Unidad5 Libro

7/25/2019 Unidad5 Libro

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MICROBIOLOGA INDUSTRIAL

UNIDAD V RECUPERACIN DE PRODUCTOS 123

UNIDAD VRECUPERACIN DE PRODUCTOS

5.1 UNIDADES DE OPERACIN EN LA RECUPERACIN DE PRODUCTOS

Depende del producto a recuperar, ya que si se trata de una protena de origen celular, solo sesedimenta la biomasa y se decanta. Sin embargo la mayora, de los productos son de origenintracelular (vitaminas, enzimas, cidos nucleicos, etc.). Por lo tanto existen varios mtodos, queincluyen a la floculacin, flotacin, filtracin o centrifugacin, las ltimas etapas del procesoimplican precipitacin, cristalizacin y/o decantacin. (8)

La recuperacin y purificacin de un producto es uno de los aspectos ms importantes de unproceso de fermentacin. Una etapa de la recuperacin cambia o la pureza o la concentracin de un

metabolito. Un proceso ideal debe optimizar ambos parmetros. En resumidas cuentas larecuperacin de productos consiste en la separacin de la biomasa celular, y los ingredientesinsolubles. (8)

Productos finales

a) Microorganismos: Produccin de biomasa

b) Metabolitos intracelulares cidos nucleicos

Vitaminas Enzimas Antibiticos

c) Metabolitos extracelulares Aminocidos Alcohol antibiticos

Las etapas de purificacin dependen de

(8)

: Concentracin. Productos laterales presentes. La naturaleza del producto. Estabilidad del material biolgico.

Grado de purificacin necesario.

Una etapa de recuperacin cambia por (8):

La pureza de un metabolito.

La concentracin de un metabolito.


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Mtodos

Floculacin

Flotacin Filtracin Centrifugacin

NOTA: Si va a ser aislado un metabolito intracelular, debe ser liberado antes de las clulas.

Ejemplo de metabolitos extracelulares: aminocidos, cido ctrico, alcohol algunas enzimas(aminasas y proteasas).

Una vez que el metabolito se ha separado de las clulas, la seleccin de etapas adicionales depurificacin depender del producto deseado.(8)

Las ultimas etapas implican (8): Precipitacin. Cristalizacin. Desecacin.

MTODOS DE:

5.1.1 FLOCULACIN Y FLOTACIN

Las clulas aisladas en el rango de 10 micras sedimentan solo muy lentamente y son difciles deprecipitar incluso con la centrfuga. En algunos casos puede utilizarse la floculacin para producirgrandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente. En la mayor parte de los casos seaade un agente floculante, como una sal inorgnica, un polielectrlito orgnico o un hidrocoloidemineral. Dependiendo del agente utilizado el proceso de floculacin puede ser reversible oirreversible. El proceso de floculacin esta tambin influido por la naturaleza de las clulas y losconstituyentes inicos y por su concentracin.(8)

El proceso inverso a la floculacin es la flotacin que es ms fcil de conseguir induciendo gas enel lquido. Las clulas se adsorben a las burbujas de gas y suben a la capa de espuma en la partesuperior del recipiente donde pueden ser recogidas y sacadas del biorreactor. (8)

Producir grandes agregados que sedimentan mucho ms rpidamente.

Agregar agente floculante (sal inorgnica).

Depende si el proceso ser reversible o irreversible.(8)

Influido por:

La naturaleza de las clulas. Los constituyentes inicos.

Concentracin.


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5.1.2 SISTEMA DE FILTROS

Lo ms frecuente es que en la primera etapa del proceso de recuperacin, la separacin de la

biomasa y el filtrado del cultivo, se lleve a cabo por algn tipo de proceso de filtracin; los dosprincipales tipos de filtros son los filtros profundos (Fig.114) y filtros absolutos (Fig.115).(8)

Fig. 113 Mecanismo por medio del cual se lleva a cabo la filtracin. Fig. 114Filtro profundo.

