UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BAJA CALIFORNIA SUR

ÁREA DE CONOCIMIENTOS DE CIENCIAS DEL MAR

DEPARTAMENTO ACADEMICO DE BIOLOGÍA MARINA

TESIS DE LICENCIATURA

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE Y FENOLES TOTALES EN

EXTRACTOS DE MACROALGAS DE LA BAHÍA DE LA PAZ, B. C. S., MÉXICO.

QUE COMO REQUISITO PARA OBTENER EL TÍTULO DE

LICENCIADO EN BIOLOGÍA MARINA

PRESENTA:

FRANCISCO VARGAS BETANCOURT

DIRECTOR:

DRA. CLAUDIA JUDITH HERNÁNDEZ GUERRERO

LA PAZ, BAJA CALIFORNIA SUR, NOVIEMBRE DE 2011

i

Dedicatoria

A mis Padres por su apoyo, confianza y por brindarme la mejor

herencia de esta vida, una carrera profesional, basada en principios y

valores.

A mis hermanos Arturo y Hugo por creer en mí, y que de una u otra

manera me dieron su apoyo y comprensión para seguir adelante.

De forma muy especial a mi esposa Karla por su enorme

comprensión, paciencia y sobretodo Amor.

A mis Abuelas Alicia y Reyna, por los valores que me inculcaron, se

que desde donde se encuentran estuvieron echando porras.

ii

AGRADECIMIENTOS

A mis asesores Dra. Claudia J. Hernández Guerrero, M. en C. Martha Alicia

Sánchez Martínez y Dr. Juan Manuel López Vivas por toda su ayuda, paciencia y

comprensión que me han brindado. A la Dra. Bárbara González por su apoyo y

ayuda en la realización de los ensayos y al material donado para la causa. Al Dr.

Sergio Martínez por sus comentarios en cuanto al análisis de resultados, a la M.C.

Ruth Noemí Aguila Ramírez por sus comentarios que ayudaron a enriquecer este

trabajo y a todos mis compañeros del Laboratorio de Microbiología por su ayuda,

comentarios y muy buenos momentos.

Al Centro Interdisciplinario en Ciencias Marinas (CICIMAR-IPN) por prestar

sus instalaciones para llevar a cabo todo el proceso de experimentación, en

especial a la Dra. Aida Martínez López y la M. en C. Magda por su apoyo con el

espectrofotómetro.

A mi familia, principalmente a mis padres Francisco Vargas Crivelli y Silvia

Betancourt Peralta por todo su apoyo y comprensión porque me enseñaron las

bases para llegar a ser quien soy, así como a mis hermanos Arturo y Hugo gracias

por aguantarme, aunque desde lejos se que estaban a mi lado.

Todo mi agradecimiento a mi esposa Karla por su amor, ayuda y

comprensión en todo momento, se que hubo altibajos que sin ti no hubiesen sido

superados.

iii

A mi queridísima suegra (y no es broma, ¡quen la quere!) gracias por su

apoyo, sus palabras de aliento y por compartir buenos y malos momentos, ahhh

por cierto, le salieron muy caras las clases de manejo jajaja!!!

A la Familia Hernández Espinosa por abrirme las puertas de su casa y

recibirme durante la carrera, a la Familia Gutiérrez Mendoza por todos esos gratos

momentos, muchas gracias.

A todos mis amigos (as) y compañeros (as) de carrera, Kuamy, Dayla,

Mario, Isaura, Saúl, Samuel, Erick, Christian, Raúl, Dellis, Charmin, Monchis, etc,

que le pusieron la sal y pimienta a la carrera, gracias por los buenos momentos.

A Dellis Montuy, por ser una gran amiga y aguantarme durante todos estos

años (ya son bastantes jaja), gracias por escucharme y los consejos e inolvidables

momentos compartidos, muchas gracias amiga!!!.

A Nayeli Rivera (che Güera), por ser una excelente amiga y por brindarme

palabras de aliento en momentos difíciles, así como inolvidables momentos

compartidos, gracias por todo.

A todos mis profesores, de los cuales tengo presente sus enseñanzas.

A todos los que han creído en mí, a los que han compartido conmigo, que

se han cruzado en mi camino y que he olvidado mencionar… ¡Muchas Gracias!

iv

INDICE

DEDICATORIA ......................................................................................................... i

AGRADECIMIENTOS ............................................................................................. ii

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS ............................................................................ vi

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y FÓRMULAS QUÍMICAS .................. vii

GLOSARIO ............................................................................................................. ix

RESUMEN ............................................................................................................. xi

INTRODUCCIÓN .................................................................................................... 1

ANTECEDENTES ................................................................................................... 3

MARCO TEÓRICO ................................................................................................ 11

Fenoles totales .................................................................................................. 11

Cuantificación de fenoles totales ....................................................................... 12

Actividad Antiradical........................................................................................... 14

Medición de la actividad antiradical ................................................................... 15

JUSTIFICACION ................................................................................................... 17

DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA ........................................................................ 17

HIPÓTESIS ........................................................................................................... 18

OBJETIVOS .......................................................................................................... 18

ÁREA DE ESTUDIO .............................................................................................. 19

MATERIALES Y METODOS ................................................................................. 20

Obtención del extracto crudo ............................................................................. 22

Método Soxhlet ............................................................................................. 22

v

Método de Maceración ................................................................................. 24

Determinación de la actividad antioxidante por DPPH....................................... 24

Contenido total de compuestos fenólicos .......................................................... 26

Comparación de los resultados obtenidos en los métodos de extracción.......... 28

RESULTADOS ...................................................................................................... 29

Rendimiento de los extractos ............................................................................. 29

Actividad antioxidante ........................................................................................ 30

Actividad captadora del radical libre DPPH de los extractos ............................. 31

Contenido de Fenoles Totales ........................................................................... 32

Comparación de los métodos de extracción utilizados ...................................... 33

DISCUSIÓN .......................................................................................................... 35

CONCLUSIONES .................................................................................................. 42

BIBLIOGRAFÍA. .................................................................................................... 43

ANEXOS ............................................................................................................... 58

vi

LISTA DE TABLAS Y FIGURAS Pág. Figura 1. Estructura química del ácido gálico…………………………………. 13

Figura 2. Reacción general de los radicales libres……………………………. 15

Figura 3. Reacción de decoloración del DPPH al ser reducido por

los antioxidantes………………………………………………………

16

Figura 4. Localización del área de estudio dentro de la Bahía de La

Paz, B.C.S. (Tomado y Modificado de Castro-Reyes 1997)…….

21

Figura 5. Sistema Soxhlet……………………………………………………….. 23

Figura 6. Sistema de evaporación……………………………………………… 23

Figura 7. Análisis preliminar de actividad antioxidante en cromatografía en

capa fina revelada con DPPH al 0.2%. Tratamiento I. Soxhlet; II:

Maceración……………………………………………………………...

30

Figura 8. Actividad captadora de radicales libres expresada en valores de

IC50, dado en mg mL-1 (±DS; n=3) para los extractos de

macroalgas y controles (BHT y ácido ascórbico)…………………..

31

Figura 9. Curva de calibración de fenoles totales…………………………….. 32

Tabla 1. Diluciones para determinar la capacidad antioxidante de los

diferentes extractos……………………………………………………

26

Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibración de fenoles totales.. 27

Tabla 3. Rendimiento de los extractos de las Macroalgas en ambos

métodos de extracción………………………………………………..

29

Tabla 4. Contenido de fenoles totales (mg EAG/ g extracto) para ambos

métodos de extracción………………………………………………….

33

vii

LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS Y FÓRMULAS QUÍMICAS

mg Miligramos

mL Mililitros

μL Microlitros

g Gramos

kg Kilogramos

X2 Prueba de Chi-cuadrada

IC50 Concentración inhibitoria media

H2O Agua

EtOH Etanol

ERO Especies reactivas de oxígeno.

TLC Siglas en inglés para cromatografía en capa fina

CH2Cl2 Diclorometano

DPPH Radical 1,1-difenil-2-picrilhidracil

DS Desviación estándar

EDTA Ácido etilén diamino tetraacético

MeOH Metanol

O2·- Radical superóxido

OH Radical hidroxilo

SOD Superóxido dismutasa

TBARS Sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico

NaCO3 Carbonato de sódio

H2SO4 Ácido sulfúrico

FRAP Análisis del poder reductor férrico/antioxidante

ABTS 6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina

UV Luz Ultravioleta

Vis Luz Visible

DMSO Dimetilsulfóxido

BHA Hidroxibutilanisol

viii

BHT Butil hidroxitolueno

EAG Equivalentes de Ácido Gálico

TAC Capacidad Total Antioxidante

He/AcOEt Hexano/Acetato de Etilo

He/éter Hexano/éter

CHCl3 Cloroformo

ix

GLOSARIO

Alga: organismos totipotenciales que llevan a cabo reacciones fotosintéticas,

tienen origen polifilético, principalmente acuáticos.

