UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL FACULTAD DE …repositorio.ug.edu.ec/bitstream/redug/39598/1/Tesis...

UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES

CARRERA DE INGENIERIA AMBIENTAL

TRABAJO DE TITULACIÓN

PREVIO A LA OBTENCION DE TITULO DE INGENIERO AMBIENTAL

TEMA:

DETECCIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE BIORREMEDIACIÓN DE

SUELOS CONTAMINADOS CON ACEITE USADO DE MOTOR

AUTOR: Yamil Javier Franco Alarcón

TUTOR: MSc. Miriam Salvador Brito

GUAYAQUIL, ABRIL 2019


FACULTAD CIENCIAS NATURALES

CARRERA INGENIERIA AMBIENTAL

UNIDAD DE TITULACIÓN

DETECCIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE

BIORREMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON ACEITE

USADO DE MOTOR

Autor: Yamil Javier Franco Alarcón

Tutor: Msc. Miriam Salvador Brito

RESUMEN

El presente estudio se basó en detectar bacterias con potencial de

biorremediación en suelos contaminados con aceite usado de motor. La muestra

fue obtenida del Cantón Milagro en una lubricadora artesanal. La muestra de tierra

fue sometida a análisis para identificar que bacteria se encontraba, procediendo a

sembrarla en Agar Cetrimide, se logró determinar la presencia de la bacteria

Pseudomona aeruginosa, para determinar los niveles de tolerancia, se realizaron

ensayos y de esta manera verificar la resistencia de la bacteria en porcentajes de

aceite. Para los bioensayos se tomó tierra; tres muestras de control blanco sin

bacterias con aceite usado de motor y tres con bacteria con aceite usado de

motor, el ensayo duro 35 días. Por el método del uso del soxhlet se puedo

determinar el potencial de biorremediación, demostrando que hubo un rango entre

85% a 97% de descontaminación en los 3 biodigestores con bacterias.

Palabras claves: Biorremediación, Pseudomona Aeruginosa, Suelo,

Contaminación, Aceite quemado.

ANEXO 13


FACULTAD CIENCIAS NATURALES

CARRERA INGENIERIA AMBIENTAL

UNIDAD DE TITULACIÓN

DETECTION OF BACTERIA WITH BIOREMEDIATION POTENTIAL OF

CONTAMINATED SOILS WITH USED ENGINE OIL

Author: Yamil Javier Franco Alarcón

Advisor: Msc. Miriam Salvador Brito

ABSTRACT

The present study was based on detecting bacteria with bioremediation potential in

soils contaminated with used motor oil. The sample was obtained from Cantón

Milagro in an artisanal lubricator. The soil sample was analyzed to identify which

bacterium was found, proceeding to plant it in Cetrimide Agar, it was possible to

determine the presence of the bacterium Pseudomonas aeruginosa, to determine

tolerance levels, tests were performed and in this way verify the resistance of the

bacteria in percentages of oil. For the bioassays, soil was taken; three samples of

white control without bacteria with used motor oil and three with bacteria with used

motor oil, the test lasts 35 days. By the method of the use of soxhlet we can

determine the bioremediation potential, showing that there was a range between

85% and 97% of decontamination in the 3 biodigesters with bacteria

Keywords: Bioremediation, Pseudomonas aeruginosa, Soil, Contamination,

Burned oil.

ANEXO 14

i

DEDICATORIA

Primero a Dios por ser camino y por ser luz.

A mi madre NANCY DE JESÚS ALARCÓN

MOREIRA, que con su carácter y su manera de

amar supo hacerme una mejor persona.

A mi padre EUGENIO MÁXIMO FRANCO

RIERA, guerrero sin igual, ejemplo de nunca

rendirse.

A mi hermano ALVARO KEVIN FRANCO

ALARCÓN, por su motivación a lograr las

cosas.

Gracias por sus valores y su apoyo

incondicional en este largo camino.

ii

AGRADECIMIENTO

A Dios principalmente, sin él nada es posible, a mis padres que con sacrificio

lograron hacerme un hombre de bien.

A los amigos que están y a los que no, que hicieron esta etapa de mi vida un

aprendizaje diario.

A mí enamorada por su apoyo.

A las Biólogas del IIRN, por su apoyo y por su conocimiento, haciendo de amigas

y tutoras.

-Rosa Siguencia

-María Fernanda Arroyo

-Mariuxi Mero

A mi tutor externo

-Robert León Suarez

A mis socios

-Steffano Espinosa

-Jessid Varela

iii

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 1

CAPITULO I ....................................................................................................................................... 3

1.1. Planteamiento del problema ........................................................................................... 3

1.2. Objetivos ............................................................................................................................ 3

1.2.1. Objetivo general ........................................................................................................ 3

1.2.2. Objetivos específicos ............................................................................................... 3

1.3. Justificación ....................................................................................................................... 3

1.4. Hipótesis ............................................................................................................................ 4

CAPITULO II ..................................................................................................................................... 5

2.1. Antecedentes .................................................................................................................... 5

2.2. Marco teórico ..................................................................................................................... 6

2.2.1. Contaminación de los suelos .................................................................................. 6

2.2.2. Hidrocarburos totales de petróleo (TPH) .............................................................. 6

2.2.3. TPH en el medio ambiente ...................................................................................... 7

2.2.4. Aceite lubricantes ..................................................................................................... 7

2.2.5. Contaminación del suelo por aceite usado de motor .......................................... 7

2.2.6. Contaminación por aceites en ecuador................................................................. 8

2.2.7. Biorremediación ........................................................................................................ 9

2.2.8. Mecanismo de las bacterias para descontaminar el suelo .............................. 10

2.2.9. Mecanismos para biorremediación de suelos .................................................... 10

2.2.9.1. Biodegradación asistida................................................................................. 12

2.2.9.2. Biotransformación de metales ...................................................................... 12

2.2.9.3. Fitorecuperación ............................................................................................. 12

2.2.9.4. Bioventing ........................................................................................................ 13

2.2.9.5. Landfarming ..................................................................................................... 13

iv

2.2.9.6. Biopilas ............................................................................................................. 13

2.2.9.7. Compostaje ...................................................................................................... 14

2.2.9.8. Lodos biológicos ............................................................................................. 14

2.3.1. Pseudomonas Aeruginosa .................................................................................... 14

2.3.1.1. Efectos en la salud ......................................................................................... 15

2.3.1.2. Mecanismos en los que actúa ...................................................................... 16

2.3.2. Extractor Soxhlet .................................................................................................... 16

2.3. Marco legal ...................................................................................................................... 18

2.3.1. Constitución de la República del Ecuador en el Año 2008 .............................. 18

2.3.2. Código Orgánico Integral Penal en el año 2014 ................................................ 22

CAPITULO III .................................................................................................................................. 23

3.1. Materiales y métodos ..................................................................................................... 23

3.1.1. Área de estudio ....................................................................................................... 23

3.1.2. Muestreo .................................................................................................................. 24

3.1.3. Determinación de bacterias .................................................................................. 24

3.1.4. Identificación morfológica. ......................................................................................... 25

3.1.4.1. Tinción de Gram ............................................................................................. 25

3.1.4.2. Prueba de Motilidad ....................................................................................... 26

3.1.4.3. Prueba de oxidasa .......................................................................................... 26

3.1.4. Determinación de niveles de tolerancia .......................................................... 27

3.1.5. Bioensayo ................................................................................................................ 28

3.1.6. Separación por el método de Soxhlet ................................................................. 29

3.1.7. Extracción mediante evaporación ........................................................................ 29

CAPITULO IV .................................................................................................................................. 30

4.1. Resultados ....................................................................................................................... 30

4.2. Discusión ......................................................................................................................... 31

4.3. Conclusiones ................................................................................................................... 33

4.4. Recomendaciones .......................................................................................................... 34

4.5. Bibliografía ....................................................................................................................... 35

