UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · patologías comunes en la cavidad bucal (5), tal es el caso...
83
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE ODONTOLOGÍA CARRERA DE ODONTOLGÍA EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TIMOL SOBRE CEPAS DE ESTREPTOCOCOS MUTANS: ESTUDIO IN VITRO Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Odontólogo Autor: Erazo Guijarro María José Tutor: PhD. Ana Del Carme Armas Vega Quito, enero 2017
Transcript of UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR … · patologías comunes en la cavidad bucal (5), tal es el caso...
UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CARRERA DE ODONTOLGÍA
EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TIMOL SOBRE
CEPAS DE ESTREPTOCOCOS MUTANS: ESTUDIO IN VITRO
Proyecto de investigación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Odontólogo
Autor: Erazo Guijarro María José
Tutor: PhD. Ana Del Carme Armas Vega
Quito, enero 2017
II
DERECHOS DE AUTOR
Yo María José Erazo Guijarro, en calidad de autor del trabajo de
investigación: “Efecto antimicrobiano del timol sobre cepas de
Estreptococos mutans: Estudio in vitro”, autorizo a la Universidad Central
del Ecuador a hacer uso del contenido total o parcial que me pertenecen,
con fines estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la
presente autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo
establecido en los artículos 5, 6, 8, 9 y demás pertinentes de la Ley de
Propiedad Intelectual y su Reglamento.
También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador realizar la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio
virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de
Educación Superior.
Firma:
________________
María José Erazo Guijarro
CC. N⁰ 0604150573
III
APROBACIÓN DEL TUTOR DEL TRABAJO DE TITULACIÓN
Yo Ana del Carmen Armas Vega en mi calidad de tutora del trabajo de
titulación, modalidad Proyecto de Investigación, elaborado por MARÍA
JOSÉ ERAZO GUIJARRO: cuyo título es: EFECTO ANTIMICROBIANO
DEL TIMOL SOBRE CEPAS DE ESTREPTOCOCOS MUTANS: ESTUDIO
IN VITRO, previo a la obtención de Grado de Odontóloga: considero que
el mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo
metodológico y epistemológico, para ser sometido a la evaluación por parte
del tribunal examinador que se designe, por lo que APRUEBO, a fin de que
el trabajo sea habilitado para continuar el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador.
En la ciudad de Quito a los 15 días del mes de noviembre del 2016.
_______________________
PhD. Ana del Carmen Armas Vega
DOCENTE – TUTORA
C.C. 1710508571
IV
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
El Tribunal constituido por: Dr. Fabricio Cevallos, Dra. Inés Villacis, Dr. Juan
Viteri
Luego de receptar la presentación oral del trabajo de titulación previo a la
obtención del título de Odontólogo presentado por la señorita María José Erazo Guijarro
Con el título:
Efecto antimicrobiano del timol sobre cepas de Estreptococos mutans: Estudio in vitro.
Emite el siguiente veredicto: (aprobado/reprobado) APROBADO
Fecha: 10 de enero del 2017
Para constancia de lo actuando firman:
Nombre Apellido Calificación Firma
Presidente Fabricio Cevallos 20
Vocal 1 Inés Villacis 18
Vocal 2 Juan Viteri 17
V
DEDICATORIA
Se dedica este trabajo a:
Dedico este trabajo a mis padres Judith y
Fausto quienes han sido un pilar
fundamental en mi vida, a mis hermanos
Fausto, Ma. Teresa y Sebastián de quienes
siempre he recibido apoyo incondicional.
VI
AGRADECIMIENTO
Agradezco por este trabajo a:
A mi tutora de tesis por su paciencia, su ayuda
incondicional, por compartir sus
conocimientos y su admirable compromiso
hacia a investigación científica, haciendo que
sea posible el desarrollo de este trabajo.
A mis padres y hermanos que con su ejemplo
me incentivan a ser cada día mejor, como ser
humano personal y profesional.
VII
ÍNDICE DE CONTENIDO
DEDICATORIA .................................................................................. V
AGRADECIMIENTO ........................................................................... VI
RESUMEN ..................................................................................... XIV
ABSTRACT ..................................................................................... XV
INTRODUCCIÓN ............................................................................... 1
CAPÍTULO I ...................................................................................... 3
1. PROBLEMA .............................................................................. 3
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ........................................ 3
1.2. OBJETIVOS ....................................................................... 4
1.2.1. Objetivo general .......................................................... 4
1.2.2. Objetivos específicos .................................................... 4
1.3. JUSTIFICACIÓN................................................................. 5
1.4. HIPÓTESIS ....................................................................... 7
1.4.1. Hipótesis de Investigación ⦋H1⦌ ...................................... 7
1.4.2. Hipótesis Nula ⦋H0⦌ ....................................................... 7
VIII
CAPÍTULO II .................................................................................... 8
2. MARCO TEÓRICO ..................................................................... 8
2.1. Caries .............................................................................. 8
2.1.1. Dieta ........................................................................ 10
2.1.2. Microorganismos ........................................................ 11
2.1.3. Tiempo ..................................................................... 14
2.1.4. Huésped ................................................................... 15
2.2. Placa Bacteriana .............................................................. 17
2.3. Plantas medicinales en Odontología ................................... 17
2.4. Aceites esenciales ........................................................... 19
2.4.1. Timol ........................................................................ 20
CAPÍTULO III ................................................................................. 22
3. METODOLOGÍA ...................................................................... 22
3.1. Tipo y diseño de investigación ........................................... 22
3.2. Universo y muestra ......................................................... 22
3.2.1. Criterios de inclusión .................................................. 24
3.2.2. Criterios de exclusión. ................................................ 24
IX
3.3. Operacionalización de variables ......................................... 24
3.4. Materiales y métodos ....................................................... 25
3.4.1. Recursos Materiales .................................................... 25
3.5. Procedimientos ............................................................... 27
3.6. Recolección de datos ....................................................... 36
3.7. Aspectos bioéticos ........................................................... 36
3.7.1. Autonomía ................................................................ 36
3.7.2. Beneficencia .............................................................. 36
3.7.3. Confidencialidad ......................................................... 37
3.7.4. Riesgo potencial del estudio ........................................ 37
3.7.5. Beneficios potenciales de estudio ................................. 38
3.7.6. Idoneidad ética y experiencia del investigador ............... 39
3.7.7. Declaración de conflicto de intereses ............................ 39
CAPÍTULO IV .................................................................................. 40
4. RESULTADOS......................................................................... 40
4.1. Discusión ....................................................................... 45
CAPÍTULO V ................................................................................... 48
X
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES .................................... 48
5.1. Conclusiones .................................................................. 48
5.2. Recomendaciones ............................................................ 49
BIBLIOGRAFÍA ............................................................................... 50
ANEXOS ........................................................................................ 58
XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Prueba de normalidad. ................................................................................. 41
Tabla 2. Prueba t de student a las 24 horas. ....................................................... 42
Tabla 3. Prueba de wilcoxon a las 48 horas. ........................................................ 43
Tabla 4. Comparación de medias en los dos periodos ...................................... 44
XII
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Cepas de estreptococos mutans ATCC 35668................................. 28
Figura 2. Presentación en polvo del timol al 100% ......................................... 29
Figura 3. Preparación del caldo de cultivo BHI .................................................. 30
Figura 4. Cajas petri con agar sangre de cordero ............................................ 31
Figura 5. Activación y rehidrataron de las cepas de estreptococo mutans
ATCC 35668 ......................................................................................................................... 32
Figura 6. Medios de absorbancia en equipo marca Jenway 6320D. .......... 33
Figura 7. Siembra del medio de cultivo con micro pipeta de 20 ml en
cajas petri con agar sangre de cordero .................................................................... 33
Figura 8. Solución o dilución del timol al 0.1%, 1% y clorhexidina al
0.12% .................................................................................................................................... 34
XIII
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Certificados de autenticidad de la cepa estreptococos mutans
(ATCC 35668)............................................................................................................. 58
Anexo 2. Caldo BHI y las instrucciones del fabricante para su
preparación. ................................................................................................................ 60
Anexo 3. Instrucciones de la empresa medibac para la activación de las
cepas estreptococos mutans ATCC 35668. ..................................................... 61
Anexo 4. Tabla de las medias de los halos de inhibición en cm del
Estreptococos mutans a las 24 horas y 48 horas. ....................................... 62
Anexo 5. Certificado del laboratorio de ciencia de alimentos de la
Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí ......................................................... 64
Anexo 6. Certificado de renuncia estadística ...................................................... 65
Anexo 7. Carta de experiencia del investigador ................................................. 66
Anexo 8. Carta de experiencia del tutor de tesis............................................... 67
Anexo 9. Carta de declaración de conflictos ........................................................ 68
XIV
TEMA: “EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TIMOL SOBRE CEPAS DE
ESTREPTOCOCOS MUTANS: ESTUDIO IN VITRO”.
Autor: María José Erazo Guijarro.
Tutora: Ana Del Carme Armas Vega.
RESUMEN
Este estudio determinó el efecto antimicrobiano del timol al 0.1 y 1 % a las
24 y 48 horas sobre cepas de estreptococos mutans ATCC 35668 en
comparación a la clorhexidina al 0,12%. La caries dental es considerada la
principal enfermedad bucal y los estreptococos mutans son
microorganismos que se relaciona directamente con esta enfermedad. La
muestra estuvo conformada por 12 cajas petri en las cuales se sembraron
20 ml de cultivo con cepas de estreptococos mutans, posteriormente 20 μL
de timol al 0.1 y 1% de concentración, así como la clorhexidina al 0.12%,
que fue empleado como control positivo se colocaron en discos de papel
filtro, se distribuyó 3 papeles filtro en cada caja petri, las evaluaciones de
los halos de inhibición existentes se realizaron a las 24 y 48 horas, los datos
obtenidos se analizados estadísticamente. El mejor efecto inhibitorio se
produjo para el timol en concentración de 1% seguida por la sustancia
control y el timol al 0,1%, en todos los casos se obtuvieron mejores
resultados a las 48 horas. Se puede afirmar entonces que emplearse el
timol al 1% a las 48 horas se obtendrá mayor efecto antimicrobiano que la
clorhexidina al 0.12% en el mismo tiempo sobre el Estreptococos mutans.