Antibiótico: agente químico producido por un organismo o de manera sintética

que es dañino para otros organismos.

Antimicrobiano: sustancia que puede inhibir el crecimiento de microorganismos o

matarlos.

Antioxidante: molécula capaz de retardar o prevenir la oxidación de otras

moléculas.

Compuestos fenólicos: son un grupo de compuestos orgánicos con uno o más

grupos hidroxilos en el anillo o anillos aromáticos. Pueden ser simples hasta

aquellos complejos conocidos como polifenoles.

Fenoles: Los fenoles son alcoholes aromáticos. Están compuestos de moléculas

que tienen un grupo -OH unido a un átomo de carbono de un anillo

bencénico.

Metabolitos primarios: compuestos orgánicos esenciales para el organismo que

los produce debido a que forman parte de su metabolismo (crecimiento y

reproducción).

Metabolitos secundarios: compuestos orgánicos sintetizados por un organismo

los cuales no tienen un papel esencial en su metabolismo.

Radicales libres: átomo o grupos de átomos con un electrón desapareado,

extremadamente inestable y con gran poder reactivo.

x

Rotavapor: equipo utilizado para evaporar disolventes a presión reducida.

Sistema Soxhlet: es un tipo de material de vidrio utilizado para la extracción de

compuestos, generalmente de naturaleza lipídica, contenidos en un sólido,

a través de un disolvente afín.

xi

RESUMEN

Los antioxidantes son compuestos que retardan o inhiben la degradación oxidativa de

las moléculas orgánicas, por lo que son utilizados en la industria alimenticia y

farmacéutica. En la actualidad se ha intensificado la búsqueda de antioxidantes de

origen natural y una de las fuentes con gran potencial son las macroalgas. En la Bahía

de La Paz, B.C.S. existen diversas especies de macroalgas, sin embargo, es poco lo

que se conoce acerca de su potencial antioxidante, por lo que este estudio pretende

evaluar el contenido de fenoles totales y la actividad antioxidante de algunas especies

de macroalgas de la Bahía de La Paz, utilizando dos métodos de extracción (Soxhlet y

Maceración). La concentración de fenoles totales fue evaluada por espectrofotometría,

basada en la reacción colorimétrica de óxido-reducción con el reactivo de Folin-

Ciocalteu, mientras que la actividad antioxidante se midió mediante la inhibición del

radical libre DPPH. Los resultados mostraron que el mayor contenido de fenoles totales

se presentó en los extractos de Laurencia gardneri y Padina concrescens con un valor

de 181.6 y 123.9 mg EAG/ g extracto. Los mejores resultados de actividad antioxidante,

se obtuvieron con el extracto de P. concrescens, que presento valores de IC50 = 0.29

mg mL-1 indicando que presenta mejor actividad que el ácido ascórbico y el BHT (IC50 =

0.46 y 0.50 mg mL-1, respectivamente). En cuanto al método de extracción se observó

que mediante el uso del sistema de Soxhlet se tiene un mayor rendimiento de

extracción pero no siempre los extractos tuvieron mejor actividad. Aunque cabe

mencionar que se requiere tener un mayor número de réplicas de extractos para

establecer una diferencia significativa entre los métodos.

Palabras clave: Actividad antioxidante, Fenoles totales, Macroalgas.

1

INTRODUCCIÓN

Los antioxidantes son compuestos que al retardar o inhibir la degradación

oxidativa de las moléculas orgánicas, ayudan a prevenir la formación de colores y

olores desagradables; estos compuestos pueden ser de origen natural o sintético,

pero la mayoría de los utilizados comercialmente son de origen sintético. Debido a

que algunos antioxidantes sintéticos, son altamente inestables bajo las

condiciones de trabajo y en ciertos casos ocasionan efectos adversos sobre la

salud de animales de experimentación, la investigación se ha enfocado en

encontrar sustancias más estables, eficaces, versátiles y/o menos tóxicas. Dando

lugar a la obtención de diferentes tipos de compuestos a partir de fuentes

naturales o rutas sintéticas. Así por ejemplo, entre los compuestos de origen

natural se encuentran: carotenoides, vitaminas C y E, tocoferoles, tocotrienoles,

flavonoides y licopertenos, entre otros (Pokorny et al. 2001).

En los últimos años, el empleo de antioxidantes sintéticos con fines

terapéuticos ha sido cuestionado debido a su posible capacidad promotora de

tumores y genotoxicidad (Gordon 1996; Safer y Al-Nughamish 1999; Rauha 2001).

Debido a esto, la búsqueda y utilización de compuestos antioxidantes de origen

natural ha despertado un gran interés. Lo cual se inserta dentro de la tendencia

mundial actual de abordar el uso de las fuentes naturales para la obtención de

fármacos efectivos contra diversas enfermedades (Raskin et al. 2002).

A partir de estas consideraciones, se ha propuesto el uso de extractos de

plantas u otras fuentes naturales como agentes neuroprotectores, ya que pueden

2

constituir mezclas de compuestos antioxidantes con diversos modos de acción

(Aruoma 1998; Bastianetto y Quirion 2002; Aruoma et al. 2003). Entre otras

ventajas de los antioxidantes naturales, puede mencionarse que exhiben una

elevada diversidad molecular y funcionalidad biológica (Raskin et al. 2002), a ello

se une que muchos de estos compuestos no son tóxicos y por ende, su uso es

aceptado como seguro en la mayoría de los caso, sin embargo, esto no siempre

es cierto y algunos antioxidantes naturales puedan tener riesgo toxicológico

(Kagan et al. 2002).

Dentro de las fuentes naturales, las algas constituyen opciones para la

búsqueda de nuevos productos bioactivos, especialmente antioxidantes, lo que se

justifica por diversas razones. Desde un punto de vista general puede decirse que

las algas son fuentes de compuestos bioactivos. A esto, se suma la biodiversidad

que presentan estos organismos en regiones templado-tropicales, lo que permite

disponer de una amplia variedad y cantidad de especies simultáneamente (Harvey

2000). Son además, organismos considerados en general poco tóxicos (Grabley y

Thiericke 1999). Su consumo como parte de la dieta de algunas poblaciones

humanas se ha asociado a una variedad de efectos beneficiosos sobre la salud,

por ejemplo la reducción de la incidencia de algunos tipos de cánceres (Higashi et

al. 1999; Funahashi et al. 1999). Es debido a esto que se sugiere que las algas

contienen compuestos biológicamente activos capaces de modular diferentes

funciones fisiológicas del organismo.

3

En la Bahía de La Paz, Baja California Sur, existe un gran número de

especies de algas marinas y algunas presentan grandes biomasas, sin embargo,

es poco lo que se conoce acerca de su actividad biológica y sobre todo de la

actividad antioxidante que presentan. Por lo que, en éste trabajo se pretende

identificar el contenido total de fenoles de algunas especies y determinar si

presentan una potencial actividad antioxidante.

ANTECEDENTES

Las algas marinas son un recurso de gran importancia. Su utilización como

alimento humano, forraje y fertilizante agrícola es bastante antiguo (Pesando y

Caram 1984; Robledo 1990). En la industria, las macroalgas se utilizan como

materia prima para obtener ficocoloides como agar-agar, carragenanos y

alginatos, fundamentalmente, además de furcelarán, laminarán, manitol,

producción de vitaminas, herbicidas e insecticidas como otros productos

importantes (Baker 1984; Dawes 1984).

En la actualidad, los organismos marinos, incluidas las algas, han atraído la

atención de muchos investigadores como fuentes de compuestos biológicamente

activos; sus propiedades biológicas, la diversidad de sus moléculas muchas con

estructuras químicas complejas y novedosas que resultan difíciles de sintetizar así

como el número de moléculas con efectos similares y/o sinérgicos en un

organismo determinado son aspectos que refuerzan ésta tendencia (Jiménez-

Escrig y Goñi 1999; Nuñez et al. 2006).

4

En los mares tropicales, las algas marinas están expuestas a una alta

incidencia de luz solar que pudieran conducir a la formación de radicales libres y

otros fuertes agentes oxidantes (Dykens et al. 1992; Namiki 1990), de manera que

la ausencia de daños oxidativos en sus componentes estructurales (ácidos grasos

poli-insaturados) de las algas (Matsukawa et al. 1997), su estabilidad a la

oxidación durante el almacenaje (Ramarathnam et al. 1995) y fisiológicos, sugiere

que estos organismos presentan un eficiente sistema de defensas antioxidantes

(Jiménez-Escrig et al. 2001; Rozema et al. 2002).

Es así que en los últimos años se han publicado diferentes trabajos

referidos a la actividad antioxidante de extractos de macro y microalgas en

modelos experimentales in vitro e in vivo. Estos estudios han permitido identificar a

los compuestos fenólicos, carotenoides y algunos aminoácidos, como los

principales responsables de la actividad antioxidante que presentan las algas y

microalgas (Nakamura et al. 1996; Yan et al. 1996; Kobayashi et al. 1997;

Matsukawa et al. 1997; Lim et al. 1998; Miranda et al. 1998; Yan et al. 1999; Duval

et al. 2000; Matsukawa et al. 2000; Wong et al. 2000; Jiménez-Escrig et al. 2001;

Miranda et al. 2001; Ruberto et al. 2001; Vidal et al. 2001; Lim et al. 2002; Han et

al. 2002; Yoshie et al. 2002; Fisch et al. 2003; Kang et al. 2003; Siriwardhana et al.

