Universidad de Antioquia

Facultad de Ingeniería

Escuela Ambiental

Grupo GeoLimna

2013

Prof. Néstor J. Aguirre R. Dr. rer. nat

Métodos de campo y de laboratorio para estudios de calidad de agua dulce

Métodos de campo y de laboratorio para el estudio de algas fitoplanctónicas

En la figura 1, se presenta el método de campo para el estudio de algas microscópicas

de agua dulce.

Recipientes

plásticos y

Rotular

Inicio

Botella

Kemmerer

Red

fitoplancton

10 μm, 2μm

Metodología en campo

Tomar muestra con

Lugol al

10%

Nevera a 4ºC

(Gel, Hielo)

Transferir a

Fijar con

Transportar en

Variación

vertical 100%,

50%, 1%

Integrar la

zona fótica

Toda la

columna

Estudios de:

N. Aguirre

F F

Figura 1. Método de campo de algas fitoplanctónicas

Las muestras de agua superficial para el conteo de algas se tomarán directamente en

recipientes plásticos de un litro. Para la recolección de la muestra de agua se emplea una

botella muestreadora tipo Kemmerer y el agua se transfiere inmediatamente a un

recipiente de plástico. La recolección de algas en los sitios con presencia de bloom se

realiza mediante el empleo de una red de fitoplancton en la superficie del bloom. Las

muestras de agua para el conteo algal se fijarán con 10 ml de lugol por cada 100 ml de

muestra. El material colectado se transporta en neveras de teflón refrigeradas con geles

hasta el laboratorio.

Las muestras de fitoplancton también pueden obtenerse al integrar la zona fótica por

medio del volumen derivado de tres secciones en la columna de agua correspondientes a

la subsuperficie, al 50% y 1% de atenuación en la intensidad lumínica. Es deseable

embalar las muestras en recipientes oscuros y protegidos de la luz para evitar el efecto

de la luz sobre el lugol.

En la figura 2, se presenta el método de laboratorio para el análisis de las muestras de

algas.

Metodología en Laboratorio

Cámara de

Utermöhl

1,10,50 ml

Observar en el

microscopio

invertido.

400X

Densidad

de

organismos

(Ros, 1979)

Medir 20

células según

Hillebrand et

al., (1999)

Biomasa de

cada

spp=[ρ*vol.]

Strathmann

(1967) y Davies

et al., (1984)

Cámara

S-R

1ml

Agitar muestra y depositar en:

Esperar 24 H y

Determinar y contar en

Para spp dominantes

Obtener

Para biovolumen

n: número de organismos contados , s: área mm2

del campo visual, h: altura de cámara mm, c:

número de campos contados , F: 103mm3/1ml

30 Campos, 1 r, o hasta curva

saturada (Uehlinger, 1964)

Contar, medir y dibujar para obtener

biovolumen

N:Org/ml

= nF

sch

bis 100 ml

N. Aguirre

F

F

F

Figura 2. Método de laboratorio de algas fitoplanctónicas

Antes de la observación en el laboratorio, las muestras se deben agitar suavemente y el

procedimiento empezará depositándose volúmenes conocidos en cámaras de

sedimentación tipo Ütermohl durante 24 horas.

Para la observación de las muestras se puede emplear un microscopio invertido Leica

DMIN, provisto de una reglilla ocular utilizando una cámara de conteo de capacidad

conocida. Las observaciones al microscopio se efectúan según Ros (1979) en Ramírez,

(2000) por medio de un conteo en 30 campos con una magnificación total de 400X, para

ello se seleccionan varias áreas o campos de observación siguiendo un sistema de

muestreo al azar (Uehlinger, 1964). Las determinaciones de los taxa fitoplanctónicos se

realizarán mínimo hasta el nivel de género.

La cuantificación de organismos por mililitro será realizada según la siguiente fórmula

sugerida por Ros (1979):

Organismos por mililitro cuando se cuentan campos = nF/ sch

n= número de organismos contados

s= superficie en mm2 del campo del microscopio

c= número de campos contados

h= altura de la cámara en mm

F= factor de conversión= 103 mm

3/ 1ml

Al final del conteo por campos aleatorios, se efectúa un recorrido exploratorio de toda la

cámara para registrar el total de las especies o morfotipos. Lo importante es diferenciar

los elementos que constituyen el conjunto de algas de las muestras. Los análisis

numéricos posteriores requieren que el observador pueda diferenciar cada morfotipo de

alga y su densidad.

