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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO AUTORA: BARRIGA GAIBOR KARLA MASSIEL TUTOR: DOCTOR ULLRICH RAINER STAHL, Ph.D QUITO 2016
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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE
QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN
TRABAJO DE TITULACIÓN, MODALIDAD PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO
AUTORA: BARRIGA GAIBOR KARLA MASSIEL
TUTOR: DOCTOR ULLRICH RAINER STAHL, Ph.D
QUITO
2016
ii
©DERECHOS DE AUTOR
Yo, Barriga Gaibor Karla Massiel en calidad de autor del trabajo de titulación,
modalidad de proyecto de investigación: “OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR
HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA
DE CAMARÓN”, autorizo a la Universidad Central del Ecuador hacer uso de todos los
contenidos que me pertenecen o parte de los que contiene esta obra, con fines
estrictamente académicos o de investigación.
Los derechos que como autor me corresponden, con excepción de la presente
autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los
artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su
Reglamento.
Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes junio de 2016
Firma:
Karla Massiel Barriga Gaibor
C.C.: 172057873-9
iii
APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Ullrich Rainer Stahl, en calidad de tutor del trabajo de titulación, modalidad de
trabajo de investigación, titulado “OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR
HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA
DE CAMARÓN”, elaborado por la estudiante KARLA MASSIEL BARRIGA
GAIBOR de la Carrera de Ingeniería Química, Facultad de Ingeniería Química de la
Universidad Central del Ecuador, considero que el mismo reúne los requisitos y méritos
necesarios en el campo metodológico y en el campo epistemológico, para ser sometido a
la evaluación por parte del jurado examinador que se designe, por lo que lo APRUEBO,
a fin de que el trabajo sea habilitado para continuar con el proceso de titulación
determinado por la Universidad Central del Ecuador
En la ciudad de Quito, a los 21 días del mes de junio de 2016
-----------------------------------------
Ullrich Rainer Stahl
C.C.: 1723190508
iv
DEDICATORIA
A José Barriga y Mercedes Gaibor
mis padres que con su dedicación,
esfuerzo y apoyo me han ayudado a
culminar una etapa importante de mi
vida.
A mi hermano Alexander que con sus
enojos, bromas y sobre todo cariño
da alegría y sentido cada día de mi
vida.
A cada uno de mis tíos que con sus
sabios consejos siempre estuvieron
presentes.
v
AGRADECIMIENTOS
A la Facultad de Ingeniería Química, por ayudarme a crecer como persona y
profesional, gracias a los conocimientos impartidos durante todos estos años de carrera
universitaria.
A mis padres, José y Mercedes que han estado en cada uno de mis triunfos y derrotas, y
que con su amor, paciencia, y ternura han logrado formar la persona que soy.
Al Doctor Ullrich Stahl por el apoyo y aporte para la mejor realización de este trabajo.
Al Ingeniero Carlos Guepud por su apoyo y consejos brindados en la ejecución de este
trabajo, y al Ingeniero don Lennin por ayudarme, apoyarme y hacerme reír siempre.
A Eliceo por el amor, paciencia, y apoyo que me ha dado durante todos estos años.
A cada uno de mis amigos por estar siempre cuando más los necesitaba, con su cariño y
apoyo, en especial a Erika Suarez por ser más que amiga es una verdadera hermana.
vi
CONTENIDO
Pág.
LISTA DE TABLAS ix
LISTA DE FIGURAS x
LISTA DE ANEXOS xi
RESUMEN xii
ABSTRACT xiii
INTRODUCCIÓN 1
1. MARCO TÓRICO 3
1.1. Problemática Ambiental 3
1.2. Camarón 3
1.2.1. Producción de camarón en el Ecuador 3
1.2.2. Características de los desechos de camarón 4
1.3. Quitina 5
1.3.1. Fuentes de obtención de la quitina 6
1.3.2. Propiedades físico químicas y características de la quitina 6
1.3.3. Obtención de quitina 6
1.4. Quitosano 7
1.4.1. Obtención de quitosano 8
1.4.2. Propiedades físico químicas y características del quitosano 8
1.5. Aplicaciones de la quitina y del quitosano 9
1.6. Glucosamina ( C6 H13NO5) 9
1.6.1. Obtención de glucosamina 10
1.6.2. Formas de glucosamina 11
1.6.3. Aplicaciones de glucosamina 12
vii
2. MARCO EXPERIMENTAL 13
2.1. Proceso experimental 13
2.1.1. Pre tratamiento de la materia prima 13
2.1.2. Obtención de quitina 13
2.1.3. Obtención de glucosamina 14
2.1.4. Determinación de glucosamina 14
2.2. Diseño experimental 14
2.3. Descripción del pre tratamiento de la materia prima 16
2.4. Descripción de la obtención de quitina 17
2.5. Descripción de obtención de glucosamina 17
2.6. Materiales y equipos 17
2.7. Sustancias y reactivos 18
2.8. Procedimiento 19
2.8.1. Procedimiento para el pre tratamiento de la materia prima 19
2.8.2. Procedimiento para la obtención de quitina 19
2.8.3. Procedimiento para la obtención de glucosamina 20
2.8.4. Procedimiento para la identificación química de azúcar reductor
con el reactivo de Fehling
20
2.8.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC 21
3. DATOS EXPERIMENTALES 22
3.1. Obtención de quitina 22
3.2. Obtención de glucosamina 22
3.3. Cuantificación de glucosamina por HPLC 23
4. CÁLCULOS 25
4.1. Rendimiento de quitina 25
4.2. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 25
4.3. Análisis estadístico 26
4.3.1. Cálculo de ANOVA para dos factores 26
4.3.2. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 28
5. RESULTADOS 30
5.1. Rendimiento de la quitina 30
viii
5.2. Identificación de la quitina mediante solubilidad en diferentes
soluciones
30
5.3. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 31
5.4. Identificación química de la glucosamina ( azucares reductores ) 32
5.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC 32
5.6. Análisis estadístico 34
5.6.1. Análisis estadístico para la determinación de glucosamina 35
5.7. Condiciones óptimas 37
5.7.1. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37
6. DISCUSIÓN 38
7. CONCLUSIONES 41
8. RECOMENDACIONES 43
CITAS BIBLIOGRÁGICAS 44
BIBLIOGRAFÍA 48
ANEXOS 49
ix
LISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Especies de camarones comerciales del Ecuador 4
Tabla 2. Propiedades físico químicas y características de la quitina 6
Tabla 3. Propiedades físico químicas y características del quitosano 8
Tabla 4. Aplicaciones de la quitina y quitosano 9
Tabla 5. Pesos de quitina obtenida 22
Tabla 6. Pesos de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 22
Tabla 7. Datos del estándar utilizado 23
Tabla 8. Datos del peso de la muestra de sólidos obtenidos mediante la
hidrólisis ácida de la quitina utilizado para el análisis en HPLC
24
Tabla 9. Codificación de los factores para el diseño estadístico 26
Tabla 10. ANOVA para el diseño factorial 3k 28
Tabla 11. Rendimiento de la quitina 30
Tabla 12. Solubilidad de la quitina en diferentes soluciones 30
Tabla 13. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida 31
Tabla 14.Cuantificación de glucosamina por HPLC 32
Tabla 15. ANOVA para la obtención de glucosamina 35
Tabla 16. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37
x
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Composición química de las cáscaras de camarón 5
Figura 2. Polímero no ramificado de N-acetil-D-glucosamina 5
Figura 3. Relación de estructuras entre la quitina, el quitosano y quitano 7
Figura 4. Estructura química de la glucosamina 10
Figura 5. Reacción química de la obtención de glucosamina 10
Figura 6. Obtención de glucosamina a partir de quitina 11
Figura 7. Diseño experimental 16
Figura 8. Diagrama de flujo de pre tratamiento de materia prima 16
Figura 9. Diagrama de flujo para la obtención de quitina 17
Figura 10. Diagrama de flujo para la obtención de glucosamina 17
Figura 11. Cálculos en Statgraphics 29
Figura 12. Reacción general del reactivo de Fehling con la glucosamina 32
Figura 13. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de
ácido clorhídrico (réplica 1) 33
Figura 14. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de
ácido clorhídrico (réplica 2) 33
Figura 15. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción
(réplica 1) 34
Figura 16. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción
(réplica 2) 34
Figura 17. Efectos principales para glucosamina 36
Figura 18. Interacción AB para la obtención de glucosamina 37
Figura 19. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina 37
xi
LISTA DE ANEXOS
Pág.