2003; Huang y Wang 2004; Kang et al. 2004; Siriwardhana et al. 2004; Zubia et al.

2007; Echavarría et al. 2009).

Anggadiredja et al. (1997) determinaron la actividad antioxidante de

muestras frescas y secas de Sargassum polycystum C.Agardh 1824 y Laurencia

5

obtusa (Hudson) J.V.Lamouroux 1813 recolectadas en las Islas Seribu, Indonesia,

por medio del método de tiocianato. Los extractos se prepararon con metanol, éter

dietilico y hexano. Los resultados mostraron que solo las muestras en fresco

presentaron actividad, siendo los extractos de metanol de L. obtusa los más

activos.

Yan et al. (1998) analizaron la actividad antioxidante por medio de los

métodos de atrapamiento de radicales DPPH y Desoxiribosa en 27 especies de

macroalgas de la Provincia de Shandong, República de China. Las cuales fueron

sometidas a extracción con acetato de etilo, acetona, cloroformo y metanol.

Encontrando que la mayor actividad antioxidante se presentó en los extractos en

metanol de Gelidium amansii (J.V.Lamouroux) J.V.Lamouroux 1813, Gloiosiphonia

capillaris (Hudson) Carmichael in Berkeley 1833, Polysiphonia urceolata (Lightfoot

ex Dillwyn) Greville 1824, Sargassum kjellmanianum Yendo 1907, Desmarestia

viridis (O.F.Müller) J.V.Lamouroux 1813 y Rhodomela teres (Perestenko) Masuda

1982.

Amin y Siew-Hong (2002) analizaron la actividad antioxidante de extractos

de etanol y acuosos de macroalgas utilizadas en el mercado de Malasia: Nori

(Porphyra sp. C.Agardh, 1824), Kumbu (Laminaria sp. J.V.Lamouroux, 1813),

Wakame (Undaria sp. Suringar, 1873) y Hijiki (Hijikia sp. Okamura, 1932) mediante

los métodos de antioxidantes totales y atrapamiento de radicales DPPH.

Determinaron que los extractos de Kumbu, Hijiki y Nori presentaron una alta

actividad antioxidante tanto para el extracto de agua como el de etanol, mientras

6

que para Wakame, sólo el extracto acuoso presento una alta actividad

antioxidante y atrapamiento de radicales DPPH.

Duan et al. (2006) evaluaron la actividad antioxidante, contenido total de

fenoles y el poder de reducción en extractos, fracciones y subfracciones de

Polysiphonia urceolata (Lightfoot ex Dillwyn) Greville 1824, recolectada en

Qingdao, China. La actividad antioxidante fue probada usando el método de

atrapamiento de radicales DPPH y la prueba de β-caroteno-linoleate, los cuales

fueron comparados con los antioxidantes comerciales BHT, ácido gálico y ácido

ascórbico. El contenido de fenoles totales fue determinado por medio del método

de Folin-Ciocalteu y fue estimado como equivalente de ácido gálico (EAG). Ellos

encontraron que en el extracto crudo y la fracción de la solución de acetato de

etilo, presentaron una alta actividad antioxidante en BHT y DPPH.

Mahinda et al. (2006) analizaron el potencial antioxidativo de diferentes

fracciones del extracto de Ecklonia cava Kjellman 1885 (metanol al 70%),

utilizando 8 métodos (atrapamiento de radicales DPPH, superóxido anión,

peróxido de hidrogeno, radical hidroxilo, oxido-nítrico, poder de reducción y la

inhibición peroxidación lipidica). Observaron actividad antioxidante en todos los

métodos y un alto nivel de polifenoles totales. Siendo el nivel de fenoles

hidrofilicos mayor que el de fenoles hidrofobicos.

Vidal et al. (2006) analizaron la composición química y propiedades

antioxidantes de Bryothamnion triquetrum (S.G.Gmelin) M.A.Howe 1915

recolectada en el área del Bajo de Santa Ana, La Habana, Cuba. Los extractos

7

acuosos presentaron actividad antioxidante con valores de 38% de atrapamiento

de radicales DPPH para 4 mg de liofilizado, además la actividad atrapadora de

radicales O2- con un IC50 = 0.36 mg mL-1, de radicales OH- con IC50 =2.11 mg mL-1

y la unión de Fe con IC50 = 0.37 mg mL-1.

Amornlerdpison et al. (2007) examinaron la actividad antioxidante del

extracto acuoso de Padina minor Yamada 1925, recolectada en la Playa Naiyang,

Tailandia. Ellos encontraron un contenido de fenoles totales de 864.71 ± 19.75 mg

de ácido gálico (EAG) y para el método de ABTS fue de 0.567 ± 0.004 µM de

Trolox (TEAC).

Zahra et al. (2007) examinaron los compuestos fenólicos de los extractos

acuosos y de etanol de Sargassum boveanum J.Agardh 1848, recolectada en

Bushehr al norte del Golfo Pérsico. Determinaron que el contenido total de

compuestos fenólicos por el método de Folin-Ciocalteu dio como resultado un

valor de 17 ± 0.492 mg de cataquina g-1. La actividad antioxidante del extracto

etanólico fue alta, alrededor del 90% de inhibición de la peroxidación del ácido

linoleico con 7 mg de peso seco mL-1 de disolvente.

Zubia et al. (2007) analizaron 48 extractos de macroalgas marinas de las

costas de la Península de Yucatán, México y evaluaron la actividad antioxidante

por medio del método de atrapamiento de radicales DPPH así como el contenido

de compuestos fenólicos. Todas las especies mostraron actividad por medio del

DPPH, y tres de ellas (Avrainvillea longicaulis (Kützing) G.Murray & Boodle 1889,

Chondria baileyana (Montagne) Harvey 1853 y Lobophora variegata

8

(J.V.Lamouroux) Womersley ex E.C.Oliveira 1977) presentan gran potencial

antioxidante con un muy bajo índice de oxidación, con un valor de IC50 equivalente

a los antioxidantes comerciales, α-tocoferol, ácido ascórbico, BHA y BHT.

Lekameera et al. (2008) analizaron el extracto de Colpomenia sinuosa

(Mertens ex Roth) Derbès & Solier in Castagne 1851 recolectada en las costas de

Tuticorin, India. La extracción se realizó por medio del sistema Soxhlet utilizando

dimetil sulfoxido (DMSO) y metanol. Se realizaron análisis de atrapamiento del

radical DPPH, radical óxido nítrico, peróxido de hidrógeno, atrapamiento de radical

ABTS y de la Capacidad Total Antioxidante (TAC). En todos los análisis

encontraron una alta actividad antioxidante para el método DPPH, una moderada

actividad en la capacidad total de antioxidantes respectivamente y concluyeron

que la actividad antioxidante fue alta en comparación con los antioxidantes

comerciales BHA y BHT.

Matanjun et al. (2008) analizaron la actividad antioxidante de los extractos

de metanol y éter dietilico de ocho especies de algas (Eucheuma cottoni Weber-

van Bosse 1913, E. spinosum J.Agardh 1852, Halymenia durvillaei Bory de Saint-

Vincent 1828, Caulerpa lentillifera J.Agardh 1837, C. racemosa (Forsskål)

J.Agardh 1873, Dictyota dichotoma Suhr 1839, Sargassum polycystum C.Agardh

1824 y Padina spp. Adanson, 1763), recolectadas del Norte de Borneo, Malasia.

La actividad antioxidante fue determinada por medio de los métodos TEAC (Trolox

Equivalent Antioxidant Capacity) y el FRAP (Ferric-Reducing Antioxidant Power) y

el contenido de fenoles totales mediante el método de Folin-Ciocalteu. Los

9

resultados indicaron que C. lentillifera, C. racemosa y S. polycystum, presentaron

el mejor atrapamiento de radicales y habilidad de poder de reducción.

Demeriel et al. (2009) evaluaron la actividad antioxidante de los extractos

de metanol, diclorometano y hexano de Colpomenia sinuosa (Mertens ex Roth)

Derbès & Solier in Castagne 1851, Dictyota dichotoma Suhr 1839, Dictyota

dichotoma var. Implexa (Desfontaines) Hauck 1883, Petalonia fascia (O.F.Müller)

Kuntze 1898 y Scytosiphon lomentaria (Lyngbye) Link 1833. La actividad

antioxidante fue determinada usando los procedimientos de inhibición de β-

caroteno y decoloración de ABTS. Los efectos antioxidantes de los extractos

fueron comparados con los antioxidantes comerciales BHT, BHA y α-tocoferol. De

manera general, los extractos de diclorometano fueron más activos, sin embargo

el extractos de hexano de D. dichotoma var. implexa presento un mayor contenido

de fenoles, mientras que el extracto de diclorometano de S. lomentaria presentó

mayor actividad en la decoloración del ABTS.