Para la determinación de especies o morfotipos se emplean claves taxonpomicas y

referencias bibliográficas como las siguientes: BOURRELLY (1966, 1968, 1985);

PRESCOTT et al., (1982); STREBEL Y KRAUTER (1988); Das Phytoplankton des

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Determinación del Biovolumen o volumen celular

Para estimar el biovolumen de algas planctónicas, se puede determinar el volumen

celular medio obtenido a partir de las dimensiones de mínimo 20 células seleccionadas

aleatoriamente en el microscopio. La equivalencia de la forma celular a un sólido

geométrico se efectúa según Hillebrand et al., (1999). La densidad absoluta (en org/ml)

de un taxa, así como el promedio del número de células de algas que forman colonias

será multiplicado por su volumen celular medio para obtener un estimativo de la

biomasa de cada taxa.

Las densidades de los taxa según los registros del conteo se sumarán y se obtendrá la

densidad algal en el sitio de colecta. Valores superiores a 30000 cel/ml pueden

considerarse altos.

El resultado final de la estimación de la biomasa será expresado en su volumen celular

(µm3/ml) por volumen de agua.

VC medio= ∑ Vi * (n)-1

Donde:

VC medio: volumen celular medio (µm3)

Vi : Volumen celular individual

n= número de individuos medidos

Luego,

Biovolumen (µm3/ml) = (VC medio) * número medio de células * densidad absoluta

(org/ml)

Métodos de campo y de laboratorio para el estudio de algas perifíticas

Para obtener muestras de algas perifíticas se realizará una remoción por medio de

cepillos plásticos del material adherido a sustratos como piedras, troncos, hojas que

estén sumergidas en el lecho de la corriente. Como unidad de área para efectuar la

remoción sobre los sustratos encontrados se utilizará un cuadrante de 8 cm2, el cual se

utilizará 30 veces al azar en el sitio de muestreo. Para ello puede emplearse un marco

de una diapositiva. En la figura 3, se presenta el método de campo para obtener

muestras de perfiton.

Figura 3. Método de campo para el perifiton

Para la observación de las muestras ficoperifíticas se utilizará un microscopio invertido

Leica DMIN, provisto de una reglilla ocular. Para el montaje de la muestra se utilizará

la cámara de conteo Sedgwick-Rafter de 1ml de capacidad (Wetzel & Likens, 1990).

Para análisis cuantitativos las muestras se estandarizan en un volumen de 100 ml.

Luego la muestra se agita en un recipiente plástico de arriba abajo 10 veces e

inmediatamente con una pipeta se extrae un mililitro de muestra para su disposición en

la cámara de conteo (figura 4).

Figura 4. Método de laboratorio para el perifiton

Para efectuar el conteo de algas perifíticas en la cámara se seleccionarán 30 campos de

observación siguiendo un sistema de muestreo al azar (Uehlinger, 1964). El conteo se

realiza con una magnificación total de 400X. La determinación taxonómica se basará en

las mismas claves y referencias bibliográficas para la determinación de algas

planctónicas. Valores superiores a 30000 cel/cm2 pueden considerarse altos.

Metodos de campo y de laboratorio para la determinación de la producción

primaria

En la figura 5, se presenta los métodos de campo y de laboratorio para la determinación

de la producción primaria acuática por el método del oxígeno propuesto por Gaarder

and Gran (1927).

Productividad PrimariaInicio

Botellas claras y

oscuras, medición O2

(Gaarder & Gran,

1927)

Disco Secchi;

Quantómetro Botella

Kemmerer

6 Botella

Winkler

por cada Z

Botella inicial

R= 2

4 botellas

Winkler:

en Z elegida

2 botellas

oscuras

(C2) y 2

claras

(C3)

PPB=

C3 – C2

PPN=

C3 – C1

ResP.=

C1 – C2

0

¿Regla de

decisión ?