PALABRAS CLAVES: ESTREPTOCOCOS MUTANS, TIMOL Y
CLORHEXIDINA.
XV
TITLE: “ANTIBACTERIAL EFFECT OF THIMOL AGAINST STREPTOCOCCUS
MUTANS STRAIN: STUDY IN VITRO”.
Author: María José Erazo Guijarro.
Tutora: Ana Del Carme Armas Vega.
ABSTRACT
This study determined the antibacterial effect of 0.1 and 1% thymol on
Streptococcus mutans ATCC 35668, after 24 and 48 hours of exposure,
compared to 0.12% chlorhexidine. Dental cavities are considered one of
the most important oral diseases and S. mutans is the microorganism that
is directly related to their emergence. The sample consisted of 12 petri
dishes in which 20 ml of S. mutans were cultured, along with 20 µL of 0.1
and 1% thymol and 0.12% chlorhexidine, which was used as the positive
control, was put in filter paper discs, 3 discs were placed in each petri dish.
The inhibition halos were measured at t=24 hours and t=48 hours. The
data obtained were then statistically analyzed. The lowest inhibitory effect
was found with the 1% thymol solution, followed by the control substance
and 0.1% thymol. In all cases, the best results were found at t=48 hours.
It can thereby be concluded that the application of 1% thymol produces a
higher inhibitory effect than 0.12% chlorhexidine after 48 hours of
exposure against Streptococcus mutans.
KEYWORDS: STREPTOCOCCUS MUTANS/ THYMOL/ CHLORHEXIDINE.
1
INTRODUCCIÓN
Según la OMS (1) entre el 60% al 90% de la población están afectados por
caries dental, esta enfermedad bucodental es más frecuente en países
asiáticos y latinoamericanos, siendo los Estreptococos mutans los
microorganismos con mayor relación en el inicio del desarrollo de caries,
observándose una asociación positiva entre el grado de infección
por Estreptococos mutans y la caries dental (2).
Fejerskov O, Kidd E (3) refieren que la caries dental es el conjunto de
signos y síntomas producidos por la disolución localizada en la superficie
del diente previamente en contacto con placa dental, si los Estreptococos
del grupo mutans son reducidos o eliminados de las superficies de los
dientes infectados el riesgo de caries puede ser controlado (4), existen
diferentes productos antibacterianos que presentan inconvenientes en
cavidad bucal que han sido desarrollados con el objetivo de disminuir placa
bacteriana por ende caries dental, como es el caso de la clorhexidina , sin
embargo en los últimos años el uso de agentes de origen natural se ha
incrementado por su accesibilidad, beneficios y eficacia sobre numerosas
patologías comunes en la cavidad bucal (5), tal es el caso del timol
considerado el componente en mayor porcentaje extraído del aceite
esencial del orégano, tomillo (6).
2
Jouki M y et al (7) refieren al evaluar las propiedades físicas, químicas así
como la actividad antibacteriana y antioxidante del timol en
concentraciones del 1% gran potencial como agente antimicrobiano contra
bacterias gram positivas y en menor nivel sobre bacterias gram negativas,
en el mismo sentido Trombetta D y et al (8) indican que esta actividad
antimicrobiana del timol actúa a nivel de los fosfolípidos de la membrana,
producen alteraciones en la permeabilidad y por consiguiente la salida de
los elementos intracelulares.
En la búsqueda de la sustancia adecuada de origen natural, que permita
una reducción de cepas de Estreptococos mutans es que se plantea la
ejecución de este estudio que tienen como objetivo determinar el efecto
antimicrobiano del timol al 0.1 y 1% sobre cepas de Estreptococos mutans:
in vitro, mediante pruebas microbiológicas.
3
CAPÍTULO I
1. PROBLEMA
1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La caries dental es considerada como un problema de salud pública, que
afecta a la mayoría de la población, es por ello se pretende encontrar un
producto al cual se tenga fácil acceso y con una correcta higiene ayude a
la prevención de esta enfermedad.
Existe un sin número de sustancias en el mercado para controlar la
formación de placa bacteriana, al que cierto porcentaje de la población no
tiene acceso, por lo que es indispensable sacar provecho de la gran
variedad de flora en el Ecuador, muchas de ellas con características
medicinales, esto obliga a realizar estudios que nos permitan evaluar su
eficacia.
El orégano, tomillo de forma ancestral está presente en la mesa y en la
farmacéutica popular para soluciones de múltiples dolencias nos lleva a
pensar que pueden ser empleadas a nivel odontológico, es por ello que se
decidió realizar una evaluación empleando al timol para analizar su efecto
antimicrobiano sobre Estreptococos mutans extrapolando su empleo en
enjuagues bucales o pastas dentales.
4
1.2. OBJETIVOS
1.2.1. Objetivo general
Determinar mediante pruebas de inhibición, efecto antimicrobiano del
timol en 0.1% y 1 % de concentración a las 24 y 48 horas sobre cepas de
Estreptococos mutans ATCC 35668.
1.2.2. Objetivos específicos
Evaluar el efecto antibacteriano del timol al 0.1% a las 24 y 48 horas
de incubación sobre cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668.
Identificar el efecto antibacteriano del timol al 1% a las 24 y 48 horas
de incubación sobre cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668.
Comparar el efecto antibacteriano del timol al 0.1% y 1% en los dos
tiempos probados de incubación sobre cepas de Estreptococos mutans
ATCC 35668.
Comparar el efecto inhibidor del timol en las dos concentraciones y
tiempos probados con la acción de la clorhexidina a 0.12% como gold
estándar sobre cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668.
5
1.3. JUSTIFICACIÓN
El timol ha alcanzado una gran importancia en cuanto a su empleo en la
composición de barnices de diferentes marcas de uso a nivel bucal sobre
lesiones cariosas en niños, sin embargo, se hace importante determinar su
capacidad sobre colonias de microorganismos específicos para el desarrollo
de enfermedades comunes en la cavidad bucal. (9)
Miller A y et al (10) refiere la necesidad de determinar si los aceites
esenciales y sus componentes como es el caso de timol tiene la capacidad
de actuar sobre infecciones orales, gástricas, dérmicas e incluso sobre
infecciones fúngicas oportunistas que se presentan en la cavidad bucal.
Esta sustancia puede ser obtenida a partir de diversos tipos de orégano por
ejemplo: orégano de monte, orégano cimarrón, orégano de Castilla,
orégano rastrero por recalcar los más importante (6) (11), y otras plantas
como tomillo (12).
Para el aislamiento de los componentes de un aceite esencial se necesita
equipos especializados así como técnicas complejas razón por la cual se
decidió la adquisición del timol como extracto puro es decir al 100%,
obtenido por procesos de laboratorio, el cual se pretende diluir para poder
obtener las concentraciones del 0.1% y 1%, para evaluar su efecto
inhibidor (7), que han demostrado inhibición bacteriana en evaluaciones
previas mediante estudios sobre microorganismos gram positivos (7)
6
teniendo en cuenta que los Estreptococos mutans también son gram
positivos (13) .
El hecho de evaluar el efecto antimicrobiano de esta sustancia sobre
Estreptococos mutans, se basa en el conocimiento existente de que estos
microorganismos son considerados como los agentes desencadenantes de
la lesión caries dental, pese al hecho de ser precursores de estos procesos,
son muchos los microorganismos a nivel bucal presentes y responsables
del desarrollo de esta lesión. En la fitoterapeútica, las plantas de forma
ancestral han sido empleadas para combatir o controlar diferentes
enfermedades, el orégano y el tomillo, más específicamente su compuesto
principal el timol proveniente de estas plantas, el mismo ha sido probado
en cuanto a su efecto sobre diferentes microorganismos, de ahí la decisión
de probar también sobre cepas relacionadas a los procesos cariosos
buscando una alternativa fiable adecuada química, microbiológicamente y
sin efectos colaterales en el control de estos microrganismos y sus
consecuencias.
La preocupación por prolongar la vida de la población en general y brindar
a ella mejoras en cuanto a su calidad de vida, llevan a buscar alternativas
naturales, por tanto, Saavedra M y et al (5) mencionan, el aumento en la
demanda de productos naturales, así como el mayor interés de la industria
farmaceútica, alimenticia y cosmética, convirtiéndose en una necesidad
actual explorar los beneficios del orégano y tomillo, entender más a fondo
7
los procesos que le dan a esta especia sus propiedades biológicas tan
diversas y atractivas (11).
En los últimos años ha aumentado el uso de sustancias naturales como
reemplazo de sustancias sintéticas debido a las desventajas de estos
productos como son sus altos costos y los posibles efectos colaterales, lo
cual limita su uso en personas de bajos recursos económicos y en aquellas
sensibles al producto (5).
1.4. HIPÓTESIS
1.4.1. Hipótesis de Investigación ⦋H1⦌
El timol al 0.1 y 1% de concentración, a las 24 y 48 horas evaluados posee
efecto antimicrobiano sobre cepas de Estreptococos mutans.
1.4.2. Hipótesis Nula ⦋H0⦌
El timol tanto al 0.1 y 1% de concentración, a las 24 y 48 horas no tiene
efecto antimicrobiano sobre cepas de Estreptococos mutans.