ANEXO A. Equipo de reacción para la obtención de quitina 50
ANEXO B. Equipo de reacción para la obtención de glucosamina 51
ANEXO C. Reacción de los sólidos obtenidos con el reactivo de Fehling 52
ANEXO D. Solubilidad de quitina en diferentes solventes 53
ANEXO E. Especificaciones de estándar de glucosamina 55
ANEXO F. Valores obtenidos de la cantidad de glucosamina 56
ANEXO G. Cromatogramas de glucosamina obtenida 66
xii
OBTENCIÓN DE GLUCOSAMINA POR HIDRÓLISIS ÁCIDA A PARTIR DE
QUITINA DERIVADA DE LA CÁSCARA DE CAMARÓN
RESUMEN
En esta propuesta de investigación se realizó la obtención de glucosamina por hidrólisis
ácida de la quitina derivada de la cáscara de camarón a nivel de laboratorio.
Se inició la experimentación con el pre tratamiento de la materia prima mediante el
lavado, secado y triturado, luego se procedió a la purificación de la quitina siguiendo el
protocolo de desproteinización, desmineralización y blanqueo. Seguidamente se realizó
la hidrólisis ácida de la misma en un equipo de reacción a una temperatura constate de
85°C, velocidad de agitación de 150 rpm y una relación de materia prima: solvente de
1:20. Se evaluó la obtención de glucosamina en función de las variables de
concentración de ácido clorhídrico: 4, 5 y 6 molar y tiempo de reacción: 60, 90 y 120
minutos.
Se realizó un estudio estadístico mediante el cual se determinaron las condiciones
óptimas del proceso, cuyos resultados fueron: el tiempo de reacción de 120 minutos y la
concentración de ácido clorhídrico 6 molar.
PALABRAS CLAVE: / CÁSCARA DE CAMARÓN / QUITINA/ HIDRÓLISIS
ÁCIDA / GLUCOSAMINA/
xiii
OBTAINING GLUCOSAMINA BY ACID HYDROLYSIS FROM CHITIN
DERIVED FROM PEEL SHRIMP
ABSTRACT
Obtaining at laboratory glucosamine by acid hydrolysis, from chitin derived from peel
shrimp.
It began experimenting with pretreatment of peel shrimp, by washing, drying and
grinding, and then proceed to the separation of chitin, following the deproteinization,
demineralization, and bleaching protocol. Following, it was made the acid hydrolysis
with hydrochloric acid at concentrations of 4, 5, and 6 molar, at different reaction times
of 60, 90 and 120 minutes and constant temperature 85 ° C, stirring speed of 150 rpm,
and the ratio was performed raw material: solvent 1:20.
Optimal conditions were determinate by Statgraphics software, whose results were:
reaction time of 120 minutes and hydrochloric acid concentration of 6 Molar.
KEYWORDS: / PEEL SHRIMP / CHITIN / ACID HYDROLYSIS/
GLUCOSAMINA/
1
INTRODUCCIÓN
La conservación del ecosistema en un mundo globalizado ha sido uno de los objetivos a
nivel industrial. Por este motivo se han contemplado la reutilización de diversas
materias, que han sido consideradas como un factor alto de contaminación ambiental.
El Ecuador es unos de los más grandes exportadores de camarón en el mundo con
alrededor de 30,000 toneladas con un ingreso económico de 170.000 dólares según el
reporte de la Cámara Nacional de Acuacultura para 2015. Esta actividad tiene el
inconveniente de presentar un elevado porcentaje de desechos, producto de una
industrialización. Por lo que es importante diseñar mecanismos para aprovechar estos
subproductos que están constituidos principalmente por el exoesqueleto, patas y cola del
camarón y los cuales son ricos en compuestos químicos que son aplicables para la
elaboración de diversos productos. Este es uno de los retos que se han planteado
muchos países a nivel mundial.
El exoesqueleto es el principal producto sólido del camarón, el cualesta constituido de
proteinas, minerales, carotenos y quitina, siendo esta ultima uno de los principales
componentes, que representa alrededor del 27 % en peso del caparazón, tomando en
consideración este porcentaje de quitina y que en su estructura principal esta compuesto
por unidades de N-acetilglucosamina, se propone determinar si es eficiente la obtención
de glucosamina apartir de una hidólisis ácida de la quitina derivada de los desechos del
camarón.
Según el Sistema de Información Nacional de Agricultura, Ganadería, Acuacultura y
Pesca (SINAGAP), el Ecuador ha realizado importaciones de alrededor de
1800productos de uso veterinario que contienen glucosamina, por lo cual mediante este
trabajo se busca determinar si los residuos de camarón nacional se pueden usar como
una fuente para la obtención de glucosamina, permitiendo de esta manera reducir el
2
costo de importación de las materias primas que son utilizadas en la industria
farmacéutica y además reducir el impacto ambiental que genera este tipo de desechos.
Al considerar a los desechos del camarón como una fuente de obtención de diversos
productos como la quitina, quitosano y alimento para animales, y tomando en cuenta
que este mercado se encuentra saturado, se ha generado la necesidad de buscar otras
alternativas de aprovechamiento de estos desechos. Por este motivo el presente trabajo
tiene como finalidad desarrollar diferentes experimentos a escala de laboratorio para la
obtención de glucosamina a partir de la quitina derivada de la cáscara de camarón
mediante una hidrólisis ácida.
Con estos antecedentes se fundamenta el uso de desechos del camarón en la obtención
de glucosamina, además de ayudar a disminuir los problemas medioambientales que
causa la inadecuada eliminación de estos desechos.
3
1. MARCO TEÓRICO
1.1. Problemática Ambiental
El Ecuador, al ser una plataforma rica en recursos pesqueros, puede incrementar la
economía de los pueblos dedicados a dichas actividades, así como también la de todo
un país, si estos recursos son explotados correctamente. [1]
La evolución de las industrias dedicadas a la extracción de especies acuáticas ha
generado un gran problema medio ambiental, sobre todo la industria camaronera, ya que
tras la extracción de la parte comestible de los crustáceos, se genera un residuo sólido
formado en su mayoría por los exoesqueletos. [2] En la actualidad, esos desechos son
descartados en basureros municipales y en otros casos directamente en los mares y ríos,
lo que origina un serio problema a nivel ambiental. [3]
1.2. Camarón
El Ecuador se ha convertido en uno de los exportadores y sobre todo productores más
importantes a nivel mundial de camarón, ya que cerca del 90% de esta producción se
deriva del cultivo en piscinas, y el restante es obtenido de manera artesanal en las aguas
del Océano Pacífico. Generando así esta industria camaronera uno de los rubros más
significativos para el país en la exportación de productos tradicionales que no sean de
origen petrolero. [4]
1.2.1. Producción de camarón en el Ecuador Según la Cámara Nacional de Acuacultura las
exportaciones de camarón ecuatoriano hasta diciembre del año 2015 fue de 65.455,247 libras,
las cuales generaron un ingreso económico para el país de alrededor de 170.000 dólares;
Originando en el Ecuador fuentes de empleo y de estabilidad económica, ya que esta industria
4
requiere de mano de obra, personal de apoyo, técnicos e investigadores que participan en cada
una de las etapas del proceso productivo del camarón.[5]
En el Ecuador existen cuatro especies predominantes para la producción y exportación
de camarón a nivel mundial, como se indica en la siguiente tabla 1:
Tabla 1. Especies de camarones comerciales del Ecuador [6]
Especies de Camarones Comerciales
Género Especie Nombre Común % de Producción
Litopenaeus
Vannamei Blanco
95 Occidentales
Stylirostris Azul
Farfantepenaeus Californiensis Café
5 Brevirostris Rojo
Solenocera Agazzissi /
Mutador Carapachudo
1.2.2. Características de los desechos de camarón Las cáscaras de camarón son
consideradas por muchos como un desecho orgánico y para otros como simple basura.
