UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA

UNIDAD IZTAPALAPA

DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD

,/' ,, /

CARACTERIZACION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS

DE LEYDIG Y SERTOLI DE RATAS ADULTAS NORMALES

TESIS QUE I?RESENTA EL

BIOL. ENRIQUE M:ENDIETA MARQUEZ

PARA OBTENER. EL GRADO DE 1 "" .

MAESTRO EN BIOLClGIA EXPERIMENTAL

DICIEMBRE 1992

1 2 6 3 8 7 L ;-.Este trabajo experimental fue realizado en el Laboratorio de

L"iAndrología, Subjefatura de Investigación del Instituto Mexicano del

Seguro Social y en el Laboratorio de Mecanismos de Regulación i

Testicular, Departamento de Ciencias de la Salud, Universidad

Autónoma Metropolitana - Iztapalapa.

Este trabajo fue financiado parcialmente por PRONAES a través del

convenio C88-03-0049, y por DGICSA mediante el convenio C90-01-

0283.

La Maestría en Biología Experimental se encuentra registrada dentro

del Padrón de Excelencia de Programas de Posgrado del CONACYT, y es

financiada por éste a través del Convenio PFPN/66/91.

I

Dedico este trabajo a todos aquéllos que de una u otra manera me impulsaron a culminar la labor que se ve plasmada en esta tesis.

A mi familia, con todo el cariño que no es fácil expresar en palabras, pero que siempre está presente. Ellos han sitio la razón de mi esfuerzo y la fuente de mi inspiración.

A mis asesores, con gratitud, ya que sus valiosos comentarios y críticas me ayudaron a conjuntar mis ideas y a exponerlas de una forma más clara y precisa.

A mis compañeros, por su insistencia constante en lograr que terminara por fin con esta parte de mi formación.

y por último, aunque no al final, a todos mis amigos, quienes han demostrado que confían en mí y que me aceptan como soy.

GRACIAS.

INDICE

1. INTRODUCCION 1

1.1. ANATOMIA DEL APARATO REPRODUCTOR MASCULINO

1.2. ANATOMIA TESTICULAR

1.2.1. Túbulos Seminiferos

1.2.2. Espermatogknesis

1.2.3. Células de Sertoli

1.2.4. Compartimiento intersticial

1.3. FISIOLOGIA TESTICULAR

1.3.1. Eje hipotálamo-hipófisis- testículo

1.3.2. Regulación funcional de las células de Leydig

1.3.2.1. Vías esteroidogénicas

1.3.3. Regulación funcional de las células de Sertoli

1.3.4. Mecanismos intratesticulares de regulación

1.3.4.1. Interacciones células de Sertoli-células de la línea germinal

1.3.4.2. Interacciones células de Sertoli-células peritubulares

1.3.4.3. Interacciones células de Sertoli-células de Leydig

1.4. MODELOS DE ESTUDIO: OBTENCION DE FRACCIONES CELULARES ENRIQUECIDAS

2

4

5

7

9

13

15

15

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19

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25

25

28

29

31

". .

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 34

3. HIPOTESIS DE TRABAJO

4. OBJETIVOS

5. MATERIAL Y METODOS

5.1. OBTENCION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS

5.2. ENSAYO DE PROTEINAS UNIDORAS

5.3. EVALUACION DE LA :2STEROIDOGENESIS

5.4. SEPARACION Y CUANTIFICACION DE LOS ESTEROIDES

5.5. DETERMINACION CUANTITATIVA DE LOS ESTEROIDES

6. RESULTADOS

6.1. OBTENCION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS

6.2. CARACTERIZACION DE PROTEINAS UNIDORAS

6.3. ESTEROIDOGENESIS EN FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CIELULAS DE LEYDIG

6.4. ESTEROIDOGENESIS EN FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE SERTOLI

7. DISCUSION

7.1. ANALISIS DE LOS RESULTADOS DE LA OBTENCION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN COMPARACION CON DIVERSAS METODOLOGIAS PREVIAMENTE REPORTADAS

7.2. PRESENCIA DE PROTEINAS UNIDORAS DE ESTEROIDES EN LAS FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE LEYDIG Y CELULAS DE SERTOLI

7.2.1. Receptores de andrógenos

7.2.2. Receptores de estrógenos

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61

64

7.2.3. Receptores de progestágenos

7.3. PATRONES ESTEROIDOGENICOS EN LAS FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE LEYDIG Y CELULAS DE SERTOLI

7.3.1. Fracción intersticial

7.3.2. Fracción tubular

8. CONCLUSIONES

9. BIBLIOGRAFIA

67

68

68

74

7 8

8 0

1

1. INTRODUCCION.

Durante mucho tiempo fue posible obtener información acerca del

funcionamiento del aparato reproductor masculino a través de la

utilización de metodologías que medían sus productos secretados

(espermatozoides y andrógenos) en medios externos a los órganos que

los componen. Conforme la naturaleza de los mecanismos

extragonadales de regulación fue mejor conocida, la utilización de

modelos diferentes de estudio se convirtió en una necesidad.

El desarrollo de técnicas de separación celular y de métodos más

sensibles de medición de la concentración de diferentes hormonas,

que permitieran la cuantificación in situ o en cantidades muy

pequeñas de tejido ha tenido un gran impacto en los niveles de

comprensión de la función testicular en los últimos años.

Para lograr conocer la respuesta específica de una estirpe celular

definida a la presencia de algún factor regulador, un modelo

experimental muy útil sería aquél que permitiera evaluar esta

respuesta en forma aislada a otros factores que pudieran estar

presentes en el tejido.

Para obtener a una estirpe celular en un grado confiable de pureza

y en un estado funcional adecuado, es necesario recurrir a

procedimientos mecánicos y/o enzimáticos, seguidos en ocasiones de

la utilización de diversas técnicas de centrifugación y de la

2

utilización de gradientes de densidad.

La edad y el estado funcional d.el animal a partir del cual se

obtendrán las estirpes celulares son factores que afectan

profundamente tanto el rendimiento y la pureza de las fracciones

separadas como el valor predictivo de los planteamientos

experimentales que las utilizan.

En vista de lo mencionado anteriormente, el interés de este trabajo

se centra en la validación de un esquema de obtención de fracciones

enriquecidas en células de Leydig y Sertoli de rata adulta normal,

que les permita mantener su integridad funcional durante

incubaciones a tiempos cortos así como servir de modelo para el

estudio in vitro de la fisiología testicular.

1.1. ANATOMIA DEL APARATO REPRODUCTOR MASCULINO.

El aparato reproductor masculino puede ser dividido en 4

principales componentes funcionales (1):

a. Los testículos o gónadas masc:ulinas, que son órganos pareados

ubicados en el interior del saco escrotal, y que son responsables

de la producción de los gametos masculinos (espermatozoides), así

como de la secreción de las hormonas sexuales,

.. .

3

b. Un sistema pareado de ductos, consistente en ductos eferentes,

epidídimos, ductos deferentes y ductos eyaculadores, l o s cuales

colectan, almacenan y conducen a los espermatozoides hacia el

exterior de cada testículo. Los ductos eyaculadores convergen en la

uretra, a partir de la cual los espermatozoides son expulsados

hacia el exterior del organismo,

c. Un par de glándulas exocri.nas (vesículas seminales) , una

glándula prostática y un par de glándulas bulbouretrales accesorias

(glándulas de Cowper), las cuales secretan un medio nutritivo y

lubricante llamado fluido seminal., que permite la supervivencia de

los espermatozoides durante su traslado al aparato reproductor

femenino, y

d. Un órgano de copulación (pene) .

Durante el desarrollo embrionario, cada testículo, junto con la

primera parte de su sistema de ductos, vasos sanguíneos, linfáticos

y nervios, desciende desde la pared posterior de la cavidad

peritoneal hacia el interior del escroto. Durante la migración, el

testículo acarrea con él una capa periférica de peritoneo, de forma

tal que en el interior del escroto, el testículo se encuentra casi

totalmente rodeado de una cavidad serosa que es una extensión de la

cavidad peritoneal y que se encuentra limitada por la llamada

túnica vaginalis.

4

1.2. ANATOMIA TESTICULAR.

El testículo es una glándula tubular compuesta, rodeada por ~. una

gruesa capa fibrosa llamada túnica albuginea. En la cara posterior

del órgano, un engrosamiento de tejido conjuntivo penetra en la

glándula y forma el mediastino. Unos delgados tabiques fibrosos

(septula testis) se extienden radialmente a partir del mediastino

hacia la túnica albuginea, y dividen al órgano en unos 200

compartimientos piramidales llamados lobulillos ( 2 ) . Cada lobulillo

está constituido por uno o más túbulos seminiferos, de una longitud

total de 30 a 60 cm. Estos túbu:tos contorneados convergen en el

mediastino, donde siguen un trayecto rectilíneo (túbulos rectos) y

se anastomosan para formar la rete testis, la cual a su vez

desemboca en los conductos eferentes, y eventualmente en la cabeza

del epidídimo.

Los túbulos seminiferos constituyen la porción exocrina del

testículo, que se ve ref lejada en su función gametogénica o de

formación de gametos maduros a partir de las células componentes de

su epitelio germinal, que es auxiliada por las células de sostén o

células de Sertoli (CS) que se encuentran formando la periferia de

los túbulos.

El tejido conectivo intertubular contiene grupos de células

poligonales de gran tamaño (célulaas de Leydig) (CL) que constituyen

el componente endocrino del testículo, y que son por lo tanto

5

responsables de la aparición y mantenimiento de las características

sexuales secundarias normales así como del comportamiento

típicamente masculino ( 3 ) .

Los testículos se encuentran irrigados por una arteria que penetra

por el hilio, continúa hacia el mediastino y se ramifica por la

cara interna de la túnica albuginea, mientras que otras ramas se

subdividen en arteriolas al interior de la glándula y se ramifican

en un capilar que rodea a l o s túbulos que irrigan; un sistema

colector venoso recoge la sangre y sus troncos son paralelos a las

arterias.

La innervación de las gónadas masculinas proviene de la cadena

simpática lumbar a través de fibras que innervan a los vasos

sanguíneos. Existen asimismo, terminaciones sensoriales por debajo

de la túnica albuginea y nervios vasomotores que penetran al

testículo (4).

1.2.1. Túbulos seminiferos.

Los túbulos seminíferos 'están constituidos por un complejo epitelio

estratificado constituido por dos; categorías celulares principales:

las CS y las células de la linea germinal. La apariencia que

presentan los túbulos en las di.ferentes etapas de la vida de un

animal depende fundamentalmente de los diversos grados de

diferenciación que presentan las células de la línea germinal, los

""

6

cuales se engloban dentro del proceso llamado espermatogénesis, el

cual es el responsable de la formación de los gametos maduros y

funcionales.

Cada túbulo se halla recubierb por una capa basal de tejido

conectivo laminar que contiene fibras elásticas y células

epitelioides aplanadas, cuya organización varía de acuerdo a la

especie de que se trate (2). En 1.0s roedores hay una capa única de

células aplanadas y poligonales que se unen borde con borde para

formar una lámina epitelioide continua que rodea al túbulo, y que

presentan una apariencia semejant.e a las de las células musculares,

por lo que se les ha denominado células mioides o peritubulares.

Se cree que las células peritubulares son las responsables de las

contracciones rítmicas y que, aunque poco fuertes, se observan en

los túbulos seminíferos de algunas especies de mamíferos (5).

En el caso del humano, el complejo peritubular se extiende desde la

membrana basal del túbulo hacia el tejido circundante, y consiste

de dos capas alternas de fibras de colágena y células mioides entre

las cuales pueden encontrarse capas delgadas de microfibrillas y

material semejante al de la membrana basal ( 6 ) . En casos de

infertilidad masculina se ha observado una conspicua

desorganización de la estructura. peritubular, detectable mediante

cortes histológicos seriados (5).

7

1.2.2. Espermatogénesis.

La espermatogénesis puede dividirse en 3 fases: a) una primera

durante la cual se producen espermatocitos como resultado de las

divisiones mitóticas de las espermatogonias; b) una segunda en la

cual la división meiótica de los espermatocitos genera cuatro

espermátides, y c) una última en la cual los espermatozoides se

forman como resultado de la metamorfosis de las espermátides a

través de un proceso denominado espermiogénesis ( 7 ) .

Existen diversas características del proceso espermatogénico que

son particulares de las diferentes especies, tales como las etapas

en que éste puede ser dividido y la duración de cada una de ellas.

Por otra parte, muchas Ivcélulas madrevv entran simultáneamente a una

línea de diferenciación sincrónica, por lo que múltiples

generaciones gaméticas evolucionan de forma paralela.

El epitelio seminífero se encuentra compuesto por 5-6 generaciones

de células germinales que no s e distribuyen al azar, sino que

forman asociaciones celulares de composición definida (8). Estos

agrupamientos representan etapas del ciclo del epitelio seminífero

definidas como series completas de asociaciones celulares sucesivas

que aparecen en un área cualquiera.

El número de etapas que comprende el ciclo varía, como ya se ha

mencionado, de acuerdo a la especie y a los criterios de

8

clasificación utilizados. La duración del ciclo ha sido determinada

en diversos mamíferos mediante la autorradiografía después de la

inyección de trazadores radiactivos (9) . Los valores obtenidos que oscilan entre 52-53 días (rata) y 64 días (hombre) son constantes

aún a nivel de la cepa particular en animales de laboratorio (7).

Las espermatogonias o células germinales se encuentran en la capa

basal del epitelio seminífero donde se dividen a través de mitosis

para dar lugar a otras espermatogonias (Tipo A) , y a

espermatogonias que proseguirán hacia meiosis (Tipo B). Las

espermatogonias tipo A se caracterizan por la presencia de un

núcleo grande, esférico o elíptico con una cromatina moderadamente

condensada, mientras que las de tipo B tienen un núcleo más pálido,

con nucleolos localizados en el (centro de la célula ( 3 ) .

Las espermatogonias tipo B al dividirse dan origen a los

espermatocitos primarios, fácilmente reconocibles por su gran

cantidad de citoplasma y núcleo conspicuo con cromatina condensada

en forma de hebras delgadas (10). La primera división meiótica se

lleva a cabo con relativa rapidez, generando a l o s espermatocitos

secundarios, y posteriormente a las espermátides, células que ya

poseen un complemento génico haploide.

En cada una de las espermátides ocurre un conjunto de

transformaciones que constituyen la espermiogénesis, consistentes

en la reducción y condensación de su núcleo, la pérdida de

9

prácticamente todo su citoplasma y la aparición del complejo

acrosomal y del flagelo, además de: una serie de cambios bioquimicos

que le permiten asumir la apariencia de un espermatozoide maduro.

Después de su diferenciación, los espermatozoides son liberados de

su contacto intimo con l o s elementos de sostén y se dirigen hacia

la luz de los túbulos seminíferos. De aquí en adelante adquieren

gradualmente su madurez funcional a través de una serie de procesos

de activación que preceden a la fertilización.

1.2.3. C é l u l a s de Sertoli.

Las CS se encuentran apoyadas en la membrana basal de l o s túbulos

seminiferos, y su citoplasma se extiende hacia la luz del túbulo,

ocupando todos los espacios libres entre las células de la línea

germinal (1). Debido a su intima asociación con estas células, se

ha postulado que funcionan como I1nodrizas1l, proporcionando soporte

estructural y metabólico para el desarrollo y diferenciación de las

células espermatogénicas (11).

