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VIRUS
Lic. en Bioquímica-2016
Brock. Biología de los microorganismos. 12°- ed. 2009
Objetivos
� Definir virus y diferenciarlos de las bacterias
� Clasificar los virus según estructura, hospedador, material genético
� Mencionar métodos para cultivar e identificar virus
� Definir ciclo de multiplicación de los virus� Definir entidades subviricas, viroides y priones
� Analizar bacteriófagos característicos T4; Lamda
Propiedades generales de los virus:
• Virus : agente infeccioso que no puede replicarse independientementede una célula hospedadora. No es una célula.
• Virión :- Forma extracelular de un virus- Facilita la transmisión de una célula hospedadora a otra
– Contiene ácido nucleico como genoma, rodeado por una cubiertaproteica y en algunos casos, otras capas externas
TAMAÑO DE LOS VIRUS
• Varía desde los 20 nm como Parvovirus (Parvovirus B19) y
Picornavirus (Enterovirus, Rhinovirus, Hepatovirus, etc ) hasta los
300 nm como los Poxvirus; tamaño semejante a Chlamydias
Parapoxvirus, Orthopoxvirus, Molluscipoxvirus).
• De 100 a 1.000 veces más pequeños que las células que infectan.
• Sólo se visualizan al microscopio electrónico por lo que para
identificarlas se suelen usar reacciones de infectividad biológica o
serológica o incluso análisis específicos de enzimas.
1nm es igual a 0.001 micrometro
Comparación de tamaños de virus y bacteria
Fuente: Tortora. Introduccion a la microbiología
Necesitan células para replicarse
Cada virus ataca un determinado tipo de célula
Ejemplo
Virus de la Hepatitis
Virus de la Rabia
Virus de Poliomielitis
Virus de Paperas
Hígado
SNC
SNC
Glándulas Parótidas
CARACTERÍSTICAS DE LOS VIRUS
CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS
• Tres grupos en función de la célula que infecten (hospedador)
• Virus vegetales
• Virus animales
• Bacteriófagos
• Rango de huésped: un virus afectará determinadas especies dentro
de cada grupo.
• Taxonómicamente: se identifica orden, familia, género y especie
• Familia: se define por morfología, estructura del genoma, las
estrategias de replicación
Simetría de los virus
� Las nucleocápsides (ácido nucleico y las proteínas) están construídas de una manera altamente simétrica
� Simetría: se refiere a la manera en la que las unidades morfológicas proteicas se ordenan en la cubierta vírica.
� Existen dos tipos:• Cilíndrica: helicoidal• Esférica: icosaédrica
Poseen 20 caras, 30 bordes y 12 vértices. Cada cara es un triánguloequilátero, resultando una estructura simétrica. Ej: adenovirus, papovavirus y herpesvirus.
Simetría viral
helicoidal
icosaédrica
Simetría mixta
Bacteriófagos
dsDNA ( ±±±±) virusClass I
Class VII
ssDNA ( ++++) virus
Class II
dsRNA ( ±±±±) virus
Class III
ssRNA ( ++++) virus
Class IV
ssRNA ( −−−−) virus
Class V
ssRNA ( ++++) retrovirusClass VI
dsDNA intermediate
dsDNA intermediate
Synthesis ofother strand
Transcriptionof minus strand
Transcriptionof minus strand
Transcriptionof minus strand
Transcriptionof minus strand
Used directlyas mRNA
Reversetranscription
mRNA (++++) mRNA (++++)
Genomereplication: Class I,
Class II,
Class VII,
DNA viruses
Genomereplication: Class III,
Class IV,Class V,Class VI,
RNA viruses
classical semiconservativeclassical semiconservative,discard ( −−−−) strand
transcription followed byreverse transcription
make ssRNA ( ++++) and transcribe from this to give ssRNA ( −−−−) partnermake ssRNA ( −−−−) and transcribe from this to give ssRNA ( ++++) genomemake ssRNA ( ++++) and transcribe from this to give ssRNA ( −−−−) genomemake ssRNA ( ++++) genome by transcription of ( −−−−) strand of dsDNA
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CLASIFICACION DE BALTIMOREBasada en la relación entre el genoma viral y su RNAmCómo se replican los virus según su ácido nucleico?