Pero estas presentan diferentes características tanto físicas como químicas.[7]Lo que les
da un aporte importante a nivel industrial, ya que son consideradas como fuentes de
materia prima renovable, debido a que en su estructura predomina un polímero formado
por unidades de N-acetil-D-glucosamina, que es un excelente principio activo para el
uso en farmacología y agroindustria. [8]
Morfológicamente el camarón consta de un 37,84% en peso de cefalotórax o cabeza y
de un 27,30% en peso de abdomen o cola. Cabe notar que el residuo generado por el
camarón depende del tipo de producto que se desee comercializar. [9]
a) Composición química de los residuos del camarón Por su composición química
los residuos de camarón son considerados como materia prima con un amplio
potencial industrial, principalmente por la quitina.
5
A continuación se indica en la figura 1 la composición química promedio de los
caparazones del camarón:
1.3. Quitina
La quitina es el segundo polisacárido más abundante después de la celulosa. Este
biopolímero está compuesto por unidades de N-acetil glucosamina que están unidas por
enlaces glicosídicos de la misma forma como las unidades de glucosa que
componen a la celulosa.
Se argumenta que el grado de desacetilación (DA) promedio de la quitina es de 66 %,
esto indica que una de cada tres unidades se encuentran desacetiladas [12]
27%
40%
30%
3%
Quitina
Proteínas
Carbonato de Calcio
Carotenos
Figura 1. Composición química de las cáscaras de camarón [10]
Figura 2. Polímero no ramificado de N-acetil-D-glucosamina [11]
6
1.3.1. Fuentes de obtención de la quitina La quitina se encuentra considerablemente
distribuida en la naturaleza, principalmente en el exoesqueleto de los artrópodos como
arácnidos, insectos, entre otros, y en los caparazones de los crustáceos como cangrejos
y camarones; siendo esta última la fuente más accesible ya que se encuentra disponible
en desperdicios de la industria marisquera.
Aparte de los artrópodos y de los crustáceos existen otras fuentes poco comunes de los
cuales también se puede extraer la quitina pero en menor proporción, como los hongos,
las algas, las levaduras, entre otros. [13]
1.3.2. Propiedades físico químicas y características de la quitina
Tabla 2. Propiedades físico químicas y características de la quitina [14]
QUITINA
PROPIEDADES CARACTERÍSTICAS
Blanca
Dura
Inelástica
No presenta solubilidad
en el agua y en
disolventes orgánicos.
Biodegradable
(lentamente)
Peso Molecular
Producto
Natural 10
6g/mol
Producto
Comercial
3-5 x 105
g/mol
Grado de Desacetilación 66 %
Contenido de Humedad 2-10 %
Contenido de cenizas < 2 %
Contenido de Nitrógeno 6-7 %
1.3.3. Obtención de quitina Aunque existen varios métodos de obtención de la quitina,
varios investigadores coinciden que es necesario la utilización de ácidos y bases.
En el caso de la obtención de la quitina a partir de los desechos de los crustáceos se
utiliza hidrólisis ácida para la desmineralización, y el uso de hidrólisis básica permite
que se rompa el enlace entra la proteína y la quitina.
7
La quitina obtenida se clasifica en función de su pureza y color, ya que si existen trazas
de proteínas o de pigmentos pueden causar problemas en sus aplicaciones
principalmente en productos biomédicos y farmacéuticos. Razón por la cual se debe
considerar que para la obtención de la quitina se debe adaptar diferentes procedimientos
según de la fuente de donde se extraiga y el uso que se le desee dar. [15]
1.4. Quitosano
La desacetilación completa de la quitina produce un compuesto llamado quitano el cual
es totalmente soluble en medio ácido, pero al tener una desacetilación incompleta de la
quitina, es decir que elimine al menos un 50 % de sus grupos acetilo, se genera un
material con distintas propiedades denominado quitosano.
El quitosano es un polisacárido llamado también chitosán, está compuesto por cadenas
distribuidas aleatoriamente de D-glucosamina, unidades de N-acetil-D-
glucosamina (unidad acetilada). [16]
El quitosano es un sólido amorfo que se obtiene de diferentes pesos moleculares y
grado de desacetilación, esto depende de las condiciones de reacción, que puede ser vía
química o enzimática. [17]
Figura 3. Relación de estructuras entre la quitina, el quitosano y quitano [18]
8
1.4.1. Obtención de quitosano El quitosano es obtenido comercialmente de los residuos
quitinosos, como por ejemplo de los desechos del camarón, cangrejo, langostino entre
otros cretáceos.
Para la obtención del quitosano existen dos alternativas que son: el proceso químico y el
proceso enzimático. El proceso químico consta de dos partes, la primera es la extracción
de la quitina, mediante una desmineralización y desproteinización de los desperdicios de
los crustáceos, y la segunda etapa es la desacetilación, mediante una hidrólisis de los
grupos acetoamidos para así obtener la conversión a quitosano, que presenta al menos
25 a 30 unidades menos de glucosamina que la quitina.
En el proceso enzimático la desacetilación de la quitina, se lo realiza mediante el uso de
enzimas desacetilasas. Estas enzimas catalizan la conversión de la quitina a quitosano
mediante una hidrólisis de los residuos de N-acetil glucosamina.[19]. A pesar de que
este proceso enzimático no es el más óptimo, presenta una ventaja importante, que es la
uniformidad en cuanto al grado de desacetilación y polimerización; a diferencia del
proceso químico se dan de manera aleatoria. [20]
1.4.2. Propiedades físico químicas y características del quitosano
Tabla 3. Propiedades físico químicas y características del quitosano[21]
QUITOSANO
PROPIEDADES CARACTERÍSTICAS
Blanco
Estructura cristalina
Inelástica
Poliamina lineal de alto
peso molecular.
Biocompatibilidad :
polímero natural no
toxico
Bioactividad
Peso Molecular
Producto
Natural
1,5x106
-
2,5x106
g/mol
Producto
Comercial 1-3 x 10
5 g/mol
Grado de Desacetilación 65 - 90%
Contenido de Humedad 2-10%
Contenido de cenizas < 2%
Contenido de Nitrógeno 7 - 8,5%
9
1.5. Aplicaciones de la quitina y del quitosano
Tabla 4. Aplicaciones de la quitina y quitosano [22]
Biopolimero Uso Propiedades
Aprovechadas
Quitosano
Películas para recubrimiento de
frutas, hojas, semillas y vegetales
Antimicrobiana y
fungicida
Clarificación de jugos de frutas Coagulante -
Floculante
Protección de Plantas Fungicida
Quitina
Liberación controlada de
agroquímicos
Formación de
hidrogeles
Formación de fibras aglutinantes en
el proceso de fabricación del papel. Biodegrabilidad
Eliminación de metales disueltos en
medios acuosos Tratamiento de agua
1.6. Glucosamina (C6H13NO5)
La glucosamina es un amino azúcar de origen natural que se encuentra presente en el
cartílago articular de los mamíferos, en una glucoproteína de la saliva que es la
mucina, paredes celulares de hongos, en el exoesqueleto de crustáceos y varios
artrópodos.
La estructura química de la glucosamina o el 2-amino-2-desoxi-D-glucosa o 2-amino-2-
desoxi-D-glucopiranosa, se indica en la figura 4
10
Figura 4. Estructura química de la glucosamina [23]
1.6.1. Obtención de glucosamina
a) Proceso químico La glucosamina al ser un monómero de la quitina se la puede
obtener mediante una hidrolisis ácida de la misma, en donde ocurre el rompimiento
del enlace glucosídico generando cantidades equimolares de ácido acético y de
glucosamina. En la figura siguiente se indica la hidrólisis de la quitina con ácido
clorhídrico para la obtención del monómero.
El ácido estándar más utilizado para hidrolizar la quitina es el ácido clorhídrico,
aunque existen otros tipos de experimentaciones en las cuales se ha trabajado con
otros ácidos como el ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico, ácido
fluorhídrico. Pero hay que considerar que la solución acuosa del último ácido
conduce a una hidrólisis parcial de la quitina a una temperatura de 20 °C después de
varias horas de reacción.
