Trabajode Investigacion de Microbiologia General

UNAJMA - EPIA

UNIVERSIDAD NACIONAL JOSÉ MARÍA ARGUEDAS

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

PROYECTO DE TESIS

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE LACTOBACILLUS SP PRODUCTOR DE BACTERIOCINAS A PARTIR DE QUESO ELABORADO ARTESANALMENTE PARA USO PROBIÓTICO.

AUTOR:

Córdova Ramírez Alex

Talaverano Rojas Abel

Guzman Poma Yori Yoon

Uchupe Ramírez Dennis

ASESOR: Blga. Luz Azucena Torres García.

ANDAHUAYLAS – PERÚ

2013

Microbiología Página 1

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1. PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

I. GENERALIDADES :1. TÍTULO:

Aislamiento y selección de Lactobacillus sp Productor de Bacteriocinas

a partir de queso elaborado artesanalmente para uso probiótico.

2. AUTOR :2.1Nombre:

Córdova Ramírez Alex

Talaverano Rojas Abel

Guzman Poma Yori Yoon

Uchupe Ramirez Dennis

2.2 Carrera Profesional:Ingeniería agroindustrial.

3. ASESORA:3.1Nombre: Blga. Luz Azucena Torres García.

4. TIPO DE INVESTIGACIÓN4.2.De acuerdo al fin que persigue:

Básica

4.1De acuerdo a la técnica de contrastación:

Descriptiva.

5. RÉGIMEN DE INVESTIGACIÓN: Libre.

6. LOCALIDAD E INSTITUCIÓN DONDE SE DESARROLLA EL PROYECTO:6.1Localidad:

Santa Rosa – Talavera – Andahuaylas – Apurímac – Perú.


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6.2Institución:

Universidad Nacional “José María Arguedas”

7. CRONOGRAMA DE TRABAJO:

8. RECURSOS8.1Recursos disponibles:

8.1.1 Personal:

3.2Profesional: Blga. Luz Azucena Torres García.

8.1.2 Bienes:

Materiales para el aislamiento de Lactobacillus sp (materiales de vidrio, plástico, equipos, materia prima,

reactivos)


ETAPAS Fecha InicioFecha

Término

Dedicación

Horas semanales

Recolección de datos 01/04/2014 08/08/2014 3hrs

Análisis de resultados 05/04/2014 08/08/2014 2hrs

Elaboración de informe 05/04/2014 08/08/2014 2hrs

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Materia prima cantidad descripciónQueso 2 unidades Queso artesanal

Materiales de vidrio cantidad descripciónPlaca petri 5 unidades De marca SCHOT

DURAN

Mechero 2 unidades De ron de quemar

Vaso de licuadora. 1 unidades De 1 litro

Vasos precipitados 2 unidades De 100 ml

Materiales de metal cantidad descripciónCuchillo 2 Marca facusa

Azas bacteriológicas. 2 Con terminal de aro y en

escuadra

Materiales de plástico cantidad descripciónLavatorios. 2 De tamaño mediano

Equipos cantidad descripciónCentrifugadora. 1 Separación de la muestra

Incubadora. 1 Para Incubación de la

muestra

Reactivos y otros. cantidad descripciónCaldo MRS. 125g del envase Medio de cultivo

especifico.

Alcohol 25ml Alcohol de 96º

Algodón. 100g Industrial

8.1.3 Local:

Laboratorio de la escuela profesional de ingeniera

agroindustrial.


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8.2Recursos no disponibles:

Caldo MRS.

Quesos artesanales.

Otros (tipeo, internet, etc.)

II. PLAN DE INVESTIGACION :1. REALIDAD PROBLEMÁTICA:

Las bacterias ácido lácticas se utilizan desde hace aproximadamente 4 mil

años en la elaboración de alimentos. Comprenden un grupo de bacterias

benignas que como producto final de su fermentación tienen al ácido

láctico. Se han identificado diversas tipos de bacterias en las

fermentaciones acido lácticas, en las que destaca el género

Lactobacillus. Se caracterizan por ser bacilos Gram positivos, no

esporulados, sin motilidad (no tienen movimiento), de metabolismo

fermentativo, anaerobio facultativo. (Fuente: Zamorano - 2002)

Existen diversos péptidos antimicrobianos denominados bacteriocinas

los cuales en su mayoría son producidos por bacterias ácido

lácticas.

Las bacteriocinas son sustancias de origen proteico, que se define

como un grupo de sustancias antimicrobianas de origen bacteriano,

caracterizadas por la adsorción a receptores de membrana

específicos, la actividad intraespecífica y, la biosíntesis letal.

Las propiedades que principalmente que tienen las bacteriocinas en

cuenta son las siguientes: naturaleza, tamaño molecular,

composición aminoacídica y estructura química, termo resistencia y

estabilidad frente a pH, se han descrito algunas que presentan en su

molécula componentes glucocídicos y/o lipídicos, además de una

fracción proteica.