Echavarría et al. (2009) analizaron los extractos metanólico y hexánico de

cinco macroalgas Colombianas: Caulerpa mexicana Sonder ex Kützing 1849,

Laurencia sp. J.V.Lamouroux, 1813, Sargassum sp. C.Agardh, 1820, Dictyota sp.

J.V.Lamouroux, 1809 y Sargassum cymosum C.Agardh 1820. Determinaron los

compuestos fenólicos totales mediante el método de Folin-Ciocalteau y midieron la

actividad captadora de radicales libres mediante el método de atrapamiento de

radicales DPPH. Ellos encontraron una alta actividad antioxidante en todos los

extractos y concluyen que posiblemente se asocia a su contenido total de fenoles.

10

Faten et al. (2009) analizaron la actividad antioxidante del extracto y

fracciones de Gracilaria verrucosa (Hudson) Papenfuss 1950 recolectada en

Marsa Matrouh, Egipto, utilizando el método de atrapamiento de radicales DPPH y

utilizando como controles los antioxidantes comerciales: BHT y BHA. De las cuatro

fracciones obtenidas (éter petróleo, acetato de etilo, n-butanol y agua) las dos

primeras mostraron una alta actividad antioxidante.

Yangthong et al. (2009) analizaron la actividad antioxidante de extractos

acuosos de Caulerpa racemosa var. Macrophysa (Sonder ex Kützing) Svedelius

1906, Gracilaria tenuistipitata var. Tenuistipitata C.F.Chang & B.M.Xia 1976,

Sargassum sp C.Agardh, 1820 y Ulva lactuca Linnaeus 1753 de las costas del sur

de Tailandia, utilizando los métodos de atrapamiento de radicales: DPPH, radical

hidroxilo (OH-) y súperoxido anión (O2-). Los extractos fueron realizados por dos

métodos: mediante autoclave y por ebullición del material biológico. Los extractos

por ebullición (a excepción de C. racemosa), presentaron un mayor contenido de

fenoles totales. Mientras que en los ensayos de DPPH y OH, la actividad fue

menor prácticamente en todos los extractos por ebullición. De las cuatro especies,

Sargassum sp. presentó el mayor contenido de fenoles totales y la mejor actividad

inhibitoria de DPPH y OH.

En cuanto a los estudios realizados en la Península de Baja California Sur,

Castro-Silva (2010) realiza un estudio con el alga Padina mexicana Thivy 1945, y

determina que en las fracciones CCAF10, CCAF11, CCAF12, CCAF13 y CCAF14

fueron las más activas con valores IC50 de entre 0.22 y 0.023 mg mL-1, siendo la

11

fracción CCAF13 la que presentó el mejor resultado (IC50 =0.023 mg mL-1). El

stock de fluoroglucinol presento valores de 0.012 mg mL-1.

Todos estos antecedentes muestran que hay un interés en el estudio de la

actividad antioxidante de macroalgas a nivel mundial, sin embargo, son pocos los

estudios en el país, por lo que resulta interesante realizar estudios para evaluar la

actividad de algas marinas de la Bahía de La Paz, Baja California Sur.

MARCO TEÓRICO

Fenoles totales

Los compuestos fenólicos son un grupo de compuestos orgánicos con uno

o más grupos hidroxilos en el anillo o anillos aromáticos. Pueden ser compuestos

simples o complejos conocidos como polifenoles. Los fenoles simples son el

resultado de la descarboxilación de ácidos fenólicos, degradación térmica de

lignina o de la actividad antimicrobiana. Solo algunos fenoles son considerados

con importancia en alimentos, como el ácido cafeico, ferúlico, gálico y sus

derivados. Los flavonoides son una familia muy diversa de compuestos, aunque

todos los productos finales se caracterizan por ser polifenólicos y solubles en

agua. Los compuestos fenólicos pueden contribuir con el aroma y sabor,

proporcionando amargura y acidez a algunos frutos, así como el color de

numerosos productos alimenticios de origen vegetal o animal. Así mismo estos

compuestos presentan actividad biológica como antimicrobiana, antiviral,

12

antiinflamatoria, antitumoral, anticancerígeno y antioxidantes principalmente (Lule

et al. 2005, en Julián-Loaeza 2010).

Cuantificación de fenoles totales

La cuantificación e identificación de los componentes fenólicos en la dieta

ha despertado un gran interés por su importancia funcional. Además, la gran

diversidad de compuestos fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así como

sus diferentes estructuras químicas, han generado la necesidad de desarrollar un

gran número de técnicas analíticas para su cuantificación e identificación

(Martínez-Valverde et al. 2000). Dentro de las técnicas analíticas para la

cuantificación e identificación de compuestos fenólicos se encuentran las técnicas

cromatográficas y métodos espectrofotométricos (Martínez-Valverde et al. 2000;

Prior et al. 2005).

Dentro de los métodos espectrofotométricos se encuentran los ensayos

ultravioleta, en donde cada grupo de compuestos fenólicos se caracteriza por

tener una o varias absorbancias máximas a distintas longitudes de onda dentro del

espectro ultravioleta. Así, los fenoles simples tienen una absorbancia máxima

entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos fenólicos tales como ácido

clorogénico, flavonoides, glicósidos derivados de flavonoides entre otros presentan

una variación más amplia (200 a 450 nm) en la longitud de onda a la cual

presentan una absorbancia máxima. Una de las técnicas más empleadas dentro

de este grupo es la determinación del ácido clorogénico, el cual se cuantifica

13

después de su extracción con etanol y su posterior lectura de absorbancia máxima

a una longitud de onda 325-328 nm (Martínez-Valverde et al. 2000). Otra técnica

usada comúnmente para determinar fenoles en alimentos es el ensayo de la

vainillina para la determinación de compuestos flavan-3-ol, dihidrochalonas y

proantocianidinas (Martínez-Valverde et al. 2000). Por otro lado está el ensayo de

Folin-Ciocalteu para la cuantificación total de fenoles (Prior et al. 2005). Esta

técnica es la más utilizada para determinar de manera cuantitativa a los fenoles y

consiste en mezclar tungstato y molibdato en un medio básico. Los fenoles son

fácilmente oxidables en medio básico y reaccionan con el molibdato formando

óxido de molibdeno (MoO), este compuesto puede ser identificado y cuantificado

por espectroscopia de UV/Vis debido a que absorbe a una longitud de 750 nm. El

contenido de fenoles totales generalmente, se expresa en equivalente de ácido

gálico (ver Fig. 1).

Figura 1. Estructura química del ácido gálico.

Los compuestos fenólicos constituyen uno de los grupos más numerosos y

representativos de metabolitos secundarios de las plantas y algas (Bravo 1998).

Están presentes en la mayoría de los productos vegetales consumidos por el

14

hombre y además los polifenoles poseen acciones molusquicidas, antihelmínticas,

antihepatotóxicas, antiinflamatorias, antidiarreicas, antiúlcera, antivirales,

antialérgicas y vasodilatadoras. Se ha verificado que inhiben la replicación del

virus de la inmunodeficiencia Humana (HIV) y del virus simplex humano (HSV),

inhiben las glucosil transferasas del Streptococcus mutans (caries dental), inhiben

la autoxidación del ascorbato, también inhiben efectos citotóxicos, la promoción

del crecimiento tumoral y la enzima xantina mono-amina oxidasa. La actividad

antioxidante de los fenoles es el origen de funciones biológicas tales como la

antimutagénica, anticancerígena y antienvejecimiento (Bravo 1998; Velioglu et al.

1998; Kahkonen et al. 1999; Tapiero et al. 2002; Proestos et al. 2005).

Actividad Antiradical

El énfasis en evaluar la capacidad antioxidante de los alimentos se sustenta

en que el estrés oxidativo es un proceso biológico propuesto como un factor

etiológico de las enfermedades crónicas no transmisibles. Esto ocurre cuando la

velocidad de formación de los radicales libres es superior a la actividad de los

sistemas protectores. En condiciones fisiológicas, los compuestos agresores son

controlados por la acción integrada y armónica de enzimas, generadas por la

evolución de miles de años y que depende de nutrientes antioxidantes de los

alimentos de origen vegetal, como las vitaminas E y C y compuestos bioactivos

antioxidantes llamados fitoquímicos. El grupo de fitoquímicos más importante es el

15

de los polifenoles, que actúan directa e independiente del sistema enzimático

(Bradford et al. 2007, en Julián-Loaeza 2010).

