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Unidad9. Principios de Ingeniería GenéticaAplicaciones de Biología Molecular

• Aislamiento, análisis y manipulación de ácidos nucleicos

• Generación de moléculas de DNA recombinante

• Ingeniería Genética

AISLAMIENTO DE ÁCIDOS NUCLEICOS (DNA) Lisis celular y de núcleos en el caso de eucariontes (para DNA)

(detergentes, proteasas, cambios de presión)

Separación del DNA del resto de los componentes celulares(principalmente proteínas). Desnaturalizantes de proteínas,

solventes (fenol-cloroformo)

Repetir la extracción. Eliminación del fenol.

Formación de sal de ácido nucleico y precipitación con etanol o isopropanol

Disolver el DNA (Se concentra)

Análisis del DNA

Análisis de Ácidos Nucleicos por Espectrofotometría

Espectro de absorción de DNA

Estimación de la concentración de A.N. por espectrofotometría

A260 = 1

50 µg/ml DNA dc

33 µg/ml DNA cs

40 µg/ml RNA

También se mide la relación de abs.

A260/ A280 => 1.8-2.0

ANÁLISIS ELECTROFORÉTICO DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Separación en geles de agarosa (1–4%)

Electroforesis horizontal.

Migran al ánodo

Tinción con bromuro de etidio

Intercala entre las bases del DNA

Forman complejos fluorescentes

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Herramientas para el análisis de DNA.Enzimas de restricción y sus sitios de corte

• Son purificadas de bacterias

•Las enzimas de restricción son endonucleasas

•Rompen en sitios específicos del DNA

•Reconocen secuencias palíndromicas específicas de 4; 6 o 8 pb

•Algunas generan extremos romos y otros extremos cohesivos en el DNA al que cortan

LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN CORTAN DEJANDOEXTREMOS COHESIVOS “STICKY”

DNA de un plásmido digerido con EcoRI

DNA genómico digerido con EcoRI

Extremos son compatibles

Se aparean las bases de los extremos cohesivos y la DNA ligasaforma el enlace fosfodiéster entre la G y la A en ambas cadenas

VECTORES DE CLONACIÓN: PLÁSMIDOS

INSERCIÓN DE DNA FORÁNEO EN UN PLÁSMIDO (VECTOR)

Corte del DNA con enzimas de restricciónLigación del DNA foráneo con una DNA ligasa, incorporándolo al vector

Plásmido

DNA de interés

Tratamiento con enzima de restricción

Fragmentos de DNA con extremos cohesivos compatibles

Mezclar los fragmentos en presencia de una DNA ligasa

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CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA GENÓMICA

Una biblioteca de DNA genómicoes un conjunto de fragmentos de DNA de un organismo y empaquetados en vectores (plásmidos), que son mantenidos en células bacterianas.

Digestióncon enzimasde restricción

DNA fragmentadoy clonado en plásmidos

Introducción de los plásmidos en bacterias

TÉCNICAS DE HIBRIDIZACIÓN DEL DNA

DESNATURALIZACIÓN-RENATURALIZACIÓN

DNA de doble hélice

Desnaturalización: se genera DNA de cadena sencilla

Renaturalización: se forma DNA duplex

BÚSQUEDA DE UN GENE EN LA BIBLIOTECA GENÓMICA o DE cDNA

Caja Petri con colonias de bacterias

Se hace una réplica de las colonias en la membrana

Lisis de las bacterias y desnaturalización del DNA con NaOH

Sonda: DNA de cadena sencilla marcado con 32P

Incubación con las sonda y

lavadoColonias con el plásmido de interés

Exposición a un film fotográfico. Detección de colonias con el plásmido de interés.

Membrana de nylon o nitrocelulosa

SÍNTESIS DE cDNA y construcción de una biblioteca de cDNA

Selección del tejido Extracción de RNAm

Hibridar con oligo-dT

Síntesis de cDNA con una transcriptasa

reversa

Síntesis de la segunda cadena de DNA

Eliminación del RNA

Las transcriptasasreversas son enzima virales. Sintetizan DNA usando RNA como molde

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Transferencia en Southern

Desarrollo de la Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

Great Fountain Geyser,

Yellowstone. Manantial

Temperatura 55-80°C

Thermus aquaticus

TaqDNA Polimerasa

El número de copias del fragmento de DNA aumenta exponencialmente

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La reacción de PCR tiene múltiples aplicaciones

• Detección de alelos mutantes caracterizados.• Búsqueda de alelos mutantes no conocidos.• Identificación de microorganismos patógenos.

– Caracterización de cepas del virus de la influenza

• Aislamiento de moléculas de DNA genómico y de cDNA (Clonación de genes)

• Secuenciación de DNA• Generación de mutantes puntuales.• Estudiar la expresión génica.

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La era genómica. Secuenciación de DNA

La era genómica. Secuenciación de DNA

SECUENCIACIÓN DE DNA

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Secuenciación de Genomas

Aplicaciones de Biología Molecular

Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)

Diagnóstico genético. PCR

Producción de proteínas recombinantes en bacterias

Plantas genéticamente modificadas. Plantas transgénicas

Terapia génica

Mapeo basado en el análisis de RFLP (polimorfismo basado en la longitud de fragmentos de restricción)

A lo largo del genoma de cada individuo hay diferencias sutiles en la secuencia del DNA. Estos cambios son de una sola base.

