SEMINARIO CURSO OPTATIVO DE ENFERMEDAD DE CHAGAS

GRUPO 4

Dístel, Matías NicolásGuiñez, María FlorenciaLa Cono, María Victoria

MEDIADORES SOLUBLES LIBERADOS POR LA INFECCIÓN CON

TRYPANOSOMA CRUZI PODRÍAN DESENCADENAR MECANISMOS DE

FISIOPATOGENIA EN LA ENFERMEDAD DE CHAGAS EXPERIMENTAL

RESUMEN Esta enfermedad afecta a cerca de 2.500.000 personas

en nuestro país y 18 millones en América Latina. El parásito presenta en el hospedador 2 estadíos: - amastigote (intracelular) - tripomastigote (extracelular) Para el control de la infección es necesario una potente

respuesta inmune humoral y celular Períodos clínicos e inmunológicos - fase aguda (tripomastigote en sangre, asociado a

inmuno supresión, asintomática) - fase indeterminada (baja parasitemia y serología

positiva) - fase crónica (sintomatología: cadiopatías o patologías digestivas)

El macrófago tiene un rol esencial (interacción célula-parásito)

La evolución de la infección depende de la estrategia de evasión del parásito y los mecanismos microbicidas del macrófago:

- NO - citocinas proinflamatorias - IL-12 , IFN-γ, TNF-α (activacion de NOSi en macrófagos)

RESUMEN

OBJETIVOS Estudiar el líquido peritoneal (sitio de

infección) en un modelo experimental murino, algunos mediadores de respuesta innata en las primeras horas post infección con T. cruzi y la respuesta adaptativa al final de la fase aguda.

DETERMINACIONES

1. Estallido respiratorio2. NO3. Activación de arginasa4. IL-65. Anticuerpos específicos (IgM e IgG)

MATERIALES Y MÉTODOS Parásito: T. cruzi (forma tripomastigote) Animales:

• Ratones control (C): recibieron PBS por vía intraperitoneal

• Ratones infectados (I): inoculados por vía intraperitoneal con 1500 tripomastigotes.

Obtención del líquido peritoneal: lavado del peritoneo con medio RPMI suplementado con suero fetal bovino al 10% en diferentes momentos (previo a la infección, durante las primeras hs, 15 y 20 días post infección)

Cultivo de células de peritoneo: • Centrifugación de células• Recuento• Observación de morfología (Giemsa)• Determinación de viabilidad (azul Trypan)

DETERMINACIONES Y RESULTADOSCURVA PARASITÉMICA

Se pueden observar los niveles de tripomastigotes circulantes, los cuales aumentan con la evolución de la

infección. Los recuentos se realizaron hasta el día 20 post infección, debido a que después de este período la

mortalidad fue del 95%.

1. Determinación del estallido respiratorio en células adherentes por técnica de reducción de NBT

a) Incubación de células a 37°C durante 2hs. (células peritoneales de ambos grupos de ratones, obtenidas previo y durante las primeras horas post infección)

b) Células no adherentes (linfocitos) se descartan y se lavan las adherentes (macrófagos-neutrófilos)

c) En otros tubos se opsonizan tripomastigotes con suero de ratón normal ó infectado crónico.

d) Incubaar 1hs a 37°C cada sistema con células adherentes de infectados y controles y se agregó NBT

e) Frenar la reacción con HClf) Centrifugar y descartar el sobrenadanteg) Colocar dioxano para extraer fracción coloreada y

leer absorbancia (540nm)

En el gráfico están representados los incrementos de la reducción del NBT en los animales infectados respecto de los controles. La diferencia fue significativa a las 12hs post infección, independientemente de que el estímulo específico fuera previamente opsonizado con suero de animales infectados crónicos o de ratones normales.

2. Determinación de NO (óxido nítrico) por reacción de Griess

a) Células no adherentes se mantuvieron en baño de hielo

b) Células adherentes se incuban 2hs con tripomastigotes de T. cruzi

c) Se lava con RPMI-suero fetal 10% y se agregaron las células no adherentes.

d) Cultivar a 37°C y 5% CO2 por 72hs.e) Extraer sobrenadante, agregar reactivo de Griess

y leer absorbancia (540nm)

Los niveles de NO en sobrenadante de cultivo de células peritoneales (reestimuladas in vitro) están relacionados con el aumento de parásitos circulantes y con la evolución de la infección. Las células en el sitio de la infección inducen un aumento de la producción in vitro de este mediador.