8
CAPÍTULO II
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Caries
Lanata J (14) refiere que la caries es una enfermedad infecciosa que se
caracteriza por producir la desintegración localizada de los tejidos
mineralizados de las estructuras dentarias sin embargo, Garg N, Garg A
(15) mencionan que cuando un órgano dentario se encuentra sometido a
los ataques ácidos producidos por la fermentación de los carbohidratos,
especialmente la sacarosa se da una pérdida importante de minerales como
calcio, fosfatos y carbonatos los cuales son constituyentes importantes de
la hidroxiapatita, Ca10 (PO4)6 (OH)2, que es la estructura química más
abundante de la porción inorgánica del diente, la cual sufre una
desmineralización (16) (17), también se produce una destrucción de las
sustancias orgánicas, resultado del cambio en la ecología así como la
actividad metabólica de los microorganismos que han estado en contacto
previamente con la superficie del diente como placa bacteriana (3).
Esta enfermedad se la considera crónica, que evoluciona de forma
progresiva e irreversible, encontrándose mayormente en zonas
susceptibles a mayor cantidad de acumulación de placa bacteriana como
son fosas, fisuras restauración mal adaptadas, espacios interdentales así
como pacientes portadores de prótesis dentales por lo tanto inicia en la
9
superficie del diente y avanza hasta su profundidad (3), su inicio se
desarrolla mucho antes del momento en que se hace clínicamente visible
(16). Una vez que la caries haya progresado, clínicamente se podrá
observar en la pieza dental un cambio en su coloración en una zona
específica llamada como mancha blanca posteriormente habrá la aparición
de una cavidad en el diente que se caracteriza por dolor espontáneo o ante
diversos estímulos, e incluso por halitosis y/o retención de comida entre los
dientes (18).
Estudios realizados consideran que la caries es infecciosa y transmisible,
en la actualidad se ha podido demostrar que si bien es cierto existe
trasmisión por parte de la madre al hijo de los microorganismos que están
asociados a la caries mas no de la enfermedad (19).
En 1960 Paul Keyes fue el primero en establecer como factores
etiopatogénicos: microorganismos, huésped y dieta es por ello que se lo
conoció como triada de Keyes, posteriormente en los ochenta al observar
que si estos factores interactuaban en un tiempo corto no producían lesión
cariosa se agregó como factor al tiempo (13). En la actualidad podemos
decir que la caries es multifactorial ya que involucra dieta,
microorganismos, tiempo y huésped cuya interacción es indispensable para
vencer los mecanismos de defensa del esmalte produciendo de esta forma
la enfermedad ya que de otro modo sería imposible el desarrollo de la
misma (13) (16).
10
2.1.1. Dieta
Este es un aspecto de gran importancia, debido a que la dienta de la
persona aportara los nutrientes necesarios para que los microorganismos
puedan desarrollarse, los más importantes son los carbohidratos
fermentables más específicamente la antes mencionada sacarosa que tiene
gran potencial cariogénico porque favorece a la colonización de
microorganismos ayudando que estos se adhieran al diente (16). Po lo que
al consumirse azúcares estos producen la disminución del pH a valores que
pueden llegar a 4,5 – 5,5 lo cual empezará a producir una desmineralización
(13).
No existen evidencias que confirmen una producción de caries de forma
natural en un ambiente en el que no haya presencia de carbohidratos en la
dieta. Es importante también recalcar que un biofilm que se ha expuesto a
carbohidratos provocará una baja de pH el cual será necesario para una
descalcificación del esmalte (13).
Es importante destacar que ciertos alimentos presentan características
propias de adhesividad que facilitan su permanencia sobre las superficies
dentarias por tiempos prolongados como: caramelos, gomas, refrescos
azucarados, hidratos de carbono, etc. Por otro lado, existen alimentos que,
a su vez, son favorables debido a que disminuyen la producción de ácidos
después de haber consumidos alimentos que contengan sacarosa entre
11
estos tenemos el maní y el queso, es por todo esto que debemos tomar en
cuenta la secuencia así como el tipo de alimentos que ingerimos (16).
2.1.2. Microorganismos
La boca proporciona un ambiente agradable y hostil para el crecimiento
microbiano tanto para los microorganismos propios de la cavidad oral, así
como para microorganismos patógenos (3) por lo cual se considera una de
las zonas del cuerpo con una variada y numerosa cantidad de
microorganismos se estima que alberga más de mil especies, cada una de
estas representada por amplia variedad de cepas (16). El concepto actual
se describe que varios microorganismos participan en la patogénesis de la
caries dental (estreptococos del grupo mutans, Lactobacillus spp
y Actinomyces spp) de los cuales, Estreptococcos mutans (E. mutans) es el
agente más importante asociado a ella. La caries y la periodontitis son
causadas por un desequilibrio en las poblaciones bacterianas de biopelículas
que se forman naturalmente y ayudan a mantener el estado normal de la
cavidad oral (20).
Para poder analizar de mejor manera los microorganismos que producen
las lesiones cariosas los dividiremos en dos grupos: los microorganismos
que inician la enfermedad son aquellos que comienzan el desarrollo de la
caries dental entre ellos encontramos los E. sobrinus y el de mayor
importancia y al cual se le dará más énfasis posteriormente, el E. mutans.
12
Y los microorganismos que producen el desarrollo o progreso de la lesión
una vez establecida. Dado que el E. mutans ya ha producido un medio
favorable microorganismos como Lactobacilos spp., Actinomyces spp.,
aprovechan y proliferan, también pueden existir oportunistas como el
hongo de la Cándida albicans que aprovechan los medios ácido para su
multiplicación (13).
2.1.2.1. Estreptococos mutans
En 1924 Clark aisló una bacteria a partir de lesiones cariosas de seres
humanos estas se caracterizaban porque en algunas ocasiones se podían
observar como coco en cadenas y en otros momentos se observaban como
cocobacilos es por ello que los denomino “mutans” debido al
comportamiento pleomórfico que presentaban (21).
Los Estreptotocos son cocos gram positivos se pueden asociar en parejas y
cadenas cortas o largas, son anaerobios facultativos, su temperatura
optima de desarrollo es de 36 ± 1⁰ C (16), es un microrganismo
cariogénico por excelencia debido a su capacidad de colonizar superficies
duras se lo puede aislar en diferentes zonas de la cavidad oral sobre todo
a partir del biofilm supragingival, así como a nivel radicular y salival. Sus
colonias son alfa (α) hemolíticas es decir presentan una destrucción parcial
de la hemoglobina, gamma (γ) hemolíticas por lo tanto no existe lisis de
hemoglobina y excepcionalmente beta (β) hemolíticas una lisis total de la
13
hemoglobina, estos patrones de hemolisis pueden ser visibles cuando son
colocados en medios o agares que contienen sangre (20).
Estos microorganismos son acidogénicos, acidófilos, acidúricos.
Acidogénicos porque tienen la capacidad producir ácidos (21), es decir el
E. mutans tiene enzimas en su membrana celular que ayudan a desdoblar
azúcares principalmente sacarosa (fructosa + glucosa) estos irán al interior
de la célula y como desechos producirán ácidos dentro de los primordiales
tenemos a. láctico, a. propiónico, a. acético y a. fórmico (20) una vez
producidos estos ácidos, a través de la placa bacteriana van a dirigirse
hacia el esmalte donde se encuentra desmineralizandolo, por ende con
porosidades, disociándose y liberando hidrogeniones, los cuales disuelven
rápidamente el mineral del esmalte, liberando calcio y fosfato, que se
vierten fuera del esmalte. Este proceso se conoce como desmineralización.
(22).
Acidófilos significa que se reproducen y crecen en medio ácido (21), este
medio favorece el crecimiento, al mismo tiempo tiene la capacidad de
impedir el crecimiento de otros tipos de microorganismos que son parte de
la flora habitual normal de la cavidad oral entre estos encontramos E.
gordonii, E. sanguis y E. oralis, Solo el E. mutas es capaz de producir
ácidos a partir de azúcares fermentados así como disminuir el pH que puede
estar en rangos de 4,4 a 4,8 y sobrevivir en estas condiciones (13).
14
Acidúrico porque a pesar de encontrarse en un medio ácido siguen
disminuyen aún más el pH (21).
Al producirse una adherencia de Estreptococos mutans, da como resultado
el desarrollo inicial de la caries, estos microorganismos presentan en su
membrana celular enzimas conocidas como transglucosidasas que toman
el nombre de glucosiltransferasas (GTF) en este microorganismo, una vez
ingeridos los carbohidratos específicamente la sacarosa esta es desdoblada
por la GTF obteniendo monosacáridos la glucosa y fructosa, a su vez la
glucosa se polimerizará dando como resultado al mutano y dextrano estos
ayudaran a la adhesión de los microorganismos a la superficie del diente
desarrollando microcolonias bacterianas, mientras que la fructosa se
dirigirá al interior de la célula para la producción de energía del E. mutans
y también producirá los ácidos como el láctico que es producto del
metabolismo, este ayudara a la desmineralización de la pieza dental dando
como resultado liberación de calcio y fosforo iniciando de esta manera la
lesión caries en la superficie de diente que con el tiempo se observará
clínicamente como mancha blanca (20) (22) .
2.1.3. Tiempo
Debido a la acumulación de alimentos en zonas retentivas que dificultan su
remoción mecánica y tiene una prolongada permanencia en las superficies
dentales, favoreciendo la producción de caries incipientes que con el paso
15
de tiempo pueden llegar a formar grandes cavidades afectando esmalte,
dentina, cemento incluso pulpa dental (3).
Por lo tanto, no se debe pensar que al existir únicamente la presencia de
carbohidratos fermentables se desarrollará caries, de esta manera es
indispensable tomar en cuenta que el tiempo es un factor de relevancia en
la aparición de un proceso carioso en la dentición temporal o permanente
(18). Gracias a este factor se producirá la fermentación de los diferentes
azúcares, los cuales producirán ácidos que se encuentran desmineralizando
los dientes por aproximadamente 20 minutos después de su consumo hasta
que se produce la recuperación del pH en el medio bucal debido al efecto
buffer de la saliva (16).