El citoplasma de estas células contiene abundante retículo

endoplásmico tanto liso como rugoso; sus mitocondrias son largas y

delgadas, con crestas tubulares transversales. El aparato de Golgi

consiste en elementos múltiples dispersos, y sus estructuras

lisosomales parecen ayudar a la digestión de las células germinales

en degeneración y cuerpos residua.les liberados por las espermátides

10

durante la espermiación (12). Es posible encontrar también dentro

del citoplasma numerosas inclusiones, como p.ej., gotas lipídicas,

y en algunas especies como en el hombre, varios cristales

( c r i s t a l o i d e s de Charcot-Botcher) y diversos tipos de vesículas

(11) -

Las características nucleares incluyen una membrana nuclear

invaginada, un nucleoplasma relat.ivamente homogéneo, y un nucleolo

Único dividido en 3 partes, que aparece al microscopio electrónico

como una estructura reticular acompañada de 2 regiones

electrodensas pequeñas -compuestas de heterocromatina- llamadas

cuerpos heteropicnóticos, cuerpos juxtanucleares, esferas

perinucleares o cariosomas satélite (12).

Se ha reportado por diversos investigadores que la actividad

mitótica de las CS en roedores es muy pronunciada durante los

períodos fetal y postnatal temprano, pero cesa entre los 12 y 15

días después del nacimiento (13). No es claro si las células

maduras poseen la capacidad de reasumir su división bajo ciertas

condiciones; en algunos casos, no existen evidencias concluyentes

de síntesis continua de DNA o proliferación celular en cultivos de

células provenientes de ratas sexualmente maduras, aún en presencia

de mitógenos (14) .

La presencia de una barrera semipermeable entre la sangre

periférica y los testículos fue postulada con base en la

11

observación de que marcadores el.ectrodensos, colorantes y otras

moléculas pequeñas se veían excluí.das de los túbulos seminiferos en

los animales adultos (15).

En la mayoría de los vertebrados, esta barrera hematotesticular se

encuentra formada por los complejos de unión entre las membranas de

las CS (16). Sin embargo, en algun.os mamíferos, la barrera primaria

comprende una serie de uniones estrechas entre células mioides

adyacentes que rodean a los túbulos seminiferos, e impiden que

ciertas sustancias lleguen a l a s espermatogonias en el

compartimiento basal.

En algunas áreas de los túbulos seminíferos, las uniones entre las

CS se extienden hasta la lámina basal, con contactos más frecuentes

al nivel de espermatogonias. Las CS se separan de éstas por

espacios de 20 nm y entre sí por regiones de 9 nm de separación,

que pueden reducirse a 2 nm al nivel de las uniones estrechas, y en

otras uniones focales, que incluso permiten un fuerte acoplamiento

eléctrico por distancias variables a lo largo del epitelio (17).

Se considera en la actualidad, que la población de espermatogonias

se encuentra separada de las demás células germinales, formándose

un compartimiento basal, que contiene a las espermatogonias y

espermatocitos preleptoténicos, y un compartimiento adluminal, que

consiste de espermatocitos y espermátides ubicadas por arriba del

nivel de las uniones estrechas. Las sustancias que lograran

.". .

12

atravesar las células de la capa mioide tendrían acceso directo a

las células del compartimiento basal, pero para alcanzar la región

adluminal deberían a su vez atravesar las uniones entre CS. Como

resultado de esto, se producen ambientes diferentes en ambos

compartimientos de los túbulos seminíferos (12).

Como las células de la línea germinal deben realizar su proceso de

diferenciación en sentido transversal respecto de cada túbulo, y

éste las llevaría a pasar sucesivamente del compartimiento basal al

adluminal, es fácil suponer que este tránsito implicaría la

destrucción y reformación constante de las uniones estrechas entre

las CS. Observaciones en diferent.es modelos experimentales (18-20)

demuestran que las fases iniciales de la espermatogénesis preceden

siempre al establecimiento de la barrera hematotesticular.

El desarrollo de la barrera hematotesticular está muy

correlacionado con el desarrollo de la luz del túbulo, cuyo tamaño

aumenta rápidamente hasta los 2 5 días aproximadamente en el caso de

la rata (21) . La segunda fase de elevación del volumen tubular y por ende de la disminución de la permeabilidad de la barrera se

presenta hacia los 45 días.

Las CS son capaces de ingerir células germinales en degeneración,

cuerpos residuales o materia particulada inyectada. La actividad

fagocítica se hace más pronunciada después de dañado el epitelio

germinal y de una degeneración masiva de células germinales (12) .

13

El inicio y mantenimiento de la espermatogénesis en el interior de

l o s túbulos seminiferos es dependiente de la presencia de una serie

de hormonas, cuyos efectos directos se aprecian en las CS ( 2 2 ) , las

cuales modifican su metabolismo para producir l o s elementos que las

células de la línea germinal- requieren para completar su

diferenciación (23).

1.2.4. Compartimiento intersticial.

En muchas especies el tejido intersticial, localizado entre los

túbulos seminiferos, representa tan solo una pequeña porción del

volumen testicular, variando entre aproximadamente un 5-10% en la

rata hasta un 60% en el cerdo (24). De acuerdo a Fawcett y cols

(25), existen al menos 3 diferentes tipos de organización del

tejido intersticial en función d , e l volumen ocupado por las CL, la

masa de tejido conectivo intersticial y la localización y grado de

desarrollo de los vasos linfáticos intertubulares.

En el caso de la rata se encuentra un número reducido de CL (1-5%

del volumen total) , poco tejido lzonectivo y un endotelio linfático

continuo alrededor del tejido limitante y discontínuo u

ocasionalmente interrumpido alrededor de los grupos de CL, con

espacios llenos de fluido y sinusoides linfáticos. Las CL rodean a

l o s capilares y usualmente no están soportadas por mallas de fibras

de colágena ni por células del tejido conectivo, tales como

fibroblastos, macrófagos, células cebadas y células mesenquimatosas

14

indiferenciadas (4) .

En la mayoría de las especies, las C L se encuentran formando

racimos en el espacio intertubular triangular, y en forma de haces

entre los túbulos mu17 compactados. En el animal sexualnente maduro,

la membrana plasmática presenta muchas especializaciones,

incluyendo complejcs de unión,, proyecciones e indentaciones

superficiales lisas y recubiertas. Alrededor de las CL existe una

nembrana basal de grosor y disposición variables que parece

funcionar como soporte en combinación con fibras de colágena (24) .

Existen cuando mencs 3 tipos de uniones entre las C L : septadas de

20 nm, de 2 nm y hendidas , y desmosomas sedimentarios (26) . Las uniones hendidas son permeables, las septadas parcialmente

perneables y las estrechas impermeables a marcadores electrodensos.

Las proyecciones superficiales son microvellosas o bulbosas, y se

encuentran íntimamente relacionadas con las uniones.

La característica Iiltraestructur'ai más conspicua en estas células

es la presencia de cn retículo endoplásmico liso bien desarrollado,

típico de las células secretoras. Existe asimismo, una red de

filamentos abundantes que forinan haces , y que se encuentran

formados por diversos tipos de proteínas fibrilares tales como

actina, vimentina y desmina ( 2 7 ; 1 .

El citoplasma contiene numerosas inclusiones semejantes a gotitas

15

de lípidos, y en algunas ocasiones presenta cristales (cristales de

Reinke en el testículo humano) cuyas funciones son desconocidas

( 2 )

1.3. FISIOLOGIA TESTICULAR.

1.3.1. Eje hipotálamo-hipófisis-testículo (fig 1.1).

La actividad secretora de las CL se encuentra bajo el control de la

hormona luteinizante (LH), una d.e l o s gonadotropinas liberadas por

la adenohipófisis, mientras que la otra gonadotropina, la hormona

folículo estimulante (FSH), influye principalmente sobre la

actividad de las CS y por lo tanto, probablemente también sobre la

diferenciación de las células de la línea germinal ( 2 8 ) .

1 6

La liberación de las gonadotropinas por parte de l o s gonadotropos

hipofisiarios depende directamente de su estimulación por parte de

la hormona liberadora de gonadotropinas (GnRH), sintetizada en el

hipotálamo y enviada hacia la hipófisis a través de un sistema

porta especializado. Las cantidades de hormona liberadora presentes

en el sistema dependen de seAales reguladoras recibidas por

receptores específicos a nivel del. núcleo supraóptico hipotalámico,

a modo de un mecanismo de retroalimentación mediado parcialmente

por las hormonas esteroides.

Las gonadotropinas liberadas a la circulación periférica modulan la

actividad de sus células blanco a través de su interacción con

receptores membranales específicos, ligados al sistema de adenilato

ciclasa (29) . Así, las gonadotropinas unidas a sus receptores

incrementan la actividad enzimática, y por lo tanto, la

concentración intracelular del 3',5'-riboadenosilmonofosfato

cíclico (AMPc) , lo que a su vez desencadena cambios en patrones de

fosforilación proteica mediados a través de la acción de

proteincinasas de tipo A (30) , y modificaciones en l a s funciones

particulares de cada tipo celular.

Se ha demostrado que, a su vez, las hormonas esteroides tienen

diferentes papel en el control de la secreción de las

gonadotropinas (31). Así, la testosterona (T) suprime de igual

manera la liberación de LH y FSH, mientras que el estradiol (E)

preferentemente regula la secreción de FSH ( 3 2 ) .

Hormona

I HIPOYALAMO! 1

i !

Sistema porta GnRH

~ P ~ F I s I s 1 4

. I I i Secreción de

gonadotropinas

. folículo estimulante j

(FSH)

~ C G l u l a s de Sertoli i

i - Síntesis de E

*

i 1

Hormona luteinizante (LH)

1 w

I Células de Leydi.;

Síntesis de proteínas específicas

Síntesis de T

Figura 1.1. Eje hipotálamo-hipófisis-testículo.

17

Factores de naturaleza proteica secretados por las CS (inhibinas),

aparentemente sinergísticamente junto con el E se encargarían de

regular las concentraciones circulantes de FSH en animales adultos

sin afectar, más que en forma mínima, la concentración plasmática

de la LH (33).

La LH se une a l a s CL a través de receptores nembranales

específicos (34) que presentan elevadas constantes de afinidad y un

número limitado de sitios de unihn. Estas proteínas receptoras son

capaces de incrementar los niveles intracelulares de AMPc, activar

la función de la proteíncinasa A, e incrementar la tasa de

fosforilación de cuando menos 6 proteínas específicas ( 3 0 ) , que

presumiblemente tendrían un papel en la regulación de la

esteroidoqénesis, directamente como parte de las enzimas

biosintéticas de la vía de l o s andrógenos, o indirectamente a

través de diversos mecanismos de regulación autocrina o paracrina

( 3 5 ) *

Generalmente se acepta que el AMPc es el principal factor que media

la transducción de la señal evocada por LH, pero investigaciones

recientes han mostrado que otros tipos de segundos mensajeros

intervienen en la regulación de la función celular.

Es ampliamente aceptado que muchas hormonas de naturaleza proteica L

18

pueden ejercer sus efectos biolóqicos a través de la estimulación

de la hidrólisis del fosfatidilincsitol 4,5-bisfosfato (PIPz), que

produce inositol trifosfato (IP3) - encargado de la movilización de

Ca+2 a partir de sus fuentes intercelulares y de la modificación de

sus flujos transmembranales - y diacilqlicerol ( D A G ) que activa a

la proteíncinasa C (36).

Existen evidencias indirectas de que la fosfolipasa C que cataliza

la hidrólisis del "IP2está regulada por una proteína específica que

une nucleótidos de guanosina (Proteína G) , activada a su vez por

l o s estímulos provenientes de la estimulación a nivel membranal

(37) . De igual forna, la síntesis del AMPc se encuentra bajo el control dual de proteínas G estimuladoras ( G s ) e inhibidoras (Gi),

a su vez controladas por estímul.os extracelulares diversos (38) ,

que serían en Últina instancia conjuntamente responsables del nivel

global de estimulación de las fu:nciones celulares.

Otras variables que afectan la actividad de las vías

esteroidogénicas incluyen la formación de complejos de

Caf2/calmodulina (39) , y la unión de una variedad de factores de

naturaleza hormonal que cuentan con receptores específicos en las

membranas de las C L , tales como e l factor de crecimiento epidermal

(EGF) (40) , la hormona liberadora de LH (LH-RH) (41) , la insulina

y sus factores relacionados (IGFs) (42) , el factor de crecimiento

de fibroblastos (FGF) ( 4 3 ) , la vasopresina (44) y las catecolaminas

(45) -

19

1.3.2.1. Vías esteroidoqénicas.

La esteroidogénesis en CL ha sido amplia y profundamente estudiada

para encontrar las rutas predominantes de síntesis de l o s

andróqenos, de forma tal que se conocen en la actualidad el

conjunto de intermediarios y l o s sistemas enzimáticos involucrados

en sus transformaciones, así como algunos de los factores

relacionados con su regulación (2!9) .

Recientemente se ha manifestad13 un punto de vista diferente

respecto a la evolución del proceso de la esteroiaoqénesis (46) , el

cual implica que las horr,onas es,teroides son biotransformadas en

llhormonadas'l o unidades ?e transformación en donde, de forma

organizada, se modifica un precursor hasta generar una hormona

final, sin que este compuesto o sus intermediarios puedan separarse

del agrupamiento.

Sin embargo, el esquema de producción de las hormonas esteroides

por lo general se considera agrupsdo en 2 vías diversas denominadas

de l o s c 4 y 2 5 en función de la posición del doble enlace en el

anillo A del ciclopentanoperhidrcfenantreno del mayor número de los

intermediarios que constituyen a cada una de las rutas metabólicas

(fig. 1.2).

La formación de la pregnenolona (Preg) a partir del colesterol

(Col) es el primer paso considerado como parte de las vías

2 0

esteroidogénicas. Esta reacción tiene lugar en las mitocondrias de

las CL, y requiere NADPH, oxígeno y una cadena de transporte

electrónico activa, donde es fundamental la presencia de un

citocromo P450 funcional ( 4 7 ) .

Se acepta por lo general, que el. 20a,22R-hidroxicolesterol es el

intermediario inicial del proceso de hidrólisis de la cadena

lateral del C o l mediado por la 20,22-desmolasa ( 4 8 ) , con la

consiguiente liberación de P r e q e isocaproaldehido hacia el

compartimiento citosólico (29).

Se ha propuesto que el paso limitante de la reacción Col a Preg es

la velocidad de asociación del primero con el sistema lítico

dependiente del citocromo P450, el cual está controlado a su vez

por el metabolismo del Ca+2 intra y extramitocondrial (49) . Por otra parte, la LH puede afectar también el proceso a cualquiera de l o s

siguientes niveles: disponibilidad del col y sus cofactores

reducidos, activación de la desmolasa propiamente dicha y/o

síntesis de novo de las enzimas del complejo ( 3 0 , 5 0 ) .

Existe un transportador inespecífico de lípidos llamado proteína

acarreadora de esteroles (SCP2: cuya localización y propiedades

estimulatorias parecen hacerh un candidato ideal para la

regulación de la actividad de la desmolasa de Col, ya que se

postula que podría participar en el aumento de su entrada a la

mitocondria, característico de la estimulación de las CL con LH, ya

21

que su síntesis se ve inducida por esta qonadotropina (51).

La producción de T a partir de Preg ha sido extensamente estudiada

desde mediados de la década de los 1950, cuando Slaunwhite y

Samuels (52) describieron la secuencia llamada de l o s 5 4 que

implica la serie de intermedizrios proqesterona (Proq) , 1 7 ~ -

hidroxiproqesterona (170HProg) y androstendiona (A) . Esta vía es predominante en un número importante de especies durante la etapa

adulta, incluyendo a la mayoría de l o s roedores, por lo que ha sido

utilizado como un indicador de la presencia de C L (29).

Certel & Eik-lIes (53) proporcionaron evidencias que apoyaban ia

existencia de una vía a1ter:nativa denominada de l o s 15,

caracterizada por la presencia de los intermediarios 17a-

kidroxipreqnenolona (170HPreq), dehidroepiandrosterona (DHEA) y

androstrendiol (Diol) , que tanbién puede operar en diversas

especies en mayor o menor proporción.