Medición de la actividad antiradical

Existen métodos empleados para medir la actividad antiradical que se

basan en la oxidación de un sustrato y se cuantifica el consumo de oxígeno,

productos de oxidación, o la pérdida del sustrato (Fukumoto et al. 2000). Otros

métodos involucran la generación de especies radicales y se determina la

concentración del radical en presencia de los antioxidantes evaluados (Kolayli et

al. 2004). En la figura 2 se observa la reacción general de los radicales libres con

los antiradicales o antioxidantes. En donde el radical libre R•, reacciona con el

antioxidante A-H por transferencia de hidrogeno, formando otro radical libre más

estable deteniendo la propagación de estos.

Figura 2. Reacción general de los radicales libres.

Entre los métodos desarrollados para medir la actividad antiradical se

encuentran: 1) actividad antioxidante equivalente a trolox (TEAC), 2) capacidad

de absorción de radicales de oxígeno (ORAC), 3) absorción total de radicales

16

potenciales (TRAP), 4) fotoquimioluminicencia (PLC) y 5) decoloración del radical

2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) (Schlesier et al. 2002). Este último método

consiste en hacer reaccionar cantidades conocidas tanto de DPPH como del

antioxidante a evaluar. El DPPH antes de la reacción con el antioxidante muestra

un color morado intenso, que al ser reducido adquiere una coloración amarilla.

Figura 3. Reacción de decoloración del DPPH al ser reducido por los antioxidantes.

Este decremento en la coloración se cuantifica a 517 nm y se calcula el IC50

que es la concentración de extracto que inhibe en un 50% la concentración de

radical DPPH (Alothman et al. 2009; Du et al. 2009).

17

JUSTIFICACION

Los compuestos antioxidantes son reconocidos por su alta capacidad para

neutralizar radicales libres, por lo que son una excelente alternativa para combatir

problemas ocasionados por el estrés oxidativo, además de que juegan un papel

importante en la vida de anaquel de diversos alimentos. Estudios realizados con

macroalgas de diferentes regiones han demostrado que presentan compuestos

con interesantes actividades antioxidantes. En la Bahía de La Paz, B.C.S., se

tienen registros de entre 130 y 205 especies de macroalgas (Espinoza-Avalos

1993; Cruz-Ayala 1996), lo que representa un recurso potencial para la búsqueda

de compuestos con actividad antioxidante.

DELIMITACIÓN DEL PROBLEMA

El exceso de radicales libres producidos en su mayoría por contaminantes

atmosféricos y por el consumo de alimentos con ácidos grasos trans, dan lugar a

un problema de salud pública (Finkel y Holbrook 2000). Por lo que existe una

necesidad en el empleo de compuestos antioxidantes. En este sentido, se han

utilizado antioxidantes sintéticos con fines terapéuticos, pero su uso ha sido

cuestionado por su posible capacidad promotora de tumores y genotoxicidad. Por

lo que se ha incrementado la búsqueda y utilización de compuestos antioxidantes

de origen natural. En la Bahía de La Paz, sólo se ha realizado un estudio para

evaluar la actividad antioxidante de una especie en particular que mostro tener

buen potencial (Castro-Silva 2010). Sin embargo, hacen falta estudios para

18

evaluar a una mayor cantidad de especies y seleccionar los extractos más activos

que puedan suplir a los antioxidantes no naturales, por lo que surge la pregunta:

¿Tienen las macroalgas de San Juan de la Costa, B.C.S., una actividad

antioxidante comparable o mejor que los productos comerciales?

HIPÓTESIS: Las algas de la zona de San Juan de la Costa son un recurso con

alto potencial de actividad antioxidante.

OBJETIVOS

Objetivo General

Evaluar la actividad antioxidante de diversas especies de macroalgas de San Juan

de la Costa, B.C.S., México.

Objetivos Particulares

1. Obtención de extractos orgánicos de las macroalgas estudiadas mediante

dos métodos de extracción (Soxhlet y Maceración).

2. Determinar la actividad antioxidante de los extractos orgánicos de las

macroalgas estudiadas.

3. Determinar el contenido total de fenoles a partir de los extractos obtenidos.

4. Comparar el rendimiento, el contenido total de fenoles y la actividad

antioxidante de los extractos orgánicos en las dos metodologías de

extracción utilizadas.

19

ÁREA DE ESTUDIO

La Bahía de La Paz es el cuerpo de agua más grande del litoral este de la

península de Baja California, ocupa una superficie de aproximadamente 1200 km2.

Se localiza entre los 24°47´y 24°06´ N y los 110°18´y 100°40´ W (Fajardo-León

1994). Está limitada al Norte por Punta Cabeza de Mechudo; al sur por la

ensenada de La Paz y al este por Isla Espíritu Santo, el Canal de San Lorenzo y

Punta Pichilingue (Fig. 4).

La Bahía de La Paz, se localiza dentro de una zona con clima semi-árido y

los aportes de agua dulce son escasos. El régimen de lluvias es en verano con un

máximo en septiembre, la precipitación pluvial anual promedio es de 210-215 mm

(Villamar 1965). La humedad promedio anual varia del 66 al 72% lo que hace que

esta zona sea seca o desértica (Espinoza-Avalos 1979). La temperatura presenta

un pico máximo en verano (agosto) y una mínima en invierno (febrero). La

salinidad media se mantiene en 34.5‰. Los vientos dominantes de noviembre a

marzo provienen del noroeste y se les llama localmente “Collas”, de abril a agosto

circulan con dirección oeste-sureste y son conocidos como “Coromueles”, también

existe la influencia de ciclones tropicales durante los meses más lluviosos

(Espinoza-Avalos 1979). Geológicamente presenta una alternancia de claros

arenosos con afloramientos rocosos. La vegetación de la línea costera está

constituida principalmente de mangles que se localizan en diversos manchones

alrededor de las marismas en la ensenada, así como en artes protegidas a lo largo

de la línea costera que forma la Bahía (Villamar 1965).

20

San Juan de la costa se encuentra aproximadamente a 60 kilómetros al

norte de la ciudad de La Paz. Se localiza entre los 24º 22´y 24º 29´ N y 110º 40´ y

11º 45´ O (Fig. 4), su profundidad máxima excede los 400 m, con fondos de arena

y fragmentos de carbonato de calcio. Cerca del golfo destaca una alargada

cadena montañosa cuya dirección es noreste-sureste y con elevaciones de hasta

600 m. El área forma parte de la región sureste de la sierra la Giganta (Cruz-Marín

1997). La localidad de muestreo es un área rocosa con canto rodado y grava que

permite la fijación de una gran variedad de macroalgas. En primavera se llegan a

observar mantos muy extensos de Sargassum y la mayoría de las algas se

encuentran en los primeros metros de la línea de costa a profundidades no

mayores a los 2 metros.

MATERIALES Y METODOS

Las algas fueron recolectadas en el área de Piedras Coloradas, San Juan

de la Costa en la Bahía de La Paz (Fig. 4), en el mes de abril de 2010. Los

ejemplares se obtuvieron de la zona submareal mediante buceo libre y se eligieron

aquellas algas que aparentemente estuvieran libres de epífitos y que presentaran

un aspecto “saludable”. Estas se obtuvieron mediante una poda parcial cortando

solo desde la base del talo. En el campo, se lavaron con agua de mar superficial

para eliminar la mayor cantidad de epifitos, conchas y materia extraña que fuera

visible a simple vista, posteriormente se colocaron en bolsas de polietileno y en

hielo para evitar su descomposición y la pérdida de metabolitos secundarios

21

(Vidyavathi y Sridhar 1991) y fueron transportadas al laboratorio de Microbiología

del CICIMAR.

Figura 4. Localización del área de estudio dentro de la Bahía de La Paz, B.C.S.

(Tomado y Modificado de Castro-Reyes 1997).

El material recolectado fue identificado hasta especie utilizando claves

específicas para dichos fines (Setchell y Gardner 1924; Taylor 1945; Hollenberg y

22

Dawson 1961; Abbott y Hollenberg 1976; Norris y Johanson 1981; Gabrielson et

al. 2000; Paul-Chávez 2000; O’Clair y Lindstrom 2001) un ejemplar se guardó

como referencia en el laboratorio de Microbiología del CICIMAR en formaldehido

al 4%. En el laboratorio, las algas se enjuagaron con agua dulce para remover

epífitos remanentes y la sal en la superficie de las muestras. Para su preservación

y almacenamiento, fueron secadas a la sombra, posteriormente se molieron y

finalmente se guardaron en botellas de plástico a -20˚C hasta el momento de su

utilización (Rao y Parekh 1981; Castro-Reyes et al. 1995).

Obtención del extracto crudo

El material seco de Ulva lactuca Linnaeus, 1753, Codium fragile (Suringar)

Hariot, 1889, Padina concrescens Thivy, 1945, Colpomenia tuberculata De

A.Saunders, 1898, Sargassum horridum Setchell y N.L.Gardner, 1924, Laurencia

gardneri Hollenberg, 1943, Opuntiella califórnica (Farlow) Kylin, 1925 y Gracilaria

vermiculophylla (Ohmi) Papenfuss 1967 (ver Anexo I) fue sometido a dos métodos

de extracción: Soxhlet y Maceración.