Estos cambios pueden generar la formación de un sitio de reconocimiento para enzimas de restricción por lo que el patrón de corte de una enzima de restricción para cada individuo va a ser único.

Individuo 1 Individuo 2

Homocigoto Homocigoto

Este es el fundamento de pruebas de paternidad.

heterocigoto

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Esta prueba también se utiliza en peritaje forense para obtener la “huella genética”

Se utiliza la técnica de Southernblot

Mancha de Sangre

El DNA se extrae de las células sanguíneas

Digestión del DNA con enzimas de restricción

Los fragmentos de DNA se separan por electroforesisSouthern blot

Sonda de DNA marcada se une específicamente

La membrana se lava y se revela para detectar bandas de

interacción DNA-DNA

El patrón de DNA se compara con el de

“sospechosos”

Distrofia Muscular

Hemofilia

Neurofibromatosis

Esclerosis lateral

Inmunodeficiencia ADA

Hipercolesterolemia

Amiloidosis

Cáncer de mama

Enfermedad policística de hígado

Enfermedad de Tay-Sachs

Alzheimer

Retinoblastoma

Fenilcetonuria

Anemia falciforme

Neoplasia endócrina

Melanoma maligno

Exostosis múltiple

Fibrosis cística

Hemocromatosis

Poliposis

Enf. Huntington

Retinitis pigmentosa

Cáncer de colon

Enf. de Gaucher

Se han mapeado genes anormales causantes de enfermedades

Diagnóstico genético. PCR

Debido a que las mutaciones más comunes que son responsables de estas enfermedades ya están caracterizadas, se han establecido algunas pruebas genéticas:

Pruebas diagnósticas. Establecen o confirman el diagnóstico de un individuo que ya está afectado.

Pruebas pre-sintomáticas. Determinan con un alto grado de certeza si un individuo va a desarrollar alguna enfermedad.

Pruebas predictivas. Indican un elevado riesgo de una enfermedadpero no pueden establecer con certeza si un individuo va a estarafectado.

Estas pruebas genéticas son especializadas pues muchas de ellas involucran la amplificación del fragmento de DNA correspondiente al gen que se busca y la secuenciación del gen.

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Producción de proteínas recombinantes en bacterias.

Escalamiento y purificación de la proteína

Aplicaciones en Biotecnología Vegetal

• Plantas transgénicas que expresan proteínas que le confieren alguna propiedad agronómica importante:– Resistencia a plagas de insectos– Resistencia a herbicidas– Resistencia a virus

• Detección de microorganismos patógenos en plantas por métodos moleculares.– Virus, bacterias, micoplasmas

El mejoramiento tradicional de plantas implica hacer una cruza entre genotipos distintos para incorporar un carácter y luego hacer selección y autocruzas para obtener un homocigoto.

Patrón de herencia Mendeliana. Puede llevar varios años hasta obtener el homocigoto con los caracteres deseados.

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La ingeniería genética de plantas implica el aislamiento de un gen de cualquier especie e incorporarlo en plantas para que tengan una nueva característica.

Una limitación importante es la transformación (introducción del DNA) de céluals vegetales.

Transformación por bombardeo

Transformación por Agrobacterium tumefaciens

Resistencia a plagas de insectos. Gusano barrenador en maíz.

En las esporas de Bacillus thuringiensis se acumulan proteínas (Cry) con actividad insecticida.

Toxinas Bt

El insecto ingiere la protoxina al alimentarse del tejido de la planta

La protoxina sufre proteólisis en el intestino del insecto y se genera la toxina activa

La toxina se une a receptores en las cel. epiteliales del intestino

La toxina se oligomeriza y forma poros en la MP de la cel. epitelial

Mecanismo de acción de las toxinas Bt

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La toxina Bt es orgánica, por lo tanto es biodegradable

Por el uso de cultivos Bt resistentes a insectos:

Se reduce el número de aplicaciones de insecticidas.

Se incrementa el rendimiento

El uso de estos cultivos se ha incrementado mundialmente en los últimos años:

Controversias sobre plantas transgénicas.

• Los vectores para la transformación de plantas tienen marcadores de resistencia a antibióticos como marcadores de selección. La presencia ubicua de estos genes pueden facilitar la transferencia resistencia a antibióticos a bacterias pátogenas.

• Generalmente los marcadores de selección son KanR y NeoR

• Escape de genes del cultivo transgénico a malezas. Generación de supermalezas resistentes a herbicidas.

El caso de maíz en México.

México es el centro de origen del maíz. Hay amplia diversidad y especies de maíz silvestre en México.

Transferencia de genes a estas especies.

Reducción en la diversidad?

Aislar el gen de interés y clonarlo en un vector.

Interrumpir el gen con una secuencia de DNA que confiera resistencia a un antibiótico.

Transformar células embrionarias totipotenciales con la secuencia quimérica de DNA.

Seleccionar las células transformadas en presencia del antibiótico.

Inyectar las células a embriones de ratón.

Transferir los embriones a una hembra para su desarrollo.

En la camada se obtendrán ratones heterocigotos (x/-)

Hacer una cruza entre dos heterocigotos.

El 25% será (-/-).

Animales transgénicos. Ratones “knock-out”