Al existir numerosas variaciones de pH por algunos meses o incluso años
se puede apreciar la pérdida neta de iones calcio y fosfato especialmente
el esmalte el cual se verá alterado por la presencia de numerosas
porosidades en su estructura, dicho cambio se lo puede apreciar
clínicamente” mancha blanca” siendo una lesión cariosa incipiente (3).
2.1.4. Huésped
El huésped posee elementos que ayudan al control de la producción de la
caries como son la saliva que es indispensable para un control de los
procesos cariosos evidenciándose que en pacientes con disminución de la
producción de saliva hay un aumento en la incidencia de esta enfermedad,
16
es así que se atribuyen a la saliva propiedades antimicrobianas y
antifúngica (23), por ello se debe tomar en consideración aquellos
pacientes con baja producción de saliva debido a que son sometidos a
quimioterapias, radioterapias y aquellos que consumen cierto tipo de
medicamentos para controlar enfermedades comunes como trastornos de
ansiedad, patologías cardiovasculares, alergias, diabetes y tratamientos
analgésico (4).
Igualmente depende de la suceptibilidad del diente al desarroollo de caries
ya que existen zonas mas propensas que otras a desarrollar caries esto se
puede deber a la posición, anatomía del diente, incluso a ciertas anomalias
en la formación del diente como amelogenesis imperfecta, hipoplasia
adamantina (16).
Dentro de los elementos que dependen del huesped encontramos también
la inmunización, que produce anticuerpos del tipo inmunoglobulina (Ig) A
de la saliva y la Ig G que producen respuesta humoral, y la respuesta
ceular mediada por linfocitos T, este punto aun se sigue analizando ya que
se atribuye a que existe un defensa por medio de la inmunoglobulina G que
puede tener una efecto contra el E. mutans pero aun no se ha comprobado
en su totalidad ya que el E. mutans a la ves puede inhibir su metabolismo
es por ello que aun esto se sigue estudiando (24).
17
2.2. Placa Bacteriana
La placa dental es definida como una comunidad de bacterias y sus
productos la cual se forma en todas las superficies de los dientes en la
cavidad bucal (15).
Es importante reconocer que la placa bacteriana que crece y se reproduce
en la superficie de un diente no necesariamente dará como resultado una
lesión cariosa sin embargo este es un requisito previo para que se
desarrolle, es así que la a formación de la placa bacteriana iniciará con la
formación de película luego habrá la unión de las células bacterianas
individuales para continuar con el crecimiento y reproducción de los
microogamismos finalmente el aumento de diversas especies con continuo
crecimiento llegando a formar biopelícula madura este proceso tienen un
tiempo aproximado de una semana o más (3).
Los microorganismos que se encuentran formando parte de la placa
bacteriana están organizados en una estructura tridimecional, la cual a su
vez esta encapsulada en una matriz que se forma con material extracelular
que proviene de las células que se encuentran en su medioambiente (15).
2.3. Plantas medicinales en Odontología
Se conoce como fitoterapia al tratamiento de las enfermedades basadas en
el empleo de plantas y sustancias vegetales. Esta palabra proviene de
18
“phyton” (planta) y “terapia” (tratamiento), esta es una práctica tan
antigua que la primera vez mencionada fue en papiros escritos 1.500 años
A.C, se señala también que las primeras plantas aplicadas en odontología
tenían un fin primordial, el control de la placa bacteriana así como otras
afecciones bucales (23).
Sin embargo el empleo de plantas medicinales, así como sus extractos en
odontología de una manera más científica es decir realizando estudios que
han permitido evaluar tanto plantas, componentes así como propiedades
que presenta, han tenido una gran acogida durante en estos últimos años
(25).
En la actualidad el empleo de las plantas tanto en medicina como en
odontología han tomado fuerza y desarrollo, es así que existen
componentes naturales incluidas en ciertos productos odontológicos como
enjuagues bucales, pastas dentales, barnices fluorados, soluciones tópicas
entre otros (26).
El empleo de la fitoterapia ha crecido de una manera sorprendente estos
últimos años, tomando en cuenta que años atrás se consideraba a la
población con menos recursos económicos que eran quienes utilizaban este
tipo de tratamientos para ciertas enfermedades sin embargo en la
actualidad se ha incrementado en todos los ámbitos de la vida de diferentes
regiones del mundo. Esto se debe a que mediante estudios se han adquirido
19
nuevos conocimientos de los más destacados son plantas así como sus
extractos tienen mayor actividad farmacológica, son menos tóxico y más
biocompatibles por ser de origen natural (23).
2.4. Aceites esenciales
Los aceites esenciales son mezclas homogéneas de compuestos químicos
orgánicos, provenientes de una misma familia química, los aceites
esenciales están contenidos en estructuras especificas ya sean glándulas o
vesículas secretoras inmersas en los tejidos de las hojas, flores, corteza y
semillas de los frutos de muchas especies (27). Se caracterizan por
presentar olor, sabor, incluso propiedades antibióticas es por ello que se
han utilizado en productos cosméticos como perfumería y aromatizantes en
alimentos como condimentos y saborizantes (28).
El término de “aceite esencial” fue utilizado por primera vez en siglo XVI
por Paracelso quien fue médico y farmacéutico, a la vez el utilizó aceites
esenciales como medicamentos, entre el siglo XVI y XVII se empezó a
extraer aceites naturales y fueron puestos a la venta (29).
De las plantas pueden extraerse aceites esenciales para muchos y diversos
fines; por un lado, protegen a la planta de plagas, gracias a su aroma
pueden atraer insectos y aves que son beneficiosos para las plantas,
también ahuyentan insectos que les produzcan algún tipo de daño,
20
animales destructores e inclusive protegen de la invasión de otras plantas
(30).
Debido a que los aceites esenciales se encuentran en pequeñas
proporciones son necesarias cantidades grandes de material vegetal (29),
los aceites esenciales de plantas aromáticas y medicinales presentan
bioactividades notables (propiedades antifúngicas, antibacteriales y
antioxidantes) (27).
Un aceite esencial es una mezcla que puede llegar a alcanzar hasta 100
sustancias químicas distintas, dándole a cada uno de estas características
propias. Dentro de los componentes más importantes podemos mencionar
a los terpenos que son familias de hidrocarburos y que por lo general son
los que encontramos en mayor cantidad pudiendo llegar a alcanzar
concentraciones de 75 a 90% del peso total del aceite esencial. Los
terpenos son inodoros o contribuyen muy poco a aroma, estos le están
dando la característica de ser volátiles e inflamables a los aceites
esenciales, así como su viscosidad y densidad (29).
2.4.1. Timol
Es un terpeno del grupo hidrocarburo (29), que lo encontramos en los
aceites esenciales de varios tipos de orégano, tomillo además de ser la
sustancia con más porcentaje; en el tomillo puede llegar a encontrarse
entre el 38% al 47%, aproximadamente de la totalidad del aceite esencial
21
(12), mientras que en orégano encontramos del 8% al 54%, este
porcentaje dependerá de tipo de órgano del que se extraiga el timol (11).
Estudios realizados en alimentos determinaron propiedades físicas así como
químicas en donde se pudieron observar grandes potencial antioxidantes y
antibacterianos (7), se obtuvieron mejor efecto inhibitorio frente a
bacterias gram positivas y en menor nivel sobre bacterias gram negativas
(6) (7).
El mecanismo de acción del timol se da a nivel de los fosfolípidos de la
membrana, lo que produce una serie de alteraciones en la permeabilidad
que dará como resultado la salida de elementos intracelulares de los
microrganismos produciendo así la muerte de las bacterias (8).
22
CAPÍTULO III
3. METODOLOGÍA
3.1. Tipo y diseño de investigación
Se planteó la ejecución de un estudio experimental in vitro ya que se realizó
mediante pruebas de laboratorio controlados al determinar la eficacia
antibacteriana del timol a una concentración del 0.1% y 1% sobre cepas
puras de Estreptococos mutans ATCC 35668, incubándolas 24 y 48 horas.
Además, se afirma que fue un estudio comparativo porque se evaluó el
efecto antimicrobiano en dos concentraciones diferentes del timol sobre
cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668 comparándolas con el efecto
de inhibitorio de clorhexidina al 0.12% en dos tiempos de incubación y es
además un estudio transversal porque se ejecutó en un determinado
momento.
3.2. Universo y muestra
La muestra se calculó en función a la siguiente fórmula:
n =2(Zα+Zβ)
2 S2
d2
n =2(1,96+1,645)2 3,6052
0,252
n= 9,36
23
Dónde:
n = son los individuos necesarios en cada una de las muestras;
Z = es el valor z correspondiente al riesgo deseado;
Z = es el valor z correspondiente al riesgo deseado;
S2 = es la varianza de la variable cuantitativa que tiene el grupo control o
de referencia
d = es el valor mínimo de la diferencia que se desea detectar (datos
cuantitativos).
La muestra estará constituida por 12 cajas petri con cepas de
microrganismos liofilizados de Estreptococos mutans se obtendrán del
importador MEDIBAC , proveedores situado de la ciudad de Quito (Anexo
1), importadas desde Minnesota, USA las muestras serán tratadas y
manipuladas en condiciones laboratoriales determinados, controlados por
personal especializado y entrenado en el Laboratorio de investigación de
ciencias de alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
24
3.2.1. Criterios de inclusión
Se incluyeron en el estudio cepas puras de Estreptococos mutans
ATCC 35668, sin ningún tipo de contaminación.
Extracto de timol al 0.1% y 1% almacenado en condiciones
controladas en ambientes específicos.
3.2.2. Criterios de exclusión.
Las bacterias que presentaron cualquier tipo de contaminación.
Cepas que no se lograran activar en medio de cultivo.