Además se está considerando la obtención del monómero de glucosamina con ácido
sulfúrico al 20 -80%, ya que al trabajar con este ácido se evita la utilización de
reactores revestidos de vidrio. [25]
1
Figura 5. Reacción química de la obtención de glucosamina [24]
11
Quitina Quitosano Desacetilación
Glucosamina acetilada
Glucosamina
De
spo
lime
riza
ció
n
Desacetilación H
idró
lisis
áci
da
Figura 6. Obtención de glucosamina a partir de quitina
b) Proceso enzimático La glucosamina también puede ser producida mediante una
hidrólisis enzimática de crustáceos,como ejemplo de ello se realizó en la Universidad
de British Columbia en el año 1996 un estudio en el cual indica que la hidrólisis
enzimática de la quitina con un conjunto de enzimas como las quitinolíticas,
quitinasa y chitobiase, se puede producir N-acetil-D-glucosamina, siendo este un
procedimiento eficaz y económico.[26]
Además en el año 2012 se publicó una patente sobre la producción de glucosamina a
partir de especies vegetales, en la cual se describe la utilización de un fertilizante a
base de nitrógeno, el cual actúa como precursor de glucosamina en plantas que
contiene un alto nivel de este monómero, en un porcentaje del 0,5 %, es decir 5
gramos por cada kilogramo de materia seca. [27]
Algunas compañías han planteado métodos para producir glucosamina a partir de una
fermentación con microorganismos que son modificados genéticamente. [28]
1.6.2. Formas de glucosamina La glucosamina puede transformarse en distintas
formas ya que es una base orgánica débil, como se detalla a continuación:
a) Sulfato de glucosamina El sulfato de glucosamina presenta una hidratación, debido
a que en estado puro es altamente higroscópico, por lo cual existe una disminución
de pH. Por estas propiedades que presenta la obtención del mismo exige que las
condiciones de extracción sean extremadamente controladas, y debe ser preservada
en un desecante.
12
b) Clorhidrato de glucosamina El clorhidrato de glucosamina es una variante de
glucosamina que se elabora generalmente de los desechos de crustáceos. Este tipo
de glucosamina se utiliza habitualmente para el dolor de las rodillas, glaucoma,
dolor de espalda y sobre todo para la osteoartritis. (Therapeutic Research Center)
Además a diferencia del sulfato de glucosamina, el clorhidrato de glucosamina es
mucho más estable y está disponible en forma altamente pura (>99%).[29]
c) Cocristales o coprecipitados de sulfato de glucosamina con cloruro de potasio o
sodio
d) Mezclas físicas de clorhidrato de glucosamina y disulfato de potasio y sodio
1.6.3. Aplicaciones de glucosamina Esta amino glucosa es un suplemento dietético
que se utiliza principalmente para:
El tratamiento de la inflamación o degradación de las articulaciones como por
ejemplo la artritis.
En la prevención de la degradación del cartílago mediante la inhibición de las
metaloproteasas.
En el mejoramiento de la sequedad de la piel ayudando en el aumento en el
contenido de humedad. Además ayuda a la suavidad o exención de arrugas de la
piel. [30]
El alivio del dolor y picazón que se produce por la inflamación de las venas
varicosas presentes en las piernas
El dolor que generan las lesiones en codos, rodillas, manos y caderas que es
originado por el ejercicio o por alguna actividad física realizada.
La glucosamina también presenta otros efectos terapéuticos, tales como antivirales,
anti-cáncerigeno, la reducción del colesterol entre otros.[31]
13
2. MARCO EXPERIMENTAL
2.1. Proceso experimental
Para la obtención de la quitina a partir de los residuos del camarón se siguieron las
siguientes etapas:
2.1.1. Pre tratamiento de la materia prima:
a) Lavado: Se realiza con la finalidad de eliminar todo tipo de impureza existente en
los desechos de camarón y así garantizar un alto rendimiento en el proceso.
b) Secado y Molienda: Se seca las cáscaras de camarón con ayuda de una estufa. Una
vez que las cáscaras estén libre de humedad; se realiza la molienda de cada una de
estas, con la finalidad de disminuir el tamaño de partícula, para así mejorar el
contacto de la materia prima con los reactivos que se van a utilizar en cada una de
las etapas.
2.1.2. Obtención de quitina
a) Desproteinización: se realiza con el propósito de retirar toda la proteína existente,
mediante la utilización de hidróxido de sodio a una determinada concentración,
tiempo de reacción y a un calentamiento constante.
b) Lavado 1: se ejecuta con la intención de eliminar todo el hidróxido de sodio
restante que contiene proteínas disueltas y llegar a un pH neutro.
c) Desmineralización: se realiza con la finalidad de eliminar todos los minerales que
contienen los desechos, entre ellos el predominante carbonato de calcio. Esto se
efectúa usando ácido clorhídrico a una determinada concentración y tiempo de
reacción.
14
d) Lavado 2: se ejecuta con la intención de eliminar todo el ácido clorhídrico restante
que contienen disueltos los minerales como el carbonato de calcio y llegar a un pH
neutro.
2.1.3. Obtención de glucosamina:
a) Mediante la utilización de ácido clorhídrico se realiza la despolimerización de la
quitina para obtener el monómero de glucosamina, para lo cual se varían diferentes
parámetros como el de concentración y tiempo de reacción, para determinar las
condiciones óptimas del proceso.
2.1.4. Determinación de glucosamina: permite cuantificar la cantidad de glucosamina
obtenida al final del proceso.
2.2. Diseño experimental
Para el diseño experimental se determinaron dos variables independientes (tiempo y
concentración de ácido clorhídrico) y una variable dependiente (cantidad de
glucosamina). Por lo cual, se escoge un diseño factorial 3k=3
2 obteniéndose nueve
tratamientos diferentes, para lo cual se ha considerado la realización de tres réplicas,
obteniendo un total de 27 tratamientos para la obtención de glucosamina.
Materia prima: se toma como base una cantidad de 7 g de materia prima. Este valor es
constante para todos los ensayos.
Relación materia prima – ácido clorhídrico: en el proceso de obtención de
glucosamina por hidrólisis ácida se empleó una relación 1:20.
Velocidad de agitación: la velocidad de agitación corresponde a 150 rpm, debido a que
esta velocidad no genera turbulencia ni puntos muertos en el recipiente de reacción.
Temperatura: corresponde a la temperatura de 85 °C y así generar la ruptura de las
cadenas del polímero de la quitina.
15
Concentración: Se determinó mediante una serie de pruebas preliminares,
comprobando mediante pruebas con el reactivo de Fehling la fragmentación de las
macromoléculas, obteniendo 3 niveles de concentración de ácido clorhídrico, que
corresponden a un nivel bajo, medio y alto.
Concentración 1: 4 molar.
Concentración 2: 5 molar.
Concentración 3: 6 molar.
Tiempo: Para el tiempo de la reacción de hidrólisis se ha tomado como referencia el
valor descrito en la patente US 6486307 “Preparación de clorhidrato de glucosamina”
t1: 60 minutos.
t2: 90 minutos.
t3: 120 minutos
Glucosamina: el contenido se determina para cada muestra mediante cromatografía
líquida de alta eficacia HPLC
G1, G2, G3: contenidos de glucosamina determinados para cada muestra.