Los filtros profundosestn constituidos poruna matrizfilamentosa, comoasbesto, lana de vidrioo papel de filtro,

llevndose a cabo elproceso de filtracindebido a que laspartculas que han deser removidas quedan

atrapadas dentro de la matriz. Las partculas que van a ser filtradas frecuentemente son mspequeas que los poros del filtro, pero a pesar de ello son separadas a medida que pasan a travs delos intersticios del filtro. (8)

Los filtros absolutos son membranas con tamao de poros ms pequeos que las partculas que vana ser filtradas, las partculas por lo tanto, son separadas sobre las superficies de los filtros.(8)

Fig. 115 Filtros absolutos


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La eficiencia depende del tamao de los microorganismos, morfologa, pH, viscosidad,temperatura, presencia de capas mucosas y presencia de otros microorganismos como posiblescontaminantes.(8)

Para mantener la eficiencia en la filtracin se utiliza una cuchilla automtica para rasparcontinuamente la biomasa del filtro.(8)

Existen dos procesos de filtracin por membrana: estticos y contra corriente. El filtro contracorriente se desarroll para evitar las obstrucciones, ya que el filtrado pasa a travs de la membranay la biomasa se separa del filtro y se transfiere con un material que se retiene. (8)

Los tipos de procesos de filtracin son:

smosis inversa(tamao de partcula 0.0001 0.001 micras) (Fig.116).(8)

Fig.116 Proceso de osmosis inversa.

La smosis inversa ha sido empleada en agua de mar para des salinizarla. El agua cruza unamembrana semipermeable, si la concentracin de solutos osmticamente activos, tales como sal, esms alta en el lado opuesto de la membrana. Sin embargo, si la presin se aplica al lado de lasmosis inversa entonces ocurrir, y el agua ser conducida a travs de la membrana del lado de lasal. (8)


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Fig. 117 Diferentes ejemplos de equipos para realizar smosis inversa.


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Ultra filtracin(tamao de partcula 0.001 0.1 micras)(8)

Fig. 118 Sistema de ultrafiltracin. Fig. 119 Sistema de ultrafiltracin.

La ultra filtracin es similar a la microfiltracin solo que en esta las membranas tienen tamaos mspequeos del poro, y se utiliza para fraccionar soluciones segn su peso molecular. La ultrafiltracines tambin eficaz en quitar los pirgenos (lipopolisacridos bacterianos de la pared de la clula),desechos celulares, virus de medios, y para el proceso del suero. Otra variacin en el sistema de laultra filtracin es la diafiltracin, donde el agua o el otro lquido se filtra para quitar contaminantesindeseados de bajo peso molecular. Esto se puede utilizar como alternativa a la filtracin o a ladilisis de gel para quitar el sulfato de amonio de una preparacin de la protena precipitada por estasal, para cambiar un almacenador intermediario o en la purificacin del agua. (8)

Microfiltracin(tamao de partcula 0.1 10 micras) (8)

Fig. 120 Equipo utilizado en microfiltracin. Fig. 121 Equipo utilizado en microfiltracin.


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La microfiltracin es relativamente costosa debido al elevado costo de las membranas, pero tienevarias ventajas comparadas con la centrifugacin. Incluyen la operacin reservada, necesidadesenergticas ms bajas, el producto puede ser lavado fcilmente, control de la temperatura, la

contencin se alcanza fcilmente. Por lo tanto, es conveniente para manejar patgenos ymicroorganismos recombinados. (8)

Nota: la ultra filtracin y la smosis dependen del peso molecular de las substancias separadas.(8)

Es influenciada por:

El tamao del microorganismo. Morfologa. pH. Viscosidad.

Presencia de mucosa. Temperatura. Presencia de otros organismos.