Extracto de timol a otras concentraciones que no sean las específicas
para ser usadas en el estudio.
3.3. Operacionalización de variables
Variable Definición Indicadores Tipo Escala Categoría de
determinantes
Timol Componente
del aceite
esencial del
tomillo,
algunos tipos
de oréganos.
Halo de
inhibición
medida en cm
Indepen
diente
Cuantitati
va
Concentración al
0.1% y 1 %
Clorhexidi
na
Sustancia de
sinfectante d
e
acción bacte
Halo de
inhibición
medida en cm
Indepen
diente
Cuantitati
va
Concentración al
0.12%
25
ricida y fungi
cida
Tiempo Tiempos de
crecimiento
bacteriano
Medición por
cronómetro
Dependi
ente
Cuantitati
va
24 y 48 horas
E. mutans Microorganis
mos
cariogénicos
gram
positivos
Crecimiento
en cajas Petri
Intervini
ente
Cuantitati
va
ATTC 35668
3.4. Materiales y métodos
3.4.1. Recursos Materiales
Materiales en Común
Hoja de recolección de datos
Regla
Lápiz
Materiales de Bioseguridad
Mascarilla
Guantes de Látex
Alcohol 70%
26
Instrumental
Micropipetas
Matraz Erlenmeyer
Pinza
Tubos de ensayo
Materiales
Cepa de Estreptococos mutans
Caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth)
Agar sangre
Timol 100%
Clorhexidina 2%
Cajas Petri
Discos de papel filtro
Parafilm
Glicerina
Agua destilada
Equipos
Agitador magnético
Balanza analítica
Incubadora
27
Se utilizaron un espectofotómetro para correlacionar la medida de
absorbancia con la concentración de microorganismos.
Cámara de flujo laminar en donde se realizó los procedimientos
microbiológicos que se necesiten de un ambiente estéril.
Autoclave que ayudo a la preparación de los caldos de cultivo, así
como esterilización de instrumental.
Balanza para pesar caldo de cultivo según indicciones del fabricante.
Los equipos fueron empleados en el Laboratorio de investigación de ciencias
de alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro de Manabí dirigido por tal por el PhD. Stalin Santacruz
Terán y el Ing. Marlon Castro García.
3.5. Procedimientos
Análisis microbiológico
La evaluación de la actividad antibacteriana del componente del aceite
esencial se realizó en cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668. Estos
microorganismos fueron adquiridos desde Minnesota, USA laboratorio
Microbiologics mediante el distribuidos MEDIBAC localizado en la ciudad de
Quito (fig. 1). Las cepas fueron adquiridas bajo pedido y posteriormente
fueron enviadas directamente al Laboratorio de Investigación de Ciencias
de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro.
28
Figura 1. Cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668. Autor: María José Erazo Fuente: Laboratorio
de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
El timol al 100% en presentación en polvo utilizado fue donado por el
Departamento de Tecnología de Alimentos de la Universidad Pública de
Navarra (Pamplona, España), en cooperación con la Universidad Laica Eloy
Alfaro de Manabí (Manta, Ecuador) donde fue ejecutado el estudio (fig.2).
La clorhexidina se obtuvo por compra en un Dental Odontológico al 2% y
se preparó al 0,12% diluyéndolo en agua destilada
29
Figura 2. Presentación en polvo del timol al 100%. Autor: María José Erazo Fuente: Laboratorio de
Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
Método de preparación para medios de cultivo deshidratados
Para preparar del caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth C5141 Criterion
California E.E.U.U.). Se preparó 8.8mg de los medios de cultivo
deshidratados en 240ml de agua destilada, luego se calentó según sea
necesario para disolver completamente, se mezcló en agitador magnético,
posteriormente se colocó para su esterilización en autoclave a 121 ° C
durante 15 minutos, finalmente el enfriamiento fue a 45-50ºC y se
distribuyó en tubos de ensayo estériles donde se realizó la inoculación
(fig.3), todo el procedimiento descrito anteriormente se realizó según
indicaciones del fabricante (Anexo 2).
30
Figura 3. Preparación del caldo de cultivo BHI. Autor: María José Erazo Fuente: Laboratorio de
Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
El agar sangre vino preparado en las cajas Petri directamente del
laboratorio MEDIBAC y selladas para evitar contaminación alguna (fig. 4).
Se requirieron 12 cajas Petri para el estudio ya que se aplicaron tres cajas
control, tres con timol al 0.1%, tres con timol al 1% y 3 con clorhexidina
0.12%, esta muestra se obtuvo mediante dos parámetros en función a la
fórmula aplicada, y descripción por Garg N, Garg A (31) realizando el
análisis por triplicado de la muestra.
31
Figura 4. Cajas Petri con agar sangre de cordero. Autor: María José Erazo Fuente: Laboratorio de
Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad
Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
Recuperación de la viabilidad de las cepas
Antes de comenzar con el experimento se activaron (Anexo 3) y
rehidrataron las cepas liofilizadas en caldo Brain Heart Infusion BHI Broth
C5141 (fig. 5). Se incubaron en estufa a 37°C, por 48 horas en
microaerofília para su reproducción. Finalmente, por cada cepa se preparó
una suspensión bacteriana al 0.5 Mc Farland.
32
Figura 5. Activación y rehidrataron de las cepas de Estreptococo mutans ATCC 35668. Autor: María
José Erazo Fuente: Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
Para medir si las cepas se reprodujeron en el tiempo se realizaron lecturas
de absorbancia a 625 de longitud de onda a 24 y 48 horas de incubación.
La medida de absorbancia obtenida fue directamente proporcional a la
concentración de los microorganismos presentes. Las lecturas se realizaron
en un equipo de medición de absorbancia Marca Jenway 6320D. Para poder
correlacionar la medida de absorbancia con la concentración de
microorganismos se utilizó el patrón 0.5 Mac Farland que representa una
concentración conocida de microorganismos la cual es de 1.5 x 108 UFC.
En las lecturas se incluyó un pozo blanco la cual contiene caldo BHI virgen,
esta lectura debe ser restada a las lecturas realizadas para eliminar la
absorbancia procedente del caldo.
33
Figura 6. Medios de absorbancia en equipo Marca Jenway 6320D. Autor: María José Erazo Fuente:
Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de
la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
Siembra de microorganismos en agar sangre
20 ml del medio de cultivo preparado fueron sembrados en cada una de las
cajas petri con agar sangre de cordero, (fig.7) se dejó secar 30 minutos en
la cámara de flujo laminar posteriormente procedió a evaluar la sensibilidad
como se describe a continuación.
Figura 7. Siembra del medio de cultivo con micro pipeta de 20 ml en cajas Petri con agar sangre
de cordero. Autor: María José Erazo Fuente: Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos
de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
34
Evaluación de la actividad bacteriana de los extractos preparados
Se realizó la dilución tanto del timol al 100% en polvo con glicerina y la
clorhexidina al 2% en agua destilada para obtener los porcentajes
requeridos del 0.1%, 1% y 0,12% respectivamente (fig. 8).
Figura 8. Solución o dilución del timol al 0.1%, 1% y clorhexidina al 0.12%. Autor: María José
Erazo Fuente: Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
Para evaluar la sensibilidad de Estreptococos mutans ATCC 35668 al timol
al 0.1% y 1% como control microbiano se empleó el método de difusión en
agar según la técnica estandarizada por el National Committee for Clinical
Laboratory Standards (NCCLS). Se depositaron 20 μL del timol al 0.1% y
1% así como la clorhexidina al 0.12% en discos de papel filtro (Fisher
Scientific Q2) de 5 mm de diámetro. Posteriormente, se colocaron 3 papeles
de forma equidistantes en cada placa que contiene el medio inoculado con
Estreptococos mutans ATCC 35668 a analizar, se identificó cada caja y se
35
sellaron con parafilm de cada una de las cajas Petri. Las placas inoculadas
se incubaron a una temperatura de 37°C durante 2 días. Se midieron el
halo de inhibición del crecimiento bacteriano en (cm) a las 24 y 48 horas
(fig.9).
Figura 9. Colocación de papeles filtro con 20 μL de cada sustancia y su sellado. Autor: María José
Erazo Fuente: Laboratorio de Investigación de Ciencias de Alimentos de la Facultad de Ciencias
Agropecuarias de la Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí.
36
3.6. Recolección de datos
Los datos de las mediciones ejecutadas fueron registrados en la hoja de
recolección de datos, construidas previamente (Anexo 4) y posteriormente
analizados mediante programa estadístico SPSS. Se observó la presencia
de halos de inhibición alrededor de cada uno de los discos, los cuales fueron
medidos de forma individual; es decir caja por caja y disco por disco, estas
medidas fueron tomadas con una regla milimetrada a las 24 y 48 horas.
3.7. Aspectos bioéticos
3.7.1. Autonomía
El estudio se realizó en el Laboratorio de investigación de ciencias de
alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Laica
de Eloy Alfaro de Manabí dirigido por el PhD. Stalin Santacruz Terán quien
autorizó el uso del mismo (Anexo 5) e Ing. Marlon Castro García. Se adjunta
certificado estadístico (Anexo 6).
3.7.2. Beneficencia
El beneficio del estudio fue evaluar el efecto antimicrobiano de timol que
ayude a la prevención de caries dental que es la enfermedad más común
de la cavidad oral y se comprobó que tan efectivo es el timol que aparecen
en algunos productos se odontológicos como enjuagues bucales, barnices
37
fluorados y a su vez que puedan ser aplicadas a otro producto tales como
pastas dentales. También mediante este estudio pudimos comprobar que
el timol tiene mejor efecto que la clorhexidina por lo cual sería posible su
reemplazarlo es así que la población se beneficiará ya que podrá evitar los
efectos colaterales de la clorhexidina que son pigmentaciones en piezas
dentales.