Método Soxhlet: A partir de cada especie de las diferentes macroalgas, se

pesaron 12.5 g de muestra seca y molida utilizando una balanza analítica.

Posteriormente se colocaron en un tubo de papel filtro y se colocaron dentro del

sistema de Soxhlet (Fig. 5). Se adicionaron 150 mL de una mezcla de

metanol:cloroformo 2:1 y fueron sometidas a extracción durante 6 horas.

Posteriormente el residuo obtenido se filtró con papel Whatman #1. El proceso se

23

realizó por duplicado para cada especie, para así partir de un total de 25 g de alga

seca. Ambas disoluciones fueron evaporadas a presión reducida en un rotavapor

Yamato RE300 (Fig. 6). Una vez evaporado, el extracto se colocó en viales

previamente tarados, para así estimar su peso seco. Todos los extractos se

almacenaron a -20 °C en condiciones de obscuridad hasta su análisis.

Figura 5. Sistema Soxhlet.

Figura 6. Sistema de evaporación.

24

Método de Maceración: Para este método con la ayuda de una balanza analítica

se pesaron 25 gr de alga seca y molida, se colocaron en un matraz y se les

adicionaron 150 mL de una solución de diclorometano:metanol 2:1 y se dejaron

durante 20 horas. Posteriormente el extracto se filtró con papel filtro Whatman #1 y

se evaporo a presión reducida en un rotavapor Yamato RE300. Una vez

evaporado, el extracto se colocó en viales previamente tarados, para así estimar

su peso seco. Todos los extractos se almacenaron a -10 °C en condiciones de

obscuridad hasta su análisis.

Determinación de la Actividad antioxidante por DPPH

Con la finalidad de realizar un análisis cualitativo de la actividad

antioxidante, inicialmente se realizó un ensayo en CCF (Cromatografía de Capa

Fina) de cada uno de los extractos, e luyendo con varias mezclas de solventes en

diferentes polaridades, He/AcOEt, CHCl3/MeOH y He/éter, hasta determinar el

sistema que permitiera la mejor separación de los compuestos. Posteriormente las

placas se revelaron con una solución de DPPH al 0.2 % en metanol (la actividad

se muestra como manchas amarillas sobre fondo violeta).

Para determinar la capacidad antioxidante de las macroalgas estudiadas se

empleó la técnica de reducción del 2,2 difenil-1-picrilhidrazil (DPPH) a la hidracina

correspondiente (Brand-Williams et al. 1995), en la cual la coloración cambia de

azul-morado a ámbar.

25

Se pesaron 40 mg de extracto seco y se diluyeron con 40 mL de etanol (de

cada uno de los extractos algales), después se tomaron 3.75, 7.5, 11.25 y 15 mL

del extracto y se llevarán a 15 mL con etanol. Para así obtener las

concentraciones de 0.25, 0.5, 0.75 y 1 mg mL-1. Para las concentraciones de 10,

30 y 40 mg mL-1, se pesaron 10, 30 y 40 mg de cada uno de los extractos y se

diluyeron en 10, 30 y 40 mL respectivamente.

Se prepararon las soluciones estándar de BHT y Ácido Ascórbico,

disolviendo 32 mg de los reactivos en 1mL de agua destilada. De esta solución se

prepararán 10 concentraciones que van desde 0.0625 mg mL-1 hasta 32 mg mL-1

con etanol.

Para la preparación del DPPH, se pesaron 25 mg de DPPH y se colocaron

en un matraz previamente tarado, se disolvieron en 100 mL de etanol, esta

solución se prepara al día. La solución se colocó en un sonicador para asegurar

una buena disolución. El matraz se cubrió con papel aluminio para protegerlo

contra la luz.

Para la determinación de la actividad se prepararon las muestras, un blanco

(para eliminar la intensidad de color de los extractos) y la solución estándar (Tabla

1). Estas se agitaron vigorosamente y se mantuvieron en oscuridad, a temperatura

ambiente por 30 minutos. Posteriormente se realizó la lectura en un

espectrofotómetro de UV a 517 nm. Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Cabe aclarar que por falta de material, los análisis de los extractos obtenidos por

26

maceración de O. californica, G. vermiculophylla y C. tuberculata no se lograron

realizar.

Tabla 1. Diluciones para determinar la capacidad antioxidante de los diferentes

extractos.

Muestra (µL) Blanco de muestra (µL)

Control (µL)

Muestra 375 375 0 Solución DPPH 750 0 750 Etanol 0 750 375 Volumen total (µL) 1125 1125 1125

Los resultados se expresan como IC50, que es la cantidad de la muestra

que reduce la absorbancia de la solución de DPPH en un 50%. Así un menor valor

de IC50 indica una mayor actividad antioxidante, porque requiere menos cantidad

de la muestra para disminuir un 50% la absorbancia de la solución DPPH (Aubad

et al. 2007). Los cálculos se muestran en el Anexo 2.

Contenido total de compuestos fenólicos

Para calcular la concentración de polifenoles totales se usó el método de

Skerget et al. 2005 modificado. El resultado se expresó en mg de ácido gálico/g de

extracto utilizando el método espectrofotométrico basado en una reacción

colorimétrica de oxidación-reducción. Para ello se utilizó el reactivo Folin-Ciocalteu

1N. Este reactivo consiste en una mezcla de ácido fosfotúngstico (H3PW12O10) y

de ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40), que se reduce por oxidación de los fenoles,

27

a una mezcla de óxidos azules de tungsteno (W8O23) y de molibdeno (Mo8O23). La

coloración azul producida posee una absorción máxima aproximadamente de 700

nm y es proporcional a la tasa de compuestos fenólicos.

La preparación de las muestras se realizó disolviendo 5 mg de extracto en

10 mL de etanol y se agito vigorosamente con la ayuda de un vortex. De esta

solución se tomó 100 µL para después completarse a 500 µL con agua destilada.

Esto se realizó para cada uno de los 9 extractos con sus dos tratamientos.

Para la curva de calibración, se preparó una solución de 1 mg mL-1 de ácido

gálico (SIGMA) (esta solución se puede guardar hasta por dos semanas en

refrigeración). A partir de esta solución se obtuvieron concentraciones de 0.1, 0.2,

0.4, 0.8 y 1.0 mg mL-1 de ácido gálico (Tabla 2).

Tabla 2. Diluciones para preparar la curva de calibración de fenoles totales.

Ácido Gálico/Agua Destilada

Solución Stock (µL)

Agua Destilada (µL)

Concentración (mg mL-1)

10 mg/10 mL 0 1000 0 10 mg/10 mL 100 900 0.1 10 mg/10 mL 200 800 0.2 10 mg/10 mL 400 600 0.4 10 mg/10 mL 800 200 0.8 10 mg/10 mL 1000 0 1

Posteriormente se tomaron 20 µL de cada uno de los extractos, se les

adicionaron 1.5 mL de agua destilada más 100 µL del reactivo Folin-Ciocalteu 1N,

28

se agitaron y se dejaron reposar por 8 minutos. Después, se le adicionaron 300 µL

de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20%, se agito nuevamente y se dejó reposar

por 2 horas a 20˚C en oscuridad. Una vez transcurrido el tiempo se leyó en un

espectrofotómetro a λ = 765 nm. De esta manera y tomando como referencia la

curva de calibración los resultados fueron referidos como mg de ácido gálico/g

extracto (mg EAG/ g extracto). Todas las pruebas se realizaron por triplicado.

Comparación de los resultados obtenidos en los métodos de extracción.

Se realizó una prueba de X2 de independencia para establecer si existen

diferencias significativas entre los dos tipos de extracción, mediante el programa

STATISTICA 6. A los datos también se les aplico una prueba de normalidad y se

sometieron a la prueba de Bartlett para comprobar homogeneidad de varianzas.

Se realizó un análisis de varianza de una vía (ANDEVA) para comparar la

actividad antioxidante entre los extractos después de la transformación de los

datos si fuese necesario, y se llevó a cabo una prueba a posteriori (Tukey HSD)

cuando los datos mostraron diferencias significativas (p˂0.05).

29

RESULTADOS

Rendimiento de los extractos

En la Tabla 3 se observan los resultados de rendimiento de extracción

obtenidos con los dos métodos utilizados. Resulta evidente que los rendimientos

más altos se obtuvieron al utilizar el método de Soxhlet. Siendo el extracto de

Padina concrescens, el que presento los valores más altos (28.4%), mientras que

Codium fragile presentó los más bajos (4.36%). En cuanto a los resultados con el

método de Maceración, los rendimientos más altos se obtuvieron con C. fragile

(2.96%) y los más bajos con Gracilaria vermiculophylla (0.6%).

Tabla 3. Rendimiento de los extractos de las macroalgas en ambos métodos de extracción.