Los problemas que debemos de considerar son: tamao de poro, selectividad de partcula, velocidadde flujo, facilidad de limpieza y reutilizacin, rea de superficie de la membrana, volumen muertodentro del filtro, la posibilidad de esterilizar el sistema y por ultimo los costos. (8)

FiltracinLa filtracin convencional de los lquidos que contienen los slidos suspendidos implica los filtrosde profundidad integrados por las lanas de los medios (pao, de cristal o la celulosa porosas) queconservan los slidos y permiten que el lquido filtrado pase a travs. Los slidos se acumulan sobreel medio del filtro, la resistencia a la filtracin aumenta y atraviesa los poros del filtro. (8)

Estas tcnicas son generalmente tiles para cosechar hongos filamentosos, pero son menos eficacespara recoger bacterias. (8)

Los dos tipos principales de filtracin convencional usados comnmente en la industria son:

Filtros de la placa y del marco o prensas de filtro Estn normalmente en la forma de un apilado horizontal que alterna las placas porosas y los marcoshuecos. El apilado se monta en una estructura que se liga con un espoln hidrulico o un tornillo.Las telas filtrantes se sostienen en el lugar entre las placas que contienen los canales del flujo dealimentacin y las corrientes empapadas. Esto esencialmente forma una serie de compartimientosalineados en los cuales la suspensin de la clula sea forzada bajo presin. (8)

En la siguiente etapa se debe desmontar, para quitar el producto de filtracin recogido. Estossistemas se utilizan para cosechar microorganismos de fermentaciones, incluyendo la preparacin debloques de levadura de panadera, en la recuperacin de los precipitados de protena y de ladesecacin del lodo de aguas residuales.(8)

Los filtros de vaco rotatorios son los sistemas continuos simples del tratamiento de aguas, eldispositivo abarca un tambor perforado hueco que se apoya en medio el filtro. Este tambor rota


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lentamente en un tanque continuamente agitado que contiene la suspensin que se filtrar. Losslidos se acumulan en el medio del filtro mientras que el lquido filtrado se traslada, bajo vaco, conel medio del filtro dentro del tambor hueco a un recipiente de recepcin, mientras que el tambor rota,los slidos recogidos sostenidos en el medio del filtro son quitados por un cuchillo.(8)

Filtracin de membranaLos mtodos modernos de filtracin emplean los filtros absolutos. stos consisten en las membranasapoyadas con los tamaos especificados del poro que se pueden dividir en tres categorasprincipales. Estn, en el orden que disminuyen las membranas del tamao, de la microfiltracin, dela ultrafiltracin y de la smosis inversa del poro. La suspensin que se filtrar se bombea a travsde la membrana, esto retarda ensuciar la membrana por los materiales de las partculas. Laspartculas que su tamao es menor que el de la membrana pasarn a travs de la membrana, mientrasque el resto se conserva. Mientras que progresa la filtracin, el flujo a travs de la membrana sepuede retardar debido a que se ensucia la membrana. Esto puede ser causado por la acumulacin deuna capa de molculas del soluto en la superficie de la membrana. La presencia de los

antiespumantes del silicio puede tener un efecto negativo similar. (8)

Mtodo contracorrienteSe emplea principalmente para reducir la tendencia a las obstrucciones. La solucin se bombea encontracorriente a travs de la membrana y la biomasa se separa del filtro y se transfiere con elmaterial que se tiene.(8)

Ventajas: Se obtiene un aumento de la velocidad de filtracin de 100 veces en comparacin

con la filtracin esttica.

SedimentacinLa sedimentacin se utiliza extensivamente para la separacin primaria de la levadura en laproduccin de bebidas alcohlicas, y en el tratamiento de aguas residuales. Esta tecnologa barata esrelativamente lenta y es conveniente solamente para los flculos grandes. El ndice de lasedimentacin de la partcula es una funcin del tamao y densidad. (8)

5.1.3 CENTRIFUGACIN

Si en vez simplemente de usar la fuerza gravitacional para separar partculas suspendidas, se aplicaun campo centrfugo, el ndice de la separacin del slido-lquido se aumenta perceptiblemente ypartculas mucho ms pequeas pueden ser separadas. La centrifugacin se puede utilizar para

separar las partculas tan pequeas como dimetro de 0.1 micras y es tambin conveniente paraalgunas separaciones del lquido-lquido. Su eficacia, depende tambin del tamao de partcula,diferencia de la densidad entre las clulas y el medio, y la viscosidad media. La opcin de lacentrifugadora depende del tamao y de la densidad de partcula, y de la viscosidad del medio. Lascentrifugadoras de alta-velocidad se requieren para la separacin de microorganismos ms pequeos,tales como bacterias, comparadas con levaduras. La centrifugacin relativamente lenta recupera coneficacia las clulas residuales de la levadura restantes en cerveza despus de que el bulto hallasedimentado hacia fuera. (8)