16
Trabajo de
Titulación
Recolección de materia prima
( Cascara de Camarón)
Obtención de Quitina
Muestra de
Quitina con ácido
clorhídrico
C1
C2
C3
t11
t12
t13
t21
t22
t23
t31
t32
t33
G11
G12
G13
G11
G11
G11
G31
G32
G33
Figura 7. Diseño experimental
Donde:
C = concentración
t = tiempo de reacción
G= Cantidad de glucosamina obtenida
2.3. Descripción del pre tratamiento de la materia prima
Recolección de materia prima
( cáscara de camarón)
Molienda
Lavado Secado
H2O
Impurezas
T= 90 °C
t = 10 h
H2O
Cáscara de camarón
pretratada
Figura 8. Diagrama de flujo de pre tratamiento de materia prima
17
2.4. Descripción de la obtención de quitina
Desproteinización Lavado y Filtrado Desmineralización
BlanqueoLavado y filtradoSecado
NaOH
Residuos de
proteínas y
NaOH
H2O HCl
Lavado y Filtrado
H2O
Minerales
disueltos
en HCl
NaClOH2O
Pigmentos
destruidos,
NaOH
H2O
QUITINA
T = 65°C
t = 5 h
T = 65°C
t = 60 min
T = ambiente
t = 30 min
Cáscara de camarón
pretratadas
CO2
Figura 9. Diagrama de flujo para la obtención de quitina
2.5. Descripción de obtención de glucosamina
Reactor de reflujo Filtrado Cristalizado Filtrado
Secado
Quitina
HCl
Macromoléculas
disueltas en HCl
CH3CH2OH
CH3COOH
HCl
CH3CH2OH
t = 30 min
T= 5°C
T = 85°C
GLUCOSAMINA
T= 60 °C
t = 30 min
Figura 10. Diagrama de flujo para la obtención de glucosamina
2.6. Materiales y equipos
Vasos de precipitación V: 250 mL Ap. ± 50 mL
V: 200 mL Ap. ± 50 mL
18
2.7. Sustancias y reactivos
Hidróxido de sodio NaOH(s)
Ácido clorhídrico 36,5 p/v HCl(l)
Hipoclorito de sodio NaClO(l)
Agua destilada H2O(l)
Ácido Acético CH3COOH(l)
Probetas graduadas V:100 mL Ap.± 10 mL
Balones de destilación de dos bocas V: 500 mL
Balones aforados V: 1000 mL
V: 250 mL
Balón de destilación con 3 bocas V: 2000 mL
Agitador mecánico Rango: 250 – 2200 RPM
Marca: Heidolph
Balanza analítica Rango: 0-220 g Ap.: ± 0,0001 g
Campana de extracción Marca: Sematech Engineering
Plancha de calentamiento con agitación
magnética
Rango: 0 – 370 °C
Rango: 0 – 1500 RPM
Marca: Velp scientifica AM4
Molino SM 300
Marca: Retsch
Termómetro Rango: -20 – 110°C
Ap ± 0,5 °C
Condensador tipo serpentín Tamaño: 29/32
Tapones de caucho Varios
Estufa Marca: Memmert
Rango: 20°C -200°C
Mangueras de caucho
Reverbero Marca: Teckno
110 V-60 Hz- 1200 W
19
2.8.Procedimiento
2.8.1. Procedimiento para el pre tratamiento de la materia prima
Lavar las cáscaras de camarón con abundante agua potable y retirar cualquier tipo
de residuo carnoso que contenga.
Secar las cáscaras de camarón durante un tiempo aproximado de diez horas (10 h) a
una temperatura de 90 °C, con ayuda de una estufa.
Triturar las cáscaras de camarón en un molino SM 300 a un tamaño de partícula de
máximo 2 mm.
2.8.2. Procedimiento para la obtención de quitina
a) Desproteinización
Pesar 100 g de las cáscaras de camarón pre tratadas
Preparar una solución de hidróxido de sodio al 3,5% p/p
Colocar las cáscaras de camarón anteriormente pesadas en un balón de 2000 mL y
en una relación 1:10 con la solución de hidróxido de sodio y armar el equipo como
se indica en el ANEXO A
Controlar la temperatura de reacción a 65 °C; esta debe permanecer constante
durante todo el tiempo de reacción.
Ajustar la velocidad del agitador mecánico a 280 rpm y dejar reaccionar la mezcla
por un tiempo de 60 minutos.
Filtrar y lavar las cáscaras de camarón desproteinizadas con abundante agua potable
hasta obtener un pH aproximadamente de 7.
b) Desmineralización
Preparar una solución de ácido clorhídrico 1 M.
Colocar las cáscaras de camarón desproteinizadas en un balón de 2000 mL y en una
relación 1:15 con la solución de ácido clorhídrico.
Ajustar la velocidad del agitador mecánico en 280 rpm y dejar reaccionar la mezcla
por un tiempo de 30 minutos a temperatura ambiente.
Lavar las cáscaras de camarón desmineralizadas con abundante agua potable hasta
obtener un pH de aproximadamente de 7.
20
c) Blanqueamiento
Preparar una solución de hipoclorito de sodio 0,3% p/p
Colocar la quitina obtenida en un recipiente y adicionar la solución de hipoclorito
de sodio en una relación 1:20, por un tiempo de 20 minutos.
Lavar la quitina blanqueada con abundante agua, posteriormente filtrar y secar con
ayuda de una estufa a una temperatura de 60°C por 5 horas.
2.8.3. Procedimiento para la obtención de glucosamina
Pesar 7 g de la quitina obtenida.
Preparar una solución de ácido clorhídrico 4 M.
Colocar la quitina y la solución de ácido clorhídrico en un balón de 500 mL en una
relación 1:20 y armar el equipo como se indica en el ANEXO B, y con ayuda de
una plancha de calentamiento ajustar la temperatura a 85 °C.
Ajustar la agitación a 150 rpm y dejar reaccionar por un tiempo de 60 minutos.
Una vez transcurrido el tiempo de reacción proceder apagar la plancha de
calentamiento y filtrar, evitando eliminar la solución obtenida por el drenaje ya que
esta es un líquido corrosivo.
Cristalizar a 5 °C con etanol al 95% por 30 minutos y filtrar.
Dejar secar el sólido obtenido en una estufa a 60°C por 3 horas.
Realizar el procedimiento anterior para los tiempos de 90 y 120 minutos.
Repetir el procedimiento anteriormente descrito para las concentraciones de ácido
clorhídrico de 5 M y 6 M.
2.8.4. Procedimiento para la identificación química de azúcar reductor con el
Reactivo de Fehling.
Pesar 0,5 g de los sólidos obtenidos y colocar en un tubo de ensayo
Agregar 5 mL de la solución A y 5 mL de la solución B del reactivo de Fehling
Introducir el tubo de ensayo en el baño maría que esta aproximadamente a 70 °C
para dar comienzo a la reacción.
21
2.8.5. Cuantificación de glucosamina mediante HPLC
La cuantificación de la glucosamina se llevó a cabo en el laboratorio de Multianalityca
Cía. Ltda para lo cual utilizaron lo siguiente:
Tipo de columna: Luna 3 m C 18 con un tamaño de poro 100 °A
Tipo de elución: Isocrática
Elución A: Acetonitrilo
Elución B: H3PO4 0,1%
Elución isocrática es cuando se lleva a cabo con un disolvente o con una mezcla de
disolventes, en concentraciones constantes durante el tiempo de análisis.
Fase Móvil: A: 10
B: 90
Detección: UV- VIS 254 nm
Flujo: 0,5 mL/min
Tiempo de corrida: 10 min
22
3. DATOS EXPERIMENTALES
3.1. Obtención de quitina
Tabla 5. Pesos de quitina obtenida
Muestra 1 Peso Inicial Cáscaras
de Camarón, g
Peso Final Quitina
Obtenida, g
1
100
23,57
2 21,75
3 24,32
4 20,65
5 27,32
3.2. Obtención de glucosamina por el proceso de hidrólisis ácida
Para obtener el rendimiento de la hidrólisis de la quitina se toma como base 7 g de la
misma y utilizando el equipo de reflujo se consiguieron los siguientes resultados:
Tabla 6. Pesos de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida
Concentración, M Tiempo, min Peso Final, g
4
60
5,91
4,18
4,46
90
5,84
4,33
4,86
120
5,51
4,19
4,01
23
CONTINUACIÓN Tabla 6
Concentración, M Tiempo, min Peso Final, g
5
60
3,88
3,66
3,81
90
3,74
3,87
3,8
120
3,34
2,96
3,1
6
60
3,59
3,19
3,97
90
3,88
3,71
3,6
120
3,5
2,44
2,38
3.3. Cuantificación de glucosamina por HPLC
Las especificaciones del estándar de glucosamina sulfato de potasio ver ANEXOE
Datos proporcionados por Multianalityca Cía. Ltda.