Macroalga Método de Extracción

Peso Extracto (g)

Rendimiento (%)

Ulva lactuca Maceración 0.26 1.04 Soxhlet 2.24 8.96

Codium fragile Maceración 0.74 2.96 Soxhlet 1.09 4.36

Padina concrescens Maceración 0.29 1.16 Soxhlet 7.10 28.4

Colpomenia tuberculata Maceración 0.26 1.04 Soxhlet 1.77 7.08

Sargassum horridum Maceración 0.43 1.72 Soxhlet 1.65 6.6

Opuntiella californica Maceración 0.30 1.2 Soxhlet 2.39 9.56

Gracilaria vermiculophylla Maceración 0.15 0.6 Soxhlet 1.35 5.4

Laurencia gardneri Maceración 0.38 1.52 Soxhlet 2.22 8.88

30

Actividad antioxidante

El análisis cualitativo de la actividad antioxidante realizado en cromatografía

en capa fina, revelado con DPPH (0.2%), mostro que aun cuando todos los

extractos presentaron en su línea base una coloración amarilla (la cual es

indicativa de la oxidación del radical), fue en los extractos de P. concrescens, C.

fragile y L. gardneri, donde se observan de manera evidente compuestos con una

actividad más evidente (Fig. 7).

Figura 7. Análisis preliminar de actividad antioxidante en cromatografía en capa

fina revelada con DPPH al 0.2%. Tratamiento I. Soxhlet; II: Maceración.

31

Actividad captadora del radical libre DPPH de los extractos.

En este ensayo se analizó la actividad captadora del radical libre DPPH y se

expresa como IC50 (mg mL-1) que es la concentración del extracto necesaria para

inhibir el 50% del radical DPPH, así un valor bajo de IC50 significa mayor actividad

antioxidante. En la figura 8 se presentan los valores de IC50 de cada extracto.

Figura 8. Actividad captadora de radicales libres expresada en valores de IC50, dado en mg mL-1 (±DS; n=3) para los extractos de macroalgas y controles (BHT y ácido ascórbico). Tratamiento I: Soxhlet; II: Macerado. Letras diferentes indican diferencia significativa (Prueba Tukey HSD p˂0.05)

32

Resulta evidente que los extractos de P. concrescens son los que

presentan la mayor actividad, en específico el extracto obtenido con el método de

Macerado, el cual obtuvo la mejor actividad antiradical (0.29 mg mL-1) aún por

debajo de los valores obtenidos con los estándares BHT y ácido ascórbico (0.50 y

0.46 mg mL-1 respectivamente). De manera general, se puede observar que los

extractos obtenidos mediante el método de extracción por maceración presentaron

un IC50 más bajo que los del método de Soxhlet y por lo tanto mayor actividad

antiradical.

Contenido de Fenoles Totales

Para la determinación del contenido total de fenoles mediante el reactivo de

Folin-Ciocalteu, se utilizó como estándar al ácido gálico a través de una curva de

calibración (Fig. 9). Los resultados se expresan como miligramos equivalentes de

ácido gálico (EAG)/g de extracto.

Figura 9. Curva de calibración de fenoles totales.

33

Los resultados del contenido total de fenoles se muestran en la tabla 4, los

valores oscilan en un intervalo entre 181.6 y 12.0 mg EAG/ g extracto. Los

extractos con mayor contenido de fenoles fueron P. concrescens y L. gardneri en

ambos tratamientos.

Tabla 4. Contenido de fenoles totales (mg EAG/ g extracto) para ambos métodos de extracción.

Especies Contenido de fenoles totales (mg EAG/ g extracto)

SOXHLET MACERADO

Padina concrescens 57.7 123.9

Opuntiella californica 24.9 21.5

Gracilaria vermiculophylla 18.46 25.5

Colpomenia tuberculata 19.0 24.9

Laurencia gardneri 114.2 181.6

Ulva lactuca 12.0

Sargassum horridum 23.7

Codium fragile 17.3

Comparación de los métodos de extracción utilizados.

Al comparar los resultados obtenidos en los dos métodos, de acuerdo a la

prueba de X2 de independencia (g.l.=4, p˂0.01, X2= 0.0014), realizada a los extractos de

Padina concrescens, Sargassum horridum y Codium fragile, se observó que

34

existe diferencia significativa en la actividad antioxidante entre los métodos de

extracción.

La prueba de Tukey HSD (p˂0.05) realizada para la comparación de la

actividad antioxidante de los extractos, indica que los extractos de P. concrescens

(en ambos métodos de extracción) y el extracto por maceración de S. horridum

son comparables con los antioxidantes comerciales: ácido ascórbico y BHT.

35

DISCUSIÓN

Rendimiento de extracción.

Los resultados obtenidos ponen de manifiesto que el rendimiento de un

extracto va a depender del método de extracción. Además de que este puede

variar dependiendo de la especie, la localidad y época del año. Al revisar la

literatura se observa que se utilizan diversos métodos de extracción y disolventes

para obtener los extractos. Estudios realizados por Echavarría et al. (2009)

utilizaron el método de Soxhlet obteniendo rendimientos de 6.77% para

Sargassum cymosum, 0.64% para Sargassum. sp y 6.33% para Laurencia sp. Los

valores para S. cymosum y Laurencia sp coinciden con los obtenidos en este

trabajo para S. horridum (6.6%) y L. gardneri (8.88%). Matanjun et al. (2008)

indican que a partir de extractos de Padina sp. realizados por maceración con

metanol, obtuvieron un porcentaje de rendimiento del 8.55%, al comparar este

valor con el de esta tesis para P. concrescens (1.16%) se observa una clara

diferencia.

El método Soxhlet se utiliza en mayor medida para la obtención de

extractos en ensayos de actividad antioxidante debido a que es un método de

extracción eficiente y en algunos casos la actividad antioxidante de los extractos

es mejor (Yan et al. 1999). Los resultados obtenidos en el actual trabajo

concuerdan en que es un método con el que se obtiene un mejor rendimiento, y en

este caso, los mejores resultados de actividad antioxidante se presentaron con el

método de maceración.

36

Actividad antioxidante

El análisis cualitativo de la actividad antioxidante mostró que aun cuando

todos los extractos presentaron una coloración amarilla que indica actividad

antioxidante, sólo los extractos de Padina concrescens, Codium fragile y Laurencia

gardneri presentaron de manera evidente compuestos con dicha coloración. Este

análisis cualitativo fue confirmado mediante la determinación de la actividad

captadora del radical libre DPPH de los extractos, la que indico nuevamente que

P. concrescens, C. fragile y L. gardneri, presentaron una alta actividad

antioxidante. Solamente para el caso de S. horridum se presentó una buena

actividad, y esta no fue tan evidente en el análisis cualitativo.

El ensayo DPPH no es especifico a un antioxidante en particular, la

actividad de los radicales libres de estos extractos puede deberse a la presencia

de otros antioxidantes solubles en agua tales como los polisacáridos, ácido fólico,

tiamina y ácido ascórbico, que contienen la mayoría de las algas marinas

(Yangthong et al. 2009). Además de que es un método rápido y sencillo que no

requiere un equipamiento sofisticado, únicamente un espectrofotómetro, y no es

necesario preparar el radical previamente, puesto que el DPPH se comercializa ya

en la forma de radical y sólo se requiere disolver en metanol. Por esta razón es

ampliamente utilizado en la evaluación de la actividad antioxidante total (Prior et

al. 2005).

En el caso de las algas pardas estudiadas en este trabajo, la mejor

actividad antioxidante (captación del radical libre DPPH) se presentó en los

37

extractos de P. concrescens obtenidos mediante el método de Macerado con un

IC50 de 0.29 mg mL-1, el cual fue más bajo que las soluciones stock de ácido

ascórbico y BHT (IC50 de 0.46 y 0.50 mg mL-1 respectivamente). El extracto

obtenido por el método de Soxhlet, también presentó una buena actividad (IC50 =

0.57 mg mL-1), aunque ligeramente por arriba de los antioxidantes comerciales. El

género Padina ha mostrado una actividad antioxidante promisoria, estudios con P.

mexicana de San Juan de la Costa, B. C. S., también mostraron una muy buena

actividad frente al radical DPPH con valores de IC50 de entre 0.02 hasta 0.22 mg

mL-1 para diferentes fracciones orgánicas comparables al stock de fluoroglucinol

(Castro-Silva 2010).

Existen otros estudios realizados con este género, en los que los resultados

no fueron tan promisorias, tal es el caso del trabajo realizado por Amornlerdpison

et al. (2007) que obtuvieron una actividad frente al radical libre DPPH de IC50 =

6.92 ± 0.16 mg mL-1, los autores mencionan que si bien el IC50 fue mayor a los

obtenidos con el antioxidante comercial Trolox, este es sintético y los extractos

probados al ser naturales pueden ser utilizados como productos nutraceuticos o

cosmetológicos. Un caso similar resulta con P. gymnospora que presentó un IC50=

3.45 mg mL-1 en la captación del radical DPPH (Zubia et al. 2007).

Sargassum horridum, también mostró una buena actividad presentando un

IC50 de 2.11 mg mL-1 (método de maceración) y de 4.46 mg mL-1 (método Soxhlet).