4.6. Anexos ............................................................................................................................. 40

v

INDICE DE TABLAS

Tabla 1: Técnicas de recuperación de suelos ................................................................. 11

Tabla 2: Coordenadas de muestreo ................................................................................ 24

vi

INDICE DE FIGURAS

Figura 1: Pseudomona Aeruginosa (A luz Ultravioleta) ................................................... 15

Figura 2: Extracción en Soxhlet ...................................................................................... 17

Figura 3: Punto de recolección de la muestra ................................................................. 23

Figura 4: Porcentaje de remoción ................................................................................... 30

Figura 5: Recolección de muestras ................................................................................. 41

Figura 6: Muestra en medio de enriquecimiento (Agua de Peptona) ............................... 41

Figura 7: Muestra en agar Cetrimide después de 24 horas ............................................. 41

Figura 8: Pseudomona Aeruginosa ................................................................................. 41

Figura 9: Preparación de emulsión para la determinación de niveles de tolerancia ........ 41

Figura 10: Emulsión para los niveles de tolerancia ......................................................... 41

Figura 11: Niveles de tolerancia por triplicado................................................................. 41

Figura 12: Bacteria en medio de enriquecimiento para su reproducción en agitación

constante ......................................................................................................................... 41

Figura 13: Lugar donde se tomó tierra para ensayos ...................................................... 41

Figura 14: Tamizaje de tierra .......................................................................................... 41

Figura 15: Pesaje de tierra 800 Gr ................................................................................. 41

Figura 16: Separación de la tierra previamente esterilizada en seis recipientes .............. 41

Figura 17: Recipientes con bacterias .............................................................................. 41

Figura 18: Recipientes sin bacterias ............................................................................... 41

Figura 19: Preparación de fosfato diamónico .................................................................. 41

Figura 20: Adición de fosfato diamónico pasado los 20 días ........................................... 41

Figura 21: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet .......................................... 41

Figura 22: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet pasada las 4 horas ........... 41

Figura 23: Separación de tierra y aceite finalizada lista para la extracción ...................... 41

Figura 24: Extracción del solvente mediante evaporación .............................................. 41

Figura 25: Extracción después de una hora .................................................................... 41

1

INTRODUCCIÓN

La contaminación de suelos por aceite usado tiene efecto negativo en él, se

produce muchas veces por derrames al momento del cambio de aceite, que el

vehículo necesita en su motor y por el mal manejo de las lubricadoras no

convencionales que aplican en este proceso, sin las medidas correspondientes.

El aceite usado tiene como base el petróleo, mismo que ha sido contaminado con

algún químico o metal pesado en un proceso previo el que puede ser el uso de

maquinarias en sus motores que lubrica sus piezas de manera más óptima y

mediante un proceso de quemado, este será cambiado (Torres, 2013).

El aceite usado y el aceite negro no es lo mismo, el aceite negro o llamado aceite

virgen, es todo aceite que se ha quedado depositado en tanques, y el aceite usado

o lubricante de desecho es el que ya cumplió la función para el que fue destinado

(Torres, 2013).

El aceite usado tiene variedad de metales pesados, como: cadmio, arsénico,

plomo, cromo, entre otros, e hidrocarburos aromáticos, como: el benceno y

algunos solventes clorados. Estos compuestos pueden ser perjudicial para la

salud humana ya que son altamente cancerígenos, la contaminación del suelo por

aceite no solo es perjudicial para el hombre sino para las demás formas de vida en

el ecosistema (Silva, Quiñonez, & Tovar, 2017).

La EPA (Environmental Protection Agency) en estudios realizados sobre los

aceites y lubricantes usados afirma que alrededor de 3.000 tipos de cáncer

diferentes son causados por la absorción de Cromo durante la quema que se

realiza al usarlo como combustible (US EPA, OCFO,OTS, 2017).

Las consecuencias negativas al suelo por aceite usado, son:

La alteración de las propiedades físicas del suelo

Aumentar la sensibilidad para infecciones de plantas

Influencia para crecimiento de vegetación

Disminución de la calidad de suelo para cultivos (CENAPRED, 2015).

2

Existen diversas técnicas biológicas para descontaminación de suelos, aire, agua,

una de ellas es la Biorremediación, que consiste en el uso de plantas, hongos,

bacterias naturales o modificadas, con la finalidad de descontaminar sustancias

toxicas o que han sido contaminadas por otro factor y hacerlas viables para el

ambiente y para la salud de todo ser vivo (López et al., 2006).

3

CAPITULO I

1.1. Planteamiento del problema

El suelo contaminado por aceite usado de vehículos se da en lubricadoras

artesanales, ya que no existe la manipulación correcta, lo que causa deterioro a la

salud humana y al medio ambiente, se debe tener en cuenta su uso, manejo y

disposición final de manera segura, para evitar un impacto ambiental.

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo general

Detectar bacterias en suelos contaminados con aceite usado de motor capaces de

degradar aceites y grasas.

1.2.2. Objetivos específicos

Establecerlas bacterias existentes en un suelo contaminado con aceite

usado de motor.

Seleccionar bacterias con capacidad de crecer en un medio selectivo con

2%, 4% y 5% de aceite usado de motor como única fuente de carbono y

energía.

Realizar bioensayos para demostrar cuantitativamente la capacidad de las

bacterias para degradar aceites y grasas.

1.3. Justificación

El suelo constituye uno de los medios en los que se vierten residuos de origen

antropogénico, los cuales son parte de procesos físicos, químicos y biológicos lo

que provoca transformaciones, las cuales alteran el funcionamiento de los

ecosistemas, considerándolos contaminantes, los mismos que afectan no solo al

ambiente sino a la salud humana (Peña, Carter y Ayala, 2001).

4

En Ecuador la investigación sobre la biorremediación de suelos contaminados por

aceites se ha detenido por la falta de presupuestos.

En el presente estudio se utiliza el petróleo y sus derivados para diversas

actividades, se es necesario prestar atención a los impactos que estos ocasionan

al medio ambiente, que pueden llegar a ser perjudiciales a la salud pública

(Rodriguez, 2011).

En este estudio investigativo, se implementará biorremediacion para la

descontaminación de aceite usado de motor de vehículos, mediante el uso de

bacterias previamente seleccionadas.

1.4. Hipótesis

Existen bacterias con potencial de degradar aceites y grasas en suelos

contaminados con aceite usado de motor de vehículos.

5

CAPITULO II

2.1. Antecedentes

El negocio de aceite globalmente es un negocio rentable por su demanda, para los

diversos usos que recibe en la industria automovilística. 7.6 millones de Tm/año de

lubricantes son consumidos en Estados Unidos, 2.2 millones en Japón, 4.7

millones lo que es la Unión Europea y 500.000 Tm en España, dando que en el

planeta hay un requerimiento aproximado de 40 millones de toneladas año

(Depuroil S.A., 2010).

Se recomienda que el cambio de aceite de un vehículo se realice en un centro

automovilístico autorizado y en condiciones óptimas, ya que estos deben

manipular, almacenar y gestionar el aceite usado. Si este proceso se lo realiza

personalmente en condiciones no adecuadas, puede que se produzca derrames al

suelo lo cual llevará a contaminación, de esta manera deberá recogerlo y

depositarlo adecuadamente (Plantel Mexicali, 2012).

Estudios realizados en Long Beach (California) en el año 2006 se realizó

biorremediación a suelos contaminados con aceite mediante el uso de

microorganismos. A la muestra contaminada de suelo se le adiciono nutrientes y

oxígeno, a esta técnica se la conoce como: Bioestimulación y Bioaumentación, lo

que permitió encontrar microorganismos degradadores de hidrocarburos,

identificando la presencia de Bacillus sphaericus, Bacilus fusiformis, Bacilus

pumilis, Acinetobacter junii y Pseudomonas sp. (López et al., 2006).