Tabla 7. Datos del estándar utilizado
Estándar
Masa, g Pureza,%
0,1986 99
24
Tabla 8. Datos del peso de la muestra de sólidos obtenidos mediante la hidrólisis
ácida de la quitina utilizado para el análisis en HPLC
Concentración, M Tiempo, min Masa, g
Réplica 1 Réplica 2
4
60 0,11 0,08
90 0,15 0,08
120 0,13 0,12
5
60 0,18 0,10
90 0,17 0,25
120 0,18 0,26
6
60 0,28 0,08
90 0,19 0,45
120 0,13 0,043
25
4. CÁLCULOS
4.1. Rendimiento de quitina
Con base a los datos de la tabla 5, se calculó el rendimiento como un porcentaje de la
obtención de quitina, tomando como base de cálculo 100 g de cáscara de camarón.
(1)
Donde:
PQ = peso en gramos de la quitina obtenida
PC = peso en gramos de la cáscara de camarón
%R = porcentaje de rendimiento de la quitina
4.2. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida
En este punto se realiza el cálculo modelo del rendimiento de los sólidos obtenidos
después de la hidrólisis ácida de la quitina.
(2)
26
Donde:
PG = peso en gramos de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida.
PQ = peso en gramos de la quitina.
%RG = porcentaje de rendimiento de la glucosamina.
4.3. Análisis estadístico
Para el análisis estadístico se utilizó el programa STATGRAPHICS, a través del cual se
probó si las variables independientes tiempo y concentración de ácido clorhídrico
tienen influencia en la cantidad de glucosamina obtenida.
Tabla 9. Codificación de los factores para el diseño estadístico
Factor Notación
Concentración de ácido clorhídrico A
Tiempo de reacción B
Interacción concentración – tiempo AB
4.3.1. Cálculo de ANOVA para dos factores
En el modelo estadístico 32 estudiaron y analizaronlos efectos individuales de cada uno
de los factores y de la interacción entre la concentración – tiempo sobre la variable de
respuesta. Por lo tanto la hipótesis que se desea probar es:
HIPÓTESIS NULA
Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido
al efecto de la concentración de ácido clorhídrico existe (A).
Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido
al efecto del tiempo existe (B).
Ho = La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido
al efecto de la interacción de los dos factores existe (AB).
27
HIPÓTESIS ALTERNATIVA
Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al
efecto de la concentración de ácido clorhídrico no existe (A).
Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al
efecto del tiempo no existe (B).
Ha= La variación significativa en el valor de la concentración de glucosamina debido al
efecto de la interacción de los dos factores no existe (AB).
(3)
(4)
(5)
(6)
N = abn (7)
(8)
(9)
Donde:
= suma de todas las observaciones.
= suma de las observaciones del tratamiento i del factor A.
= suma de las observaciones del tratamiento i del factor B.
= suma global de todas las observaciones.
= suma de cuadrados totales.
= suma de cuadrados del efecto A.
28
= suma de cuadrados del efecto B.
= suma de cuadrados del error.
= total de observaciones del experimento.
= número réplicas.
= grados de libertad.
= cuadrados medios.
= estadístico de Fisher
Tabla 10. ANOVA para el diseño factorial 3k
FV SC GL CM Fo Valor - p
Efecto A
Efecto B
Efecto AB
Error
Total
4.3.2. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina
Para extraer información sobre el punto óptimo del proceso se utiliza una técnica
matemática que es la optimización.
Se empleó el programa estadístico STATGRAPHICS para determinar las condiciones
óptimas, utilizando la técnica de superficie de respuesta.
29
Figura 11. Cálculos en Statgraphics
30
5. RESULTADOS
5.1. Rendimiento de la quitina
En la siguiente tabla se muestran los valores del rendimiento de la quitina obtenida a
partir de las cáscaras de camarón.
Tabla 11. Rendimiento de la quitina.
Muestra 1
Peso Inicial
Cáscaras de
Camarón, g
Peso Final
Quitina
Obtenida, g
Rendimiento
De Quitina, %
Rendimiento
reportado, %
1
100
23,57 23,57
22,22
2 21,75 21,75
3 24,32 24,32
4 20,65 20,65
5 27,32 27,32
5.2. Identificación de la quitina mediante su solubilidad en diferentes soluciones
En la tabla 12 indica una prueba característica de la quitina que es la solubilidad en
diferentes solventes.
.
Tabla 12. Solubilidad de la quitina en diferentes soluciones
Muestra H2O CH3COOH
(10% p/v)
HCl
(3 M)
HCl
(Concentrado)
QUITINA Insoluble Insoluble Insoluble Soluble
Ver ANEXO D
31
5.3. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida
En la tabla siguiente se indica el rendimiento de los sólidos obtenidos después de la
hidrólisis ácida de la quitina.
Tabla 13. Rendimiento de sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida
Concentración, M Tiempo, min Rendimiento, %
4
60
84,46
59,78
63,76
90
83,49
61,98
69,54
120
78,81
59,88
57,31
5
60
55,48
52,38
54,51
90
53,43
55,33
54,35
120
47,75
42,32
44,31
6
60
51,33
45,68
56,84
90
55,54
53,11
51,46
120
50,00
34,97
34,07
32
+ Cu2O
2
+ 2 Cu2+
5.4. Identificación química de la glucosamina (azúcares reductores)
Se comprobó la presencia de glucosamina en las diferentes muestras obtenidas por
hidrólisis ácida de la quitina, ya que al reaccionar con el reactivo de Fehling durante
unos minutos y en un baño maría a una temperatura de 65 ° C, se tornó de un color rojo
indicando que existe una oxidación en medio alcalino, en el cual, el grupo carbonilo es
oxidado a grupo carboxilo. Dando una prueba positiva a la presencia del monosacárido
de forma lenta, esto dependió de las concentraciones de ácido clorhídrico del
compuesto de glucosamina que se encontraban en cada una de las muestras analizadas.
Ver ANEXO C
OH-
5.5. Cuantificación de glucosamina por HPLC
La cuantificación de glucosamina se realizó en un HPLC UV-VIS en Multianalityca
Cía. Ltda. Los valores obtenidos se detallan en la tabla 14
Tabla 14. Cuantificación de glucosamina por HPLC
Concentración, M Tiempo,
min
Glucosamina mg/100g Glucosamina g/100g
Réplica 1 Réplica 2 Réplica 1 Réplica 2
4
60 14291,38 14577,39 14,29 14,58
90 14080,98 14334,89 14,08 14,33
120 15793,47 15881,65 15,79 15,88
5
60 18955,94 18694,01 18,96 18,69
90 19132,02 19815,17 19,13 19,82
120 23597,94 23281,69 23,60 23,28
6
60 24724,95 24927,90 24,72 24,93
90 28442,48 28703,49 28,44 28,70
120 35334,03 35581,01 35,33 35,58
Figura 12. Reacción general del reactivo de Fehling con la glucosamina
33
En las figuras 13, 14 se representa la variación de la cantidad de glucosamina en
función de la concentración de ácido clorhídrico de cada muestra obtenida.
En las figuras 15,16 representa la variación de la cantidad de glucosamina en función
del tiempo de reacción de cada muestra obtenida.
Figura 13. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de ácido
clorhídrico (réplica 1)
Figura 14. Cantidad de glucosamina en función de la concentración de ácido
clorhídrico (réplica 2)
34
5.6. Análisis estadístico
El análisis de la varianza (ANOVA) es una potente herramienta estadística, que evalúa
la importancia de uno o más factores al comparar las medias de varias respuestas en los
diferentes niveles de los factores. Además es de gran importancia en la industria para el
control de diversos procesos, como por ejemplo en el laboratorio.
Figura15. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción
(réplica 1)
Figura16. Cantidad de glucosamina en función del tiempo de reacción
(réplica 2)
35
5.6.1. Análisis estadístico para la determinación de glucosamina
El análisis de varianza ANOVA es una técnica esencial en el estudio de datos
experimentales. La idea general de esta técnica es separar la variación total en las partes
con las que contribuye cada factor de variación en el experimento.