Ejemplos:I: herpes VI: RetrovirusII: parvovirus VII: Hepatitis BIII: IBDV (bursitis infecciosa-pollos)IV: TMV, hepatitis CV: sarampión, gripe, dengue
RNA polimerasa(hospedador)
RNA polimerasa(hospedador)
Polimerasas del hospedador sólo usan dsDNA para formar mRNA (ni ssDNA ni RNA)
RNA polimerasadependiente de RNA (virus)
RNA polimerasa dependientede RNA (virus)
(Actúa como mRNA)
RNA polimerasa dependientede RNA (viral) - dentro del virus
RNA polimerasadependiente de RNA (viral) - dentro del virus
Retrovirus
Transcriptasareversa (viral)Proteasa,Integrasa -dentro del virus
RNA polimerasa(hospedador)
RNA polimerasa(hospedador)
Transcriptasa reversa (viral) paraReplicación, mediante RNA
DNA polimerasa(hospedador)
ENZIMAS DE LOS VIRIONES
-Lisozima
-RNA polimerasas
-Transcriptasa reversa
-Neuraminidasas
-Hemaglutininas
Sólo ácido nucleico y cápside?
Crecimiento y cuantificación
� Para el estudio de virus bacterianos se usan cultivos puros en medios líquidos o semisólidos. Son los más fáciles de estudiar porque hay muchas bacterias fáciles de cultivar.
� Los más difíciles de cultivar son los virus vegetales porque a veces el estudio requiere de la planta entera; se deben producirorificios en la pared de la planta para permitir la penetración del virus…
� Los virus animales afortunadamente pueden ser estudiados porque muchos virus animales pueden ser cultivados en tejidos o cultivos celulares, facilitando la investigación.
CÓMO CULTIVARVIRUS ?
-Bacteriófagos
Cuando ocurre una infección viral exitosa, las células se lisan, formando una placa. Contando el número de unidades de formación de placa, se puede calcular el título o el número de unidades infecciosas de virus.
No siempre coincide la cuantificación por los métodos mencionados…. Por qué ??
Microscopio electrónico vs. Recuento de placas de lisis
Eficiencia de la siembraEl Nº de unidades formadoras de calvas es siempre menor que el RtomicroscópicoEj. : - virus defectivos (alta tasa de mutación en virus ARN)
- cápsides vacías- algunos no logran infectar con éxito (nunca es 100%)
CÓMO CULTIVARVIRUS ?
Virus humanos y animales:
-Huevos embrionados
- cultivos primarios y líneas celulares
Cultivo de tejidos
• Cultivos primarios : consisten en una variedad de tipos celulares y tienen un crecimiento limitado in vitro conservando en sus divisiones las características fisiológicas y genéticas del tejido de origen
• Líneas celulares : pueden seguir su multiplicación in vitro durante muchas divisiones. Pueden ser de origen neoplásico
Cultivos celulares
� Un cultivo celular se obtiene induciendo el crecimiento de un órgano del animal de experimentación. Se separan las células por instrumentación quirúrgica, disociación de las mismas por tratamiento enzimático para romper las uniones intercelulares.
� Se coloca en una superficie plana (caja de Petri, o botella de Roux) y se adiciona medio de cultivo líquido.
� Se forma una monocapa porque las células liberan material glicoproteico que permite su adhesión en el fondo
� El medio es complejo, tiene aminoácidos, vitaminas suero fetal bovino (SFB), sales, glucosa, buffer, indicador de pH, antibióticos, antifúngicos.