Se basa en el método de

Tomar muestra de agua en

zona eufótica (100%, 50%,

25%, 10%,1%) con

Determinar ambiente

lumínico con

Llenar

Determinar C1 = concentración O2

Incubar t0

Medir O2

ti

N. Aguirre

F

FAnalizar resultados

Figura 5. Método para determinar la producción primaria en el agua.

El método del oxígeno empleando botellas claras para simular la actividad fotosíntética

y oscuras para simular la respiración acuática fue desarrollado por Gaarder y Gran en

1927, y a pesar de ser un método aproximado, es una herramienta valiosa para

determinar la producción primaria bruta en el agua.

El método consiste en tomar la muestra de agua a analizar en una determinada

profundidad. Esta profundidad se obtiene mediante la medición previa de la

transparencia Secchi y estimando la profundidad de la zona fótica. Luego se eligen las

profundidades de extinción de la luz a las que se incubarán las botellas que contienen

las muestras de agua.

Se deben llenar seis botellas con las precauciones necesarias para determinar el oxígeno

disuelto. Las botellas tipo Winkler pueden ser de 100 a 300 ml de capacidad. Dos de las

botellas estarán pintadas de negro o recubiertas con papel aluminio para evitar la

entrada de luz (botellas oscuras); las otras dos, estarán en su condición normal (botellas

claras). En la quinta y sexta botellas, debe determinarse la concentración inicial de

oxígeno en el agua (C1). Las botellas deben emplearse teniendo en cuenta las réplicas

que permitan controlar el error experimental.

Luego del llenado de las cinco botellas, todas excepto las que contienen el agua para la

medición de la concentración inicial de oxígeno, se incuban in situ en el agua a la

misma profundidad de extracción donde se tomó la muestra. Todo esto, debe hacerse

rápidamente y manteniendo las botellas resguardadas de la luz directa para evitar el

shock lumínico de las algas. Si se trabaja a tres profundidades, se tendrán entonces seis

botellas claras, seis botellas oscuras y seis botellas para la concentración de oxígeno

inicial (Ramírez, 1991a).

El tiempo de exposición de las botellas cambiará según la cantidad de plancton que

contenga el agua (sistemas eutróficos = 30-60 minutos, sistemas oligotróficos = 1-4

horas). Después del tiempo de exposición, se determina la concentración de oxígeno en

cada una de las botellas mediante el método de Winkler o directamente mediante un

oxímetro. En la botella clara se mide la producción de oxígeno por fotosíntesis (C3) y su

aumento se interpreta como una medida del carbono asimilado por la comunidad allí

existente. En la botella oscura se mide el consumo de oxígeno por respiración (C2)

(Ramírez, 1991a). Los cálculos de PPB en mg C/ m3/h, se obtienen así:

PPB mg C/ m3/h= 0,312* (C3-C2)*1000 Cole (1983)

T*PQ

T= tiempo de incubación de las botellas en horas.

PQ= Cociente fotosintético= 1,2

Regla de decisión (ver Margalef, 1983, Esteves, 1998):

Valores entre 0-75 mg C/ m3/h corresponden a ambientes oligoproductivos

Valores entre 75-250 mg C/ m3/h corresponden a ambientes mesoproductivos

Valores > a 250 mg C/ m3/h corresponden a ambientes euproductivos

Clorofila a.

Para la determinación cuantitativa de la clorofila a y de otras formas de clorofila, son

muy empleados los métodos espectrofotométricos. Entre éstos, figuran métodos

monocromáticos como el propuesto por Talling y Driver (1963, en Ramírez 1991b).

Cl a = 11.9 A665*v / Vz

Donde A= A665nm antes de acidificar el extracto-A750nm antes de acidificar el extracto/

A665nm después de acidificar el extracto-A750nm después de acidificar el extracto

v= volumen del extracto en ml.

V=Volumen filtrado en Litros.

Z=Ancho de la celda de cuarzo en cm.

En la figura 6, se presenta el método de determinación de la clorofila a.