Se utiliza para separar slidos-lquidos, fluido-fluido y fluido-partcula. En el caso de fluido-partcula se debe de considerar la pureza necesaria del fluido y la concentracin; en el caso de


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fluido - fluido se debe de considerar la pureza del lquido deseado y la recuperacin que se requierade la fase ms ligera ms pesada.(8)

Las ventajas de la centrifugacin incluyen la disponibilidad de los sistemas completamente

continuos que pueden procesar rpidamente volmenes grandes en centrifugadoras pequeas delvolumen. Las centrifugadoras pueden ser esterilizadas por vapor, permitiendo el proceso asptico, yno hay costos de los materiales consumibles para las membranas, los productos qumicos o lasayudas del filtro. Sin embargo, las desventajas de la centrifugacin son los altos costos de capitalinicial, el ruido generado durante la operacin y el costo de electricidad, tambin, la ruptura fsica declulas puede ocurrir debido al alto esquileo y la temperatura puede no ser del todo controlablepudiendo afectar productos termo-sensibles. La generacin de bioaerosol es otra desventajaimportante, particularmente cuando las centrifugadoras se utilizan para ciertos organismos opatgenos recombinados del ADN. (8)

Se emplean dos tipos de centrfuga:

Con filtro o tamiz: la separacin se produce a medida que las partculas son reforzadascontra la pared filtrante.(8)

De deflectores:la separacin se debe a la diferencia de densidades entre las partculas y ellquido.(8)

Factores a considerar:

1. Pureza necesaria de la fase fluida.2. La recuperacin que se necesite de la fase fluida.

3.

La recuperacin que se necesite de la fase particulada.4. El contenido de la humedad de la partcula.

Fig. 122 Detalles dela construccin de undecantador(1-corrienteque fluye hacia el

interior,2-eliminacinde partculas,3-zona debajo contenido en

agua,4-sedimentacinde partculas,5-espiraldel decantador,6-nivelde fluido,7-efluentelquido claro,8-eje dedireccin.)


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Centrifugadoras industrialesLas centrifugadoras se pueden dividir en unidades en reducida escala del laboratorio ycentrifugadoras ms grandes del piloto y a nivel industrial. Las centrifugadoras de escala del

laboratorio incluyen, en la orden ascendente de la velocidad alcanzable: banco-tapa, alta velocidad yultracentrifugadoras, capaces de aplicar RCFs de 5,000500,000 g. Las centrifugadorassemicontinuas y continuas se requieren para procesar grandes volmenes implicados. Sin embargo,los RCFs alcanzados son relativamente bajos.(8)

Cuatro tipos principales de centrfugas industriales se utilizan:

1. Las centrifugadoras tubulares que producen generalmente la fuerza centrfuga ms alta de13,000-17,000 g. Tienen tazones de fuente tubulares huecos del rotor que proporcionan unatrayectoria larga de flujo para la suspensin, que se bombea dentro en el fondo y fluye para

arriba a travs del rotor. El material de partculas se lanza al lado del tazn de fuente, y loslquidos clarificados hacia fuera en la tapa para la coleccin continua. Mientras que elmaterial de partculas se acumula en el interior del tazn de fuente, el dimetro defuncionamiento se reduce. Por lo tanto, debe haber retiro peridico de slidos.(40)

2. Las centrifugadoras del tazn de fuente consisten en un tazn de fuente que esta montadoverticalmente y se interconecta a los cilindros y es capaz del funcionamiento en 5,000-10,000g. La alimentacin pasa del centro a travs de cada compartimiento alternadamente, y laspartculas ms pequeas son recogidas en los compartimientos externos.(40)

3.