Alteraciones inducidas en la célula huésped
Efecto citopático:• Destrucción de la monocapa
• Formación de células multinucleadas• Desarrollo de cuerpos de inclusión• Transformación
Cuerpos de Negri característicos presentes en una célula de Purkinje del cerebelo de un paciente que falleció por rabia.
BACTERIOFAGOSReceptores de fagos en
Escherichia coli:
-LPS (lipopolisacárido)
-pili sexual
-proteína de captación de hierro
-proteína transportadora de maltosa
REPLICACIÓN VÍRICA
-Unión o adsorción del virión a la célula hospedadora
-Penetración, entrada o inyección del ácido nucleico en la célula
-Ciclo lítico Ciclo lisogénico
-Síntesis del ácido nucleico - Integración en el y las proteínas del virus genoma del-Ensamblaje de las cápsides y hospedadorempaquetamiento de los - Replicación degenomas víricos en ellas la bacteria y síntesis -Liberación de los viriones de nuevas proteínas maduros por lisis celular (ej. toxinas)o por gemación.
CICLO LÍTICO
Fago virulento
CICLO LISOGÉNICO
Fago temperado oprofago
Bacteria lisógena
http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072556781/student_view0/chapter17/a nimation_quiz_2.html
Célula permisiva
Ciclo lítico
� Fijación
� Penetración
� Eclipse
� Ensamblaje
� Liberación
El ciclo lítico de lambda puede ser inducido por agentes que dañan el ADN:
luz UV, rayos X, sustancias químicas (mostaza nitrogenadas).
CÓMO LA BACTERIA EVADE LA INFECCIÓN POR UN VIRUS ?
-Ausencia de receptores en el hospedador
-Endonucleasas de restricción, para cortar DNA de fagos
-CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats) son loci que contienen múltiples repeticiones cortas directas quefuncionan como sistema inmune presente en bacterias y archae. Como RNAi, silenciarían la expresión de DNA extraño como plásmidos y fagos
CÓMO SE DEFIENDE UN VIRUS DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN DEL HOSPEDADOR ?
Modificando su propio DNA por:- glicosilación - metilación -acetilación
- Codificando proteínas que inhiben los sistemas de restricción de la bacteria
ENTIDADES SUBVÍRICAS
- VIRUS AUXILIARES: virus parásitos de otros virus
VIRUS DEFECTIVOS: dependen de virus intactos del mismo tipo para que les proporcionen las funciones necesarias (Ej: P4 depende de P2 porque no codifica proteínas de la cápside)
VIRUS SATÉLITES: dependen de virus que no están emparentados. Se encuentran en animales y plantas (Ej: virus adenoasociado necesita de un Adenovirus)
-VIROIDES
-PRIONES
Viroides� Son los patógenos más pequeños � Son moléculas infecciosas de ARN monocatenario circular que
carecen de cubierta proteica.� Tienen estabilidad extracelular debido a la estructura que poseen,
molécula corta de doble cadena con extremos cerrados
� Replican en núcleo de células vegetales� Viajan de célula en célula vegetal a través de los plasmodesmos� Producen enfermedades en plantas Impacto en agricultura
� No tiene receptores por eso ingresan por heridas en las plantas producidas por insectos o acción mecánica
Prión
Agente infeccioso: es una proteína patógena que tiene alterada su estructura terciaria, teniendo un incorrecto plegamiento.Sin ADN ni ARN, sólo aminoácidos.
(PrnP )
(PrPSC)
PRIONES
Prión: pequeña partícula infecciosa proteica. Provocan
encefalopatías espongiformes (enfermedad neurodegenerativa).Proteínas modificadas del hospedador que puede transmitir la
enfermedad.