3. Determinación de la activación de arginasa medida por los niveles de urea

a) Previo lavado con RPMI, se agrega tritón 0,1% con inhibidor de proteasas, se dejó 30 min. a T° ambiente (para lisado de las células adherentes peritoneales)

b) Se agregó MnCl2 y Tris HCl para activar la enzima y se dejó por 10 min. a 55°C

c) Agregar L-arginina (sustrato de la arginasa) y se dejó por 1hs a 37°C.

d) Frenar la reacción con solución ácida H3PO4-H2SO4

e) Agregar reactivo ISPF y leer absorbancia (540nm)

Los niveles de urea, marcadores de la vía metabólica de la arginasa, se mantuvieron por debajo de valores basales con una ligera tendencia a disminuir con la evolución de la infección. Se observa un patrón inverso a la producción de NO, lo que sugiere una polarización del metabolismo de la L-arginina hacia la activación de NOSi.

4. Determinación de IL-6 en líquido peritoneal por ELISA

a) Las muestras y las diluciones estándares se incubaron en las placas sensibilizadas con anticuerpos monoclonales anti IL-6

b) Lavadoc) Agregar anti IL-6 conjugado con peroxidasad) Revelar con estreptavidina y

tetrametilbencidinae) Frenar la reacción con H2SO4f) Leer absorbancia (450nm)

Se observa un aumento significativo en los animales infectados desde las primeras horas post infección hasta los días 15 post infección, momento en el cual comienza a disminuir

5. Determinación de anticuerpos específicos por ELISA

a) Sensibilizar las placas de poliestireno con antígenos de T. cruzi durante toda la noche

b) Bloquear con PBS-albúmina por 2hs .c) Incubar las muestras de líquido peritoneal

durante 2hs.d) Lavar con PBS-Tweene) Agregar anti IgM ó anti IgG conjugado a

peroxidasaf) Revelar con estreptavidina y

tetrametilbencidinag) Leer absorbancia (450nm)

Se observa un incremento significativo de anticuerpos específicos en LP con la evolución de la infección presentando mayores niveles de IgM. Por otra parte los niveles de IgG fueron significativos recién a los 20 días post infección.

CONCLUSION El T. cruzi es destruido por el macrófago mediante la

activacion de diferentes mecanismos microbicidas: produccion de radicales libres de oxígeno y síntesis de NO.

La evolución de la infección a nivel experimental depende de la carga parasitaria y de la respuesta innata, la cual si es baja disminuye los daños en la fase crónica.

El proceso de fagocitosis gatilla el estallido respiratorio en el macrófago (observado por el aumento de la reducción de NBT).

El aumento de calcio intracelular activa la NADPH oxidasa, lo que lleva a una liberación de radicales de oxígeno y superóxidos que se combinan con NO y tienen efectos microbicidas.

En otros trabajos previos desarrolados se demostraron altas concentraciones de NO a nivel sistemico en animales que cursaban el final del periodo agudo, lo cual junto con la síntesis de citocinas inflamatorias (IL-12 y TNF-α) estaría relacionado a la morbimortalidad de la infección.

A su vez, las citocinas inflamatorias producidas en la etapa aguda aumentan la inducción de la NOSi, que junto con el NO, no sólo eliminan el parásito sino que también generan daño tisular a nivel local provocado por el estrés oxidativo.

Los niveles elevados del NO y la escasa producción de urea (determinacion de actividad de arginasa) sugieren una mayor inducción de la NOSi, mientras la activación de arginasa estaría regulada (la arginina es sustrato de las dos enzimas)

La IL-6 en etapa crónica tiene relación con los daños en la función cardíaca. En este trabajo se observa el aumento de IL-6 en las primeras hs. de infección (fase aguda), por lo que esta citocina se correlaciona con altas parasitemias y mortallidad.

Los niveles de IgM aumentaron antes que los de IgG, pero ambas aumentan con la evolución de la infección.

Se encontraron altos niveles de Ig anti galectina I (inmunomodulador), tanto en suero de pacientes en fase aguda como crónica, lo cual está relacionado con el daño cardíaco.

Los resultados demostraron la compartamentalizacion de la rta inmune, producción temprana de mediadores inflamatorios (radicales, NO) y el aumento de IL-6. Estos mediadores a largo plazo generan una rta inmune contra las células del hospedador.