3.7.3. Confidencialidad
Los datos obtenidos se realizaron únicamente con fines de investigación y
solo fueron utilizados en este trabajo de investigación.
3.7.4. Riesgo potencial del estudio
El estudio fue in vitro sin embargo el anteproyecto fue presentado al comité
de ética del Hospital Eugenio Espejo en donde fue aprobado, cumplió con
todas las normas bioéticas tanto nacionales como internacionales, se siguió
el protocolo de manejo de desechos del Laboratorio de investigación de
ciencias de alimentos de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la
Universidad Laica de Eloy Alfaro de Manabí, por lo cual no existió ningún
tipo de riesgo potencial el estudio. Este protocolo cumple con el reglamento
de manejo de desechos infecciosos para la red de servicios de salud del
Ecuador el cual en sus artículos 28 y 29 explican el tratamiento de las
mismas, donde se menciona "Art.28.- El tratamiento de los desechos
infecciosos consiste en la inactivación de la carga contaminante bacteriana
38
y/o viral en la fuente generadora" "Art. 29.- Los métodos de tratamiento
de los desechos infecciosos son: A.-Esterilización (autoclave): Mediante la
combinación de calor y presión proporcionada por el vapor de agua, en un
tiempo determinado. B.-Desinfección química: Mediante el contacto de los
desechos con productos químicos específicos."
Por tanto, para lograr la inactivación de la carga contaminante de las cajas
Petri antes de su desecho, se colocó en el autoclave a 121 ° C durante 30
minutos
3.7.5. Beneficios potenciales de estudio
Directo: Para el profesional odontólogo pues podrá comprobar la efectividad
de los productos odontológicos que contienen timol como enjuagues
bucales y barnices fluorados así como la aplicación del timol en nuevos
productos.
Indirecto: El beneficio también será para los pacientes quienes ocupan
ciertos productos odontológicos, también se podrán incorporar pastas
dentales en el mercado con sustancias de origen natural como es el timol,
el cual podrá reemplazar productos que tienen efectos colaterales
como tales como pigmentación de dientes y restauraciones.
Otro de los importantes beneficios de trabajo será que, al evaluar el efecto
antimicrobiano de timol, se podría llegar a utilizar este componente en
39
industrias ecuatorianas y así poder elaborar de productos odontológicos de
buena calidad.
3.7.6. Idoneidad ética y experiencia del investigador
Este trabajo fue realizado por mi persona (Anexo 7) y como tutora la PhD
Ana Armas (Anexo 8).
3.7.7. Declaración de conflicto de intereses
Al realizar este trabajo no se obtuvo ningún beneficio personal ni
económicos por lo cual se adjunta carta de declaración de conflicto de
interés (Anexo 9).
40
CAPÍTULO IV
4. RESULTADOS
Se realizó la compilación de los resultados, considerando que existieron dos
sustancias analizadas clorhexidina y timol evaluados en dos tiempos
diferentes, teniendo en cuenta que los resultados de los análisis
microbiológicos obtenidos fueron los del diámetro de un halo resultante de
la acción de las sustancias sobre cajas Petri donde se había cultivado
previamente Estreptococos mutans ATCC 35668. Esto quiere decir que
mientras mayor sea el diámetro del halo, el agente es más efectivo para
controlar el desarrollo de dicho microorganismo.
Para el análisis estadístico se empleó el programa estadístico SPSS, el
primer paso fue la realización de pruebas de normalidad con lo cual se
obtuvo que a las 24 horas la muestra proviene de una población con
distribución normal, mientras que a las 48 horas existen datos que indican
que la muestra no proviene de una población con distribución normal (tabla
1) es por ello que se realizaron la prueba T de student y prueba de Wilcoxon
para las 24 y 48 horas respectivamente.
41
Pruebas de normalidad
Tiempos
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Estadístico Gl Sig. Estadístico gl Sig.
24 horas
CLOREXIDINA
0,12% ,219 9 ,200* ,857 9 0,088
THIMOL 0,1% ,242 9 ,137 ,911 9 0,324
THIMOL 1% ,220 9 ,200* ,925 9 0,437
48 horas
CLOREXIDINA
0,12%
,396 9 ,000 ,684 9 0,001
THIMOL 0,1% ,356 9 ,002 ,655 9 0,000
THIMOL 1% ,217 9 ,200* ,919 9 0,383
Tabla 1. Prueba de normalidad.
Los datos fueron analizados mediante la prueba T de student para
determinar la existencia de diferencia estadísticamente significativa
evaluándose las sustancias en pares a las 24 horas, observándose
diferencia entre los grupos testados, entre la Clorhexidina 0,12% y Timol
0.1% se acepta que las medias de las muestras no fueron similares, se
obtuvo un (p=0,0) es decir la Clorhexidina 0,12% tiene la media mayor
42
que la muestra de Timol 0,1%, de igual manera al considerar la muestra
de Clorhexidina 0,12% y Timol 1% mediante la misma prueba se obtuvo
un p = 0,001 aceptando que las medias de las dos muestras no son
similares y que la clorhexidina es la que en este caso tiene la menor
medida, al considerar las muestras de Timol 0,1% y Timol 1% el mismo
test se encontró un p = 0,000 aceptando que las medias de las dos
muestras no son similares y que el Timol 0,1% es el cual tiene la menor
medida (tabla 2).
Prueba T student de muestras emparejadas
t gl Sig. (bilateral)
Par 1 CLOREXIDINA 0,12% - THIMOL
0,1%
9,314 8 0,000
Par 2 CLOREXIDINA 0,12% - THIMOL 1% -5,345 8 0,001
Par 3 THIMOL 0,1% - THIMOL 1% -10,901 8 0,000
Tabla 2. Prueba T de student a las 24 horas.
A las 48 horas la evaluación de las sustancias, se realizó mediante prueba
de Wilcoxon (tabla 3) cuyos resultados fueron un p = 0,006 al analizar las
muestras de Clorhexidina 0,12% y Timol 0,1% en el periodo de tiempo
antes mencionados aceptando que las muestras no son iguales y que la
43
clorhexidina tiene la medida mayor. De la misma forma, al considerar
Clorhexidina 0,12% y Timol 1% examinados y mediante la misma prueba
se encontró un p= 0,016 aceptando que las medias de las dos muestras no
son similares, pero en este caso la clorhexidina presenta la medida menor.
Finalmente, la muestra de Timol 0,1% y Timol 1% fueron evaluadas
también por la prueba de Wilcoxon, encontrando un p= 0,008 aceptando
con ello que las medias de las dos muestras no son similares y que el timol
en menor porcentaje tiene el menos valor.
Estadísticos de pruebaa
Par 1: THIMOL 0,1% -
CLORHEXIDINA 0,12%
Par 2: THIMOL 1% -
CLORHEXIDINA 0,12%
Par 3: THIMOL
1% - THIMOL
0,1%
Z -2,724 -2,410 -2,670
Sig. asintótica
(bilateral) 0,006 0,016 0,008
Tabla 3. Prueba de Wilcoxon a las 48 horas.
Por último, para la comparación de las muestras entre las 24 horas y las
48 horas se aplicó también la prueba Wilcoxon en la cual se muestra que
todas las medidas son diferentes (tabla 4), siendo estadísticamente mayor
los valores a las 48 horas la clorhexidina al 0,12% muestra un valor de
44
significancia de 0,007; El timol al 0,1% muestra (p=0,011), el timol al 1%
muestra un (p=0,005) es decir el efecto antimicrobiano a las 48 horas es
estadísticamente mejor en comparación de las 24 horas.
Tabla 4. Comparación de medias en los dos periodos
Puede decirse entonces que las concentraciones tanto a las 24 horas como
a las 48 horas permitieron obtener resultados estadísticamente diferentes
mejorando su efecto a las 48 horas. Se puede confirmar que el mayor
efecto inhibitorio se produjo para el timol en concentración de 1% seguida
por la sustancia control y el timol al 0,1%, afirmando que de emplearse
timol al 1% este tiene mayor efectividad sobre el Estreptococos mutas.
1,2000
1,4556
0,78670,9444
1,53331,7333
24 horas 48 horas 24 horas 48 horas 24 horas 48 horas
CLORHEXIDINA 0,12% TIMOL 0,1% TIMOL 1%
Comparacion de medias por periodos
45
4.1. Discusión
A lo largo de los últimos años el deseo de obtener de plantas y sus extractos
la sustancia idónea para controlar problemas bucales se ha incrementado
de manera vertiginosa es así que observamos estudios que incorporan el
timol como agente antibacteriano Muñoz A, Castañeda M, Blanco K (6) han
descrito las propiedades físicas, químicas así como la actividad
antibacteriana y antioxidante del timol. Mientras que estudios del timol en
concentración del 1% con gran potencial como agente antimicrobiano
contra bacterias gram positivas y en menor nivel sobre bacterias gram
negativas, sin embargo este estudio se realizó sobre bacterias que afectan
a alimentos (7), lo que coincide con nuestro estudio ya que los E. mutans
son cocos gram positivos, considerados como los responsables del inicio del
proceso carioso (13).
Dentro de las enfermedades bucales la caries es el más frecuentes (1) ,
debido a su multietiología: tiempo, huésped, dieta y microorganismo (13),
es por ello que deja en dificultad su control obligando a la necesidad de
utilizar agentes que permitan combatir los E. mutans que se han
constituido los microrganismos íntimamente ligados a los procesos cariosos
(32), mucho mejor si esta son de origen natural ya que de esta manera
podríamos evitar efectos adversos de sustancias como clorhexidina (33).