Humanos
Kuru
Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ)
Animales
Scrapie
Encefalopatía espongiforme bovina (vacas locas)
NoSíRespuesta inflamatoria
NoSíRespuesta inmunitaria
LargoDep. virusPeriodo de incubación
NoSíEfecto citopatológico
Patología
NoSíRadiaciones ionizantes y UV
NoLa mayoríaCalor (80ºC)
NoAlgunosProteasas
NoSíFormaldehído
Desinfección con
SíSíPresencia de proteínas
No?SíPresencia Acido Nucleico
PRIONVIRUSCOMPARACION VIRUS VS PRIONES
• El prototipo de estos microorganismos es PrPSc (prión proteico del scrapie)
• Tanto humanos como algunos animales codifican una proteina PrPC(prión proteico celular)
ESTRUCTURA Y FISIOLOGIA
HorasDíasMultiplicación
Membranas Plasmáticas
Vesículas Citoplasmática
s
Localización dentro o sobre las células
NoSíPresencia de Scrapie en fibrillas
NoSíResistencia a la proteasa
ExtendidaGlobularEstructura
PrPCPrPScCOMPARACION PrPSc VS PrPc
Características patogénicas de los virus lentos
La encefalopatía espongiforme describe:
• El aspecto de las neuronas vacuoladas
• La pérdida de función.
• Falta de antigenicidad /ausencia de reacción inmunitaria.
• Ausencia de inflamación.
• Síntomas: pérdida de control muscular, escalofríos, temblores, demencia.
PATOGENESIS
• PrPSc se une a la PrPc que hay en la superficie celular y hace que se transforme en PrPSc, se desprenda de la célula y se acumule en las placas mieloides del cerebro.
• Al ser proteinas del hospedador no se produce respuesta inmunitaria)
• A continuación la célula repone PrPc.
• Las neuronas y los fagocitos absorben la PrPSc, difícil de degradar, lo que contribuye a la vacuolización del tejido cerebral y destrucción tisular.
• Los priones se pueden aislar de distintos tejidos del cerebral pero solamente el cerebro presenta alguna lesión.
PATOGENESIS
PrPc
PrPSc
Una proteína aberrante provoca la enfermedad:
•PrPSc se une a la PrPc que hay en la superficie celul ar
•PrPSc hace que PrPc se transforme en PrPSc y se desprenda de la célula.
•A continuación la célula repone PrPc.
•Las neuronas y los fagocitos absorben la PrPSc, difícil de degradar, lo que contribuye a la vacuolización del tejido cerebral y destrucción tisular.
Neurona
Nucleo
DNA
FunciónNormal
FunciónAnormal
PrPSc
(prion malformado)
PrPc
(prion normal)PrPSc-induce malplegamiento
TraducciónTranscription
Prnp
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La enfermedad por priones ocurre por3 mecanismos posibles:
Infecciosa: la forma patogénica de la proteína priónica se transmite entre animales o humanos
Esporádica: mal plegamiento al azar de una proteína priónicanormal en un individuo sano
Por vía hereditaria: una mutación en el gen de la proteína PrP se traduce en una proteína que cambia para convertirse en patógena.
BACTERIÓFAGOS
Referencia: Brock. Biología de los microorganismos. 12°ed. 2009
Virus bacterianos
CARACTERÍSTICAS DEL FAGO T4
Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli-Es virulento: desencadena ciclos líticos-DNA: bicatenario-codifica algunos de sus tRNA-sufre permutación circular (genera moléculas de ADN de la longitud del genoma del virus con secuencias permutadas por una endonuclesa que corta longitudes constantes de ADN independientemente de la secuencia) forma concatémeros-Sintetiza proteínas que modifiquen la RNA pol del hospedador para reconocer los promotores medios del fago. Necesita el factor sigma del hospedador-Tiene la base 5-hidroximetilcitosina (en lugar de citosina)que se glicosila y permite resistir ataque por ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION del hospedador. Las enzimas para la síntesis de esta base la codifica el virus
Generación de moléculas de ADN de T4 con secuencias permutada por una endonucleasa que corta longitudes constantes de ADN sin tener en cuenta la secuencia.
Izquierda: copias de T4 se recombinan para formar un concatemero.
Medio: flechas rojas, sitios de cortes de la endonucleasa.