La Biorremediación de suelos contaminados en Ecuador específicamente en la

Amazonía, que es donde se encuentra la mayor parte de nuestro crudo, se ha

venido trabajando desde la década de 1990, hasta derrames que ocurren en la

actualidad. Se recoge parte del suelo contaminado con palas mecánicas y llevada

en volquetas para ser transportadas y luego explanadas para su biorremediación.

Se usan dos tipos de formas para la remediación del suelo la primera es el

compostaje, que se hacen grandes pilas de tierra que son removidas con

maquinarias para su oxigenación, y la segunda técnica es el landfarming que son

6

pilas más pequeñas y la aireación es estática. En ambos casos se les adiciona

cantidades grandes de microorganismos como: bacterias, hongos, levaduras para

que la degradación de los hidrocarburos se más rápida (Cuvi, 2015).

2.2. Marco teórico

2.2.1. Contaminación de los suelos

Es la alteración de la superficie terrestre por sustancias que degradan el suelo y

haciéndola perjudicial para su uso, y para todo ser vivo. La agricultura es uno de

usos que se ve afectado por la contaminación perdiendo el equilibrio en el

ecosistema. Lamentablemente no siempre puede tratarse el suelo y en ocasiones

solo se puede recuperar un porcentaje de este (Ecología Verde, 2015).

La implementación de normativas y leyes por la contaminación del suelo ha sido

baja en la mayoría de países de Latinoamérica, aquí una de las razones:

Falta de acceso rápido de las evidencias para acción política

Responsabilidad para tratar los derechos del ecosistema

Compromiso político, dejando de lado las leyes ambientales, ya que

los cambios de suelos ocurren durante décadas y pueden ser difícil

detectar (Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación

y la Agricultura, 2016).

2.2.2. Hidrocarburos totales de petróleo (TPH)

En ingles TPH, que significa hidrocarburos totales de petróleo, las cuales se

utilizan para reconocer una serie de compuestos derivado del petróleo crudo, el

cual puede ser muy perjudicial al ambiente con un mal uso, debido que el mismo

posee diferentes compuestos químicos tales como hidrogeno y carbono. Se ha

probado científicamente que los TPH se comportan distintos en el suelo que en el

agua (ATSDR, 2016).

7

2.2.3. TPH en el medio ambiente

Los TPH pueden entrar al suelo o a cuerpos hídricos mediante derrame, en los

cuerpos de agua unos se podrían formar una capa superficial y otros podrían

sedimentarse en el fondo, mientras que en el suelo hay una probabilidad que dure

más tiempo. Existen bacterias o microrganismos capaces de degradar TPH, tanto

en el suelo como en el agua (ATSDR, 2016)

2.2.4. Aceite lubricantes

El aceite en un motor cumple la función de lubricar todas las piezas que causan

movimiento, para su mayor duración. Estos lubricantes están constituidos con

aditivos que pueden ser sintéticos o minerales y son derivados del petróleo los

cuales ayudan a dar mayor rendimiento en la lubricación(Tayán, 2018).

Las características principales del aceite lubricante en el motor son la viscosidad,

resistencia de oxidación, punto de fluidez y sus funciones básicas son: reducción

de fricción, disipación del calor y dispersión de los contaminantes. La función de

un lubricante en un motor es un tema muy complejo, que debe ser una

combinación entre balance de propiedades tanto del aceite de base como los

aditivos que la componen (El Comercio, 2017).

2.2.5. Contaminación del suelo por aceite usado de motor

El aceite usado de motor de vehículos contiene, diversas sustancias que causan

daños a la capa de suelo, convirtiéndola en inerte, el aceite por lo consiguiente

causa mal olores que al hacer contacto con la luz y el aire se desprenden toxinas

al ambiente siendo contraproducente a la salud humana. El mayor problema de las

contaminaciones de los suelos por aceite, ocurre en lubricadoras artesanales, ya

que estas no cuentan con una zona de almacenamiento de aceite, por lo que

optan desechando directamente al suelo (Gallegos & Vlecela, 2015).

8

El aceite usado es una combinación de base mineral y otra sintética con aditivos

(1-20%) en su proceso el automóvil contamina el aceite de diversas maneras; las

piezas en su desgaste producto del movimiento se mezcla con este aceite;

compuestos oraganometálicos que contienen metales pesados, producto de la

gasolina o lubricantes (SerCampo, 2011).

La contaminación de suelos por aceite quemado suele ocurrir principalmente a

causa del hombre y a su mala manipulación, no ocurre naturalmente como lo es

con el petróleo, ya que, el aceite quemado es cambiado en lubricadoras, donde en

el proceso de cambio de aceite ocurre la contaminación (ATSDR, 2016).

2.2.6. Contaminación por aceites en ecuador

El 11 de octubre del 2018 en Guayaquil un tanque de petróleo de una estación

eléctrica, contaminó una ribera del manglar, a la altura del noroeste de Guayaquil,

dando una corriente de petróleo en el estero. El Ministerio de Obras Públicas en

conjunto con el Ministerio del Ambiente horas más tarde llegaron al sector para

evitar que se siga propagando el derrame, cabe recalcar que este lugar es hábitat

de aves y crustáceos (El Telégrafo, 2018).

El 21 de junio del 2016, se reportó que a la altura del Km 21 de la vía a Daule

hubo un derrame de material aceitoso, tipo combustible, que poco después fue

confirmado que fue derramado accidentalmente por la empresa Balsasud (Balsera

Sudamericana). Uno de los calderos utilizados como parte del proceso de

fabricación que ahí realizan, se había llenado en exceso y estaba rebosando de

aceite que sale de la producción, llegando hasta el rio Daule (Secretaria de

Gestión de Riesgos, 2016).

9

2.2.7. Biorremediación

Es una técnica que se ha usado por muchos años, sirve para descontaminar,

suelos mediante microorganismos que habitan en el mismo y en el subsuelo, los

cuales están formados por materia orgánica, agua, aire y principalmente

microorganismos (ya que en un gramo de suelo se pueden encontrar de miles a

millones de ellos) (Argüelles, 2010).

Los hongos, plantas o enzimas para la descontaminación del suelo en el medio

ambiente, pueden ser físicas, químicas y biológicas, muchas veces causada

antropológicamente. Busca restaurar el medio contaminado para sus diversos

usos (Rodríguez, 2012).

El uso de microrganismos es óptimo para la biorremediación debido que se

alimentan de algunos compuestos tóxicos para el ambiente, tales como: el

petróleo y gasolina. Para que ocurra la descontaminación, el medio ambiente

donde se encuentra la bacteria, hongo o protozoos debe cumplir ciertas

condiciones como; la temperatura optima, agua suficiente, y debe existir un

porcentaje adecuado de nutrientes, esto favorece la degradación del compuesto

toxico a agua y bióxido de carbono (Argüelles, 2010).

Entre los microorganismos sobresalen las bacterias que son seres vivos con

mayor capacidad metabólica del planeta y que pueden degradar casi toda

sustancia orgánica, además las bacterias pueden descontaminar ambientes donde

no hay oxígeno(anaeróbicos), así como también en ambientes con oxígeno

(aeróbicos) (Rodríguez, 2012).

La Micorremediación es una rama de la biorremediación por la cual se

descontamina el medio ambiente mediante hongos, los cuales en cierta cantidad

son capaces de absorber metales pesados (Stamets, 2017).

10

2.2.8. Mecanismo de las bacterias para descontaminar el suelo

Los tratamientos biológicos se caracterizan porque pueden ser in situ o ex situ lo

cual es un tratamiento económico, pero que si conllevará mayor tiempo y su

eficiencia es más difícil de verificar porque son procesos largos e

2.2.9. Mecanismos para biorremediación de suelos

Existe una amplia manera de recuperación de suelos contaminados, algunas que

ya han sido usadas y otras están en proceso de experimentación, con el propósito

de descontaminar los suelos con aquello que fue alterado, esto dependerá de las

propiedades del suelo y de su contaminante, que tan viable económicamente

podría ser, y el tiempo optimo que podría ser usado (Bernard, Sanz, Garcia, &

Valiño, 2007).