Clorofila “A” Inicio

Espectrofotométricos:

-Talling & driver (1963)

-Vollenweider (1971)

-Parsons & Strickland (1963)

-Sartory y Grobbelaar

(1984)

V= volumen conocido

Filtro Millipore φ 0.45μm

<0.5 atm.

Botella Rϋttner

0.5-1L

Nevera de teflón

y refrigerar 4ºC

Etanol .

Baño maría

Centrifugar

5’. 3500

rpm(2n)

Espectrofotómetro

PT

Espectrofotómetro

Feopigmentos

Se basa en métodos

Tomar muestra con

Transportar a laboratorio en

Filtrar en la oscuridad

Extraer clorofila

Medir Abs. (665nm , 750nm)

Adicionar HCl

N. Aguirre

F

F

Recipientes plásticos

Oscuros rotulados.

500ml

Transferir a

F

Figura 6. Método para determinar la concentración de clorofila a en el agua.

La cantidad de agua a filtrar depende de la observaciones de campo y de microscopio

sobre la densidad algal esperada. 500ml pueden ser un volumen suficiente para

ambientes ricos en fitopláncteres y 1000ml para ambientes de aguas transparentes.

Después de la extracción de la muestra, la filtración del agua debe efectuarse lo más

rápido posible, evitando incidencia de luz muy fuerte y altas temperaturas. La presión

durante la extracción no debe exceder de 0.5 atmósferas. Los filtros más utilizados para

filtrar las muestras de agua son H.A. Millipore de celulosa con poro de 0.45 um

(Ramírez, 1991b).

Para la extracción de la Clorofila a se sugiere emplear el Et-OH Etanol grado analítico

en baño maría. Por su parte se sugiere un tiempo de centrifugación de 5 minutos a una

velocidad de 3500 rpm. Valores mayores a 10 ug/L de clorofila a pueden considerarse

altos.

Métodos para el estudio de protozoos de vida libre

Los métodos para el estudio de la comunidad de protozoos heterótrofos y mixotróficos

en los ambientes de agua dulce son diversos. Sin embargo para efectos del estudio de

esta comunidad de microorganismos se tendrán en cuenta los siguientes métodos de

estudio. Un primer acercamiento al estudio de los flagelados heterotróficos se realizará

a través de la clasificación por tamaño según los criterios establecidos por Auer & Arndt

(2001), así:

Criterios de tamaño para el estudio de los flagelados:

Pequeños (< 5 Um)

Medios (5-10 Um)

Grandes (> 10 Um)

Metodos para el análisis de muestras in vivo. Las muestras de protozoos obtenidas se

transportarán al laboratorio con una temperatura igual al sitio de toma de muestra, luego

serán observadas usando la técnica de conteo in vivo empleando un microscopio con

control de temperatura y evitando su agitación. Estas muestras se analizan como

máximo, una hora después de la toma de la muestra (Mathes & Arndt, 1995). Con éste

método se puede determinar la abundancia, el biovolumen y el taxón (Massana & Güde,

1991; Gasol, 1993; Arndt et al., 2000).

Metodos para el análisis de muestras fijadas. Se preparan muestras fijas con el fin de

realizar un estudio detallado de los taxa. Para ello, las muestras de protozoarios se fijan

en una solución de formaldehido al 0,6% y se emplea un microscopio de

epifluorescencia usando 4’,6 diamidino-2-phenylindol (DAPI) como reactivo de tinción

(Güde et al., 1985).

En la figurar 7 se presentan los métodos para el análisis de los protozoos de vida libre

en el agua dulce.

Figura 7. Método de campo para el estudio de protozoos de vida libre.

Análisis de muestras al microscopio. Para el análisis de muestras al microscopio se

emplean cámaras de diferentes tamaños (10ul, 50 ul, 400 ul, 2 – 10 ml). La

diferenciación entre los flagelados de nutrición autotrófica y los de nutrición

heterotrófica, se establece a través de un microscopio de epifluorescencia siguiendo los

criterios propuestos por Davis & Sieburth (1982). En la figura 8 se presenta el método

de laboratorio para el estudio de protozoos de vida libre.