Se ha propuesto asimismo la existencia de algunas variantes a estas

rutas clásicas, tales como :La que involucra a esteroides

sulfoconjuqados en posición 30 (54) y algunos otros derivados

hidroxilados.

Las enzimas de la vía esteroidoqénica que catalizan la

transformación de Preg en T se encuentra localizadas en la fracción

citosólica y en el.. retículo end'oplásmico liso de las CL. Así, la

22

enzima 17a-hidroxilasa/C17,20 liasa requiere de la actividad del

citocromo P45017, asociada al retículo para generar a l o s

intermediarios A y DHEA ( 5 5 ) , la tranformación de A en T o de DHEA

en Diol es catalizada por la 17-cetoesteroide reductasa (no

dependiente de citocromo P450) ( 5 6 ) , y la transformación de Preg o

Diol en el correspondiente esterl3ide 2 4 es catalizada por la 3 0 -

hidroxiesteroide deshidroqenasa (29).

La expresión de varias enzinas de las vías esteroidoqénicas se ve

regulada por la presencia de una serie de factores de naturaleza

hornonal tales como LH, AMPc o E. Por ejemplo, la expresión de las

desmolasas dependientes de P4150 puede ser incrementada por

exposición crónica a LH o AMPc, y se ve inhibida por

concentraciones elevadas de T en CL normales o tumorales de ratón

(50) . Esta requlacidn varía de acuerdo a la edad del animal (57) ,

y se ha observado que las CL feta.les reaccionan en forma diferente

a la presencia de qonadotropina coriónica humana (hCG) ( 5 8 , 5 9 ) .

Finalmente, la prioridad que presente alguna determinada ruta

esteroidoqénica sobre l a s demás dependerá de la especie, la edad,

la estacionalidad reproductiva e incluso l o s ritmos circadianos en

los animales sensibles a estas variaciones, además de otra serie de

factores aún no claramente definidos.

SIOSINTESIS DE ANDiiOGENOS VIA A‘:

o

H O a!?$ 1REGNENOLON4 - o d $ PROGESTERONA

va

”3H PREGNENDLONA

3

FIGURA 1.2 ‘lías esteroidogénicas en c é l u l a s de Leydiq.

En esta figura se muestran las dos vías principales de biosíntesis de testosterona (T) a partir del colesterol en las células de Leydiq. En la vía predominante (señalada con flechas gruesas) denominada de los 34, la preqnenolona (Preg) es transformada a progesterona (Proq) por la acción de la 3R- hidroxiesteroide deshidrogenasa, para ser posteriormente hidroxilada en posición 17cr y ser luego convertida en el andrógeno androstendiona ( A ) a través de la actividad de la C17,20-liasa; finalmente, la A es transformada a T por la 17- cetoesteroide reductasa. En la vía alternativa de l o s n5, la Preq es 17a-hidroxilada y transformada al andrógeno dehidroepiandrosterona (DHEA) para ser finalmente convertida a T por acción de la 3f3-hidroxiesteroide deshidrogenasa.

2 3

1.3.3. Regulación funcional de las células de Sertoli.

La FSH juega un papel central en 1.a regulación de la diferenciación

de las CS y en el mantenimiento de su funcionamiento normal en las

células de animales adultos (60,61) . La unión de FSH a sus

receptores membranales específicos activa al sistema de adenilato

ciclasa, lo que incrementa la concentración intracelular de AMPc y

activa la proteíncinasa AMPc-dependiente, desencadenando una

cascada de eventos de fosforilación proteica (62).

Por otra parte, como resultado de la estimulación hormonal, la

actividad secretora de la CS se ve aumentada (63) . Dentro de las proteínas cuya secreción se VE? incrementada se encuentran la

proteína unidora de andróqenos (ABP) (ó4,65) , la transferrina

(66,67), el activador tisular de plasminóqeno (68,69), la inhibina

(70,71) , diversas qlucoproteínas ácidas (63,72) , proteínas que unen

a IGF (73), etc.

Diversos autores han demostrado que el incremento en la secreción

proteica de las CS está relacionado directamente con el aumento en

los niveles de RNAs mensajeros específicos de estas proteínas, al

menos en el caso de la ABP (74), transferrina ( 7 5 ) y activador de

plasminógeno (76) .

Al igual que en el caso de la regulación de las CL, la activación

de la adenilato ciclasa de las CS está mediada por algunas

2 4

proteínas Gs (77) , y quizá también con la participación de proteínas

del tipo Gi (78).

Por otra parte, la interacci6n de FSH con los receptores

membranales también determina un incremento en la producción in

vitro de E por parte de las CS provenientes de animales inmaduros

(79). Un incremento significativo en la producción de E se observa

desde el primer día de incubación en presencia de FSH (80), aunque

esta capacidad disminuye considerablemente hacia l o s 20 días de

edad del animal, al tiempo que la tasa mitótica de las CS hace lo

propio ( 8 1 , 8 2 ) .

Las CS in vitro poseen una alta tasa glucolítica (83) y producen

lactato y piruvato que puede ser detectado en los medios de

cultivo. Este proceso es estimulado por la presencia de FSH ( 2 3 , 8 4 )

y dibutiril AMPc (dbAMPc) (85). Este fenómeno se ha interpretado

como parte de la contribución que FSH realiza al proceso de la

espermatogénesis, ya que tanto el lactato como el piruvato

producidos permiten que l o s espermatocitos paquitenos y las

espermátides redondas, incapaces de realizar glucólisis por sí

mismas, completen su diferenciación (86).

Diversos factores hormonales solubles participan asimismo en la

regulación fUnCiOna1 de las CS, tales como EGF ( 8 7 ) , IGFs-I y I1

(88,89), andrógenos (go), FGF y somatomedina C (91) , los cuales

afectan tanto la actividad de aromatasas celulares, como la

25

síntesis de proteínas específic,ss, en cultivos primarios de CS

provenientes de animales inmaduros.

1.3.4. Mecanismos intratesticulares de regulación.

Existen evidencias cada vez más concluyentes de que l o s cambios

sutiles de la función testicu1a.r pueden ser regulados en forma

local, a través de interacciones de tipo paracrino y autocrino que

involucran contactos intercelulares, así como por interacciones

mediadas a través de factores sol.ubles de naturaleza diversa (92) .

Así, las hormonas hipofisiarias proporcionarían el estímulo basal

del cual depende en primera instancia el funcionamiento testicular,

mientras que la regulación fina del tiempo e intensidad de las

respuestas de estirpes celulares particulares, dependería de las

complejas interacciones inter e intracompartamentales.

Algunos de los mecanismos de regulación intratesticular para los

cuales diversos investigadores han obtenido pruebas experimentales

se muestran en la fig 1.3.

1.3.4.1. Interacciones células de Sertoli-células de la línea

germinal.

Debido a que la espermatogénesis se encuentra principalmente bajo

el control de T y FSH, y a que las células de la línea germinal

26

carecen de receptores específicos para estas hormonas, las

interacciones entre las CS y las células de la línea germinal

parecen jugar un papel esencial para la adecuada maduración de los

gametos masculinos.

La viabilidad de las células germinales disminuye rápidamente

cuando éstas son aisladas, mientras que en cultivos in vitro de

fracciones tubulares que incluyan CS, las células de la línea

germinal pueden sobrevivir estableciendo contactos con éstas ( 9 3 ) .

Estos cocultivos permiten incrementos en la síntesis del DNA y RNA

de las células germinales que no pueden ser mimetizados por

cocultivos en presencia de otras estirpes celulares de naturaleza

epitelial (94) .

El desarrollo de las células de la línea germinal está muy

precisamente determinado en términos cemporales y espaciales, y

esta organización parecería depender en primera instancia de la

serie de puentes citoplasmáticos que se establecen entre las CS y

ellas, si bien en número relativamente escaso (95) y de una forma

muy plástica ( 9 6 ) .

Es muy claro el papel de I1nodrizal1 que las CS cumplen con respecto

a las células de la línea germinal, ya que el establecimiento de la

barrera hematotesticular deposita en ellas la misión de canalizar

los diversos componentes metabólicos esenciales para la

supervivencia celular hacia los diferentes estados de

2 7

diferenciación con l o s cuales establecen contacto (97) . De igual manera, las grandes limitaciones metabólicas que presentan

especialmente los espermatocitos y l a s espermatides, determinan la

elevada dependencia de estas células de los productos que les

proporcionan las CS (98,99) .

Como ya se ha mencionado, las cs poseen una elevada tasa

glucolítica y producen lactato :y' piruvato que liberan hacia el

medio. Las células de la línea germinal, por su parte, son

incapaces de subsistir utilizando como sustrato de oxidación a la

glucosa a pesar de contar con todas las enzimas glucolíticas (99),

pero sí son capaces de utilizar al lactato y al piruvato para

mantener los niveles basales de ATP necesarios para sobrevivir

(100) .

Un posible mecanismo mediante el. cual las CS pudieran afectar la

diferenciación de las células germinales es la secreción de

factores paracrinos específicos,. Debido a que la organización

temporal y espacial del epitelio seminífero varía, se esperaría que

estos factores variaran asimismo en función de la etapa específica

del ciclo del epitelio seminífero en el cual se encontraran las

células germinales que rodean a las de Sertoli (101) , lo cual

determinaría que las células de la línea germinal tendrían también

la capacidad de influir sobre el. metabolismo de las CS.

LeMagueresse & Jégou (102) han mostrado que las células germinales

28

pueden afectar la producción de E y la síntesis de ABP de las CS de

ratas inmaduras i n v i t r o de u:na forma diferencial. De forma

equivalente, las células de la línea germinal son capaces de

estimular la actividad de la adenilatociclasa membranal de las CS

(103), de disminuir la secreción de transferrins (104) y de modular

la secreción de la proteína cíclica-2 (105) en cocultivos con

células de ratas inmaduras.

La presencia de células peritubulares en cultivos de fracciones

enriquecidas en CS incrementa la tasa de supervivencia de estas

últimas (106), y permite que las células se organicen en

estructuras tubulares, tal como se observa al cultivar las CS en

matrices extracelulares (107), y que incluso incrementen su

actividad secretora i n v i t r o (108).

Diversos estudios han demostrado que la membrana basal que limita

a los túbulos seminiferos está compuesta de moléculas tales como

fibronectina, coláqenas I y IV y proteoqlicanos ricos en condroitín

sulfato que son depositados por las células peritubulares, amén de

otros proteoglicanos ricos en heparán sulfato y laminina aportados

por las CS (109).

Por otra parte, las células peritubulares secretan una proteína

denominada P-Mod-S de un peso molecular de 70 KDa y cuya síntesis

2 9

es incrementada por la T (110), la cual estimula en forma máxima la

secreción de transferrina, ABP e inhibina, sin afectar los niveles

de activador de plasminógeno presentes en l o s medios de cultivo

(111,112) , a través del aumento de l o s niveles intracelulares de

GMPc (113).

Otras interacciones requlatorias entre células peritubulares y de

Sertoli parecen involucrar a los factores de crecimiento y

transformación Q y R (TGF-Q y TGF-6) y al EGF que son secretados

y/o presentan receptores específlcos en alguno o en ambas estirpes

celulares (114), y a la T que cuenta con receptores específicos en

ambos tipos celulares (115).

1.3.4.3. Interacciones células de Sertoli-células de Leydiq

(Interacciones intercompartamentales).

Como se ha señalado anteriormente, las CL son capaces de modular la

actividad funcional de las CS a través de su producción de T, la

cual es captada por éstas a través de receptores específicos, lo

que resulta en una estimulación de la actividad de RNA polimerasa

y la síntesis y secreción de AB€' y transferrina (116).

El concepto de que las CS pudieran a su vez influir sobre la

actividad de las CL ha venido afirmándose a partir de la

determinación de que daños estructurales a secciones particulares

de túbulos seminiferos pueden afectar secundariamente la morfología

Papadopoulos y cols (119), Verhoeven & Cailleau (120) y Yixun &

Dah1 (121) han descrito la activi'dad de un factor estimulador de CL

producido por túbulos seminiferos de testículos humanos o de rata

o por cultivos primarios de cs que parece incrementar la síntesis

de T en cultivos prirnarics de CL en períodos cortos de incubación

(4-5 horas) . Este factor parece estimular un paso temprano de la vía esteroidogénica, bloqueandc, a la vez en forma parcial la

conversión de los precursores C2len andrógenos ( 1 2 2 ) .

Además de estos efectos agudos sobre la esteroidoqénesis, las CS

parecen tener efectos tróficos a largo plazo sobre las CL. Así,

cuando se establecen cultivos primarios de CL de cerdo en medios

condicionados de CS (MCCS) cultivadas en presencia de FSH e

insulina, se observa en las primeras la disminución tanto en el

número de receptores para hCG como en la respuesta esteroidogénica

asociada a esta estimulación (125).

VASO SANGUINE0

TEJIDO INTERSTIC IAL TUBULO SEMlNlFERO

FIGURA 1-13 1,Tccanismos intratest iculares de regal.ación.

Diversos investigadores han postulado v a r i o s mecanismos de regulación paracrina de la función testicular que se ilustran en esta figura. De esta forma, se ha propuesto que la testosterona ( I r ) sintetizada por las células de Leydig puede ser tomada por las células de Sertoli en el túbulo seminífero a través de receptores específicos, modulando la síntesis de varias proteínas tales como la transferrina y la proteína unidora de andróqenos (ABP:, las cuales pueden influir sobre la diferenciación de l a s ciilulas de la línea germinal. Cabe mencionar que e s t a s últimar; podrían modificar a su vez la actividad funcional de las células de Sertoli, lo que no se muestra en la figura. Por otra parte, las cé1ul.a~ de Sertoli podrían modular la esteroidogénesis de las células de Leydig a través de su producción de 17B-estradiol (E) , a nivel de las enzimas de las vías biosintéticas de andrógenos y/o mediante su interacción con receptores específicos, o bien a través de la secreción de factores proteicos particulares. Las interrelaciones entre las células peritubulares y las células de Sertoli no se indican específicamente en esta figura.

126387 3 1

La diversidad de las respuestas evocadas por las CS sobre las CL

parece ser debida a la diversidad de condiciones experimentales

existentes entre los modelos utilizados por los diferentes grupos

de investigación, en términos d.e p.ej., edad de los animales,

composición de los medios de cultivo, etc (30) .

De igual manera, la naturaleza del o los factores involucrados en

estas interacciones queda por ser determinada. Algunos factores de

naturaleza inhibitoria ya descritos son presumiblemente de

naturaleza proteica y pesos moleczulares que oscilan entre 10 y 3 0

KDa (122,123,126,127), aunque diversos autores han intentado sin

éxito relacionar unívocamente alguna de las proteínas secretadas

por las CS con el factor moduladclr de la esteroidogénesis (72,128-

130).

1.4. MODELOS DE ESTUDIO: OBTENCION DE FRACCIONES CELULARES

ENRIQUECIDAS.

LOS sistemas originales de análisis concernientes a la función de

las CS comprendían el uso de túbulos seminíferos completos,

separados del compartimiento intersticialmediante disección húmeda

al microscopio estereoscópico (1:31). Estudios posteriores utilizan

una serie de tratamientos enzimáticos (DNAsa, colagenasa,

hialuronidasa, pancreatina y otras enzimas) para lograr la

disgregación de las asociaciones entre células germinales y CS, y

3 2

por lo tanto, la obtención de células individuales o de acúmulos de

un número celular limitado (132-1.37).

La mayoría de estas investigaciones han utilizado organismos

inmaduros o a lo sumo púberes para disminuir la contaminacijn

resultante de la presencia de una gama completa de estados de

diferenciación de las células de 1.a linea germinal. Algunos autores

han argumentado (138) que estas ciilulas se asemejan en cierto grado

a sus contrapartes adultas, una vez que la edad del animal hubiera

rebasado los 15-17 días, etapa en que se establecen las uniones

estrechas in vivo.