Derecha: moléculas genoma generado. Cada uno de los genomas T4 formados de la derecha contiene los genes A-G, pero los terminales son únicos en cada molécula.
Características del Fago T4
� Genéticamente, el DNA de T4 se representa como un círculo, aún cuando el genoma es en sí lineal, debido al fenómeno denominado PERMUTACION CIRCULAR.
� Esto se debe a que para cada virus, la secuencia terminal del DNA puede variar, aunque las repeticiones del principio y final del genoma están presentes para cada virión. Explicación: Mecanismo de replicación.
� Desde un origen de replicación único, se forma un OJO de replicación, que acabará formando la horquilla típica de replicación bidireccional.
� Hay un extremo que queda temporalmente libre (en la forma Y) donde estála secuencia repetida. Esta secuencia puede asociarse con la cadena complementaria del extremo opuesto, formándose un CONCATEMERO, tras rellenarse los huecos con DNApol y DNA ligasa.
� El problema de T4, que no tienen otros virus T impares (T7, por ejemplo) es que estos concatémeros serán cortados por una enzima que no corta sitios específicos , sino que lo hace cuando la cabeza del virión está llena.
� Esto ocurre con algo más de un genoma, por lo que se originarán virus con extremos repetidos.:Abcd.............Abcd
� Al cortarse el genoma (Abcd..........Abcd) por una enzima que no es específica de nucleótido, se desplaza la secuencia, dando la sensación de una estructura genéticamente circular
La circularidad puede explicarse por redundancia terminal, dondecada cromosoma comienza y acaba con la misma secuencia de nucleótidos y por permutación circular, en la que los extremos redundantes no son los mismos para cada cromosoma, sino que son aleatorios.
Evolución temporal de la infección por T4
Fago T4
CARACTERÍSTICAS DEL FAGO LAMBDA
-Simetría: compleja -Hospedador: Escherichia coli
DNA:- se integra al genoma bacteriano (fago lambda) o puede existir como plásmido (fago P1)-Predomina la expresión de un represor de lisis (cI)-Por eso se llama FAGO ATEMPERADO o PROFAGO: desencadena ciclos lisogénicos en las células infectadas.-Las bacterias infectadas presentan nuevas propiedades, por ej.expresan toxinas que las convierte en patógenas.
CARACTERÍSTICAS DEL FAGO LAMBDA
-Las bacterias infectadas por fago lambda son inmunes al ataque por partículas similares
-Puede revertir a fago virulento: la inactivación del represor de lisis (cI) induce el CICLO LÍTICO debido al aumento de la expresión de la proteína Cro.
-El DNA es lineal bicatenario con extremos 5’ cohesivos formados por 12 nucleótidos complementarios: sitio cos. Al entrar al hospedador se aparean y el DNA pasa a ser circular.
-Se integra al cromosoma de Escherichia coli por el sitio att
LISOGENIA
Bacteria hospedadora expresa nuevaspropiedadesEjemplos? Toxinas
Integración de ADN de lambda en el hospedador
Enzima: integrasa
Operón gal: utilización galactosaOperón bio: síntesis biotinaOperón moa: síntesis cofactores molibdeno
coscos
Replicación de lambda por el círculo rodante
La hebra verde oscuro desenrolla, se está replicando en su extremo opuesto. Es una síntesis asimétrico porque una de las cadenas parentales sigue sirviendo como molde y el otro se utiliza sólo una vez
CICLO LÍTICO O LISOGÉNICO ?Cro versus cI
Para establecer lisogenia, dos eventos deben suceder: -Evitar la producción de proteínas tardías - Una copia del genoma lambda debe integrarse en el cromosoma del huésped.
GENOMA DE LAMBDA
Elementos claves: dos proteínas represoras el represor de lambda cI y el represor Cro
cI > Cro => LISOGENIA cI < Cro => LISIS
FAGO LAMBDA: CICLO LISOGÉNICO o LÍTICO ?