Figura 8. Método de laboratorio para el estudio de protozoos de vida libre.

El biovolumen de los organismos se determina por la medición de las formas

geométricas de los organismos (Premke & Arndt, 2000). Estas mediciones se efectúan

empleando un microscopio Zeiss Axioplan con magnificación desde 40X hasta 1000X y

equipado con contraste de fases y contraste de interferencia óptico. Al menos se tiene

cuenta un mínimo de tres alícuotas (2-

Determinación de taxa. Para la determinación taxonómica se tiene en cuenta la

sistemática propuesta por Corliss (1979) y Patterson & Larsen (1991). También se

emplearán las guías taxonómicas de Patterson et al., (1989); Larsen & Patterson,

(1990); Voers et al.,(1995); Tong et al., (1998); Bernard et al., (2000).

Métodos de campo y de laboratorio para el estudio del zooplancton

En la figura 9 se presenta el método de campo para obtener muestras de zooplancton en

ambientes de agua dulce.

Metodología en campo

Inicio

Botella Schindler

Vol.: 5L (15 Litros )

Red

Zooplancton

45 μm

Flujometro

Tiempo ,

velocidad,

GPS

Recipientes

plásticos

Rotulados

100ml

Nevera a

4ºC

(Gel, hielo)

Determinar

Tomar muestra con

Para

medir con

Transportar en

Formaldehido al

4%

Tomar

muestra con

botella

integradora

Variación

vertical:

100%,

50%,1%

Integrar

zona Fótica

Toda la

columna

Fijar con

Transferir a

Estudios de:

N. Aguirre

F F

Figura 9. Métodos de campo para el estudio del zooplancton

Como se observa en la figura 9, las muestras de agua pueden ser colectadas con el

empleo de una botella tipo Kemmerer, Schindler o Ruttner. Las muestras volumétricas

se pueden obtener a diferentes profundidades en la columna de agua, integrando zonas

específicas de la columna de agua o teniendo en cuenta un criterio lumínico. Estas

muestras permiten realizar análisis cuantitativos de riqueza de especies o de densidad

zooplactónica expresada en No de organismos/100ml. Densidades mayores a 200

organismos/100 ml se pueden considerar altas.

También pueden obtenerse muestras a través de arrastres subsuperficiales en el agua

empleando redes de 0,45 um de diámetro, en cuyo caso el análisis arroja resultados

cualitativos. El formaldehido al 4% suele ser el reactivo empleado para la fijación de

muestras. También puede adicionarse vaselina líquida para evitar el daño de estructuras

como toracopodos o furcas.

En la figura 10, se presenta la metodología para el análisis de las muestras al

microscopio. Usualmente este análisis permite la determinación de taxa. Si los

zoopláncteres son pequeños <100 um, el conteo de estos se realiza en el microscopio

con el objetivo de 4X. Si los zooplacteres son grandes >100 um los organismos se

determinan en el microscopio pero se cuentan en un estereomicroscopio usando una caja

de Petri.

Metodología en Laboratorio

Agitar

Organismos 1 ml

Wetzel y Likens (2000)

ρ ρ

Ind/Litro

Disectar en

Estereomicroscopio

Depositar 1 ml de muestra en

Determinar y contar Spp?

r = 5

Observar en Microscopio

Invertido 40X

(obj. 4X)

Cámara

S-R

N. Aguirre

F

F

F

Figura 10. Métodos de laboratorio para el estudio del zooplancton

La densidad de zooplancton se estima mediante el conteo de los organismos presentes

en la muestra completa en caso de abundancias bajas, para lo contrario se contarán los

organismos presentes en 5 alícuotas de 1 ml cada una. Estas se depositan en una caja de

Petri y se observan al estereomicroscopio. Posteriormente se determinará el valor medio

de las cinco alícuotas contadas, se multiplicará por el volumen de la submuestra y se

dividirá por el volumen total filtrado (Wetzel y Likens, 2000). Las densidades serán

reportadas en ind./100ml. La determinación de zooplancton se realiza empleando las

claves de Edmondson (1959); Elmoor-Loureiro (1997); Paggi (1975); Sendacz y Kubo

(1982), STREBEL Y KRAUTER (1988); Villabona et al., (2009).