Por otra parte, la eliminación total del componente germinal para

crear un estado semejante al síndrome clínico de aplasia germinal

puede ser inducida por una variedad de métodos que incluyen la

administración de busulfán durante el desarrollo embrionario (139),

alimentación con dietas deficientes en vitamina A (140) ,

irradiación fetal (141), criptorquidia (142) o esterilización por

calor (143). Todos estos métodos dañan a las células germinales,

pero también afectan a las CS y al compartimiento intersticial en

grados variables (144), lo que pone en tela de juicio el valor de

estas aproximaciones para obtener fracciones celulares

enriquecidas.

En el caso de las células del compartimiento intersticial, se han

aplicado diversos tratamientos a las fracciones crudas obtenidas

33

por tratamientos iniciales con colagenasa para separar a los

túbulos seminiferos (145), que incluyen su paso por gradientes de

Ficoll (146), Percoll (147) o Metrizamida (148). Estos diversos

tratamientos pueden llegar a .modificar la viabilidad y las

propiedades funcionales de las cglulas intersticiales separadas,

particularmente para el caso de :-as CL (149).

Los cultivos primarios de l a s diferentes estirpes celulares del

testículo se han convertido en una metodología cada vez más

utilizada para el estudio de los diversos elementos de la

fisiología gonadal. Nediante el a.islamiento inicial de l a s células

y su mantenimiento durante períodos nás o menos prolongados en

condiciones i n v i t r o , los investigadores han podido analizar sus

respuestas directas a hormonas, nutrientes u otros factores.

. .

3 4

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.

Los trabajos que utilizan como modelo de estudio un órgano completo

i n vivo han sido en la mayoría de los casos la aproximación

experimental inicial a través de la cual se intenta dilucidar tanto

su fisiología como su participación en el funcionamiento global del

organismo.

Una preocupación presente en fcrma permanente en l o s diversos

investigadores es la validez que un modelo i n v i t r o tiene frente a

su referente original. Este cuestionamiento ha llevado a una

búsqueda continua de criterios de validación que permitan eliminar

todas las dudas planteadas a este respecto.

Para el caso del estudio de la fisiología testicular todas estas

inquietudes ya han sido consideradas, y los cuestionamientos han

girado principalmente respecto a si la edad de los animales o la

forma de obtención de las gónadas afectan o no el funcionamiento

normal de estos órganos, siendo por lo tanto necesario plantear

35

esquemas que permitan valorar dicho funcionamiento, teniendo

siempre en mente lo ya conocido para el animal completo.

En consecuencia, la utilizacitjn de metodologías simples y

fácilmente reproducibles para la obtención de fracciones

enriquecidas en determinadas est.irpes celulares del testículo en

animales adultos y normales, y' su correspondiente evaluación

funcional una vez aisladas, permitirá la validación de estos

modelos celulares i n v i t r o tanto para el estudio de l a s condiciones

normales de funcionamiento gonadal como también para la

determinación del efecto que diferentes factores endógenos y

exógenos presentan sobre éstas.

. -

3 6

3. HIPOTESIS DE TRABAJO.

Es posible obtener fracciones enriquecidas en células de Leydig y

Sertoli a partir de testículos de ratas adultas normales

preservando su integridad morfológica y funcional, de forma tal aue

puedan servir como un modelo de estudio in vitro de los mecanismos

de regulación paracrina y autocrina que participan en el control de

las funciones testiculares.

4. OBJETIVOS.

a. Diseñar una metodología que permita la obtención de fracciones

enriquecidas en C L y CS de ratas adultas normales a partir de un

mismo testículo.

b. Evaluar la pureza, viabilidad, y grado de contaminación cruzada

de las fracciones fracciones enriquecidas en C L y CS.

c. Determinar la presencia de componentes unidores de hormonas

esteroides en las fracciones enriquecidas en C L y CS.

d. Determinar l o s patrones esteroidogénicos presentes en las CL y

CS tanto en condiciones basales como de estimulación aguda.

3 7

5 . MATERIAL Y METODOS.

Se utilizaron ratas macho adultas normales de la cepa Wistar de

aproximamente 90 días de edad, las cuales fueron sacrificadas por

decapitación en grupos de 3 a 5 animales. Los testículos se

extirparon y la sangre secuestrada en el órgano se eliminó en la

mayor cantidad posible mediante varios lavados con una solución

amortiguadora Krebs-Ringer pH 7.4, adicionada con glucosa al 0.2%

(KRBG: 125 nM rJaC1, 5 mM KC1, 1.2 mM MgS04, 35 mM Tris, 1 m!'

NaH2P04).El peso promedio del pair de testículos fue de 3.5 g, con

un rango que oscil6 entre 2.8 a 4.1 g .

5.1. OBTENCION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS.

La metodología de separación est6 basada en la reportada por Welsh

& Wiebe (134) para las CS de animales inmaduros y por Janszen y

cols (146) para las CL, modiflcada de tal forma que pudieran

obtenerse ambos tipos de fracciones celulares a partir del mismo

par de testículos (fig 5.1).

Los testículos fueron procesados como se mencionó anteriormente

para eliminar la sangre retenida y fueron descapsulados, para ser

posteriormente tratados con una solución de colagenasa (Sigma, Tipo

Ia) a una concentración final de 1 mg/ml en un volumen total de 7

m1 por par de testículos, durante 18 minutos a 3 7 O C , con agitación

.

30

periódica.

La actividad de la colagenasa fue suspendida por la adición de 2

volúmenes de solución salina isotónica y dejando reposar la

suspensión durante 10 minutas a temperatura ambiente. A

continuación, dicha suspensión se filtró a través de una malla de

nylon con un poro de diámetro entre 50 y 100 pm, para retener a los

túbulos seminíferos, y separar las 2 fracciones crudas iniciales.

La fracción intersticial cruda SE! centrifugó a 1,500 x g durante 10

minutos a una temperatura de 1 O C , y la pastilla celular se

resuspendió en un volumen final de 1 m1 de KRBG, para ser

posteriormente colocada sobre una solución KRBG-Ficoll 400-Albúmina

sérica bovina fracción V (Sigma) , pH 6.5, a una concentración final

del 13% y 0.2% respectivamente, y se centrifugó a 1.000 x g durante

15 minutos a la temperatura anteriormente señalada, para recuperar

la fracción enriquecida en CL.

La fracción tubular cruda que había quedado retenida por la malla

fue recuperada y fragmentada con bisturí hasta quedar compuesta por

segmentos tubulares de 1-3 mm de longitud, para ser posteriormente

tratada con una solución de KRBG-pancreatina (Sigma) a una

concentración final de O. 2 mg/ml durante 20 minutos a 28OC, con

agitación periódica. La activida.d de la pancreatina fue suspendida

por enfriamiento a 4OC, y la suspensión fue nuevamente fragmentada

en forma mecánica para desprender los grupos de células germinales

Testículos descapsulados

KRBG-Colagenasa (1 mg/ml) 18', 37OC, c/aqitación

Adición de 2 vols. de NaCl 0.14M y dejar reposar a T ambiente durante 10'

Filtración a travc5s de una malla de diámetro de poro de 50-100 bm

Fracción tubular cruda Centrifuqación a 1500 x g durante 10' a 5OC

Resuspensióndelbotón celular en KRBG

Centrifugacióna 1000 x q durante 15' a 5OC a través de KRBG-Ficoll -BSA y recuperación del

botón celular

FIGURA 5.la Obtención de fracciones enriquecidas en células de Leydig a partir de testículos de ratas adultas normales.

Fracción tubular cruda

Fragmentación mecánica y con KRBG-pancreatina (0.2 mg/ml) durante 2 0 ' a 2 8 O C, c/aqitación

Suspensión de la actividad enzimática por enfriamiento a 5OC durante 10'

Fragmentación mecánica por agitación violenta y paso a través de una aguja de calibre 22 qa

Sedimentación a través de un gradiente discontinuo de sacarosa en KRBG 1 : 2 - 6 % ) durante 30' a 5OC

Recuperación de las fracciones correspondientes al 4 y 5% de sacarosa y filtración a través de una malla de diámetro de poro 50-100 pm

Centrifuqación a !500 x g 5' a 5OC y resuspensión del botón celular

FIG 5.lb Obtención de fracciones enriquecidas en células de Sertoli a partir de testículos de ratas adultas normales.

3 9

embebidos en l o s fragmentos tubulares.

La suspensión celular fue sedimentada a continuación a través de un

gradiente discontinuo de sacarosa en KRBG (2-6% en intervalos

simétricos, cada uno con un volumen de 5 ml) a 1 x q , durante 30

minutos a una temperatura de 4OC. Pasado este tiempo, se

recuperaron las fracciones correspondientes al 4 y 5% de sacarosa

y se centrifugaron a 500 x g durante 5 minutos a 4OC, para

recuperar la fracción enriquecida en CS.

La viabilidad celular resultante :fue evaluada utilizando la técnica

de exclusión del azul de tripano (151), con recuentos en al menos

3 campos diferentes con 100 células cada uno, por cada preparación

de un par de testículos. La pureza celular se evaluó con base en

criterios morfológicos, utilizando tinciones previas con fucsina

ácida, o bien microscopía de contraste de fases.

5.2. ENSAYO DE PROTEINAS UNIDORAS.

Las fracciones enriquecidas fueron centrifugadas a 1,500 x q

durante 5 minutos a 4 OC, y resu.spendidas mediante una agitación

vigorosa en 6 m1 de una solución amortiguadora Tris-EDTA (10 mM

Tris, 1 mM EDTA, pH 7.4). La suspensión se centrifugó a 105,000 x

g durante 60 minutos a 4OC en una ultracentrífuga Beckman L5-65 a

35,000 rpm en un rotor Tipo 65, p'sra obtener el citosol, el cual se

4 0

guardó en refrigeración hasta su posterior uso. Los citosoles

fueron ensayados a una dilución final de 1: 10, que estudios

preliminares mostraron ser la má.s adecuada.

Se afiadieron a las alícuotas de citosoles de ambos tipos de

fracciones enriquecidas (volumen final=500 pl) cantidades variables

de esteroides radiactivos ( 3H-l, 2,6,7-T 98.767 Ci/mmol;

3~-1,2,4,5,6,7-DHT123.10 Ci/mmo.L, 3H-6,7-E42.56 Ci/mmol o 3H-l,2-

Prog 56.08 Cilmmol) mezclados con cantidades variables del

correspondiente esteroide no radiactivo, con el objeto de variar la

actividad específica inicial de la hormona ensayada.

Los tubos se incubaron durante toda la noche (18-22 horas) a 4OC,

y l o s esteroides libres fueron separados por la adición de 200 p l

de una solucicn de carbón activado-dextrán T70 (Pharmacia 0 . 6 2 5 -

O. 0 6 2 5 % , seguida de agitación vigorosa y centrifugación a 3,000 rpm

durante 15 minutos a 4OC.

La especificidad de las proteínas unidoras se evaluó a través de un

análisis por saturación, mediante la incubación de los citosoles en

presencia o ausencia de concentraciones variables de diferentes

esteroides competidores (1 y 100 x con respecto a la concentración

utilizada para los experimentos iniciales de unión). Los esteroides

no radiactivos disueltos en etanol fueron añadidos previamente a

cada tubo, y el solvente fue (evaporado a sequedad para evitar

interferencias en el ensayo, antes de la adición de los citosoles. 5

126387 4 1

La incubación se realizó ba-jo las condiciones señaladas

anteriormente.

LOS sobrenadantes se decantaron a viales de vidrio y se les

adicionaron 5 m1 de Instagel (Packard) como líquido de centelleo.

La eficiencia de conteo fue del 51% para tritio en el rango de

desintegraciones por minuto detectadas.

La obtención de los parámetros de: unión de l a s proteínas unidoras

(Kd: Constante de disociación y Número de sitios de Unión) se

realizó mediante la expresión qráfica propuesta por Scatchard

(152).

5.3. EVALUACION DE LA ESTEROIDOGENESIS.

Se incubaron alícuotas con un volumen de 500 p 1 de las suspensiones

celulares correspondientes a las fracciones enriquecidas en CL y CS

durante períodos variables ( O a 3-80 minutos) a una temperatura de

37OC , con el objetivo de evaluar su producción esteroidogénica,

mediante la determinación de l as cantidades de precursores y

producto final de la vía de los n4 esteroides generados por sus

sistemas enzimáticos.

Para determinar la respuesta de las células a la estimulación

trópica, diversas dosis de hCG (0.0003 a 3 U/ml, Gonadotropyl-C,

42

i?.oussel, act. esp. aproximada de 70 U/mg) o de FSH (O. 1 a 100

nq/ml, Sigma) fueron añadidas respectivamente a las fracciones

enriquecidas en CL y CS inCubadams durante períodos de hasta 180

minutos y bajo las condiciones se:ñaladas en el párrafo anterior.

Adicionalmente, se determinó la capacidad de transformación de

diversos precursores de la vía me'diante la adición de 'H-Preg, 3H-

?rog, 3H-170HProg y 'H-A a las f:cacciones enriquecidas en C L en

condiciones basales, de l o s mismos esteroides además de 3H-C01 en

las fracciones estimuladas con hCG y de los mismos esteroides que

en las incubaciones basales además de 3Y-T, 3H-DHT y 3H-E para las

fracciones enriquecidas en CS.

Las mediciones de los esteroides; endógenos se llevaron al cabo

utilizando radioinmunoanálisis ( R I A s ) específicos j153-155), previa

purificación de los esteroides totales mediante sistemas de

cromatoqraf ía en capa fina, de acuerdo a lo señalado en el

siguiente inciso. En el caso de l o s esteroides generados a partir

de la transformación de los diversos precursores radiactivos, se

evaluó directamente la radiactividad presente en l a s zonas de las

cromatoplacas correspondientes a cada esteroide, y se determinó el

porcentaje de transformación con respecto a la cantidad inicial de

radiactividad añadida para cada precursor.

.. .

4 3

5.4. SEPARACION Y CUANTIFICACION DE LOS ESTEROIDES.

Las alícuotas de las fracciones enriquecidas incubadas de acuerdo

a lo señalado anteriormente fueron recuperadas en un tubo de

centrífuga de vidrio de 15 m 1 con tapón esmerilado, y se les

adicionaron 5 m1 de éter etílico, seguido de una agitación vigorosa

durante 1 minuto. Los tubos fueron posteriormente introducidos en

una mezcla hielo seco-acetona ccln el objeto de congelar la fase

acuosa y facilitar su separación de la fase orgánica, la cual se

recuperó en un tubo de centrífuga de igual volumen. Este

tratamiento se repitió una vez más para cada tubo procesado, previa

descongelación de la fase acuosa después de la primera extracción.

Para llevar un control de la pérdida de material durante los

procedimientos previos a la determinación cuantitativa de los

esteroides, se añadieron a tubos procesados de forma idéntica a la

mencionada anteriormente, aproximadamente 1,000 cpm de cada uno de

los esteroides; la misma alícuota se añadió a viales de conteo que

sirvieron como monitores de la radiactividad total inicialmente

adicionada.

Una vez reunidas las fases orgánicas de las 2 extracciones, éstas

fueron concentradas por evaporación a sequedad a un volumen final

de 0.75 ml, para ser posteriormente aplicadas a las cromatoplacas

con objeto de separar los esteroides.

4 4

Los extractos fueron resuspendidos con 10 gotas de una mezcla de

metano1 al 10% en éter etílico y fueron posteriormente transferidos

a una línea de origen en la cro~natoplaca (Silica Gel 6 0 , F-254,

O. 2 5 mm de espesor, 20 x 20 cm) , marcada a 2 cm de uno de los bordes, en fcrma tal que cada muestra r?o se extendiera más de 3 mm

con respecto al punto original de aplicación. Cada tubo fue lavado

repetidamente con la mezcla mencionada con el objeto de recuperar

la mayor parte posible de la muestra. Se colocaron adicionalmente

2 yg de estándares preestablecidos de los diferentes esteroides por

separar en carriles paralelos dentro de cada placa.