Ciclo lisogénico:-Síntesis activa de cI (represor de ciclo lítico)-Genoma de fago lambda está integrado en el DNA del hospedador-No hay producción de proteínas tardías
Ciclo lítico:-Síntesis de grandes cantidades de Cro-Cro reprime proteínas cII y cIII que inducen síntesis de cI-Proteasa FtsH del hospedador degrada cII. Esto afecta a cI.
Fago MS2
- Bacteriófago ARN- Codifica 4 proteínas (Maduración, cápside, proteína de lisis, replicasa- SOLAPAMIENTO DE GENES-HOSPEDADOR: E. coli F+, tiene pili sexuales donde el fago se une.
El ARN viral actúa como RNAm y la regulación desu expresión génica se basa en el control del acces o del ribosoma a los diferentes inicios de traducción del virus
Fagos M13, fd, f1
-Fagos de ADN filamentosos con simetría helicoidal-Infectan células capaces de actuar como donadoras en una conjugación- Genoma es ADN circular de cadena sencilla-No produce lisis de la bacteria, se libera por GEMACION por lo que la célula tiene un retraso en el crecimiento pero puede coexistir con el virus
M13 se usa como vector de clonación en Ingeniería Genética.
Pared de la bacteria
GEMACIÓN
Bacteriófago Mu (mutador)
- Es un fago atemperado - Se replica POR TRANSPOSICIÓN
- Acetilación de residuos de adenina para eludir los sistemas de restricción del hospedador
-FAGO ATEMPERADO: Se integra dentro de genes del hospedador e induce MUTACIONES en el genoma del hospedador
-Puede revertir A CICLO LÍTICO
- Se usa en Ingeniería Genética para generar fenotipos bacterianos mutantes.
Elementos transponibles son secuencias de ADN que se mueven deun punto a otro en el genoma
del hospedador
Mu y la región invertible G: determina especificidad de hospedador
Especificidad de hospedador según fibras de cola: G+ (lee SU): E. coli K12; G- (lee S’U’): otros hospedadores
METODOS COMUNES PARA INACTIVAR VIRUS
A.ESTERILIZACIÓN - vapor a presión, calor seco, óxido de etileno,
rayos gamma
B. DESINFECCIÓN DE SUPERFICIES- hipoclorito de sodio, glutaraldheído,
formaldheído, ácido peracético
C. DESINFECCIÓN DE LA PIEL- clorhexidina, etanol al 70%
ACCIÓN DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE
VIRUS
Agentes Físicos
1.Temperatura; los virus son muy termolábiles• 55-60ºC viven unos segundos• 37ºC unos minutos• 20ºC unas horas• 4ºC unos días• -70ºC pueden vivir de meses o años.
Los V envueltos son más sensibles que desnudos.
La congelación/descongelación provocan pérdida de infectividad (se deben congelar las muestras si no se procesan inmediatamente)
ACCIÓN DE LOS AGENTES FISICOS Y QUIMICOS SOBRE
VIRUS
Agentes Físicos
2.- Radiaciones: Alteran los ácidos nucleicos. Los daños pueden ser por:
distorsión estructural, mutaciones puntuales, ruptura de la cadena de
DNA
Los virus monocatenarios son más sensibles que los de doble cadena
Sales: se estabilizan mediante la adición de sales
como MgCl2, MgSO4 y Na2SO4.
pH: los virus son estables entre pH 5 y 9.
Reacción a los agentes químicos
Éter: virus envueltos son los más afectados.
Formol: suprime la infectividad de virus al reaccionar con su ácido nucleico. Se emplea en la producción de vacunas a base de virus inactivados.
Antibióticos y otros antibacterianos: no tienen efecto sobre los virus.
Amonio cuaternario y compuestos a base de yodo: no los afecta.
Hipoclorito de sodio: efectivo en concentraciones mayores que las requeridas para destruir bacterias.
Muchas Gracias!!