL PACIENTEDIAGNÓSTICO DEL PACIENTE
Envío de muestras Informe resultado
Informe de normalidad a los padres
CENTRO DE CONFIRMACIÓNLab. GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
Envío de muestras Informe resultado
Análisis de AA, AO, ACC y de mutaciones en el gen correspondiente
Laboratorio de Cribado NeonatalC3 elevado en SP
Rutina Laboratorio:Glucosa, electrolitos,pH, gases, amonio..
C3 elevado en SP
LAB GENÉTICA BIOQUÍMICA Y MOLECULARPlasma ACOrina AO
Plasma C3 y C4DC ↑Orina AMM y Lac ↑
Plasma C3 ↑ Orina AMM ↑
Plasma C3 ↑ Orina AMM ↑
Plasma C3 ↑ Orina AP ↑
Plasma C3 N- ↑ Orina AMM N- ↑
Plasma HCys
Deficiencia t i i l l t t
Deficiencia Succinil CoA
Deficiencia MMCoA mutasa
Deficiencia CblC CblD CblF
Deficiencia PCoA
y ↑Plasma Hcys N
↑Plasma Hcys N
↑Plasma Hcys ↑
↑Plasma Hcys N Plasma Hcys N- ↑
nutricional lactante y/o materna de
vitamina B12o
Falso positivo
Succinil-CoA sintetasa
MMCoA mutasa,CblA o CblB
CblC, CblD, CblF,TC-II, CblJ
PCoA carboxilasa
Análisis molecular Actv. Mutasa, Incorp PropA áli i Actv.PCCAnálisis molecular
Análisis genes SUCLA2,SUCLG1
incorp PropAnálisis genes MUT,
MMAA, MMAB,MMADHC
Análisis genes MMACHC, MMADHC(2),
TCN2, LMBRD1, ABCD4
Actv.PCCAnálisis genes PCCA y PCCB
D fi i i d A id i A id i A id iDeficiencia de SUCLA
Aciduria Metilmalónica
Aciduriametilmalónica
con homocistinuria
Acidemia propiónica
CRIBADO NEONATAL AMPLIADO EN ESPAÑACRIBADO NEONATAL AMPLIADO EN ESPAÑA
PaisVasco
2007Sólo PKU+MCAD
Galicia2000
Vasco
La RiojaAragón2010
Cataluña2013
Madrid2011
2009Extremadura Castilla la Mancha
Sólo 2011
2011
Murcia2007
2009 Sólo 2011
Andalucía2008
MelillaCeuta
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