Las centrifugadoras de apilado de disco pueden funcionar en 5,000-13,000 g. El tazn de

fuente de la centrifugadora contiene un apilado de discos cnicos. Mientras que el lquidoentra, el material de partculas de la centrifugadora se lanza hacia fuera, afectando a lasuperficie inferior de los discos del cono. Las partculas entonces viajan hacia fuera a lapared del tazn de fuente donde acumulan. Estas centrifugadoras tienen generalmente lafacilidad para descargar el material recogido peridicamente durante la operacin.(40)

4. Las centrifugadoras de Tornillo-jarra funcionan continuamente en 1,500-5,000 g y sonconvenientes para desecar los materiales slidos gruesos en altas concentraciones. Se utilizanen los sistemas de aguas residuales para la separacin del lodo, y para cosechar levaduras yhongos. (40)

5.1.4 DESINTEGRACIN DE LOS MICROORGANISMOS

En ocasiones la recuperacin requiere que los microorganismos sean fragmentados porprocedimientos qumicos, fsicos biolgicos. La seleccin del mtodo depende principalmente dela naturaleza de las clulas, es importante al seleccionar el mtodo de desintegracin que labiomolcula de inters no sea destruida.(8)

La seleccin de un mtodo va a depender principalmente de la naturaleza de las clulas. (8)

Aunque las membranas celulares no ofrecen especial resistencia a la ruptura, las paredescelulares varan ampliamente en lo rpidamente que puedan ser rotas.(8)


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Cuando se seleccione un mtodo de desintegracin, es importante que la biomolcula dianano se destruya.(8)

Los mtodos de desintegracin de microorganismos son:

Autlisis: para clulas de levadura, con adicin de cloruro sdico, acetato de etilo Cloroformo.(8)

Plasmlisis:con una adicin de cloruro sdico.(8)

Ultrasonidos:no empleada industrialmente por su alto costo.(8)

Molinos de bolas:realizan la ruptura mediante la accin de bolas de vidrio. (8)

Homogenizadores: el material se coloca bajo fuerte presin hidrosttica que se liberabruscamente permitiendo que el lquido salga por una vlvula.(8)

Mtodos fsicos (8):

1. Descongelacin

2.

Medio lquido: Ultrasonidos. Molinos Dino

y Coloidal(Fig.123).

Prensas deFrench yManton.

Fig. 123 Molino coloidal.


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3.Medio slido:

Molino coloidal.

Molino de bolas (Fig.124).Prensa de

Hughes.

Fig. 124 Molino de bolas,vista interior

Mtodos qumicos (8):

Liofilizacin. Cambio en la presin osmtica. Detergentes.

Tratamiento con cidos. Extraccin con acetona/tolueno.

Mtodos biolgicos:

Enzimas que digieren la pared celular. Fagos. Agentes que inhiben la pared celular.


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Fig.125

5.1.5 CROMATOGRAFA

Esta es una de las etapas ms caras de recuperacin, se lleva a cabo principalmente en materialesfarmacuticos, reactivos de diagnstico y para investigacin. En muchos casos deben utilizarsevarios mtodos cromatogrficos, uno despus de otro.(8)

La separacin se produce en una columna (fase estacionaria, generalmente una resina) se utilizapara adsorber el producto que luego es eluido en una fase mvil (lquida), este lquido puede teneruna densidad nica o utilizarse con un cambio gradual de densidad (gradiente de densidad). Pormedio de un detector se detectan las fracciones fluidas que contienen el producto deseado,utilizando luz visible o UV.(8)

Segn su mecanismo de separacin se clasifican en:

Filtracin en gel (peso molecular):las molculas de diferentes tamaos pueden ser separados mediante el paso a travs de geles condiferente tamao de poro. En el caso de molculas grandes, no penetran el gel; y en el demolculas pequeas, penetran ms o menos profundamente en el gel y su movilidad por lo tantoresulta retardada. A escala industrial, se utiliza principalmente para separar las sales e impurezasde bajo peso molecular. A escala ms pequea, se utiliza para fraccionar y purificar molculas deprotena por ejemplo insulina o interfern.(8)

Cromatografa de adsorcin (interacciones hidrofbicas):La separacin supone interacciones hidroflicas o hidrofbicas (fuerzas de Van der Waals) entre elportador y el material biolgico. La elucin y el fraccionamiento se consiguen mediante solucionesde mayor o menor polaridad o fuerza inica.(8)


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Materiales de adsorcin (8):

Silicatos.