Los tratamientos pueden ser; in situ que se realizan en la zona afectada o ex situ

que requerirá tomar una porción del suelo contaminado y llevarla a laboratorio

para su análisis y su próximo tratamiento. El tratamiento in situ, no necesitan tanto

manejo, pero son más complejos por la dificultad ya que se pondrá a contacto con

los agentes de descontaminación toda la masa de suelo contaminada. A diferencia

del ex situ, son más óptimos ya que, son económicos, rápidos y brinda una

completa recuperación de la zona afectada (Bernard et al., 2007).

Se puede identificar como descontaminación para disminuir los niveles de

concentración del contaminante del suelo, que pueden ser: Físico-químicos,

Biológicos, Térmicos y Mixtos.

11

Tabla 1: Técnicas de recuperación de suelos

Tipo de

tratamiento

Tratamiento Aplicación

Descontaminación Físico-químico Extracción

Lavado

Flushing

Electrocinética

Adición de enmiendas

Barreras permeables

activas

Pozos de recirculación

Oxidación ultravioleta

In situ

Ex situ

In situ

In situ

In situ

In situ

In situ

Ex situ

Biológico Biodegradación asistida

Biotransformación de

metales

Fitorecuperación

Bioventing

Landfarming

Biopilas

Compostaje

Lodos biológicos

In situ

In situ

In situ

In situ

Ex situ

Ex situ

Ex situ

Ex situ

Térmico Incineración

Desorción térmica

Ex situ

Ex situ

Mixto Extracción multifase

Atenuación natural

In situ

In situ

Fuente: Técnicas de recuperación de suelos contaminados (Bernad, Sanz, García, &

Valiño, 2016).

12

2.2.9.1. Biodegradación asistida

La Biodegradación, es el proceso por el cual microorganismos autóctonos o

inoculados (bacterias y hongos) metabolizan los contaminantes orgánicos que se

encuentran en suelos y/o el agua subterránea, convirtiéndolos en productos finales

inocuos. En este proceso, los contaminantes orgánicos son biotransformados

porque generalmente los microorganismos pueden utilizarlos para su propio

crecimiento como fuente de carbono y energía y, en el caso de que no sean

capaces de crecer a partir de ellos, pueden seguir transformándolos si se les

aporta un sustrato de crecimiento alternativo o cosustrato (Bernard et al., 2007).

2.2.9.2. Biotransformación de metales

Los microorganismos se encuentran expuestos a la presencia de metales

pesados, lo cual selecciona variantes capaces de tolerar sus efectos nocivos. El

estudio de estas interacciones, con sus mecanismos de tolerancia, expone el

potencial de éstos para ser utilizados en procesos biotecnológicos como la

Biorremediación de la contaminación ambiental por metales pesados. Mediante

experimentos de laboratorio, se logró extraer cepas por cultivo directo y

enriquecimiento selectivo y determinar su grado de compromiso en la

biotransformación y biodisponibilidad de metales como cromo, plomo y mercurio,

concluyendo que uno de los géneros más comprometidos es el Micrococos,

seguido por Pseudomonas (Bernard et al., 2007).

2.2.9.3. Fitorecuperación

Es una técnica que se usa para descontaminar suelos contaminados por metales

pesados mediante especies vegetales. Las plantas usadas en este método deben

representar tolerancia para resistir la elevada cantidad de metales en su rizosfera

y en sus tejidos. El fin de este tratamiento está en la selección de plantas

adecuadas para la descontaminación (Bernard et al., 2007).

13

2.2.9.4. Bioventing

Usa microorganismos para biodegradar compuestos orgánicos en los suelos en

zonas que no estén tan contaminadas, a diferencia del biosparging que en zonas

donde hay mayor contaminación. El Bioventing se parece al método de extracción

por vapor del suelo, pero, este se encarga de que en su mayoría biodegradar la

volatilización (Bernard et al., 2007).

2.2.9.5. Landfarming

Es mediante recuperación bilógica, que se trata de eliminar el exceso de

hidrocarburos de menor densidad, que el método de extracción de vapor no puede

eliminar y que, si pueden ser degradados por microrganismos, que funciona de

manera, que, se excava el suelo, para luego extender una capa fina en el lugar

donde se encuentra el contaminante y que se vaya a recuperar, para luego

comenzar con la estimulación microbiana aeróbica que consta de aire y la adición

de nutrientes (Bernard et al., 2007)

El ingreso de aire se consigue mediante remoción de suelo por arado, la adición

de bacterias capaces de degradar hidrocarburos. (Bernard et al., 2007).

2.2.9.6. Biopilas

Este es otro método para descontaminar suelos que han sido afectados por el

derrame de petróleo, para este método se acumula el suelo en pilas continua y

como el proceso de landfarming es mediante aireación y adicción de nutrientes

que sirve para que los microorganismos respiren. Estos métodos son muy

parecidos a diferencia que las biopilas es mediante la inyección de aire con

tuberías, que se las coloca a través de las pilas, esto permitirá que el compuesto

no se evapore ni se volatilice producto del sol. Es un tratamiento recomendable ya

que es muy corto plazo (Bernard et al., 2007).

14

2.2.9.7. Compostaje

Es unos de los procesos biológicos más conocidos y eficaces, este método es

mediante actividad microbiana que acelera la degradación del contaminante y

puede ser aeróbica y anaeróbica. El suelo contaminado es combinado con restos

de animales y vegetales, conocido como abono que proporciona equilibrio de

carbono y nitrógeno se tiene que verificar los parámetros como luz, oxigeno,

temperatura y humedad. Este tratamiento se puede ser in situ, con el material

contaminado apilado y aireado con bombas de vacío, o en reactores (Bernard et

al., 2007).

2.2.9.8. Lodos biológicos

Este método se trata de excavar y filtrar para eliminar materiales gruesos, es un

biorreactor controlado que mezcla el suelo con otros aditivos para la

descontaminación, en este método se controla pH, oxigeno, humedad,

temperatura, asimismo, para impedir la concentración de los contaminantes se

homogeniza el material contaminado. También existen diferentes mecanismos

como: de adsorción/desorción, disolución/precipitación, intercambio iónico,

complejación, transferencia de oxígeno, volatilización y reducción del tamaño de

partícula (Bernard et al., 2007).

2.3.1. Pseudomonas Aeruginosa

La Pseudomonas Aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonaceae se trata de

un bacilo recto o ligeramente curvado Gram negativo, con un tamaño de 2–4 x 0,5-

1 micras, y móvil gracias a la presencia de un flagelo polar. En relación con su

metabolismo, es aerobio (aunque puede desarrollarse en condiciones anaerobias

utilizando nitrato), catalasa positiva y oxidasa positiva. Se caracteriza por producir

una variedad de pigmentos, como la piocianina (de color azul verdoso), la

pioverdina (pigmento fluorescente de color verde amarillento) y la piorrubina (de

color rojo) (figura 1) (INSHT, 2016).

15

Figura 1: Pseudomona Aeruginosa (A luz Ultravioleta)

Se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, en el agua (ríos, lagos,

depósitos, duchas, bañeras, piscinas y piscinas de hidromasaje, etc.), en los

suelos húmedos, en los vegetales y en los materiales húmedos, también puede

formar parte de la flora microbiana normal saprófita de las zonas húmedas de la

piel (axilas, conducto auditivo, región perineal y mucosas). Su temperatura óptima

de crecimiento es de 37ºC, pero puede tolerar temperaturas de hasta 45ºC-50ºC.

Puede sobrevivir durante al menos 70 días en agua destilada (INSHT, 2016).