Resultados con este género han dado lugar a diferentes valores de actividad

dependiendo de la especie y el tipo de extracto. Echavarría et al. (2009)

38

determinaron una muy buena actividad en el extracto metanolico de Sargassum

sp. con un IC50 =0.361 mg mL-1, mientras que Matanjun et al. (2008) reportaron

para S. polycystum un IC50 = 1.86 ± 0.02 mg mL-1 en su ensayo TEAC. Por otra

parte con S. ramifolium y S. pteropleuron los valores fueron más altos con un IC50

de 6.64 y 7.14 mg mL-1 respectivamente (Zubia et al. 2007).

En trabajos realizados con algas verdes, también las han considerado como

un recurso con una buena actividad antioxidante (Matanjun et al. 2008). En

algunos géneros, la presencia de altos niveles del complejo clorofila-proteínas ha

sugerido su potencial efecto biológico como antioxidantes (Barrett y Anderson

1980).

En el caso de Codium fragile los resultados mostraron valores de IC50 de

4.55 y 9.34 mg mL-1 para los extractos obtenidos por Maceracion y Soxlhet,

respectivamente. Al comparar con otros trabajos como los realizados por Zubia et

al. (2007) que reportan para el extracto de Codium decorticatum, valores de IC50 =

51.48 mg mL-1. Se observa que C. fragile de la Bahía de La Paz tiene mayor

potencial antioxidante. Un comportamiento similar se observó para el extracto de

Ulva lactuca (método Soxhlet) donde se obtuvo un IC50 de 19.20 mg mL-1 que

muestra una mejor actividad que extractos de Ulva lactuca de Tailandia, que

presentan valores de IC50 de 103.73 ± 0.59 mg mL-1 para el extracto obtenido por

el método de ebullición y un IC50 de 61.68 ± 0.51 mg mL-1 para el extracto por el

método de autoclave (Yangthong et al. 2009).

39

No todas las algas pardas presentan buena actividad antioxidante, tal es el

caso de Colpomenia tuberculata (IC50 = 13.18 mg mL-1, Soxhlet). Sin embargo, al

comparar este valor con los obtenidos por Lakemeera et al. (2008) para los

extractos de DMSO y MeOH de C. sinuosa (IC50 = 0.03 y 0.028 mg mL-1,

respectivamente), se observó que este género presenta una significativa actividad

antioxidante.

Con respecto a las algas rojas, el género Laurencia ha mostrado una

interesante actividad antioxidante. Echavarría et al. (2009) reportaron que el

extracto metanolico de Laurencia sp., presentó valores de IC50 = 0.77 mg mL-1.

Los resultados de este trabajo con L. gardneri, mostraron una menor actividad

antioxidante con valores de IC50 de 5.13 mg mL-1. De igual manera L. obtusa

recolectada en Quintana Roo, México presentó poca actividad con un IC50 de

37.50 mg mL-1 (Zubia et al. 2007). De manera similar Gracilaria vermiculophylla

dio lugar a una baja actividad antioxidante (IC50 = 38.07 mg mL-1, Soxhlet), similar

a lo encontrado por Zubia et al. (2007) que reportan valores de IC50 de 33.73 y

42.27 mg mL-1 en las algas G. caudata y G. bursa-pastoris, respectivamente.

Contenido de fenoles totales

Matanjun et al. (2008), reportan que las algas pardas y verdes son las que

presentan un mayor contenido de fenoles totales. Estudios con algas pardas han

demostrado que son potentes antioxidantes por su alto contenido en polifenoles

40

tales como el fluoroglucinol, que presenta radicales libres que neutralizan la

actividad oxidante (Carte 1998; Ben-Dor et al. 2005).

En este estudio Padina concrescens presentó uno de los valores más altos

de fenoles totales (123.9 mg EAG/ g extracto), además de ser el extracto con la

mejor actividad antioxidante. Según Wangensteen et al. 2004 existe una

correlación entre el contenido de fenoles y la actividad antioxidante. Sin embargo,

la determinación de fenoles totales no siempre está directamente relacionada con

la medición de la actividad antioxidante, pero puede ser útil para tales estudios, en

especial si se combinan con métodos para medir la actividad antioxidante (Lim et

al. 1998). De hecho, la producción de compuestos antioxidantes, como

compuestos fenólicos, está influenciada por factores extrínsecos (presión de

herbívora, irradiación, profundidad, salinidad, nutrientes, etc.), e intrínsecos (tipo,

edad y estado reproductivo) (Connan et al. 2006, en Zubia et al. 2007).

Sin embargo, es muy difícil el comparar las actividades antioxidantes de las

algas con otros estudios, debido a que cada autor usa diferentes protocolos de

extracción, métodos de prueba y hasta unidades. Es por eso que el uso del índice

de oxidación IC50 representa una herramienta valiosa.

Comparación de los métodos de extracción utilizados

Al comparar los dos métodos de extracción para las especies

seleccionadas mediante la prueba estadística de X2 de independencia (g.l.= 4, p˂0.01,

X2= 0.0014), resulta evidente que con el método Soxhlet se obtiene un mejor

41

rendimiento de extracción, sin embargo, la actividad antioxidante es mayor en los

extractos obtenidos por maceración debido a que presentan un mayor contenido

de fenoles totales. Se ha observado que el método de extracción puede influir en

la composición y por ende en las propiedades de los compuestos contenidos en

un extracto (Ruperez et al. 2002). En cuanto a los disolventes utilizados, el

metanol se utiliza frecuentemente en la extracción de compuestos fenólicos por la

posibilidad de que se establezcan puentes de hidrógeno entre sus moléculas, lo

que determina una alta afinidad entre ellas (Jimenez-Moleón et al. 2008), mientras

que el cloroformo y el diclorometano favorecen la extracción de flavonoides de

baja polaridad. Para determinar el efecto que tiene la variación en los disolventes

o la forma de extracción en el aislamiento de compuestos con mayor actividad

antioxidante hace falta realizar un mayor número de experimentos.

42

CONCLUSIONES

Resulta evidente que existe una variación en la actividad antioxidante de las

macroalgas de San Juan de la Costa, B.C.S. observando valores de IC50 entre

0.29 y 38.07 mg mL-1 y valores de fenoles totales de 12.0 a 181.6 mg EAG/ g

extracto.

Los mejores resultados se obtuvieron con ell extracto (Maceración) de Padina

concrescens, el cual mostro una promisoria actividad antioxidante (0.29 mg

mL-1) incluso mejor que la de los antioxidantes comerciales BHT (0.5 mg mL-1)

y ácido Ascórbico (0.46 mg mL-1). Además de que este extracto presenta un

alto contenido de fenoles totales (123.9 mg EAG/ g extracto).

Los extractos de Sargassum horridum, Codium fragile y Laurencia gardneri

presentaron una moderada actividad con valores entre 2.11 y 9.34 mg mL-1.

Sin embargo fue en el extracto (Macerado) de Laurencia gardneri donde se

presentó el mayor contenido de fenoles totales (181.6 mg EAG/ g extracto).

El método de extracción Soxhlet da lugar a un mejor rendimiento en los

extractos, pero bajos valores de actividad; mientras que con el método de

maceración se obtuvo un mayor contenido de fenoles totales y una mejor

actividad antioxidante.

43

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ANEXOS

ANEXO 1.- Listado Taxonómico de macroalgas Rhodophyta Florideophyceae Gracilariales Gracilariaceae Gracilaria vermiculophylla (Ohmi) Papenfuss 1967 Ceramiales Rhodomelaceae Laurencia gardneri Hollenberg, 1943 Opuntiella californica (Farlow) Kylin, 1925 Heterokontophyta Phaeophyceae Dictyotales Dictyotaceae Padina concrescens Thivy, 1945 Scytosiphonales Scytosiphonaceae Colpomenia tuberculata De A.Saunders, 1898 Fucales Sargassaceae Sargassum horridum Setchell y N.L.Gardner, 1924 Chlorophyta Ulvophyceae Ulvales Ulvaceae Ulva lactuca Linnaeus, 1753 Bryopsidophyceae Bryopsidales Bryopsidaceae Codium fragile (Suringar) Hariot, 1889

59

Anexo 2. Cálculos para determinar los valores de actividad antioxidante

(IC50).

CI50 = C1-ΔC

Donde:

ΔC = [(C1-C2)x(PI1-50)]/ (PI1-PI2), en el que: PI1 y PI2

corresponden a los valores de porcentajes de inhibición

inmediatamente superiores e inferiores al 50% de inhibición y C1 y C2

corresponden a las concentraciones en las que se producen PI1 y

PI2, respectivamente.

Porcentaje de reducción de la solución DPPH, es la cantidad de solución

DPPH, expresada en porcentaje, que la muestra (µL) ha logrado reducir.

% Decoloración DPPH = [1 – (Am – Abm/ADPPH)] * 100

Donde:

Am = absorbancia de la mezcla de reacción (DPPH + extracto)

Abm = absorbancia del blanco de muestra (extracto + agua)

ADPPH = la absorbancia de la solución de DPPH