Para estudiar si las variables tiempo y concentración presentan una influencia específica
en la variable de respuesta, se efectúo el análisis de varianza ANOVA utilizando el
programa estadístico STATGRAPICS, por lo cual se tiene la siguiente tabla 15
Tabla 15. ANOVA para la obtención de glucosamina
Fuente Suma de
Cuadrados
G
L
Cuadrado
Medio Razón-F Valor-P
Valor
Crítico
de F
Efectos Principales
A: Concentración 667243023,7 2 333621511,8 6257,54 7,1E-15 4,256
B: Tiempo 100073546,4 2 50036773,18 938,51 3,6E-11 4,256
Interacciones
AB 44311742,37 4 11077935,59 207,782 7,4E-09 3,633
Residuos 479836,1283 9 53315,12536
Total ( Corregido) 812108148,6 17
La tabla 15 descompone la variabilidad del porcentaje de glucosamina en
contribuciones debidas a varios factores. La contribución de cada factor se mide
eliminando los efectos de los demás factores. Los valores-P prueban la significancia
estadística de cada uno de los factores.
El factor A correspondiente a la concentración de ácido clorhídrico, y el factor B que
corresponde al tiempo de reacción, así como los factores AB que corresponden a la
interacción de ambos, tienen un valor-P menor a 0,05, por lo tanto, se puede establecer
que son significativamente influyentes en la cantidad de glucosamina obtenida.
El estadístico de F obtenido del factor A y B y la interacción AB son mayores al F
crítico calculado a un nivel de confianza del 95%, por lo que se rechaza la hipótesis
36
nula y por lo tanto se acepta la hipótesis alternativa, por lo que el factor A tiene
influencia en la cantidad de glucosamina eliminando el efecto del factor B.
El factor B tiene influencia en la cantidad de glucosamina eliminando el efecto del
factor A y la interacción de los factores AB tiene una influencia significativa en la
cantidad de glucosamina obtenida.
La figura 17 muestra los efectos de manera individual de los factores de tiempo de
reacción y concentración para la obtención de glucosamina, donde el factor
concentración tiene mayor influencia que el tiempo de reacción en el contenido de
glucosamina obtenida.
En la figura 18 se aprecia que para los dos factores A y B, la variable de respuesta varia
en forma diferente.
Figura 17. Efectos principales para glucosamina
37
Figura 18. Interacción AB para la obtención de glucosamina
5.7.Condiciones óptimas
Las condiciones óptimas estimadas para la obtención de glucosamina se obtuvieron
mediante el programa estadístico STATGRAPHICS.
5.7.1. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina
Tabla 16. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina
Concentración
HCl, M
Tiempo,
min
Glucosamina,
mg/100g
Glucosamina,
g/100g
6 120 35581,01 35,58
Figura 19. Condiciones óptimas para la obtención de glucosamina
38
6. DISCUSIÓN
En el aislamiento de la quitina se logró obtener un rendimiento de 20,65 a 27,32%
como se indica la tabla 11 con respecto al peso de las cáscaras de camarón,
comparando con los resultados obtenidos en la tesis titulada “Obtención de
quitosano a partir de quitina para su empleo en conservación de frutillas y moras”
(Luna, 2012), donde se establece que el rendimiento de quitina corresponde al
22,22 %, determinándose así que los valores obtenidos en el presente trabajo son
aceptables, ya que presenta un porcentaje de error del 7,9 % con respecto al
rendimiento reportado en bibliografía. Además, la quitina obtenida cumple con las
siguientes características: soluble en HCL concentrado e insoluble en agua, ácido
acético y HCl 3 M, como se indica en el ANEXO D. Este análisis cualitativo
realizado al polímero obtenido se contrasta con los resultados presentados en la
bibliografía citada anteriormente, comprobando que la quitina cumple con la
característica de solubilidad.
El rendimiento de los sólidos obtenidos después de la hidrólisis ácida de la quitina
varía entre 34,07 %, a 84,46% como se indica en la tabla 13, obteniendo valores
altos de rendimientos para concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de
reacción bajos, debido a que, a estas condiciones no hay una hidrólisis completa, ya
que es posible tener una mezcla de productos como: N-acetil glucosamina,
glucosamina y ácido acético; por lo tanto, para lograr la ruptura de los enlaces -1,4
glicosídicos es necesario trabajar a condiciones altas de concentración, tiempo y
temperatura de reacción para lograr la completa despolimerización de la quitina.
Mediante un análisis cualitativo con el reactivo de Fehling se determinó los 3
niveles de concentración de ácido clorhídrico que se utilizaron para la hidrólisis de
la quitina, considerando el siguiente criterio: el cambio de color a rojo que
experimenta con cada una de las muestras al reaccionar con dicho reactivo. Esto se
39
evidencio con las muestras obtenidas con concentraciones de ácido de 4, 5 y 6
molar, indicando el poder reductor de este tipo de azúcar que proviene del grupo
carbonilo que es oxidado a grupo carboxilo; lo que no sucedió con las muestras
obtenidas con concentraciones de ácido clorhídrico de 1, 2 y 3 molar, ya que estas
al reaccionar con el reactivo de Fehling no experimentaron ningún cambio de color,
indicando que no existe un fraccionamiento de las macromoléculas de la quitina.
Los valores que se encuentra entre 14,29 a 35,33 g / 100 g de muestra corresponde
a la cantidad de glucosamina, los que varían en función de la concentración del
ácido clorhídrico y del tiempo de reacción, según las figuras 13, 14, 15 y 16 se
puede analizar que el contenido de glucosamina incrementa conforme aumenta la
concentración de ácido clorhídrico y el tiempo de reacción. Esto se debió a que
existe una mayor despolimerización de las macromoléculas de la quitina al
permanecer el ácido clorhídrico a alta concentración en contacto con el polímero
por tiempos de reacción prolongados, lo que permite obtener una glucosamina de
mayor pureza.
La determinación de la glucosamina obtenida se realizó en un HPLC con un
detector UV- VIS a 254 nm, confirmando la identificación a través de los picos
observados en los cromatogramas de las muestras hidrolizadas de la quitina, se
comparó el área del pico del estándar con el área de una de las muestras analizadas,
dando una área para el estándar de 858307,563 mv/ min y para la muestra de
329562,438 mv/ min, al realizar la cuantificación de los picos se determinó el
número de moléculas de glucosamina contenido en la muestra, por lo tanto, la
concentración de la misma. Este análisis cuantitativo está basado en el área del pico
del analito con la del estándar inyectado bajo las mismas condiciones
cromatográfícas, este análisis se realizó a cada una de las muestras, VER ANEXO
G.
Mediante el programa estadístico STATGRAPHICS, se determinaron las
condiciones óptimas del proceso para la obtención de glucosamina, obteniéndose
que las condiciones óptimas corresponden a 6 M de ácido clorhídrico y 120
minutos de reacción; siendo la concentración la variable que tiene mayor influencia
en el contenido de glucosamina como se observa en la figura 19 que cual se
40
determina la interacción tanto del tiempo de reacción como el de la concentración
de ácido clorhídrico sobre la variable de respuesta; por lo tanto, la concentración
presenta una mayor influencia sobre la cantidad de glucosamina obtenida, debido a
que en concentraciones altas existe una mayor hidrólisis y así la ruptura de los
enlaces -1,4 glicosídicos de las macromoléculas de la quitina.
Comparando las ventajas y desventajas del proceso químico con el enzimático, se
determinó que el primero tiene una considerable desventaja, debido a que se ocupa
mayor cantidad de insumos como: productos químicos considerados agresivos para
el medio ambiente y agua; mientras que, el proceso enzimático usa 50% menos de
agua, ya que aprovecha la humedad de los desechos de los crustáceos, y al no
utilizar químicos, permite obtener productos finales con menos impurezas; por otro
lado, la desventaja del proceso enzimático es que se debe controlar más variables de
operación como: pH, temperatura, porcentaje de encima, tiempo de incubación,
entre otros, las cuales no se controlan en el proceso químico; además, el tiempo de
hidrolisis de la quitina en mayor en el proceso enzimático.