2.3.1.1. Efectos en la salud

La Pseudomonas aeruginosa, es un patógeno oportunista que rara vez causa

enfermedad en individuos sanos; en el caso de producirse esta, suele

manifestarse como:

Infecciones dérmicas: puede causar foliculitis, que se caracteriza por la

aparición de pápulas pruriginosas en la zona lateral del tronco y/o en las

zonas axilar, inguinal, púbica, etc., estando asociada al contacto

prolongado con agua contaminada. También ocasiona el síndrome de la

uña verde (cloroniquia), causada por la exposición frecuente de las uñas

previamente dañadas a ambientes húmedos contaminados.

16

Neumonía: producida por la inhalación de bioaerosoles de agua o fluidos

contaminados. La infección en personas sanas es extremadamente rara,

siendo el pronóstico muy grave.

Otitis externa (otitis del nadador): infección del canal auditivo externo

ocasionada por contacto prolongado con agua contaminada.

Infección ocular: asociada principalmente a la contaminación del líquido

utilizado para la limpieza de las lentes de contacto, pudiendo causar una

queratitis que puede resultar en la perforación y derretimiento corneal, en

la infección de cicatrices o, incluso, en la pérdida de visión del ojo

infectado.

Es responsable de numerosos casos de infección nosocomial, afectando

principalmente a individuos inmunocomprometidos, con quemaduras graves,

heridas quirúrgicas, neutropenia o con infecciones pulmonares subyacentes.

Puede ocasionar, entre otros: neumonía, meningitis, sobreinfección de heridas,

ectima gangrenosa, infecciones urinarias, infecciones osteoarticulares,

endocarditis, infecciones oculares o septicemia (INSHT, 2016).

2.3.1.2. Mecanismos en los que actúa

La Pseudomona aeruginosa se ha demostrado en estudios que tiene la capacidad

de biodegradar tipos de compuestos que son usados para distintas labores

domésticos como detergente de lavandería que poseen un compuesto

alquilbenceno sulfonato, muy usado y que tiene problemas de contaminación de

ríos y lagos (Soberón, 2009).

2.3.2. Extractor Soxhlet

Creado en 1879 por el químico alemán Franz Ritter Von Soxhlet con la propuesta

de separar la grasa en los alimentos, que se ha venido desarrollando por décadas

que consiste en la extracción de sólidos. Las grasas se disuelven en disolventes

17

no polares, como: el hexano y el éter de petróleo, las grasas se separan de los

demás componentes conociéndolo como extracción solido-liquido. El equipo se

encuentra compuesto por; una parrilla que sería la fuente de calor que dará paso a

la evaporación, el matraz que contiene el disolvente, un sifón donde se encuentra

la muestra solida dentro de un papel filtro, y un refrigerante que se encargara de

aportar el frio para que haya condensación. (Figura 2).

Sifón donde se

encuentra la

muestra

Matraz donde se

encuentra el disolvente

Refrigerante que

aporta frío y ocurra

condensación

Parrilla que es fuente

de calor para que

ocurra la evaporación

Figura 2: Extracción en Soxhlet

18

2.3. Marco legal

Existen normativas vigentes, en la República del Ecuador que protegen al medio

ambiente de los desechos causados por las lubricadoras, y hay que hacer

mención sobre ellos

2.3.1. Constitución de la República del Ecuador en el Año 2008

TITULO II

CAPÍTULO SEGUNDO

Derechos del Buen Vivir

SECCIÓN SEGUNDA

Ambiente Sano

Art.14.- Se reconoce el derecho de la población a vivir en un ambiente sano y

ecológicamente equilibrado, que garantice la sostenibilidad y el buen vivir, sumak

kawsay.

Se declara de interés público la preservación del ambiente, la conservación de los

ecosistemas, la biodiversidad y la integridad del patrimonio genético del país, la

prevención del daño ambiental y la recuperación de los espacios naturales

degradados.

Art. 15.- El Estado promoverá, en el sector público y privado, el uso de

tecnologías ambientalmente limpias y de energías alternativas no contaminantes y

de bajo impacto. La soberanía energética no se alcanzará en detrimento de la

soberanía alimentaria, ni afectará el derecho al agua. Se prohíbe el desarrollo,

producción, tenencia, comercialización, importación, transporte, almacenamiento y

uso de armas químicas, biológicas y nucleares, de contaminantes orgánicos

persistentes altamente tóxicos, agroquímicos internacionalmente prohibidos, y las

tecnologías y agentes biológicos experimentales nocivos y organismos

genéticamente modificados perjudiciales para la salud humana o que atenten

19

contra la soberanía alimentaria o los ecosistemas, así como la introducción de

residuos nucleares y desechos tóxicos al territorio nacional.

CAPÍTULO SEPTIMO

Derechos de la naturaleza

Art. 71.- La naturaleza o Pacha Mama, donde se reproduce y realiza la vida, tiene

derecho a que se respete integralmente su existencia y el mantenimiento y

regeneración de sus ciclos vitales, estructura, funciones y procesos evolutivos.

Toda persona, comunidad, pueblo o nacionalidad podrá exigir a la autoridad

pública el cumplimiento de los derechos de la naturaleza. Para aplicar e interpretar

estos derechos se observarán los principios establecidos en la Constitución, en lo

que proceda. El Estado incentivará a las personas naturales y jurídicas, y a los

colectivos, para que protejan la naturaleza, y promoverá el respeto a todos los

elementos que forman un ecosistema.

CAPÍTULO NOVENO

Responsabilidades

Art. 83.- Son deberes y responsabilidades de las ecuatorianas y los ecuatorianos,

sin perjuicio de otros previstos en la Constitución y la ley:

6.Respetar los derechos de la naturaleza, preservar un ambiente sano y utilizar los

recursos naturales de modo racional, sustentable y sostenible.

TITULO VII

CAPÍTULO SEGUNDO

Biodiversidad y Recursos Naturales

SECCIÓN PRIMERA

Naturaleza y ambiente

Art. 395.- La Constitución reconoce los siguientes principios ambientales:

20

1. El Estado garantizará un modelo sustentable de desarrollo, ambientalmente

equilibrado y respetuoso de la diversidad cultural, que conserve la biodiversidad y

la capacidad de regeneración natural de los ecosistemas, y asegure la satisfacción

de las necesidades de las generaciones presentes y futuras.

2. Las políticas de gestión ambiental se aplicarán de manera transversal y serán

de obligatorio cumplimiento por parte del Estado en todos sus niveles y por todas

las personas naturales o jurídicas en el territorio nacional.

3. El Estado garantizará la participación activa y permanente de las personas,

comunidades, pueblos y nacionalidades afectadas, en la planificación, ejecución y

control de toda actividad que genere impactos ambientales.

4. En caso de duda sobre el alcance de las disposiciones legales en materia

ambiental, éstas se aplicarán en el sentido más favorable a la protección de la

naturaleza.

Art. 396.- El Estado adoptará las políticas y medidas oportunas que eviten los

impactos ambientales negativos, cuando exista certidumbre de daño. En caso de

duda sobre el impacto ambiental de alguna acción u omisión, aunque no exista

evidencia científica del daño, el Estado adoptará medidas protectoras eficaces y

oportunas.

La responsabilidad por daños ambientales es objetiva. Todo daño al ambiente,

además de las sanciones correspondientes, implicará también la obligación de

restaurar integralmente los ecosistemas e indemnizar a las personas y

comunidades afectadas.

Cada uno de los actores de los procesos de producción, distribución,

comercialización y uso de bienes o servicios asumirá la responsabilidad directa de

prevenir cualquier impacto ambiental, de mitigar y reparar los daños que ha

causado, y de mantener un sistema de control ambiental permanente.

Las acciones legales para perseguir y sancionar por daños ambientales serán

imprescriptibles.

21

Art. 398.- Toda decisión o autorización estatal que pueda afectar al ambiente

deberá ser consultada a la comunidad, a la cual se informará amplia y

oportunamente. El sujeto consultante será el Estado. La ley regulará la consulta

previa, la participación ciudadana, los plazos, el sujeto consultado y los criterios de

valoración y de objeción sobre la actividad sometida a consulta.