Las cromatoplacas se desarrollaron sucesivamente en 3 sistemas

diferentes: a) Benceno puro, b) Benceno-acetato de etilo ( 7 : 3 ) y c)

Benceno-Metano1 ( 9 5 : 5 ) . Una vez concluida la separación en el

tercer sistema, la cromatoplaca se secó y se reveló bajo luz

ultravioleta a una longitud de onda de 254 nm para determinar la

posición de l o s c4-3-ceto-esteroides; la Preq se reveló previa

adición del reactivo de Oertel (iicido sulfúrico-etanol 2:l).

Los esteroides fueron eluídos a tubos de ensaye de vidrio con 1 . 2

m1 de éter etílico-metano1 (9:l). Alícuotas de 500 1-11 cada una

fueron utilizadas para la determinación de los esteroides de la vía

mediante RIAs específicos, o bien fueron contadas directamente en

viales de vidrio adicionados con 5 m1 de Instagel (Packard) para

determinar los porcentajes de transformación de l o s precursores

añadidos.

. . . . . . . ""

4 5

5.5. DETERMINACION CUANTITATIVA DE LOS ESTEROIDES.

Las determinaciones de los esterlDides se realizaron por medio de

R I A s específicos, utilizando como fuente de los anticuerpos sueros

de conejos previamente inmunizados con esteroides unidos a través

de diferentes grupos funcionales (preferentemente en la posición

19-OH) , en forma de hapten0 a la albúmina sérica bovina en

diferentes proporciones (156) mediante residuos de ácido succínico.

Los marcadores radiactivos utili.zados fueron: ( 3H) -1,2-C01 (44.7

Ci/mmol) , ( 3H) -7-Preq (25 Ci/mmol) , ( 3H) -1,2,G17-Prog (100 Ci/mmol) ,

( 3H) -l12-170HProg ( 5 0 Ci/mmol) , ( 3H) -1,2,6,7-A (100 Ci/mmol) , ( 3H) -

1,2,G-T (100 Ci/mmol) y (3H) -6,7-E (45 Ci/mmol) , previamente

purificados por cronatografía en (capa fina de acuerdo a lo señalado

en el inciso anterior.

Tomando en consideración las cantidades de l o s diferentes

esteroides de la vía normalmente encontradas en homogenizados de

testículo completo de rata adulta. normal (157), se eligió un rango

de concentraciones de O a 1,000 pg para la curva patrón de cada

esteroide. Se partió de una soluc.ión madre de concentración 1 mg/ml

de cada esteroide puro disuelto en etanol absoluto; a partir de

ésta, se prepararon las siguientes diluciones: a) Solución N (1

ng/pl) , b) Solución E (20 pg/pl) , y c) Solución J (0.2 pg/pl).

La curva patrón para cada esteroide se preparó por quintuplicado,

de acuerdo a las proporciones sefialadas en la siguiente tabla:

4 6

Tubos Masa (Pg) Volumen ( ,LL 1 ) Solución

Totales

1-5

6 - 1 0

11-15

16-20

2 1 - 2 5

2 6 - 3 0

31-35

36-40

41-45

46-50

51-55

56-GO

-

O

1

2

4

10

2 0

40

100

200

400

1,000

10, 000

5

10

2 0

50

100

2

5

10

20

50

10

J

J

J

J

J

E

E

E

E

E

N

A cada suero se le evaluó su capacidad de unión con una

concentración inicial de aproximadamente 10,000 dpm del esteroide

correspondiente, disuelto en solución amortiguadora de fosfatos

(Na,HPO,/NaH,PO, 0.1 M, NaCl 0.15 M , gelatina 0.1%, NaN, 0.1%, pH 7:

Amortiguador RIA). Los sueros fueron inicialmente diluidos en

proporciones desde a 1: 1,000 hasta 1: 500,000 para determinar la

dilución adecuada para unir el 50% de la radiactividad adicionada

en l o s rangos de sensibilidad determinados para cada esteroide.

4 7

Las diversas curvas patrón fueron incubadas por quintupiicado

durante 18-22 horas a 4OC para lograr el equilibrio de unión. Al

final de la incubación se agregaron 200 y1 de una suspensión de

carbón activado-Dextrán T70 (0.625-0.0625%) a cada tubo para

separar la fracción libre de la unida al anticuerpo, y se

centrifugó a 3,000 rpm durante 15 minutos a 4OC. El sobrenadante

que contenía la fracción unida se decantó a viales de conteo con 5

m1 de Instagel como líquido de centelleo y se contó en un

espectrofotómetro de centelleo ITquido Packard Tri-Carb 3390 con

una eficiencia en condiciones óptimas del 51% para 3H, como se ha

señalado anteriormente.

Las proporciones de sueros utilizadas fueron las siguientes: Preg,

Prog y 170HProg 1:10,000; A y T, 1:5,000, y E 1:3,000. Las

alícuotas obtenidas de las incubaciones de fracciones enriquecidas

en CL y CS mencionadas anteriormente, fueron procesadas de manera

semejante a lo señalado arriba, y las concentraciones de los

diversos esteroides presentes se determinaron por interpoiación en

las curvas patrón correspondientes.

Las concentraciones de los diferentes esteroides endógenos y

transformados, tanto en células estimuladas como en los controles

no estimulados, fueron comparadas mediante pruebas de T de Student,

y las diferencias entre dichas concentraciones fueron consideradas

significativas a un nivel de p menor de O. O 1 (p<O. 01) .

6 . RESULTADOS.

6.1. OBTENCION DE FRACCIONES ENRIQUECIDAS.

El procedimiento de obtención de fracciones enriquecidas permitió

separar adecuadamente los componentes de l o s compartimientos

tubular e intersticial. En el caso de la fracción intersticial fue

posible, partiendo de una composición inicial de aproximadamente el

6% de CL (fracción intersticial- cruda) obtener una preparación

final con el 50% de pureza y un 90% de viabilidad (tabla 6.1). La

principal fuente de contaminación celular en este caso correspondió

a espermatocitos primarios y espermatogonias en lo tocante a

células nucleadas, además de eritrocitos, señal de contaminación

por residuos de sangre presentes en la preparación. Debe

mencionarse que no fue apreciable la presencia de espermatozoides,

espermátides o CS, que mostrarían la presencia de componentes

tubulares en la fracción enriquecida en CL.

Con el objeto de intentar la disminución de la proporción de

eritrocitos que contaminaba la preparación final de CL, se analizó

el efecto de tratamientos hipotcjnicos sobre la viabilidad de las

células esteroidogénicas. A diferencia de lo que sucede cuando este

tipo de tratamientos se aplican al conjunto de las células

sanguíneas, l o s choques hipot6nicos afectan sensiblemente la

viabilidad de las CL, la cual disminuye de un valor inicial cercano

49

al 90% a uno equivalente al 60-70% de las células presentes.

En lo que corresponde a la fracción enriquecida en CS, el grado

máximo de pureza obtenido fue de aproximadamente un lo%, con las CS

formando acúmulos celulares, en asociación con células de la línea

germinal. La utilización de distintos procedimientos

suplementarios, tales como la centrifuqación a través de soluciones

de Ficoll de diferentes densidades no logró un enriquecimiento

sustancial en cuanto a pureza, pero sí una disminución notable de

la viabilidad celular (tabla 6.1) .

La principal fuenre de contaminación celular correspondió a las

espermátides, las cuales debido a la gran diversidad de formas que

adoptan en funcien de la etapa de diferenciación en que se

encuentran ubicadas, poseen densidades muy diversas que las colocan

a todos los niveles de los gradientes de sacarosa e impiden su

separación completa de otros tipos celulares.

6.2. CARACTERIZACION DE PROTEINAS UNIDORAS.

Se ensayaron por separado los citosoles tanto de hornogenizados

completos de testículo, como de fracciones enriquecidas en CL y CS

para buscar proteínas unidoras de T, DHT y Proq. Los estudios

iniciales se enfocaron hacia la determinación de las condiciones de

ensayo de las proteínas unidoras que permitieran su caracterización

5 0

en presencia o ausencia de las concentraciones endógenas de los

esteroides normalmente encontradas en los tejidos.

Citosoles obtenidos de hornogenizados de testículo completo fueron

incubados directamente en presencia de los ligandos radiactivos o

bien incubados previa adición de 500 p1 de una solución carbón

activado-Dextrán T70 y centrifugación a 3,000 rpm durante 15

minutos a 4 O C . Los resultados obtenidos mostraron que la diferencia

entre los parámetros de unión de ambos tipos de citosol era mínima,

por lo que se decidió trabajar en adelante con citosoles no

tratados en for7,a alguna, ya que no existia interferencia

apreciable en el ensayo por parte de los esteroides endógenos.

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 6.2. Es evidente

que l o s componentes unidores se encuentran localizados en la

fracción tubular; ningún compcnente unidor se encuentra en la

fracción enriquecida en CL. Todas las proteínas unidoras

presentaron constantes de disociación (K,,) en el rango nanomolar

(lO"'-lO"'h), y presentan un número limitado de sitios de unión (N,),

por lo que es muy poco probable que representen componentes

inespecíficos de unión. Es notoria la ausencia de componentes

unidores de E en ambas fracciones testiculares, si bien se encontró

capacidad unidora cie E en homagenizados de testículos completos

(datos no mostrados).

Tomando en consideración l a s características de unión de l o s

1 2 6 3 8 7 51

componentes localizados en las fracciones enriquecidas en CS se

procedió al análisis de su especificidad. Para este efecto, se

consideraron esteroides tanto del tipo 04-3-cetona (T, A y Prog),

comon5-3-hidroxi (Dehidroepiandrosterona:DHEA), Sa-reducidos (DHT)

o con aromatización en el anillo il (E).

En la tabla 6.3 se muestran los resultados obtenidos al poner en

competencia dichos esteroides a 2 concentraciones diferentes de

ligando frío (lx y 100 x con respecto a la cantidad inicial de

esteroide radiactivo añadido) con el ligando radiactivo. Debe

señalarse que el blanco del ensayo presenta una unión inespecífica

de aproximadamente el 2 0 % , porcentaje que se ha restado de los

resultados obtenidos.

6.3. ESTEROIDOGENESIS EN FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE

LEYDIG.

Las concentraciones de los diversos intermediarios y productos de

la vía esteroidogénica de los esteroides n4 se muestran en la tabla

6 . 4 y la fig 6.1. En todos l o s casos puede observarse que la

producción esteroidogénica se mantiene durante el período

analizado, lo que se refleja en e1 aumento en la concentración de

todos los intermediarios, desde el. primero (Preg) hasta el producto

final T.

52

Es asimismo evidente el cambio de la pendiente de la curva de

biosíntesis a partir de aproximadamente los 60 minutos de

incubación, lo que parecería reflejar cambios en las velocidades de

producción esteroidoqénica. Esta circunstancia se vuelve más clara

cuando se grafican las velocidades de producción de los diversos

esteroides ( p q / 1 0 6 céls/min) , como se aprecia en la fig 6.2. Cabe

mencionar que existe una correlación clara entre las

concentraciones de los esteroides y la velocidad de su síntesis.

Cuando l a s CL se ven sometidas a l a estimulación por diversas dosis

de hCG durante períodos de 180 minutos, se observa una clara

estimulación de la producción de T, la cual es dosis-dependiente en

el intervalo analizado (fiq 6.3) . La máxima estimulación (a una dosis de 3 Uinl de hCG) representa aproximadamente el 1,300 % de la

concentración control de T producida durante las 3 h de incubación.

El patrón de biosíntesis observado al medir las concentraciones de

esteroides correspondientes a sus pozas rnetabólicas se observa

también cuando se determina la transformación de 3H-Prega lo largo

de la vía (tabla 6.5 y fig 6 . 4 ) . De esta forma, hacia l o s 120

minutos de incubación, el 64.9% de la Preq añadida ha sido

transformada prácticamente en un 60% hacia ambos andróqenos ( A y

T) , y esta proporc.ión se incrementa conforme se considera a los

siguientes intermediarios.

El intermediario con'sumido en mayor proporción (170HProg) es

53

asimismo el que presenta una menor concentración dentro de las

pozas metabólicas celulares. Al final de la incubación puede

observarse que no menos del 45% de cualquiera de los esteroides

transformados fue convertido en T.

En presencia de una dosis máxima de hCG (3U/ml), puede observarse

que hacia los 120 minutos de incubación se consumió totalmente el

3 ~ - ~ 0 1 añadido, lo que no se logra en las CL no estimuladas (fig

G . 5) . Por otra parte, el Col consumido entra a la vía

esteroidoqénica y es secuencialmente convertido en los precursores

de manera semejante a lo que sucede en las células no estimuladas

(fiq 6.6).

6 . 4 . ESTEROIDOGENESIS EN FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE

SERTOLI.

La producción de E por las CS durante períodos de incubación cortos

(0-180 minutos) se muestra en la tabla 6.6. Si bien la cantidad de

E sintetizada es pequeña (un máximo de 135 pg/106CS) , la producción

de dicha hormona no tiende a disminuir, aún tratándose de su

síntesis basal.

Cuando las CS son estimuladas por diferentes concentraciones de FSH

puede observarse un incremento significativo para todas las dosis,

a excepción de la más baja (O. 1 ng/ml) , a partir de l o s 30 minutos

La evaluación de la transforma.ción de diferentes precursores

marcados con tritio en la fracción enriquecida en CS demostró la

utilización tan solo de l o s esteroides de la vía de l o s 9 4 en su

transformación hacia l o s productos finales T, DHT y E (tabla 6.7).

Si bien la 3H-Preg fue metaboliza.da en aproximadamente un 2 5 % , la

radiactividad que provenía de ella no pudo ser detectada en la zona

cromatográfica correspondiente a ninguno de los c4-intermediarios.

Por otra parte, la 'H-Tadicionada. a esta fracción fue transformada

hacia los productos finales E y DHT casi en su totalidad hacia l o s

120 minutos de incubación (datos no mostrados).

. ..

FIGURA 6.1 Contenido de los diversos esteroides de la vía de los intermediarios c4 en las fracciones enriquecidas en células de Leydig de ratas adultas normales, incubadas durante períodos de hasta 180 minutos a 37OC. Cada punto representa e.1 promedio de 3 experimentos diferentes, con triplicados para cada tiempo analizado ( n : = 9 ) .

pg:n>dlbn CL

2500

2000

1500

1000 I

ANDROSTENDIONA

,,/

/

/ i

I

O 50 1 O 0 150 200

MINUTOS

O 50 1 O 0 150 200

MINUTOS * S

O 50 1 O 0 150 200

MINUTOS

FIGURA 6.2 Velocidades de producción de los diversos esteroides de la vía de l o s intermediarios -3 en fracciones enriquecidas en células de Leydig de ratas adultas normales, incubadas durante períodos de hasta 180 minutos a 3 7 ° C .

Panel A. Esteroides con 21 átomos de carbono (pregnenolona, progesterona y 17 OH- proqesterona) .

Panel B. Est.eroides con 19 átomos de carbono (androstendiona y testosterona) .

pg esteroide/rnillon CLimin

50 I 40 -

30 -

20 -

10 -

ESTEROIDES C21

/ .. , \

". - -4 I O I

O 20 40 60 a0 1 O0 120 140 MINUTOS - PREGNENCLONA PROGESTERONA 170H PROGESTERONA

pg esteroide:rnillón CLirnin

60

50

40

30

20

10

0.

ESTEROIDES C 1 9

I

O 20 40 60 80 1 O 0 120 140 MINUTOS

ANDROSTENDIONA TESTOSTERONA -

FIGURA 6.3 Síntesis de testosterona (T) por fracciones enriquecidas en células de Leydiq de ratas adultas normales, incubadas en presencia de diferentes dosis de qonadotropina coriónica humana (hCG) durante períodos de 130 minutos a 37OC. Cada punto representa el promedio de 3 experinentos diferentes, con tubos en triplicado para cada concentración de hCG utilizada (n:=9).