46
De ahí el propósito de esta investigación, el evaluar el efecto del timol con
relación a la clorhexidina para poder evitar así los efectos adversos como
pigmentación en dientes y restauraciones por un uso en periodos largos y
continuos (33) (34) considerando que el timol es una sustancia frecuentes
en distintos componentes desarrollados para el control de enfermedades
bucales principalmente barnices (9), los resultados de este estudio sin
embargo demostraron que el timol al 1% tuvo mejores resultados tanto a
las 24 como 48 horas lo que indicaría que la clorhexidina al 0.12% podría
ser reemplazado en los productos odontológicos cuyo propósito es la
prevención de caries.
En la literatura encontramos pocos estudios en los que el timol se haya
aplicado sobre E. mutans dentro de ellos Botelho M y et al (35) realizó un
estudio y llegó a la conclusión que las CIM=5mg/ml y CBM=10mg/ml sin
embargo ellos no lo comparan con la clorhexidina es por ello que se
consideró la búsqueda de una sustancia natural que pueda controlar estos
microrganismos, sobre todo considerando que pocos son los efectos
adversos reportados del empleo de aceites esenciales entre ellos tenemos
que no puede ser ingerido en embarazadas, ni personas alérgicas. (36)
La literatura menciona el efecto antimicrobiano de los aceites esenciales en
el control de patologías orales como el de Maraví G (37) revela como el
aceite esencial de orégano aplicado al 50% comprado con la clorhexidina
presenta mejores resultados la clorhexidina al 0,12% sin embargo al aplicar
47
al 100% obtuvieron mejores resultados que la clorhexidina al 0,12% y
ORTEGA E (38) quien aplica aceite esencial del tomillo y orégano al 10%
llegando a la conclusión que estos aceites esenciales en estas
concentraciones no tienen efecto inhibitorio sobre estreptococos mutans,
por otro lado en nuestro estudio se incorporó el componente que se
encuentra en mayor porcentaje en el aceite esencial tanto del orégano (35)
y el tomillo (12), se ha “demostrado que es el que otorga el efecto
antimicrobiano es por esto que se necesitan concentraciones menores para
obtener resultados similares.
Aun cuando los resultados del timol se mostraron superiores al de la
clorhexidina empleada como control, podemos afirmar que la búsqueda por
un componente de origen natural que pueda por sus propiedades cumplir
con el propósito que es controlar la presencia de cepas de Estreptococos
mutans en cavidad bucal se hace necesaria por lo que nuevos estudios y
metodologías requieren ser probadas evaluando si existen componentes
con mejores resultados que el timol y porque no, en un futuro cercano
encontrar una sustancia natural que sin efectos secundarios consiga actuar
como coadyuvante del timol en el control de la lesión cariosa en la población
más vulnerable.
48
CAPÍTULO V
5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
5.1. Conclusiones
Mediante pruebas de inhibición se concluyó que el timol al 1 % de
concentración obtuvo mejores efectos que la clorhexidina al 0.12% y al
timol al 0.1 % sobre cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668 tanto a
las 24 como 48 horas.
El efecto antimicrobiano del timol al 0.1% sobre cepas de
Estreptococos mutans ATCC 35668 es inferior en los dos tiempos evaluados
y en comparación al timol al 1% y a la clorhexidina empleada como control.
Se identificó que el efecto antimicrobiano del timol al 1% a las 48
horas fue superior que a las 24 horas.
La clorhexidina como control presento un mejor efecto inhibitorio
sobre cepas de Estreptococos mutans ATCC 35668 comparada con el timol
al 0.1 tanto 24 horas como a las 48 horas.
El efecto antimicrobiano del timol al 0.1% sobre cepas de
Estreptococos mutans ATCC 35668 es inferior en los dos tiempos evaluados
y en comparación al timol al 1% y a la clorhexidina empleada como control.
49
5.2. Recomendaciones
Se recomiendo continuar con este estudio evaluado concentraciones
mayores del timol sobre cepas de Estreptococos mutans tomando como
gold stand la clorhexidina.
Desarrollar una investigación del timol asociado a otras sustancias
provenientes de aceites esenciales para mirar si hay mejoras en su efecto
antimicrobiano.
Continuar con la investigación del timol y su efecto sobre cepas que
estén involucradas en enfermedades de la cavidad bucal.
50
BIBLIOGRAFÍA
1. Organizacion Mundial de la Salud. El problema mundial sobre la
enfermedades bucodentales. Ginegra: OMS; 2014.
2. Peréz Quiñones JA, Duque Riverón , Hidalgo Gato-Fuentes. Asociación
del Estreptococos mutans y lactobacilos con la caries dental en niños.
Revista Cubana estomatología. 2007 diciembre ; 44(4): p. 2-3.
3. Fejerskov O, Kidd E. Dental Caries: The Desease and its Clinical
Management. tercera ed. Fejerskov O, Kidd E, editors. Iowa: Blackwell;
2015.
4. Núñez , García L. Bioquímica de la caries dental. Revista Habanera de
Ciencias Médicas. 2010 junio ; 9(2).
5. Saavedra , Salazar , Jiménez JM, Quiñonez B, Quiñonez B, Salas E, et al.
Evaluación in vitro del efecto de extractos de aloe vera sobre
Streptococcus mutans. Acta Bioclínia. 2014 diciembre; 4(8): p. 6-8.
51
6. Muñoz A, Castañeda M, Blanco K. Composición y capacidad antioxidante
de especies aromáticas y medicinales con alto contenido de timol y
carvacrol. Scientia et Technica. 2007;: p. 125-128.
7. Jouki M, Tabatabaei F, Mortazavi S, Koocheki A. Quince seed mucilge
films incorporated with oregano essential oil: Physical, thermal, barrier,
antioxidant and antibacterial properties. Food Hydrocolloids. 20013;: p.
9-19.
8. Trombetta , Castelli F, Sarpietro MG, Venuti , Cristani , Daniele , et al.
Mechanisms of Antibacterial Action of Three Monoterpenes. Antimicrobial
agents and chemotherapy. 2005 june; 49(6): p. 2474-2478.
9. Conepcion García. Estudio a doble ciego aleatorio, sobre la prevención
quimioterapéutica de la caries dental con barnices de clorhedixina y timol
en niños de 5 a 8 años. 2004. Universidad Complutense de Madrid.
10. Miller , Cates R, Lawrence M, Fuentes A, Espinoza , Martinez J, et al. The
antibacterial and antifungal activity of essential oils extracted from.
Pharmaceutical biology. 2014 october; 53(4): p. 1-7.
52
11. Arcila , Loarca G, Lecona S, González. El orégano: propiedades,
composición y actividad biológica de sus componentes. Archivos
Latinoamericanos de Nutrición. 2004;: p. 100-111.
12. Borugă O, Jianu C, Mişcă C, Goleţ I, Gruia A, Horhat F. Thymus vulgaris
essential oil: chemical composition and antimicrobial activity. Journal of
Medicine and Life. 2014 july; 7(3).
13. Negroni. Microbiología Estomatológica. Fundamentos y guía práctica.
2nd ed. Buenos Aires : Médica Panamericana ; 2009.
14. Lanata J. Atlas de operatoria dental. In Lanata EJ. Atlas de operatoria
dental. Buenos Arires : Alfaomega; 2008. p. 3-7.
15. Garg N, Garg. Textbook of Operative Dentistry. 2nd ed. Garg N, Garg A,
editors. Panama : Jaypee; 2013.
16. Henostroza G. Caries dental. pricipios y procedimientos para el
diagnóstico. 1st ed. Henostroza G, editor. Lima : Universidad Peruana
Cayetano Heredia ; 2007.
53
17. Gómez de Ferraris , Campos A. Histoigía, embiología e ingenieria tisular
bucodental. 3rd ed. Gómez de Ferraris M, editor. Buenos Aires : Ed.
Médica Panamericana; 2009.
18. Rubio Martínez E, Cueto Suárez M, Suárez Feito R, Frieyro González J.
Técnicas de diagnóstico de la caries dental. Descripción, indicaciones y
valoración de su rendimiento. Revista de la Sociedad Boliviana de
Pediatría. 2006; 46.
19. Pérez. Es la caries dental una enfermedad infecciosa y transmisible.
Estomatológica Herediana. 2009 Agosto; 19(2).
20. Ojeda , Oviedo , Salas L. Streptococcus mutans y caries dental. CES
Odontología. 2013 ;: p. 44-56.
21. Gutiérrez S. Fundamentos de ciencias básicas aplicadas en odontología.
1st ed. Gutiérrez S, editor. Bogotá : Pontificia Universidad Javeriana ;
2006.
54
22. Rojas F. Algunas consideraciones sobre caries dental, fluoruros, su
metabolismo y mecanismos de acción. Acta Odontológica Venezolana.
2008; 46(4).
23. Kleryson F. Fitoterapia: una opción para el tratamiento odontológico.
Saude. 2010; 4(1).
24. Martínez S, Juárez R, Vila V, Hormaechea M. Relación entre la Salud
Bucal y la Concentración de Inmunoglobulina A Salival en Adolescentes.
Odontoestomatología. 2013 mayo; 15(21).
25. Ferreira F, Souza , Tavares , Francisco G. ResearchGate. [Online].; 2004
[cited 2016 noviembre 06. Available from:
https://www.researchgate.net/profile/Fabio_Perazzo/publication/23380
0574_Utilizacion_de_sustancias_naturales_en_Odontologaa/links/09e4
150ba045c60fee000000.pdf.
26. Calixto M. Plantas medicinales utilizadas en odontología. Kiru. 2006;
3(2).
27. Henao J, Muñoz , Padilla L, Ríos E. Extracción y caracterización del aceite
esencial de Lippia origanoides H.B.K. "Orégano de Monte" cultivado en
55
el Quindío y evaluación de la actividad antimicrobiana. Revista de
Investigación de la Universidad de Quindío. 2010;: p. 82-86.
28. Guerrero. Universidad Nacional de Colombia. [Online].; 2012 [cited 2016
noviembre 06. Available from:
http://www.bdigital.unal.edu.co/10842/1/7510002.2012.pdf.