El Estado valorará la opinión de la comunidad según los criterios establecidos en

la ley y los instrumentos internacionales de derechos humanos. Si del referido

proceso de consulta resulta una oposición mayoritaria de la comunidad respectiva,

la decisión de ejecutar o no el proyecto será adoptado por resolución debidamente

motivada de la instancia administrativa superior correspondiente de acuerdo con la

ley.

Art. 399.- El ejercicio integral de la tutela estatal sobre el ambiente y la

corresponsabilidad de la ciudadanía en su preservación, se articulará a través de

un sistema nacional descentralizado de gestión ambiental, que tendrá a su cargo

la defensoría del ambiente y la naturaleza.

SECCIÓN QUINTA

Suelo

Art. 409.- Es de interés público y prioridad nacional la conservación del suelo, en

especial su capa fértil. Se establecerá un marco normativo para su protección y

uso sustentable que prevenga su degradación, en particular la provocada por la

contaminación, la desertificación y la erosión.

En áreas afectadas por procesos de degradación y desertificación, el Estado

desarrollará y estimulará proyectos de forestación, reforestación y revegetación

que eviten el monocultivo y utilicen, de manera preferente, especies nativas y

adaptadas a la zona (Asamblea Nacional constituyente de la Republica del

Ecuador, 2008).

22

2.3.2. Código Orgánico Integral Penal en el año 2014

SECCIÓN SEGUNDA

Delitos contra los recursos naturales

Art. 252.- Delitos contra suelo. - La persona que, contraviniendo la normativa

vigente, en relación con los planes de ordenamiento territorial y ambiental, cambie

el uso del suelo forestal o el suelo destinado al mantenimiento y conservación de

ecosistemas nativos y sus funciones ecológicas, afecte o dañe su capa fértil,

cause erosión o desertificación, provocando daños graves, será sancionada con

pena privativa de libertad de tres a cinco años.

Se impondrá el máximo de la pena si la infracción es perpetrada en un espacio del

Sistema Nacional de Áreas Protegidas o si la infracción es perpetrada con ánimo

de lucro o con métodos, instrumentos o medios que resulten en daños extensos y

permanentes(Ministerio de Derechos Justicia y Derechos Humanos, 2014).

23

CAPITULO III

3.1. Materiales y métodos

3.1.1. Área de estudio

La muestra de suelo contaminado fue recolectada en la vía Milagro - La Troncal

que forma parte del cantón de Milagro, Provincia del Guayas, es la tercera ciudad

más poblada de la provincia del Guayas.

Figura 3: Punto de recolección de la muestra

Fuente: Google earth

Figure 3: Punto de recolección de la muestra

Fuente: Google Earth 2018

Elaborado: Franco. J

24

La muestra fue recolectada de un taller de automóviles no convencional donde

se descarga aceite directamente al suelo sin ningún tipo de control.

Los datos generales por el medio de coordenadas UTM WGS84 Zona 17S de

la zona Punto de recolección de la muestra de suelo:

Tabla 2: Coordenadas de muestreo

Fuente: Franco. J

3.1.2. Muestreo

Las muestras fueron tomadas al azar en diferentes puntos de una lubricadora

artesanal NN, por triplicado para obtener una muestra representativa; Las

muestras fueron recolectadas superficialmente abarcando un volumen de 10 cm3,

y se obtuvo una muestra de 100 gramos; las muestras durante su transporte hacia

el laboratorio de microbiología en el Instituto de Investigaciones de Recursos

Naturales (IIRN) ubicado en la Facultad de Ciencias Naturales de la Universidad

de Guayaquil fueron conservadas en una hielera para evitar la alteración

microbiana (Hernandez, Bojaca, & Duque, 2007).

3.1.3. Determinación de bacterias

Se tomó 10gr de la muestra de suelo contaminado con aceite usado de motor, se

homogenizo y se diluyó en 90 mL de un medio de enriquecimiento (agua de

peptona).

Previo a la determinación de niveles de tolerancia se comprobó en la muestra la

existencia de bacterias Pseudomonas, para ello se empleó un medio selectivo

para Pseudomonas, agar Cetrimide, se aplicó el método de extendido superficial

empleando un asa de drigalsky luego se inoculó la placa con 200 µL de la muestra

para luego incubarla por 24 horas a 35°C de luego se repico la muestra en placa

X Y

Muestra 655242.90 9761535.33

25

sucesiva para ir purificando la muestra y a la misma temperatura de incubación a

37°C por 18-24 horas (Hernandez et al., 2007)

3.1.4. Identificación morfológica.

3.1.4.1. Tinción de Gram

La tinción de Gram es una técnica que se desarrolló por el Bacteriólogo Danés

Hans Christian Gram en el año 1884, técnica que se divide a las bacterias en dos

tipos: Gram positivas y Gram negativas. Se tomó una pequeña muestra y se la

colocó en el portaobjeto con una gota de solución salina, luego de mezclar se la

dejó secar tres veces cerca del mechero de Bunsen y se continuó con los

siguientes pasos mencionados:

La muestra secada al calor se cubrió por el lapso de un minuto con Cristal

Violeta

Luego el tinte purpura (tinción primaria) se lavó con agua destilada

Se cubrió la muestra con Yodo (mordante) por un minuto

La placa con el Yodo se procedió a lavar con agua destilada

Consiguiente, el portaobjeto se lavó con 95% de etanol

El alcohol se lavó con agua destilada

A continuación, se la porta objeto es teñido con Safranina (contra-tinción)

en tiempo de 5 minutos

Se lavó la muestra una vez más con agua destilada y se dejó secar

Luego se observó en el microscopio con el objetivo de 100X usando aceite

de inmersión (Gram, 1884)

El tinte purpura y el Yodo se combinan con la bacteria se colorean de purpura o

violeta oscura. Son clasificadas como Gram positivas aquellas que mantienen ese

color una vez el alcohol intento decolorarlas, mientras tanto las que pierden el

color violeta obscuro y purpura son clasificadas como Gram negativas (Gram,

1884).

26

En el inventario de plantas recomendadas para fitorremediación de coliformes

fecales en aguas negras se usó la tinción de Gram se puedo determinar que la

bacteria E. coli es gran negativa ya que hubo decoloración (León, 2017).

3.1.4.2. Prueba de Motilidad

El test se enfoca en el movimiento de la bacteria mediante sus flagelos se lo

conoce como motilidad, el fin de esta prueba es para verificar si la bacteria es

móvil o inmóvil, y el método empleado para observar es usando una lámina

excavada de Koch por la técnica de gota pendiente, se agregó una gota de agua

destilada, se colocó el cubreobjetos y se observó a en el microscopio después de

agregar aceite de inmersión. También se realizó una preparación en freso en 2 µL

a 2.5% de salinidad para revisar motilidad usando objetivos de 40, 60 o 100x

(Villafañe, 2008).

3.1.4.3. Prueba de oxidasa

Esta prueba se detecta la presencia de enzima citromono oxidasa, se recomienda

el asa de platino, debido a que el asa de nicrón cromada da un resultado falso

positivo. Para esta prueba existe el papel impregnado con el reactivo el mismo que

se debe humedecer con agua destilada, tomar el inoculo bacteriano y frotarlo

sobre el papel reactivo. El desarrollo de un color violeta fuerte dentro de 1 o 2

minutos es positivo (Villafañe, 2008).

27

3.1.4. Determinación de niveles de tolerancia

Los ensayos se realizaron por triplicado con una concentración del 2%, 4% y 5%

de aceite usado de motor. En medio mínimo, donde la fuente de carbono fue el

aceite.

Para el presente ensayo se emplearon tres emulsiones; una compuesta de 10ml

de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y 2 mL de aceite usado de motor; que

representan una concentración al 2% de aceite usado de motor.

La segunda emulsión se preparó con 10ml de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y

4 mL de aceite usado de motor; que representan una concentración al 4% de

aceite usado de motor.