La producci'jn de T es siqnificativamente diferente al control no tratado con hCG (pCO.01) a pa.rtir de una concentración final de hCG de 0.03 U / m l .

O L

PRODUCCION DE T

pg T/millón CL/h

.. .. . I

0 CONTROL n t ICG 0.03 Ulml

EN PRESENCIA DE HCG

7r

TRATAMIENTO

0 hCG 0.0003 UlmI 0 hCG 0.003 U/ml

hCG 0.3 UlrnI m hCG 3 Ulnd

* Diferente al control (p <0.01)

FIGURA 6.4 Transformacibn de l o s diversos 'H-esteroides adicionados a fracciones enriquecidas en células de Leydig de ratas adultas normales. En cada pane.1 se representa el porcentaje del esteroide correspondiente transformado a los diversos ~4-intermediarios de la vía.

Panel A. Transformación de la 'H-pregnenolona. Panel B. Transformación de la 'H-progesterona. Panel C. Transformación de la 'H-170H

Panel D. Transformaciónde la 'H-androstendiona. progesterona.

% PREGNENOLONA TRANSFORMADA

120!

% PROGESTERONA TRANSFORMADA

. O 0

S o YO

60 60

30 40

20 20

' 9 , 17 OH PROGESTERONA TRANSFORMADA

1 O 0

a o

60

40

20

0 5 10 20 30 1 5 60 90 120

MINUTOS

TESTOSTERONA ANOROSTENOIONA

1 O 0

80

60

40

20

o

'% ANDROSTENDIONA TRANSFORMADA

5 io 20 30 35 60 90 120 MINUTOS

TESTOSTERONA

FIGURA 6.5 Consumo de 'H--colesterol añadido a las fracciones enriquecidas en células de Leydig de ratas adultas normales, incubadas durante períodos de h.asta 180 minutos a 37°C. Cada punto representa el promedio de 3 experimentos diferentes, con tubos por triplicado para cada tiempo analiz.ado (n=9) .

Todos los porcentajes de transformación para las células estimuladas con gonadotropina coriónica humana (hCG) a una concentración final de 3 U / m l son significativamente diferentes con respecto a los controles no estimulados (p<O.Ol) a partir de l o s 10 minutos de incubación.

.

í 1

i

I

O

O O o O O O O O N O 03 CQ -3 cv

FIGURA 6.6 Porcentaje de radiactividad total añadida inicialmente en forma de 'H-colesterol a fracciones enriquecidas en células de Leydig de ratas adultas normales, que es transformada a los diverc,os c4-intermediarios de la vía esteroidoqénica, en células no estimuladas o estimuladas con una dosis de gonadotropina coriónica humana (hCG) de 3 U / m l , durante períodos de hasta 180 minutos a 37OC. Cada punto representa el promedio de 3 experimentos diferentes, con tubos por triplicado para cada tiempo analizado (n=9) .

Los porcentajes de 'H-colesteroi transformado a los diversos intermediarios es significativamente diferente en las células estimuladas con respecto a sus controles a partir de l o s 10 minutos de incubación para l o s intermediarios c21 (preqnenolona Y progesterona) , o a partir de l o s 3 0 minutos para l o s andrógenos (androstendiona y testosterona) (p<O. 01) .

Panel A. Trsnsformación a 'H-pregnenolona. Panel B. Tr3nsformación a 'H-proqesterona. Panel C. Transformación a 'H-androstendiona. Panel D. Transformación a 'H-testosterona.

Y o RADIACTIVIDAD TOTAL

30

PREGNENOLONA

25 -

20 -

15 - f""--

O/o RADIACTIVIDAD TOTAL

- - I PROGESTERONA

O 5 0 1 O 0 150 200 O 50 100 150 200

MINUTOS MINUTOS - CONTROL -*- hCG - CONTROL --I(c hCG

'Yo RADIACTIVIDAD TOTAL

25

ANDROSTENDIONA

20

- / 15

-

'/o RADIACTIVIDAD TOTAL

TESTOSTERONA

40 -

30 -

O 50 1 O 0 150 200 O 50 100 150 200

MINUTOS MINUTOS - CONTROL hCG - CONTROL -*- hCG

. . .. . .

FIGURA 6.7 Síntesis de 1713-estradiol (E) por fracciones enriquecidas en células de Sertoli de ratas adultas normales, no estimuladas o tratadas con diferentes dosis de hormona folículo estimulante (FSH) durante períodos de hasta 180 minutos a 3 7 O C . Cada punto representa e.1 promedio de 3 experimentos diferentes, con tubos por triplicado para cada tiempo analizado (n=9).

Las cantidades producidas de E son significativamente diferentes para las células estimuladas 'con todas las concentraciones de FSH utilizadas, excepto ia más baja ( F S H 1 ) para todos l o s tiempos analizados (p<O.Ol).

FSH1: 0.1 ng/ml FSH2: 1 ng/ml

FSH3: 10 ng/ml FSH4: 100 ng/mi

._

W W

v)

v) W I- z v)

I W ce m O v)

I v) LL W

n -

a

n O I-

LL

o O O O

O N W

o \

c.

O

FIGURA 6.8 Efecto de las diferentes dosis de hormona folículo estimulante (FSH) sobre la síntesis de 17B-estradiol en fracciones enriquecidas en células de Sertoli de ratas adultas normales, incubadas durante períodos de 180 minutos a 3 7 O C . Cada punto representa el promedio de 3 experimentos diferentes, con tubos por triplicado para cada dosis de FSH utilizada ( n = 9 ) .

La producción de E es significativamente diferente al control no estimulado ( ~ ~ 0 . 0 1 ) para todas l&s dosis de FSH excepto la más baja (FSH1) .

FSH1: O . 1 nq/ml FSH2: 1 ng/ml

FSH3: 10 nq/ml FSH4: 100 ng/ml

W W

cn cn W I- 7 cn

n

a A W U m O cn I v, LL W n O t- o W LL W

W m P

O O

O O

O O

O O

O O

O I- 7 W

2 a a t-

U I-

O

TABLA 6.1

CELULAS DE LEYDIG Y SERTOLI EN LAS FRACCIONES OBTENIDAS DEL TESTICULO DE RATA ADULTA

FRACCION CELULAR % PUREZA" % VIABILIDADb

Fracción de células de Leydig purificadas a través de Ficoll 5 0 f 7 ( 2 4 ) ' 90 5 3 ( 2 8 )

Fracción de células de Sertoli sedimentadas a través de un gradiente de sacarosa 7 2 3 ( 2 2 ) 92 i 2 ( 2 3 )

Fracción de células de Sertoli sedimentadas y posteriormente centrifugadas a través de Ficoll 11 2 2 ( 8 ) 80 k 12 ( 8 )

'Las células fueron teñidas con fucsina ácida e identificadas por su morfología. La contaminaci6n en la fracción intersticial corresponde a espermatocitos primarios y espermátides y en la fracción tubular las células diferentes a Sertoli son principalmente espermatocitos primarios.

bEstimada por exclusión de azul de tripán.

'Promedio 2 desviación estándar,; el número de observaciones se indica entre paréntesis.

TABLA 6 . 2

LOCALIZACION DE PROTEINA UNIDORAS DE ESTEROIDES EN FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE LEYDIG Y SERTOLI"

ESTEROIDE CELS. LEYDIGb CELS. SERTOLI'

TESTOSTERONA

Sa-DIHIDROTESTOSTERONA

PROGESTERONA

N D,

ND

ND

K,j 6.90 1 3 . 2 3 N, 1.20 i: 0 . 3 9

K, 1.00 2 0.11 N, 0.19 ? 0.06

KLi 5.50 ? O . 66 N, 0.15 k 0.01

"Los citosoles de las células aisladas fueron ensayados en cuanto a su capacidad de unión a los 3H-esteroides señalados mediante incubaciones a una temperatura de 4OC durante 18 horas y un tratamiento posterior con una solución de carbón-dextrán para separar l o s esteroides unidos tie los libres. Los datos fuercln procesados de acuerdo al análisis gráfico de Scatchard, y l o s valores de K, y N, representan los promedios k desviaciones estándar de los parámetros cinéticos de cada tipo de receptor, obtenidos a partir de un ajuste lineal de una curva de unión Construida con al menos 5 puntos diferentes, cada punto ensayado por triplicado.

bCélulas intersticiales (43-57% de células de Leydiq) . 'células tubulares (5-11% de células de Sertoli) . dND = No detectable.

'Promedio 2 desviación estándar expresado en M.

. .

TABLA 6 . 3

INFLUENCIA DE DIVERSOS ESTEROIDES SOBRE LA CAPACIDAD DE UNION DE 3H-T Y 3H--DHT EN CITOSOLES DE

FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE SERTOLI'

ESTEROIDE COMPETIDOR 3H-ESTEROIDE

INDICE MOLAR 'H-T Ti-DHT

CONTROL

TESTOSTERONA

100 100

l x 100 x

6 3 b 5 3

5 0 47

5a-DHT l x 100 x

6 1 5 3

61 4 3

17R-ESTRADIOL l x 100 x

82 83

8 0 81

PROGESTERONA l x 100 x

84 79

ANDROSTENDIONA l x 100 x

85 79

91 110

111 105

DHEA l x 100 x

83 7 5

Titosoles de fracciones enriquecidas en células de Sertoli fueron incubados en presencia de 3H-Testosterona (T) o 3H-5cr- Dihidrotestosterona (DHT) y concentraciones equimolares (lx) o 100 veces mayores (1OOx) de diversos esteroides fríos competidores durante 18 horas a 4OC. Una vez finalizado el período de incubación, los esteroides libres fueron separados mediante centrifugación en presencia de una solución de carbón-dextrán y cuantificados mediante espectrofotometría de centelleo.

bPorcentaje de unión con respecto a un control sin esterolde competidor alguno.

+

TABLA!. 6 . 4

FRODL-CCI@?I ESTE401DOGENIC>A ZN FTWCCIOXES E:!RIQ!JECIDAS EN CELL;AS CE L Z i D I G DURANTE PERIODOS C3RTGS 3E INCUBACION"

-" LL EROIDE

TIEYPO DE IYCUB-&CION ( M I N )

3 0 G o 120 180

"2 x 10' zélulas de Le>-dig fueron incubadas por triplicado a una temperatcra de 3 7 ° C en un volumen total de 500 i ~ 1 durante períodos de 0-180 Tinucos . La actividad enzinática fue detenida por la adición ?e un volumen igual de N a O H 2N, l o s esteroides fueron extraídos con éter, separados psr cromatograf ía en capa fina y cuantificados a través de radioinmunoanálisis específicos.

PORCENTAJE DE 'H-ESTEROIDES METABOLIZADOS POR CELULAS DE LEYDIG DURANTE PERICDOS CORTOS DE INCUBACION"

TIEMPO CE INCCBACION (YIN) ?REG PROG 170HP A

- 3

10 20 30 t 3 "

60 90

120

5.1 2.9 15.9 23.2 32.4 40.9 $7.1 54.9

4.7 8.3

11.3 15.2 20.8 27.9 44.9 68.2

- s . 1 I . " 12.1 14.2 18.6 20.0 23.3 26.3 2 7 . 0 31.3 34.9 36.0 56.5 -io. 1 8 2 . 9 14.5

" O

-

" 3 x 10' células de Leydiq fueron incubadas por triplicado a una temperatura de 3 7 O C en un volumen final de 500 p l , en presencia de aproximadamente 10' cpm de los diferentes 'H-esteroides señalados. La actividad enzimática fue detenida por la adición de un volumen igual de :JaOH 2N, los esteroides fueron extraídos con éter, separados por cromatoqrafía en capa fina y cuantificados por espectrofotometria de centelleo. Los datos representan el promedio de tres incubaciones diferentes, y los porcentajes se calcularon con respecto a la cantidad inicial de 'H-esteroide añadido.

TABLA 6. G

PORCENTAJE DE 'H-ESTEROIDES METABOLIZADOS POR CELULAS DE SERTOLI SLRANTE PERIOIIOS CORTOS DE INCUBACION"

TIEMPO ( M I N ) ?REG PROG 170H A r

10 20 3 0 60 O 0 120

26.5 29.5 5 2 . 9 2 0 . 2 L 3 . 3

29.8 3 G . 2 68.1 49.7 44.6 25.5 l l . 5 79.7 61.4 54.6 27.2 59.7 91.6 31.2 6g.5 27.0 71.5 96.9 93.7 2 2 . 3 28.7 84.9 99.0 97.9 5 2 . 7

- m " -

'3 x 10' células de Sertoli fueron incubadas por triplicado a una temperatura de .37"C En un volumen final de 500 p l en presencia de aproximadamente 1O'sprn de los 'H-esteroides señalados. La actividad enzimática fue detenida por la adición de un volumen igual de NaOH 2N, los esteroides fueron extraídos con éter, separados por cromatoqrafía en capa fina y cuantificados por espectrofotometría de centelleo. Los datos representan el promedio de tres incubaciones diferentes, y l o s porcentajes se calcularon con respecto a la cantidad inicial de :H-esteroide añadido.

TABLA 6 . 7

EFECTO C E LA FSH SOBRE LA PROCLCCION DE ESTRADIOL POR FRACCIOPJES ENRIQUECII3AS EN CELULAS DE SERTOLId

XINUTOS TRAT.XMIENTOb

CONTROL FSHl FSH2 FSH3 FSH4

15

30

4 5

G O

7 - I 3

90

120

18 o

::D.

:iD

25113

G G r 2 0

7 5 ~ 1 9

50221

105127

1 3 5 ~ 3 7

: iD

r? D

30-9

55116

, Or15

85220

-

110?20

1 2 5 ~ 2 8

2 O T S

4 5 x 1 0

35x12

135123

1 9 0 ~ 2 5

235229

290t30

3i5r24

30?9

GOi10

120i23

165x23

225+34

320k22

3 7 5 2 3 2

330131

'Triplica volumen durante

.dos de tubos conteniendo 2 x 10' células de Sertoli en un final de 500 u1 fueron incubados a 3 7 O C con agitación l o s períodos señalados en la tabla. La incubación fue

detenida por adición de un volunen igual de una solución 2 N de NaOH, l o s esteroides fueron extraídos con éter y el estradiol cuantificado a través de un radioinmunoanálisis específico.

"Se añadieron las siguientes concentraciones finales de FSH: O . 1 ng/ml ( F S H l ) , 1 ng/ml ( F S H 2 ) , 10 ng/ml (FSH3) o 100 ng/ml (FSH4).

-ND = No detectable.

5 5

7 . DISCUSION.

7.1. ANALISIS DE LOS RESULTADOS DE LA OBTENCION DE FRACCIONES

ENRIQUECI2.4S EN CQMPARACION CON DIVERSAS METODOLOGIAS 'PREVIAMENTE

REPORTADAS.

Existen iiferentes netodologías [que han sido utilizadas para 1a

obtención je rracciones enriquecidas en diversas estirpes celulares

a partir 5e testículos de animales normales o alterados, adultos,

púberes c prepúberes, c u y o s rendinientos -.-arían ampliamente, al

iguai que io hacen las condiciones norfolóaicas y funcionales en

que las células se encuentran al L+lnal del procedimiento de

separacicn.

. .

LOS estudios iniciales desarrollados por Christensen y Yason (131)

permitieron la separación húmeda cruda de túbulos seminiferos y

compartimiento intersticial, no s610 en ratas adultas, sino también

en ratón, cuyo, hamster y otras Especies menores. Es, sin embargo

menester 7.encionar que las fracciones obtenidas de esta forma no

pueden ser distinguidas funcionalmente, ya que ambas son capaces de

metabolizar 4-''C-Prog con eficiencias semejantes, lo que revela una

contaminación de la fracción tubular por parte de C L .