Métodos para el estudio de plantas acuáticas

Las plantas acuáticas pueden distribuirse en diferentes lugares de los biotopos acuáticos.

Así se pueden encontrar plantas emergentes, de hojas flotantes, sumergidas y flotantes

libres (Aguirre et al., 2011).

Las plantas acuáticas se pueden determinar directamente en campo con el empleo de

claves taxonómicas. Sin embargo, algunas especies de difícil identificación deben

colectarse, esto teniendo en cuenta su sistema radicular, tallo, hojas y estructuras

florales, con el fin de ser determinadas en un herbario. Si la muestra debe conservarse,

se procede a prensar y secar el material en campo. La prensa consiste en listones de

madera cruzados y sujetados con correas. Las plantas pueden recibir por aspersión o

inyección alcohol con el fin de conservar el material hasta su arribo al herbario.

Además de las instrucciones generales, Schmidt-Mumm (2002) también propone

recomendaciones sobre colecta y preservación de material macrofítico especifico para

cada grupo. A las plantas errantes emergentes de mayor tamaño como Eichhornia

crassipes, se les debe eliminar hojas, tallos y raíces excesivas, además de una incisión

en las hojas y peciolos inflados para lograr el aplanamiento de la planta. Macrófitas de

menor talla como las errantes emergentes: Lemna, Spirodela, Azolla y Salvinia y como

las errantes sumergidas (Riccia y Wolffia) se deben colectar empleando una red de

acuario.

Las plantas acuáticas se conservan en recipientes plásticos con alcohol al 75%. Las

plantas acuáticas se pueden muestrear sobre líneas transectas de 100 m sobre las cual se

registra el espécimen. Si se requiere un análisis cuantitativo de cobertura, se dispone de

un cuadrante de 1 m de lado cada 10 m sobre la línea transecta. El material vegetal

incluído en este cuadrante se cuenta registrando el número de individuos por taxa, y se

pesa al menos cuatro ejemplares de cada especie para registrar la biomasa húmeda

(Aguirre et al., 2011).

Macroinvertebrados acuáticos.

Para el muestreo de los macroinvertebrados acuáticos se emplea un red tipo surber, con

la cual se obtienen muestras cuantitativas. Adicionalmente, se toman muestras

cualitativas empleando redes triangular y de pantalla. También se obtienen muestras

cualitativas capturando manualmente los organismos adheridos a sustratos como

piedras, troncos, hojarasca y plantas acuáticas.

Los macroinvertebrados colectados se fijan en alcohol y en recipientes plásticos

rotulados se transportan al laboratorio. Adicionalmente, se determina la velocidad de la

corriente, el perímetro húmedo y el caudal del ambiente lótico empleandose un

correntómetro. Se recomienda tener en cuenta información adicional para análisis de

resultados como la hora del día en que se realizó el muestreo, la altitud, la descripción

general del sitio, características del entorno, registro de lluvias, entre otros aspectos.

En el laboratorio, la muestra a analizar se deposita con suficiente alcohol en una caja de

Petri. Se separan con pinzas los diferentes taxa con base en afinidades morfológicas y

luego se procede a la determinación de las taxa teniendo en cuenta las referencias el uso

del estereomicroscopio y claves taxonómicas. Se esquematiza y analiza la relación de

cada uno de los taxa observados con la calidad del agua.

Los principales niveles empleadas generalmente en la identificación de los taxa siguen

la siguiente jerarquización taxonómica: Reino, Phyllum, Clase, Orden, Familia, Género

y Especie. Cada una de estas categorías o niveles taxonómicos a su vez, pueden formar

subcategorías. El nombre científico de un organismo consta del género y de un segundo

término en minúscula que es la especie. Los trabajos especializados de McCafferty

(1981), Needham y Needham (1982), Roldán(1988), Müller(1995) y Roldán (2003) son

algunas de las fuentes de consulta utilizadas para la determinación de los

macroinvertebrados en el laboratorio y el análisis de la calidad de agua basada en

bioindicadores.

Referencias Bibliograficas

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