Y la tercera emulsión compuesta de 10 ml de alcohol cetona, 2 µL de tween 20 y 5

mL de aceite usado de motor; que representa una concentración al 5% de aceite

usado de motor.

Luego se preparó el medio mínimo a base de agar de 11.1 gr de agar TSA (Agar

Soya Triptona) en 300 mL de agua destilada.

Luego se separaron 100 mL del agar TSA y se mezcló con la emulsión al 2%, 100

mL con la del 4%, y los otros 100 mL con la del 5% homogenizando

vigorosamente, ahí se procedió a verter en las placas; una vez solidificadas se

aplicó el método de extendido superficial empleando un asa de drigalsky y se

inoculó la placa con 200 µL de la muestra de bacterias previamente aisladas que

se tenían en reserva en un cryobank y se las incubó por 24 horas a 37°C

A los cultivos se les realizaron observaciones diarias por ocho días desde 23 Julio

del 2018 hasta el 30 de Julio del 2018 durante sus repiques. Se estableció como

placas positivas aquellas que presentaron crecimiento por disgregación del aceite

usado; luego las placas positivas fueron reservadas en cryobank para

posteriormente realizar el ensayo de biorremediacion (Hernandez et al., 2007).

28

3.1.5. Bioensayo

Se preparó 200 mL de agua de peptona, a la cual se le inoculó la Pseudomona

aeruginosa que fueron aisladas y reservadas en el cryobank, para su reproducción

se las incubó a 37°C en medio de enriquecimiento con agitación constante por 24

horas.

Posteriormente se tomó tierra de un lote vacío la que luego se tamizó para obtener

un granulaje homogéneo y optimo; de ahí se la llevó al laboratorio para su pesaje

obteniendo 800 gr de tierra, y se empleó el autoclave para esterilizar y eliminar así

bacterias y hongos oportunistas que puedan tener influencia en el resultado del

ensayo, se llevó la tierra esterilizada al horno por 24 horas para eliminar todo

rastro de humedad que se encontrara, la que luego se separó en seis recipientes

con un peso de 100 gr en cada uno.

Se preparó una emulsión de 35.6 mL al 5%, de aceite quemado, para cada uno de

los recipientes misma concentración que previamente se había determinado era la

óptima tanto para que las bacterias se desarrollen y se produzca la

biorremediación del aceite quemado, la misma que está compuesta por los 5 mL

de aceite usado de motor, 30 mL de alcohol cetona y 0.6 mL de tween 20, luego

se mezcló la emulsión con los 100 gr de tierra de cada recipiente. Una vez

preparado los recipientes de bioensayo con la tierra y la emulsión de aceite se le

agregó 10 mL a cada biodigestor del medio de enriquecimiento con la

Pseudomona aeruginosa con una concentración de 1.32𝑥108 mL (Hernandez et

al., 2007).

El bioensayo de remediación se compone por: tres recipientes de muestras en

blanco sin bacterias y tres recipientes con bacterias, la duración del ensayo fue de

35 días. A los 20 días se agregó 10mL de fosfato diamónico a cada recipiente para

nutrir a la bacteria (Hernandez et al., 2007).

29

3.1.6. Separación por el método de Soxhlet

Se tomó la tierra de los 6 biodigestores de forma separada que previamente se

había sometido a biorremediación por un periodo de 35 días con la bacteria y el

aceite para su tratamiento, para luego colocarla en el Soxhlet con el papel filtro. se

pesó el balón vacío y se procedió a agregar 250 mL de alcohol cetona como

solvente, mediante el proceso de evaporación y condensación que emplea el

soxhlet, se logró separar la mezcla de tierra-aceite dicho tratamiento fue por el

lapso de 4 horas (Hernandez et al., 2007).

3.1.7. Extracción mediante evaporación

Una vez que el aceite se disolvió en el alcohol cetona, el balón se colocó en un

plato caliente para proceder a la evaporación del solvente y su posterior

recuperación, operación se repitió con los balones restantes procedentes del

procesamiento del contenido de los 6 recipiente como resultado solo quedó el

aceite en el balón (Hernandez et al., 2007).

30

CAPITULO IV

4.1. Resultados

Se aislaron bacterias del suelo contaminado con aceite usado de motor, donde

prevaleció la especie que se identificó como Pseudomona Aeruginosa.

La única bacteria capaz de crecer en el medio de cultivo en 2%, 4%, 5% de aceite

usado fue Pseudomona Aeruginosa.

Figura 4: Porcentaje de remoción

En el bioensayo con suelo contaminado se observó un porcentaje de remoción de

TPH 89.84± 11.84% en el tratamiento con Pseudomona Aeruginosa, mayor que el

control abiótico donde se apreció una remoción de 55.11± 0.16% de TPH

(F=15.47; P=0.029). En el bioensayo se determinó un valor máximo de

degradación del 97%, confirmando que esta bacteria es eficiente para la

degradación de aceite usado se confirma la hipótesis, demostrando que existen

bacterias capaces de degradar hidrocarburos totales de petróleo de un suelo

contaminado con aceite usado de motor de vehículos.

a

b

0

20

40

60

80

100

120

Control Tratamiento

Rem

oció

n d

e T

PH

(%

)

31

4.2. Discusión

Se seleccionó tierra contaminada con aceites usados de motor para proceder a

aislar bacterias que tengan el potencial para eliminar (Biorremediar) los

componentes hidrocarburíferos del aceite usado de motor.

Posteriormente se verificó su capacidad para eliminar el aceite quemado en una

concentración de 45gr/kg de tierra. En trabajos como el de Sabate, Solanas, Viñas

y Sabaté (2005) se realizaron ensayos en una concentración de TPH’s de 8gr/kg,

en el que sugirieron que a lo largo de los 200 días de su ensayo parte de los

compuestos se volatilizaron lo cual pudo haber obtenido una incidencia en sus

resultados, al igual que en los ensayos realizados por Ruberto, Vazquez y Mac

Cormack (2003) en el que usaron una concentración de TPH’s 2.5gr/kg de tierra

en el que concluyeron que el aceite se volatilizó debido a los compuestos de

cadenas policíclicas y otros compuestos volátiles, aunque su ensayo duró 51 días.

Para el presente estudio se empleó para la biorremediación el organismo conocido

como Pseudomona aeruginosa, ya que la misma fue aislada del suelo

contaminado con aceite y porque se encuentran descritas sus propiedades de

biorremediación de hidrocarburos; en trabajos como el de Ruberto et al. (2003) en

donde emplean a varios individuos de la Acinetobacter sp. miembros del orden de

las Pseudomonadales, las que mayormente son empleadas para la remediación

de combustibles como en los trabajos de Adeyi, Adeyi, Giwa y Solomon (2017) y

Striebich et al. (2014) y generalmente se emplean bacterias para biorremediación

que procedan de medios contaminados.

En el trabajo de Ruberto et al. (2003), se empleó bioestimulación al suelo que fue

extraído de la Antártida y alejado de las actividades antropogénicas ya que el

mismo posee una baja concentración de Nitrógeno (N) y Fosforo (P) de forma

natural, como estimulación empleó NaNO3 como fuente de nitrógeno y como

fuente de fosforo Na2HPO4 en tanto el presente trabajo empleó (NH4)2HPO4 como

fuente tanto de N y P.

32

En el caso de Ruberto et al. (2003) difiere en lo que sugiere Sabate et al. (2005)

ya que hay una incidencia en la biorremediación debido a la incorporación de

bioestimulantes; además no se observa que tenga algún efecto que coadyuve a la

biorremediación de los hidrocarburos, por lo que en sus resultados no refleja

alguna diferencia significativa para establecer aquello.

Se compararon los resultados de los ensayos realizados por Sabate et al. (2005)

con bioestimulación y sin bioestimulación, y se observó una ligera pero

significativa reducción de la contaminación, este hallazgo no se lo podría

cuantificar en el presente trabajo ya que, aunque se les adicionó nutrientes a los

biodigestores no se tuvo un control sin Bioestimulación para hacer la comparación

post ensayo; y determinar si hubo o no algún grado de incidencia en la

biorremediación.