41
7. CONCLUSIONES
Se logró la obtención de glucosamina por hidrólisis ácida a partir de la quitina
derivada de las cáscaras de camarón, obteniendo se entre 2,38 y 3,88 g de sólidos
obtenidos después de la hidrólisis, los que contienen entre 14,29 y 35,58 g de
glucosamina por cada 100 g de muestra analizada, estos últimos resultados se
obtuvieron mediante el análisis cuantitativo en un HPLC con detector UV-VIS.
En el proceso de laboratorio para la obtención de quitina se obtuvo rendimientos de
20,65 a 27,32%, lo que comparados con el contenido de quitina en las cáscaras de
camarón que corresponde al 27 %, nos permite determinar que el proceso empleado
es viable, ya que se está recuperando casi en su totalidad la quitina contenidas en
los desechos.
En el análisis cualitativo, al reaccionar cada muestra con el reactivo de Fehling, se
obtuvo un resultado positivo, el que se evidenció con el cambio de color a rojo
ladrillo, indicando el fraccionamiento de las macromoléculas, es decir la ruptura de
enlaces 1,4 glicosidicos de la quitina, al hacer reaccionar con las concentraciones
de 4, 5 y 6 molar de ácido clorhídrico.
Al llevar a cabo el análisis del contenido de glucosamina por HPLC, se pudo
confirmar que se establece una diferencia significativa en la cantidad obtenida de
glucosamina en cada una de las muestras. Esto debido a que a bajas
concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de reacción cortos existe una
hidrólisis incompleta, lo que no sucede a condiciones altas de concentración de
ácido clorhídrico y tiempo de reacción, en las que se presentan fraccionamiento de
las macromoléculas de la quitina.
42
Se determinó que para la ruptura de los enlaces 1,4 glicosidicos, es necesario
trabajar con concentraciones de ácido clorhídrico y tiempos de reacción altos, para
así obtener el monómero de la quitina, y además evitar que se presenten productos
no deseados.
La mayor cantidad de glucosamina fue obtenida a concentraciones de ácido
clorhídrico alto y tiempos elevados de reacción, debido a que, existe una
interacción entre estas dos variables, siendo la concentración de ácido clorhídrico
la que gobierna el proceso, ya que, presenta mayor influencia en la hidrólisis de las
macromoléculas de la quitina, como se indica en la figura 17.
Las condiciones óptimas para el proceso estimadas mediante el análisis estadístico
usando la técnica de superficie de respuesta correspondieron a 6 M de
concentración de ácido clorhídrico y un tiempo de reacción de 120 minutos,
obteniéndose 35,33 g de glucosamina por cada 100 g de muestra analizada en el
HPLC con detector UV-VIS.
43
8. RECOMENDACIONES
Antes de realizar la extracción de quitina, realizar la verificación de cada uno de los
exoesqueletos del camarón, ya que estos debes estar en buenas condiciones, es
decir, libres de cualquier olor que no sea el característico a mariscos, evitar la
descomposición de los mismos y tomar en cuenta que la textura debe ser
consistente, para así evitar algún tipo de interferencia en la calidad de la quitina.
Se sugiere que se realice un estudio para la extracción de colorante de las cascaras
de camarón ya que en su estructura presenta el colorante carotenoide que es la
astaxantina, el cual es usado como aditivo en los alimentos por su color
característico que es el naranja.
Se recomienda a las personas interesadas en el proceso de obtención de
glucosamina a partir de desechos de camarón, que se realice un estudio para la
extracción por vía enzimática, para así eliminar la producción de soluciones que
son contaminantes para el medio ambiente.
Se sugiere hacer un estudio sobre el proceso de obtención de glucosamina de otras
fuentes que no sean de mariscos, ya que existe un gran porcentaje de personas que
presentan algún tipo de alergia a este tipo de producto.
44
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[13] NIETO, Op. Cit., p. 30
[14] LUNA, Yadira. Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en
conservación de frutillas y moras. Trabajo de Grado. Ingeniera Química.
Universidad Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. pp. 24-25
[15] Ibid pp. 26-27
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[28] ALVAREZ, Helsy y BRACHO, Orlando. Obtención de glucosamina a partir de los
desechos del camarón. [En línea] Editorial Instituto Universitario Tecnológico
Alosos Gamero. 2011. P. 32 [Fecha de Recuperación: 01 Junio 2016] Disponible
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glucosamina-a-partir-de-los-desechos-del-camaron.
[29] Ibid. pp. 32-33
47
[30] PETIARD, V, MICHAUX, S. y COURTOIS, D. Producción de glucosamina a
partir de especies vegetales. 2376114, 09 Mar 2012, 17 Mar. 2016. 3p
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48
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desechos del camarón. [En línea] Editorial Instituto Universitario Tecnológico Alosos
Gamero. 2011. p. 29
LUNA, Yadira. Obtención de quitosano a partir de quitina para su empleo en
conservación de frutillas y moras. Trabajo de Grado. Ingeniera Química. Universidad
Central del Ecuador. Escuela de Ingeniería química. p. 23
49
ANEXOS
50
ANEXO A. Equipo para la obtención de la quitina
Figura A. 1. Equipo de reacción para la obtención de la quitina
51
ANEXO B. Equipo para la hidrólisis ácida de la quitina
Figura B.1. Equipo de reacción para hidrólisis ácida de la quitina
52
ANEXO C. Reacción de los sólidos obtenidos con el reactivo de Fehling
Figura C. 1. Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con
concentración de ácido 4 M
Figura C. 2. Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con
concentración de ácido 5 M
Figura C. 3.Reacción del reactivo de Fehling para sólidos obtenidos con
concentración de ácido 6 M
53
ANEXO D. Solubilidad de la quitina en diferentes solventes
Figura D. 1. Solubilidad de quitina en ácido acético
Figura D. 2. Solubilidad de la quitina en HCl concentrado
54
CONTINUACIÓN ANEXO D
Figura D. 3. Solubilidad de la quitina en agua
Figura D. 4. Solubilidad de la quitina en HCl 3 M
55
ANEXO E. Especificaciones de estándar de glucosamina
56
ANEXO F. Valores obtenidos de la cantidad de glucosamina
57
58
CONTINUACIÓN ANEXO F
CONTINUACIÓN ANEXO F
59
CONTINUACIÓN ANEXO F
60
CONTINUACIÓN ANEXO F
61
62
CONTINUACIÓN ANEXO F
CONTINUACIÓN ANEXO F
63
CONTINUACIÓN ANEXO F
64
65
CONTINUACIÓN ANEXO F
66
CONTINUACIÓN ANEXO F
67
ANEXO G Cromatogramas de glucosamina obtenida
Figura. G 1. . Cromatograma 4M – 2 horas (réplica 1)
Figura. G 2. Cromatograma 4M – 2 horas (réplica 2)
68
CONTINUACIÓN ANEXO G
Figura. G 3.Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 1)
Figura. G 4.Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 2)
69
CONTINUACIÓN ANEXO G
Figura. G 5. Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 1)
Figura. G 6. Cromatograma 4M – 1 hora (réplica 2)
CONTINUACIÓN ANEXO G
70
Figura. G 7. Cromatograma 6M – 2 horas (réplica 1)
CONTINUACIÓN ANEXO G
Figura. G 8. Cromatograma 6M – 2 horas (réplica 2)
71
Figura. G 9.Cromatograma 5M – 1 horas (réplica 1)
CONTINUACIÓN ANEXO G
Figura. G 10.Cromatograma 5M – 1 horas (réplica 2)
72
Figura. G 11. Cromatograma 5M – 2 horas (réplica 2)
CONTINUACIÓN ANEXO G
Figura. G 12. Cromatograma 5M – 2 horas (réplica 1)
73
Figura. G 13. Cromatograma 5M – 1:30horas (réplica 1)
Figura. G 14. Cromatograma 5M – 1:30horas (réplica 2)
CONTINUACIÓN ANEXO G
74
Figura. G 15. Cromatograma 6M – 1:30 horas (réplica 1)
Figura. G 16. Cromatograma 6M – 1:30 horas (réplica 1)
CONTINUACIÓN ANEXO G
75
Figura. G 17. Cromatograma 6M – 1:00 hora (réplica 1)
Figura. G 18. Cromatograma 6M – 1:00 hora (réplica 2)