29. Ortuño M. Manual práctico de aceites eseciales, aromas y perfumes. 1st
ed. Ortuño M, editor. España: Aiyana; 2006.
30. Sánchez M. Los aceites ecenciales. La perfecta medicina de la naturaleza.
1st ed. Sánchez M, editor. Bloomington: Ballboa Press; 2016.
31. Cáceres , Colorado , Salas , Muñoz , Hernández L. Actividad antifúngica
in vitro de estractos acuosos de especias contra Fusarium oxysporum,
Alternaria alternata, Geotrichum candidum, Trichoderma spp, Penicillum
digitatum y Aspergillus niger. Revista Mexicana de Fitopatología. 2013;:
p. 105-112.
32. Barrancos J. Operatoria Dental. 4th ed. Barrancos J, editor. Buenos
Aires: Editorial Medica Panamericana ; 2006.
56
33. Torres López M, Díaz Alvarez M, Acosta Morales. La clorhexidina, bases
estructurales y aplicaciones en; la estomatología. Gaceta médica
Espirituana. 2009;: p. 1 - 8.
34. Chimenos E. Antisépticos en medicina bucal: la clorhexidina.
Terapeútica. 2003 Enero ; LIX(1.458).
35. Botelho M, Nogueira N, Bastos G, Fonseca S, Matos F, Montenegro D.
Antimicrobial activity of the essential oil from Lippia sidoides, carvacrol
and thymol against oral pathogens. Brazilian Journal of Medical and
Biological Research. 2007 January; 40(3).
36. Rovetto G, Moreno N, Bolívar V, Calvo S, Suárez G, Justiniano , et al.
Aplicaciones medicinales del tomillo. Revista Universidad Cristiana de
Bolivia. 2010 junio; 1(2).
37. Maraví G. Biblioteca Nacional COP. [Online].; 2012 [cited 2016
noviembre 5. Available from:
http://www.cop.org.pe/bib/tesis/GISELLA%20GIOVANNA%20MARAVI
%20INGA.pdf.
57
38. Ortega Salazar. Repositorio Digital Universidad Central Del Ecuador.
[Online].; 2016 [cited 2016 noviembre 05. Available from:
http://www.dspace.uce.edu.ec/handle/25000/5706.
39. Iheozor , Worthington H, Walsh T, O’Malley L, Clarkson J, Macey R, et al.
Water fluoridation for the prevention of dental caries. The cochrane
Collaboration. 2015;: p. 1-5.
40. Liébana. Microbiología Oral. 2nd ed. Granada : McGraw-Hill; 2012.
41. Chaudhari L, Jawale B, Sharma S, Sharma H, Kulkarni P. Antimicrobial
Activity of Commercially Available Essential Oils Against Streptococcus
mutans. The journal of contemporary dental practice. 2012;: p. 71 - 74.
42. Gupta , Kumar A, Garg A, Catanzaro R, Marotta F. Comparative study of
cinnamon oil and clove oil on some oral microbiota. Acta Biomed. 2011;:
p. 197 - 199.
43. Castro R, Guzmán R, Giacaman R. Comparación de la concentración total
de proteínas salivales de adultos y adultos mayores. Revista clínica de
periodoncia, implantología y rehabilitación oral. 2012 abril; 5(1).
58
ANEXOS
Anexo 1. Certificados de autenticidad de la cepa Estreptococos Mutans (ATCC 35668).
59
Certificate of Analysis: Lyophilized Microorganism Specification and Performance Upon Release
© 2012 Microbiologics, Inc. All Rights Reserved. 200 Cooper Avenue North Saint Cloud, MN 56303 Page 1 of 1 DOC.286
Specifications
Microorganism Name: Streptococcus mutans
Catalog Number: 0969
Lot Number: 969-44
Reference Number: ATCC® 35668™*
Purity: < 0.1% Total Pellet CFU
Recovery: > 1000 CFUs per Pellet
Passage from Reference: 4
Expiration Date: 2017/9/30
Release Information:
Quality Control Technologist: Christine Condon
Release Date: 2015/11/18
Performance
Macroscopic Features: Medium:
Small, circular, white to translucent. SBAP
Microscopic Features: Method:
Gram positive cocci in medium or long chains. Gram Stain (1)
ID System: Vitek GP (1) Other Features/ Challenges: Results
(1) Catalase (3% Hydrogen Peroxide): negative
Brad Goskowicz, President
AUTHORIZED SIGNATURE
See attached ID System results document.
Disclaimer: The last digit(s) of the lot number appearing on the packing slip is merely a packaging event number. The lot number displayed on this certificate is the actual base
lot number. Note for Vitek®: Although the Vitek® panel uses many conventional tests, the unique environment of the card, combined with the short incubation period, may
produce results that differ from published results obtained by other methods.
Refer to the enclosed product insert for instructions, intended use and hazard/safety information. Individual products are traceable to a recognized culture collection. (*)The ATCC Licensed Derivative Emblem, the ATCC Licensed Derivative word mark and the ATCC catalog marks are trademarks of
ATCC. Microbiologics, Inc. is licensed to use these trademarks and to sell products derived from ATCC® cultures.
(1) These tests are accredited to ISO/IEC 17025:2005.
60
Anexo 2. Caldo BHI y las instrucciones del fabricante para su
preparación.
61
Anexo 3. Instrucciones de la empresa MEDIBAC para la activación de las
cepas Estreptococos mutans ATCC 35668.
62
Anexo 4. Tabla de las medias de los halos de inhibición en cm del
Estreptococos mutans a las 24 horas y 48 horas.
24 HORAS
REPETICIONES CLOREXIDINA
0,12%
TIMOL
0,1%
TIMOL 1%
CAJA 1 1,20 0,80 1,30
CAJA 1 1,00 0,65 1,50
CAJA 1 1,00 0,70 1,10
CAJA 2 1,00 0,80 1,50
CAJA 2 1,40 0,80 1,50
CAJA 2 1,30 0,85 1,80
CAJA 3 1,20 0,80 1,70
CAJA 3 1,40 0,78 1,80
CAJA 3 1,30 0,90 1,60
PROMEDIO 1,20 0,79 1,53
63
48 H0RAS
REPETICIONES CLOREXIDINA
0,12%
THIMOL 0,1% THIMOL 1%
CAJA 1 1,50 1,00 1,50
CAJA 1 1,50 0,90 1,70
CAJA 1 1,40 0,90 1,30
CAJA 2 1,30 1,00 1,70
CAJA 2 1,50 1,00 1,80
CAJA 2 1,50 1,00 1,90
CAJA 3 1,50 0,90 1,90
CAJA 3 1,50 0,90 2,00
CAJA 3 1,40 0,90 1,80
PROMEDIO 1,46 0,94 1,73
64
Anexo 5. Certificado del Laboratorio de Ciencia de Alimentos de la
Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí
Manta, 14 de noviembre del 2016
A quien corresponda:
Por medio de la presente certifico que la Srta. María José Erazo Guijarro
estudiante de la Universidad Central Del Ecuador realizó análisis en las
instalaciones del Laboratorio de Ciencia de Alimentos de la universidad
Laica Eloy Alfaro de Manabí, como parte de su trabajo titulado “Efecto
antimicrobiano del timol sobre cepas de Estreptococos mutans: Estudio in
vitro”. El timol utilizado fue donado a la Universidad Laica Eloy Alfaro de
Manabí Por la Universidad Pública de Navarra, España.
Atentamente,
Stalin Santacruz Ph.D.
Docente investigador
Universidad Laica Eloy Alfaro de Manabí
65
Anexo 6. Certificado de renuncia estadística
Quito, DM 8 de noviembre del 2016
A quien corresponda:
Yo, JAIME REINALDO MOLINA ARAUZ con C.I: 1709175275 por el presente
renuncio a todos los derechos de autor y propiedad intelectual relacionado
al trabajo estadístico, análisis de resultados, matriz o variables realizado
en el trabajo titulado “EFECTO ANTIMICROBIANO DEL TIMOL SOBRE CEPAS
DE ESTREPTOCOCOS MUTANS: ESTUDIO IN VITRO” de la Srita. María José
Erazo Guijarro, por lo tanto, puede hacer uso del presente como a bien
tuviere.
Atentamente:
_________________________
Ing. JAIME MOLINA ARAUZ
C.I: 1709175275
66
Anexo 7. Carta de Experiencia del Investigador
Quito, 25 de octubre del 2016
A quien corresponda:
Yo María José Erazo con C.I. 0604150573 certifico que es la primera vez
que realizo un proyecto de investigación, por lo tanto, tengo poca
experiencia en el desarrollo del mismo.
Atentamente,
___________________
María José Erazo Guijarro
Estudiante de la
Facultad de Odontología
67
Anexo 8. Carta de Experiencia del tutor de tesis
Quito, 25 de octubre del 2016
A quien corresponda:
Yo Ana Del Carmen Armas con C.I. 1710508571 por medio de la presente
carta declaro tener amplia experiencia como tutora en proyectos de
investigación, y a la vez me he desempeñado como docente desde el 2012
hasta la actualidad en la Facultad De Odontología además de haber formado
parte de algunos departamentos de investigación en diversas universidades
del país.
Atentamente,
Ana Del Carmen Armas
Docente de la
Facultad de Odontología
68
Anexo 9. Carta de declaración de conflictos
Quito, 25 de octubre del 2016
A quien corresponda:
Yo María José Erazo con C.I. 0604150573 declaro que en la investigación
titulada: “Efecto antimicrobiano del timol sobre cepas de Estreptococos
mutans: Estudio in vitro, no tengo ningún tipo de relación con la empresa
Medibac, y certifico que no existe ningún tipo de beneficio económico ni
personal en el desarrollo de esta investigación.
Atentamente,
_________________
María José Erazo Guijarro
Estudiante de la
Facultad de Odontología