La concentración de bacterias para el ensayo fue la misma empleada por Topp

(2001), el cual utilizó una concentración de 0.5 McFarland equivalente a un

densidad celular de 1𝑥108 la cual fue ajustada con un espectrómetro a λ 200nm,

con la diferencia que en el presente trabajo se empleó otro organismo

(Pseudomona aeruginosa).

En cuanto a los resultados de la eficiencia de la biorremediación tenemos que la

Pseudomona aeruginosa tuvo una eficiencia promedio del 89.84± 11.84% en

eliminar el aceite quemado de motor, mientras que en trabajos como el de Adeyi

et al. (2017) la Pseudomona aeruginosa tiene una eficiencia del 99% sin la adición

de bioestimulación y con ella una del 98%; y dentro del mismo estudio se probó a

otro microorganismos del orden Pseudomonadales; la Pseudomona fluorecence

con una eficiencia del 95% y 43% respectivamente con y sin Bioestimulación; cabe

señalar que esta gran variación en la eficiencia de biorremediación puede deberse

a la naturaleza del compuesto pudiendo ser el aceite quemado de más difícil o

prolongada degradación con respecto a los combustibles que una gran parte de

sus componentes se volatilizan.

33

4.3. Conclusiones

Se detectaron bacterias en los suelos contaminados con aceite usado de motor

capaces de degradar aceites y grasas, pero solo las Pseudomonas sp. fueron las

más tolerantes a las altas concentraciones del aceite quemado por lo que se la

empleó para los distintos ensayos.

Se utilizó la bacteria Pseudomona sp. encontrada en el área de estudio y se la

mezclo en un medio selectivo con 2%, 4% y 5% de aceite usado de motor como

única fuente de carbono y energía para determinar el potencial de

biorremediación.

Se determinó que las Pseudomona aeruginosa eran las que poseían mayor

tolerancia a vivir en medios contaminados de aceite quemado en una

concentración del 5% de aceite usado de motor y se encontró que posee un

potencial de biorremediación promedio del 89.84± 11.84%.

Se concluye que el tratamiento con Pseudomona aeruginosa presentó un valor

máximo de degradación del 97% en uno de los tres bioensayos, concluyendo que

esta bacteria es capaz de degradar aceite usado de motor.

34

4.4. Recomendaciones

Se recomienda hacer más investigación sobre la biorremediación de suelos

contaminados por aceite usado de motor, ya que se podría encontrar más

microorganismos con la capacidad de biorremediar el suelo contaminado.

Evitar la contaminación por descargas de aceite al suelo debido que es

perjudicial al ambiente.

Generar normativas que regulen a las lubricadoras artesanales debido a

que ellos no poseen una Gestión ambiental, por producto de los derrames y

descargas del aceite usado de motor y que podría infiltrarse en el suelo y

llegar a la capa freática, produciendo una mayor contaminación al medio

ambiente.

Implementar que todas las lubricadoras tenga un sitio para depósito de

aceites usados y/o trabajen con Gestores de aceite calificados y siguiendo

la normativa legal vigente.

Impartir charlas con personal preparado a trabajadores y dueños de

lubricadoras y lavadoras con respecto a qué hacer con los desperdicios de

aceite.

Se debe aplicar las normativas legales vigentes en el País y hacer una

mejor Gestión de Calidad Ambiental en estas pequeñas lubricadoras.

35

4.5. Bibliografía

Adeyi, V. A., Adeyi, A. A., Giwa, A., & Solomon, B. O. (2017). Comparative

Bioremediation of Diesel Oil Bearing Soil by <i>Pseudomonas

aeruginosa</i> and <i>Pseudomonas fluorescence</i>

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40

4.6. Anexos

Bienvenido a Minitab, presione F1 para obtener ayuda.

ANOVA unidireccional: Control; Biorremediado

Método

Hipótesis nula Todas las medias son iguales

Hipótesis alterna Por lo menos una media es diferente

Nivel de significancia α = 0,05

Se presupuso igualdad de varianzas para el análisis.

Información del factor

Factor Niveles Valores

Factor 2 Control; Biorremediado

Análisis de Varianza

Fuente GL SC Ajust. MC Ajust. Valor F Valor p

Factor 1 1,431 1,4308 3,03 0,157

Error 4 1,887 0,4717

Total 5 3,318

Resumen del modelo

R-cuad. R-cuad.

S R-cuad. (ajustado) (pred)

0,686828 43,13% 28,91% 0,00%

Medias

Factor N Media Desv.Est. IC de 95%

Control 3 1,403 0,834 ( 0,302; 2,504)

Biorremediado 3 0,427 0,497 (-0,674; 1,528)

Desv.Est. agrupada = 0,686828

Comparaciones múltiples de Dunnet con un control

Agrupar información utilizando el método de Dunnett y una confianza de 95%

Factor N Media Agrupación

Control (control) 3 1,403 A

Biorremediado 3 0,427 A

Las medias no etiquetadas con la letra A son significativamente diferentes de la

media del

nivel de control.

41

ICs simultáneos de 95% de Dunnett

Gráfica de intervalos de Control; Biorremediad


Método










Factor 1 2,5521 2,5521 15,47 0,029

Error 3 0,4949 0,1650

Total 4 3,0470

Resumen del modelo

R-cuad. R-cuad.


0,406168 83,76% 78,34% 63,45%

Medias


Control 2 1,88500 0,00707 (0,97099; 2,79901)

Biorremediado 3 0,427 0,497 ( -0,320; 1,173)






Biorremediado 3 0,427


media del

nivel de control.

42




Método










Factor 1 2,5521 2,5521 15,47 0,029

Error 3 0,4949 0,1650

Total 4 3,0470

Resumen del modelo

R-cuad. R-cuad.


0,406168 83,76% 78,34% 63,45%

Medias


Control 2 1,88500 0,00707 (0,97099; 2,79901)

Biorremediado 3 0,427 0,497 ( -0,320; 1,173)


Comparaciones en parejas de Tukey

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95%


Control 2 1,88500 A

Biorremediado 3 0,427 B

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

43

ICs simultáneos de 95% de Tukey





Biorremediado 3 0,427


media del

nivel de control.



Gráfica de caja de Control; Biorremediado

————— 20/12/2018 11:37:48 ————————————————————

Bienvenido a Minitab, presione F1 para obtener ayuda.

Recuperando proyecto desde el archivo:

‘C:\Users\Usuario\Documents\Resultados Biorremediación.MPJ’

44

Figura 5: Recolección de muestras

Figura 6: Muestra en medio de

enriquecimiento (Agua de Peptona)

45

Figura 7: Muestra en agar Cetrimide después de 24 horas

Figura 8: Pseudomona Aeruginosa

46

Figura 9: Preparación de emulsión para la

determinación de niveles de tolerancia

Figura 10: Emulsión para los niveles de

tolerancia

47

Figura 11: Niveles de tolerancia por triplicado

Figura 12: Bacteria en medio de enriquecimiento para su

reproducción en agitación constante

48

Figura 13: Lugar donde se tomó tierra para ensayos

Figura 14: Tamizaje de tierra

49

Figura 15: Pesaje de tierra 800 Gr

Figura 16: Separación de la tierra previamente esterilizada en seis recipientes

50

Figura 17: Recipientes con bacterias

Figura 18: Recipientes sin bacterias

51

Figura 19: Preparación de fosfato diamónico

Figura 20: Adición de fosfato diamónico pasado los 20 días

52

Figura 21: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet

53

Figura 22: Separación de tierra y aceite mediante el soxhlet pasada las 4 horas

54

Figura 23: Separación de tierra y aceite finalizada lista para la extracción

55

Figura 24: Extracción del solvente mediante evaporación

Figura 25: Extracción después de una hora

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