Albmina. Carbn activado. Dextranos entrecruzados.

Hidroxiapalita.

Cromatografa de intercambio inico (carga):La separacin se realiza para macromolculas con grupos inicos, la macromolcula se adsorbe alportador y se eluye mediante una solucin de fuerza inica definida. Se usa principalmente enpurificacin de antibiticos a partir de caldos de fermentacin, en la purificacin a gran escala deprotenas. (8)

Cromatografa de afinidad (actividad biolgica):

El material deseado se une especfica y reversiblemente a un ligando que ha sido fijado a unportador inerte. Por ejemplo, un nucletido de adenina puede ser purificado permitiendo que se unaa un portador que contiene una deshidrogenasa. (8)

Isoelectroenfoque (punto isoelctrico):Pueden ser purificadas las protenas utilizando gradientes de pH en asociacin con intercambioinico en geles. Se produce un gradiente lineal de pH y las protenas se separan de acuerdo con supunto isoelctrico. Solo pueden manejarse volmenes pequeos.(8)

Mtodos de purificacin para cromatografa

5.1.6 EXTRACCIN

Extraccin con solventes(8)

Se establece un sistema de dos fases usando un solvente inmiscible en el caldo acuoso defermentacin.

Idealmente el producto deber ser transferido cuantitativamente a la fase solvente.

Una vez que se encuentra el producto deseado en la fase solvente puede ser adicionalmente

purificado.

Este mtodo es ampliamente utilizado en la industria de los antibiticos.

Para la purificacin de enzimas en estado activo no pueden utilizarse solventes orgnicos;deben utilizarse sistemas acuosos de dos fases.

Las clulas permanecen en una de las fases y la enzima es transferida a la otra fase sinprdida de la actividad.

Una variante de este mtodo es la extraccin con soluciones supercrticas.


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En la extraccin de antibiticos como la penicilina, se utiliza el caldo de amilo o butilo. En lapurificacin de enzimas en estado activo, se utilizan soluciones de sales con polmeroshidroflicos, donde el polmero separa por coeficiente de densidad y afinidad la enzima de los

restos celulares en un mismo medio acuoso.(8)

5.1.7 CRISTALIZACIN Y PRECIPITACIN

Una vez extrado el metabolito puede concentrarse y/o purificarse, por cristalizacin, evaporacin opor transferencia a baja temperatura.(8)

Una vez extrado un metabolito puede ser adicionalmente concentrado y purificado porcristalizacin, por evaporacin o transferencia a baja temperatura. (8)

La cristalizacin a baja temperatura es una forma muy suave de purificacin.(8)

En caso de purificacin se aade aveces un agente qumico para facilitarla reaccin de concentracin.(8)

Desecacin

Para materiales biolgicos es esencialsecar el producto final con la finalidad

de que su actividad no se pierda.(8)

La desecacin implica: Transferenciade calor al producto hmedo y eldesprendimiento de la humedad conuna corriente de gas.(8)

Fig. 126 Cmara de desecacin.

Los mecanismos para la transferencia de calor pueden ser por:

Directo.

Conveccin.

Radiacin.

Aparatos utilizados para la desecacin:1. Secadores de conveccin: pulverizacin, rotatorios y de bandas.2.

Secadores por contacto: capa fina o de cmara.


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5.2 RENDIMIENTO

Las prdidas en la recuperacin dependen de la sensibilidad de las substancias al proceso y

del nmero de etapas de purificacin. El rendimiento final es solamente un factor, ya que elcosto de los productos qumicos, el equipo y los salarios deben ser considerados en elclculo global.(8)

La fraccin total atribuida a la purificacin esta en un promedio de alrededor del 20% peroen casos extremos, con cierto tipo de metabolitos intracelulares puede ser tanto como el90%.(8)

Para obtener un mejor rendimiento pueden ser combinados y optimizados los procesos deseparacin El rendimiento final es solamente un factor, ya que el costo de los productosqumicos, el equipo y los salarios deben ser tambin considerados en el clculo global.(8)

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