\

Es posible obtener una mejor separación entre ambos compartimientos

cuando se utilizan enzimas proteolíticas que ayuden a la digestión

5 6

de l o s componentes que mantienen la integridad del ccnpartixiento

intersticial. Así, diversos investigadores utilizaron tratamientos

durante tiempos cortos con diferentes concentraciones de colagenasa

(134,145), DNAsa I (158) o tripsina-EDTA (137), para obtener

preferentemente a 'xna de las 2 fracciones, en szasiones en

detrimento de la integridad funcional de la otra.

Refinamientos técnicos posteriores incluyeron la ctilización de

tratamientos enzimáticos alternativos con ylicina/colagenasa (136) ,

pancreatina (134) o hialuronidasa (159) o tratamientos térmicos

post-siembra (160) para el caso de la separación para cultivo

primario de células del túbulo seminífero, así como la

centrifuqación a través de gradientes de densidad de Ficoll (146) ,

Percoll (147) o Metrizamida (148) en el caso de la obtención de

fracciones enriquecidas en CL.

La pureza de las fracciones obtenidas así como su viabilidad y

funcionalidad varían ampliamente de acuerdo a la técnica utilizada.

Así, las fracciones enriquecidas en CL pueden ilegar a tener una

pureza de cerca del 60% después de la centrifugación a través del

Ficoll (146), más del 90% cuando se utilizan gradientes de Percoll

(149), y un máximo del 94% en el caso de los gradientes de

Metrizamida (161), aún en el caso de que se manejen testículos de

animales adultos. Sin embargo, cabe mencionar que en algunos de

estos casos, particularmente cuando se utilizan gradientes de

Percoll, existen dudas fundamentadas acerca del efecto que esta

. . .

En el caso de las fracciones enriquecidas en CS, la situación varía

ampliamente dependiendo de si se utilizan animales inmaduros o

adultos para la separación de los compartimientos testiculares. De

esta forma, es posible obtener fracciones de CS prácticamente puras

cuando se trabaja con testículos de animales de 10-20 días de edad

(134), dada la ausencia de formas avanzadas de células de la línea

germinal y -3 la falta de una barrera hematotesticular

definitivamente constituida (164:. En cambio, la proporción de CS

en l o s testículos de animales adultos no llega al 1% del total

celular, y la presencia de uniones intercelulares bien

desarrolladas ccmplica los procesos de su separación y purificación

(150) .

En este trabajo se reportan Los resultados de combinar las

metodologías planteadas originalmente por Welsh & Wiebe (134) para

la separación de CS de ratas inmaduras, y por janszen y cols (146)

para la obtención de CL en ratas 'adultas, a ratas macho normales de

90 días de edad.

De acuerdo a lo señalado en la tabla 6.1, las fracciones

enriquecidas en CL tienen una pureza de 5 0 2 7 % con una viabilidad

final del 90+3%, a partir de una "pureza inicial" del 6% con

58

respecto al testículo completo. E s c o s resultados sGn comparables a

10s obtenidos por Janszen y cols (?.;6), los ccales reportan purezas

de 59?17% después de hacer pasar ].as células aisladas a través del

Ficoll, por una solución de dextr6n al 6%. Tratamientos semejantes

con soluciones de dextrán realizados a las CL purificadas por la

metodología planteada en este trabajo no incrementarcn

significativamente la pureza de la fracción, pero sí disminuyeron

la viabilidad aproxinadamente hasta un valor máximo del G O % .

En lo que toca al rendimiento cel.ular obtenido, Gale y cols (147)

utilizando centrifuqacien a travi!s de Percoll, reportan cifras de

1.5 x 10 células totales por testiculo, de l a s cuales el 74% serían

de Leydiq, mientras que Sharpe y Cooper (165) reportan un total 2e

27.824 .4 x lo6 CL de un total de 55 millones de células obtenidas

por testículo nediante tratamientcs únicamente con colagenasa.

G

El esquema de separación aquí reportado permite obtener

aproximadamente un total de 20 x 10Ucélulas intersticiales por par

de testículos, de las cuales aproximadamente la mitad serían CL

juzgadas por criterios morfológicos, previa tinción de

preparaciones fijas con fucsina ácida. Esta cifra representaría una

recuperación aproximada d e l 30% del número total de las CL, que

mediante criterios morfométricos ha sido estimada en 34 x 10'

células por testículo de rata adulta (166), y además serían viables

en una gran proporción, a diferencia de l o s casos anteriormente

mencionados, donde la viabilidad puede llegar a disminuir hasta un

r

59

70% en algunos casos.

Mendelson y cols (167) reportaron que las suspensiones crudas de

testículos de ratas adultas tratadas únicamente con colagenasa

contienen el 50% de CL libres de eritrccitos. Este reporte ha sido

cuestionado por diversos autores (p. ej. 147 j , y es muy claro que

las fracciones enriquecidas en C:L obtenidas como resultado del

desarrollo de esta tesis se ven fuertemente contaminadas con

eritrocitcs, a pesar de su centrifugación a cravés de la solución

de Ficoll-BSA 13%-0.2%. Janszen y cols (116) reportaron que la

densidad celular de los eritrocitos es aprDximadamente de 1.075

g/ml, por lo que sería imposible que éstos f,eran excluidos por la

solución de Ficoll, la cual presenta ana densidad aproximada de

1.053 g/ml.

Como resultado de la centrifugaci6n a través del Ficoll, la mayoría

de las células "ligeras1' (espermatozoides y espermátides) quedan

retenidas en la interfase, mientras que las células mayores o

"pesadas" sedimentan. Un análisis corfológico de la pastilla

celular (fracción enriquecida en CL) refleja que la principal

contaminación celular corresp0nd.e a espermatocitos primarios y

algunas espermátides, las cuales debido a sus formas muy variadas,

presentan un amplio espectro de ciensidades. Es prudente mencionar

que, al menos bajo un criterio puramente morfológico, la fracción

intersticial enriquecida parece estar libre de CS.

6 0

Cuando se comparan l o s resultados obtenidos con aquéllos reportados

por autores que utilizaron qradientes de densidad de Metrizamida o

Percoll para la separación de diferentes poblaciones de células de

Leydig, se puede observar que la densidad celular de la fracción

obtenida por centrifuqación a través de la solución de Ficoll-BSA

corresponde a las poblaciones con mayor capacidad de respuesta

esteroidogénica (ver más adelante).

En lo que toca a la fracción enriquecida en CS, iss datos

existentes en la literatura son escasos, y más bien se refieren a

sistemas de cuitivo prinario (150). Los datos presentados en la

tabla 6.1 reflejan una baja pureza (7i3%) con una elevada

viabilidad ( 5 2 t 2 % ) , una vez recuperadas l a s fracciones del

gradiente correspondientes originalmente al 4 y 5% de sacarosa.

Esta pureza representa un enriquecimiento de aproximadamente 5x con

respecto a la cantidad original de CS en un túbuio seminífero

adulto (98) , y no pudo ser incrementada sustancialmente por

centrifuqaciones posteriores a través de soluciones de Ficoll-BSA

que disminuyeron la viabilidad inicial al 80512%.

6 1

7.2. PRESENCIA DE PROTEINAS UNIDORAS DE ESTEROIDES EN LAS

FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN CELULAS DE LEYDIG Y CELULAS DE SERTOLI.

La localización de componentes unidores de esteroides como un

parámetro para determinar el grac,o de contaminación por parte de

las fracciones enriquecidas de los diversos compartimientos

testiculares ha sido descrita anteriormente en la literatura. Es,

sin embarqo menester mencionar que no existe un total acuerdo con

respecto ni a la ubicación de 1.0s camponentes unidores en los

compartimientos testiculares, ni en lo que toca a la variación de

esta presencia en términos de la edad o condición de l o s animales

analizados.

7.2.1. Receptores de andrógenos.

La evidencia inicial de receptores de andróqenos en el testículo

provino de estudios in vivo realizados con marcadores radiactivos

en animales hipof isectomizados (168) , donde se ubicaron componentes

unidores tanto citosólicos como nucleares. Vernon y cols (169)

plantearon inicialmente la existencia de 2 diferentes componentes

unidores ubicados en l o s túbulos seminíferos de ratas adultas

hipofisectomizadas caracterizados por su alta afinidad a T y DHT,

uno de los cuales podía ser equivalente a la proteína unidora de

andróqenos (ABP) reportada originalmente por Ritzén y cols (170).

Wilson & French (171) describieron las parámetros cinéticos de

62

unión de los presuntos receptores testiculares de andrógenos, y los

compararon con aquéllos reportadcs para los receptores de

andrógenos descritos en epidídino y próstata, encontrando

constantes de equilibrio de disociación (Kd) para T y DHT de 2-5 x

IO-'%, y una mayor ?finidad por !:ET que por T. Otros receptores

citoplásmicos de andrógenos con características semejantes a las

descritas han sido caracterizados en testículos de otras especies

de mamíferos (172 , 173 j .

Estos receptores anarogénicos son claramente distinguibles de la

ABP tanto a través de sus propiedades fisicoquímicas tales como la

.Jida media de disociación del andrcjgeno unido (a T=O°C, t1/2=2 días

para el receptor y 6 xinutcs para . A B P ) , como por su comportamiento

en electroforesis en gel de poliacrilamida (Rf de 0.25 para el

receptor citoplasmático y de O. 5 para ABP en geles al 7%) , su

termosensibilidad y su patrón de especificidad (174,175).

Tindall y cols (176) describieron inicialmente la presencia del

receptor de andrógenos en fracciones enriquecidas en CS aisladas de

animales hipofisectomizados, y Sanborn y cols (177) localizaron

receptores citoplásmicos y nucleares en CS obtenidas de ratas

inmaduras y mantenidas en cultivo durante 2-3 días.

Aunque algunos autores reportan una unión muy débil al receptor de

andrógenos por parte de la cronatina de células de la línea

germinal (178), existe un acuerdo respecto a que las CS representan

6 3

el sitio principal de unión a andrógenos en el compartimiento

tubular, y de que no existe un significativo componente unidor en

la fracción intersticial del testículo, lo que convertiría a los

receptores de andrógenos en marcadores adecuados de la pureza de la

fracción tubular.

Los resultados obtenidos en este trabajo (tabla 6.2) rnuestran que

la fracción enriquecida en CS presenta componentes unidores de T y

DHT eon una Kdae 6.90t3.23 y 1.00:t0.11 nM respectivamente, dentro

del rango descrito por otros autores ya mencionados (171,176) para

receptores de andrógenos. Es claro, de acuerdo a lo señalado en

esta tabla, que no fue posible detectar componente unidor alguno en

la fracción intersticial, lo que podría representar una evidencia

de la no contaminación cruzada de l o s ccmpartimientos testiculares.

En io tocante a la especificidad de la unión, de acuerdo a lo

observado en la tabla 6.3, cuando 3H-T o 3 H - D H T funcionan como

ligandos, ambos andrógenos presentan una capacidad equivalente para

su desplazamiento de la unión, lo que se aprecia cuando actúan

Prog, A o DHEA como competidores. ;3s interesante observar que el E,

aunque en una proporción menor, logra desplazar también a la marca

radiactiva de los componences unidores, aunque su estructura

molecular no sugeriría la posibilidad de interaccionar con el

anillo A, el cual es la parte de la molécula receptora responsable

de la especificidad de unión (174).

6 4

Tomando en cuenta los resultados obtenidos, particularmente

aquéllos relacionados con la afinidad de l o s diferentes andrógenos

por los componentes unidores, y los relacionados con las constantes

cinéticas de unión, las evidencias parecerían apoyar que en este

nodelo de estudio, las especies nolecuiares que anen andrógenos

parecerían corresponder más bien a1 componente receptor que a la

proteína transportadora de andróge.nos ABP.

Sanborn 1; cois (177,179) han mostrado que ios andrógenos, en

términos generales compiten más fuertemente que los

qlucocorticoides o l o s estrógenos 'para desplazar l a narca unida en

pruebas de especificidad, resultad.os semejantes a los encontrados

por Schmidt y Danzo en cultivos de CS de animales inmaduros (180).

Si bien en este trabajo no se incluyeron a l o s qlucocorticoides

dentro de l o s esteroides competidores, datcs obtenidos por Ortlip

y cols (181) sugieren que estas 2 familias de esteroides no se

interfieren mutuamente en cuanto la unión a sus receptores

específicos.

7.2.2. Receptores de estrógenos.

Abney (182) describió un componente unidor de estrógenos en citosol

de homogenizado completo de testículo, con una Kdde 4.0721.05 x lolo

M-', cuyas características fisicoquímicas de unión difieren de

acuerdo a la edad del animal (1E83,184). Este componente unidor

parece ser muy lábil, ya que tanto la desensibilización por parte

, ..

6 5

de gonadotropinas (185), como pequeñas variaciones térmicas (186)

son capaces de inactivarlo.

Mulder y cols (187) reportaron inicialmente la presencia de un

componente unidor de E en l a s fracciones citoplasmática y nuclear

del tejido intersticial de testículo de rata aislado mediante la

técnica de disección húmeda, mientras que Van Beurden-Lamers y cols

(188) determinaron en estas mismas fracciones un intervalo de 100-

150 fmol E/mg proteína como la máxima capacidad de unión. A pesar

de esto, debe mencionarse que l o s receptores ubicados en la

fracción nuclear son muy difíciles de determinar, debido a la gran

cantidad de componentes no especificos de unión presentes en el

sistema (189).

Estudios realizados con fracciones intersticiales purificadas a

través de Metrizamida o Percoll (185,190), han permitido asignar a

las CL la ubicación de los receptores de estrógenos, l o s cuales

parecen ser muy específicos para E, ya que no permiten el

desplazamiento de l a unión de 3H-E por esteroides de ninguna otra

familia (182).

De acuerdo a l o s resultados obtenidos en este trabajo, no fue

posible detectar unión específica alguna a E en ninguna de las

fracciones testiculares aisladas. Aunque no se detalla dentro de

los resultados, l o s homogenizados de testículo completo presentan

capacidad de unión a 3H-E en el rango de Kd de lo%, capacidad que

_.

6 6

ya no puede ser detectada al ensayar las fracciones separadas.

Pueden existir varias razones que expliquen estos resultados. En

primer lugar, el tipo de 3H-E utilizado presenta una actividad

específica relativamente baja (42.56 Ci/mmol), lo cual permitiría

distinguir los componentes unidores tan solo en el caso de que se

presentaran en una concentración relativamente elevada, lo que

podría ser el caso en los homogenizados de testículo completo, pero

no necesariamente en los citosoles de las fracciones enriquecidas

en CL.

Por otra parte, la presencia de otros componentes unidores , o de

las mismas enzimas de l a vía esteroidogénica por l a s que el E

presenta afinidad ( 1 9 1 ) , podrían contribuir a "secuestrar la marcall

e impedir la adecuada visualización de un receptor específico.

Debe, sin embargo, mencionarse que la primera posibilidad señalada

es muy poco probable, ya que de acuerdo a los resultados obtenidos

en este trabajo, no parece haber componente unidor de esteroides

alguno en la fracción intersticial del testículo. En lo que toca a

la segunda posibilidad, no se tienen los datos suficientes como

para evaluar la importancia de su participación a este respecto.

Cabe aclarar por otra parte, que si bien diversos autores han

señalado la existencia de estos receptores en la fracción

intersticial del testículo, no ha podido establecerse hasta la

fecha con la suficiente claridad el papel de los estróqenos en la

7 . 2 . 3 . Receptores de proqestáqenos.

Son pocos los investigadores q u e han reportado la presencia de

eomponentes unidores de proqescáqenos en tescículos cie mamífero

(175,193). Schmidt & Danzo (180) fueron los prineros en reportar la

presencia de un componente uniaor de Proa en citosol de CS de ratas

inmaduras mantenidas en cultivo primario, el cual es relativamente

insensible a la competencia por parte del 25020, el zcetato de

nedroxiproqesterona y la T.

Estos datos sugieren que pueden existir 2 tipos diferentes de

moléculas unidoras en el citoso:L de las CS ya que, aunque las

proqestinas son capaces de interaccionar con l o s receptores de

andrógenos, no presentan una fuert.e capacidad de desplazar la unión

de 'H-T en ensayos de competencia, lo que podría representar la

existencia de un receptor específico para Proq presente en estas

células.

Los resultados obtenidos

existencia de componentes

nM ell la fracción tubular

en este trabajo (tabla 6.2) señalan la

unidores de Pro9 con una Kdde 5 . 5 0 2 0 . 6 6

enriquecida en CS, e indican que Prog no .

68

es capaz de desplazar a 3H-T o 3FI-DHT de su interacción con estos,

lo que parece estar de acuerdo con lo señalado por Schmidt & Danzo.

.l 1 . 3 . PATRONES ESTEROIDOGENICOS E:N LAS FRACCIONES ENRIQUECIDAS EN

CELULAS CE LEYDIG Y CELLLAS DE SERTOLI.

7.3.1. Fracción intersticial.

Diversos autores han reportado el estado funcional tanto basal como

posterior a estimulaciones con hClS de fracciones enriquecidas en CL

obtenidas por diferentes métodos con el objetivo de plantear cuál

de las metodologías empleadas permite obtener un mayor rendimiento

unido a un mejor mantenimiento del adecuado funcionamiento

metabólico celular.

Sharpe & Cooper (194) , al comparar los métodos de disección húmeda,

dispersión con colagenasa y una combinación de ambos, detectan una

producción basal de T de 2.920.2 :ng/106 células positivas a tinción

6 9

para 3D-hidroxiesteroide deshidrogenasa en un período de 4 horas,

la cual es Prácticamente igual a los 2 . 7 2 0 . 2 ng que se obtiene para

las fracciones resultantes de trat.amientos con colagenasa. Por otra

parte, Cooke y cols (149) determinaron que los tratamientos

mecánicos previos 3 la dispersión con colagenasa presentaban

efectos deletéreos sobre la capacidad esteroidoqénica celular.

Las células intersticiales dispersadas y posteriormente sometidas

a centrifugación a través de gradientes de densidad de Metrizamida

o Percoll se reparten en poblaciones celulares con diferencias de

densidad apreciables (195,136).

En el caso de la xtilización de gradientes de Metrizamida, la

población I (a=1.085-1.117 g/ml) presenta una producción de 22 nq

T , ! 1 0 4 células/3h, prácticamente la tercera parte de la

correspondiente a la población I1 (a=1.128-1.145 g / n l ) . Trabajos posteriores de este grupo de trabajo (197) señalan que las

diferencias en producción de T parecen reflejar al menos en parte

diferencias en la actividad de la C17,20-liasa.

Para el caso de las células separadas en gradientes de Percoll (15-

57% de pureza), Kerr y cols (196) han reportado la presencia de 3

fracciones diferentes de acu.erdo a su densidad, aunque

prácticamente no existen diferencias en cuanto a la producción

total de T, la cual es comparable a la correspondiente a células

disociadas por tratamientos con colagenasa. Cuando el gradiente

. - , .

. . . .

7 0

utilizado es más abierto (O-50%), la :.áxima producción de 7 de las

células purificadas es de aproximadamente 5 ng/106 células/2h

(198 , 199) .

Un parámetro inportante para eval,lar e1 estado funcional de las CT,

aisladas es determinar su capacidad de respuesta a la estimulacion

con diferentes dosis de LH o h C G , ya sea en términos de la

cuantificación de T y/o ANPc producidos como resultado de la

estimulación, o bien rnediante :la deterninación de I c s sitios

receptores y constantes de disociación de la unión del ligando con

sus receptores nembranales específicos.

Sharpe & Cooper (194) reportan una escimulación máxima de 10 x de

la producción de T por períodos de 4 horas en células aisladas

mediante tratamientos con colagenasa, eon respecto a la producción

basal del andrógeno, situación que también se presenta cuando la

estimulación proviene de dosis máximas de dbAMPc. Estos autores

reportan también la presencia de 3 nq de 125-I-hCGunida por 10'

células aisladas.

Las poblaciones celulares resultantes de la utilización de

gradientes de densidad para separar a las CL presentan variaciones

en términos tanto del número de receptores para hCG como de la

respuesta a la estimulación gonadotrópica que pueden generar

(195,196,200,201).

71

Las células purificadas a través de gradientes de Metrizamida

presentan un soio tipo de sitio unidor de h C G de acuerdo a sus

características fisicoquímicas (1'35), pero diferente capacidad de

respuesta en términos de producción de T y AMPc (200) . El número total de receptores para L H / h C G por célula también presenta

variaciones (197) .

las poblaciones celulares resultantes de la utilización de

qradientes de Percoll presentan elevada actividad unidora de 125"- -

hCG por célula (aproximadamente lo4 receptores/célula) , actividad

que no siempre se correlaciona c3n la capacidad de respuesta a una

estimulación qonadotrópica, medida ya sea en términos de la

producción de T o de AMPc (199 ,ZO:L) .

LOS resultados obtenidos en este trabajo señalan que la produccicn

kasal de T es de 6 . 9 7 k 0 . 4 6 ng/:L06 células/3h de acuerdo a lo

señalado en la tabla 6.4. Esta producción de T se encuentra en ei

yismo orden de rnaqnitud que reporta la mayoría de los autores

xencionados, inclusive para fracciones separadas a través de

gradientes de densidad, y es claramente semejante a l o s 5 . 4 2 2 . 0 n9

T / 1 0 6 células/3h reportado por Janszen y cols (146), cuya

netodologia fue la base para la utilizada durante este desarrollo

experimental.

LOS resultados que se mue'stran en la tabla 6.4 y la figura 6.1

indican que la vía preferencial de síntesis en las C L es la de los

" . i

72

llamados intermediarios 14 (Prog,, l7OHProg y A ) , como ha sido

reportado anteriormente (29) . Esta predominancia de la vía puede ser apreciada tanto en el caso de la determinación de las pozas

endógenas (tabla 6.4) como cuando se evalúa la transformación de

Frecursores radiactivos agregados excgenamente : T a b l a 6.5 y fig

6 . 4 ) .

Si bien existe una disminución aparente de la velocidad de

prOdUCCiÓn de los diversos interxediarios 5~ f ig 6.2) , las

concentraciones de todos los esteroides en las suspensiones

celulares continúan creciendo a lo larqo del 2eríodo de incubación,

lo que refiejaría una adecuada act:i.Jidad de las enzimas de la vía

involucradas, lo que permitiría a su vez suponer qae las células se

encuentran viables aún al final del período de incubación.

Resultados no incluidos anteriormente indican que la viabilidad

celular se Tantiene por encima del 8 0 % cuando se mantienen a las

células suspendidas en KRBG a 3 7 O C durante períodos hasta de 4

horas.

En términos de velocidades de transformación de los precursores

radiactivos, la vía biosintética parece encontrarse acelerada, al

menos en el segmento que abarca desde Preg hasta 170HProg; de ahí

en adelante la situación cambia, quizá debido a las características

de la 17a-hidroxilasa/C17,2O-liasa, que funciona como enzima

limitante de la vía (29) .

7 3

No se determinó como parte de este trabajo la presencia de

receptores a hCG en las fracciones enriquecidas en CL, por lo que

este parámetro no puede confrontarse con los resultados obtenidos

por otros grupos de trabajo. Sin embargo, una forma indirecta de

demostrar la existencia de un sistema funcional del receptor a LH

sería la capacidad de la hCG para estimular de forma dosis-

dependiente la producción de T en las fracciones celulares.

Como se obsertra en 13s figuras, dosis m6ximas de 3 U / n l de hCG son

capaces de estimular aproximadamente 15 veces la producción basal

de T medida c3mo r.7 T / 1 0 5 células/h (fig 6 . 3 ) , y de producir un

consumo total del '3-col añadido exógenamente en períodos máximos

de 90 minutos (fig G . 5 ) , el cual se reparte hacia la vía

esteroidogénica en forma equivalente a la que se presenta para las

pozas metabólicas de los intermediarios endógenos ( f i g 6.6). Esta

estimulación es dosis-dependiente en un intervalo de 3 x 3

U/ml (fiq 6 . 3 ) , y no parece aumentar a dosis mayores (resultados no

mostrados). Cabe mencionar que Janszen y cols (146) reportan que,

utilizando la netodología que sirvió de base para la manejada en

este trabajo, dosis de 1pg/ml de LH son capaces de estimular hasta

300% la producción de T / 1 0 6 células/2h.

-

Sharpe & Cooper (194) muestran una estimulación máxima de 900% en

el caso de CL purificadas tan solo mediante dispersión con

colagenasa, mientras que Cooke y cols (149) indican que la

población celular I11 de células de testículo de rata purificadas

1 2 6 3 8 7 7 4

a través de un qradiente de Percoil xkre incrementada 10 veces su

producción basal de T al ser tratadas las C L con una dosis máxima

de hCG. El factor de estimulación para las células purificadas a

través de gradientes de Metrizamida y mediante tratamientos

múltiples secuenciados se mantiene también dentro de este intervalo

(1,000-2,000%) (197,200-202).

7.3.2. Fracción tubular.

Estudios iniciales realizados por Christensen S( Mason (131)

utilizando túbulos seminiferos separados incompletamente del

compartimiento intersticial mediante técnicas de disección húmeda

demostraron que ambos compartimientos testiculares tienen la

capacidad de formar andróqenos i.n vitro a partir de la adición

exóqena de 14C-4-Proq,si bien las CL presentan una mayor capacidad

en este sentido.

Estudios posteriores (79,203) demostraron que la actividad

esteroidogénica de los tdbulos seminiferos aislados y en particular

de l a s CS se dirige fundamentalmente hacia la formación de

estrógenos y derivados Sa-reducidos tales como DHT a partir de 3H-T

adicionada exógenamente, aunque es también capaz de transformar

precursores 0 4 (Proq, l7OHProg y A ) más no 0 5 , debido a su carencia

de 3R-hidroxiesteroide deshidrogenasa (204).

La actividad de aromatasa es relativamente baja en CS aisladas de

7 5

ratas mayores de 20 días ce edad (205) , hasta llegar al punto en

que las C L concentran la mayor actividad de esta enzima en

testículos completos de animales adultos o en cultivos celulares

primarios (206) , lo que se ha su.gerido está relacionado con la

disminución de la capacidad mitótica <e las CS conforme el animal

va madurando (82) .

Dorrinqton y cols (205) reportan una producción máxima de E de

alrededor de 100 pg/mg de proteína/24h en cultivos no estimulados

de CS de animales de 20 días de edad, nientras que Rommerts y cols

(206) detectan una producción de 0.5C0.4 nu Preg/mg de proteína12h

y de 0.4110.21 nq E/mg de proteína/24h en fracciones enriquecidas

de animales de la misma edad, y Zna concentración de

aproximadamente 2 ng E/mg proteína/24h en fracciones enriquecidas

en CS de aninales adultos (70 días de edad) irradiados

prenatalmente para eliminar el componente germinal de sus túbulos

seminiferos.

Dorrinqton & Armstronq (79) demostraron originalmente la capacidad

de la FSH para estimular la producción de E a partir de T añadida

exógenamente en CS cultivadas in vitro, en concordancia con la

existencia de receptores específicos para esta hormona presentes en

las membranas celulares (207).

Rommerts y cols ( 8 0 ) , en cultivos de fracciones enriquecidas en CS

de ratas inmaduras, mostraron que tanto FSH como dbAMPc y T

c

7 6

añadidas a l o s medios de cultivo For 5-6 días, son capaces de

estimular la producción de E y de ABP hasta en 10 -leces con

respecto a los cultivos no tratados, siendo aparentemente no

sinérgico el efecto de FSH y T (206).

Los datos de producción de E por las fracciones enriquecidas en CS

reportados en esta tesis no pueden ser directamente comparados con

datos existentes en la literatura, ya que no se encuentran

reportadas las concentraciones producidas por células obtenidas de

ratas adultas normales durante períodos cortos de incubación, y la

única referencia para animales adultos sería el trabajo de Marcante

y cols ( 2 0 4 ) , el cual se enfoca má:s bien hacia la transformación de

los precursores adicionados exógenamente.

Los resultados obtenidos en cuanto a la capacidad de transformación

de l o s 3H-esteroides adicionados a fracciones enriquecidas en CS

(tabla 6.6) parecen avalar la no existencia de una actividad de 38-

hidroxiesteroide deshidrogenasa en estas células y por l o tanto la

ausencia de un contaminante apreciable de la fracción intersticial

del mismo testículo, ya que aproximadamente el 75% de la 3H-Preg

añadida no es transformada duranice períodos hasta de 60 minutos.

Debe señalarse que si bien el 25% de la 3H-Pregañadida inicialmente

sí es tranformada, no es posible detectar la radiactividad derivada

de ella en ninguna de las zonas cromatográficas correspondientes a

l o s c4-intermediariosr ni a los productos finales T, DHT o E, lo

que representaría su posible metabolización a través de vías

77

alternativas, tales c3mo la 20a-hidroxilación (63,208).

Cabe mencionar que los esteroides E y DHT no son metabolizados

durante la incubación, de acuerdo a su caracter de productos

sintéticos finales de la vía esteroidogénica en CS (datos no

mostrados).

En lo que toca a la estimulación de la producción de E de las CS

dependiente de FSH, los resulzados contradicen lo señalado

originalmente por Dorrinqton y cols (205), quienes demostraron que

CS de animales adultos eran incapaces de responder a la acción de

esta gonadotropina. Los resultados reportados (figs 6.7 y 6.8) en

este trabajo indican, sin embargo, que dicha estimulación existe al

menos para períodos cortos de incubación, si bien no al nivel

encontrado en testículos de animales inmaduros (206).

Aunque esta tesis no se avocó a la detección de la presencia de

receptores específicos de FSH en la fracción enriquecida de CS, los

resultados obtenidos permiten s'uponer de manera indirecta que

dichos receptores se encuentran presentes y funcionales en las CS

obtenidas bajo las condiciones reportadas en este trabajo

experimental.

8 . CONCLUSIONES.

2. Las fracciones celulares enriquecidas aparentemente no son

dañadas como resultado de su oktención, ya que presentan una

elevada viabilidad final, la cual se mantiene si se resuspenden en

amortiguadores adecuados durante períodos cortos.

3. Utilizando criterios morfológicos y fisio~ógicos, las fracciones

enriquecidas en CL y CS no se encuentran significativamente

contaminadas entre sí, aunque incluyen a otras estirpes celulares

propias del mismo compartimiento zesticular del cual se originan,

particularmente en el caso del compartimiento tubular.

4. La fracción enriquecida en CL presenta un funcionamiento normal,

tanto en condiciones basales como de estimulación con hCG, de las

vías esteroidoqénicas de síntesis de andróqenos, evaluadas tanto a

partir de las pozas metabólicas propias de las células, como

tomando en consideración la capacidad de transformación de

precursores e intermediarios añadiaos exóqenamente.

7 9

7. No es posible localizar componentes unidores de E en l a s

fracciones testiculares, aunque sí existan en citosoles de

hornogenizados de testículos completos.

80

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EL JURADO DESIGNADO POR LA DIVISION DE CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD DE LA UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA, UNIDAD IZTAPALAPA, APROBO LA PRESENTE TIlSIS A LOS DIAS

DEL :.!ES DE DICIEMBRE DEL ARO DE MIL :;OVECIENTOS XOVENTA Y DOS.

-"-- DR. JOSE A URO BEW4UDEZ GOMEZ-LLANOS

AQUIN FERNANDO HERRERA MUÑOZ

FU Q. CANA ELENA LEMUS BRAVO