Las bacteriocinas se pueden utilizar como pro-bióticos en diferentes

alimentos procesados. Al ingerir productos con contenido de pro-bióticos

logra alcanzar un buen estado de salud del individuo, es a través de la


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resistencia otorgada contra la invasión de microorganismos patógenos,

que se logra mediante la generación de sustancias antimicrobianas como

ácido láctico. (Fuente: biblioteca.universia.net - bacteriocinas)

El uso de bacteriocinas producidas por bacterias ácido lácticas junto con

otras tecnologías, mejora la seguridad en alimentos, ha sido comprobado

mediante la combinación con calor, agentes antimicrobianos, sistema

lactoperoxidasa, presión hidrostática y campo eléctrico pulsado, las cuales

van a gen erar que se alargue la vida útil y comercial de los productos.

Los beneficios que brindan las bacteriocinas, están relacionados con la

salud humana y animal, por tal motivo estas bacterias pueden ser usadas

en la conservación de ciertos alimentos usando las bacteriocinas como

antimicrobianos, los cuales ayudan a una mejor digestión. Presentan

varias características y ventajas que las hacen particularmente

atractivas: un espectro de inhibición específico, un sistema de

autorregulación de PH, estabilidad y procesos de producción, costo

efectivo y el consumo en forma segura para los humanos por un

periodo prolongado. (Fuente: Sedano – 2006)

Actualmente, la bio-conservación en la industria alimentaria se basa en

las bacteriocinas producidas especialmente por el género Lactobacillus.

1.1.Antecedentes:

En el año 2002, en Francia y Colombia, realizaron un trabajo acerca

de bacterias ácido lácticas productoras de bacteriocinas

aisladas de quesos frescos artesanales. Las cepas

productoras de bacteriocinas se reconocieron mediante la inhibición

del crecimiento de Listeria sp utilizada como cepa indicadora

(Gonzales,1994).

El Sedano en el año 2006, aisló 81 cepas de Lactobacillus de 11

muestras de masato procedentes de Pucallpa – Ucayali, de estas 81

cepas, 8 cepas presentaron actividad inhibitoria, y solamente una


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demostró que la sustancia inhibitoria no era un ácido orgánico ni

peróxido de hidrógeno, pudiendo corresponder a una bacteriocina.

En el Perú ya se han realizado diversos estudios sobre las bacteriocinas

presentes en el queso, como es el caso de la Universidad Mayor de San

Marcos, donde aislaron bacteriocinas a partir de bacterias del género

Lactobacillus sp. Presentes en fermentaciones ácido láctico como es el

caso de yogurt. Fue un trabajo de investigación realizado por Ruth

Liliana Cristóbal Delgado de la facultada de farmacia y bioquímica en el

año 2008, en sus estudios de postgrado

1.2.Justificación:

Las bacteriocinas, por ser sustancias antagónicas (antimicrobianos que

inhiben el daños de las bacterias) ayudan en las dietas no digeribles y

brindan un buen estado de salud. Se pueden utilizar también como

conservadores biológicos puros que en un momento dado podrían

reemplazar a los conservadores químicos ya que tienen la ventaja de ser

proteínas que al biodegradarse no forman compuestos secundarios,

debido a esto se debería dar un valor agregado en producciones

industriales de derivados lácteos como el queso para ser usados como

pro bióticos.

2. PROBLEMA:¿Cómo aíslar y se seleccionar Lactobacillus sp. Productor de

bacteriocinas a partir de queso elaborado artesanalmente para uso

probiótico?

3. HIPÓTESIS:Implícita.


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4. OBJETIVOS:4.1.Generales:

Aislar y seleccionar Lactobacillus sp. Productor de bacteriosinas a

partir de queso elaborado artesanalmente para uso probiótico.

5. DISEÑO DE CONTRASTACIÓN5.1Material de estudio:

Queso:

Se recolectaron quince muestras de quesos artesanales elaborados

en Sanmiguel de Llimpe perteneciente a la provincia de Chincheros ,

los cuales lo compramos en la feria dominical de Chincheros.

Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de química de la

EPIA. De cada queso se tomará una porción de aproximadamente

300g, la cual se colocará en una bolsa estéril o de primer uso y se

transportará a temperatura ambiente.

5.2Técnicas:

5.2.1. Técnica para el aislamiento de Lactobacillus sp. productores de

bacteriocinas para uso probiótico.

A. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

De cada porción de queso, realizar dos cortes radiales desde

el centro del queso usando un cuchillo estéril.


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Tomar de cada muestra, 25 g de queso y se

homogenizarla con 225 ml de caldo MRS (Merck, pH 6.5)

por 1 minuto usando como homogeneizador una licuadora.

Realizar diluciones decimales hasta 10-4 en frascos con 90 ml

de caldo MRS, de la dilución 10-4, tomar 0.1 ml y se sembrar

en superficie por diseminación con espátula por duplicado en

placas Petri con agar MRS (Merck, pH 6.5).

Incubar las placas a 37 °C por 72 horas.

B. OBTENCIÓN DE BACTERIOCINAS:

Después del tiempo de incubación, se seleccionara 5

colonias al azar de cada placa.

Anotar las características morfológicas de las colonias

como: color, tamaño (mm), aspecto y forma.

C. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS BACTERIOCINAS:

Cultivar cada aislado identificado en caldo MRS pH 6.5

a 37°C por 18 horas en ausencia de oxígeno.

Centrifugar a 3500 rpm por 15 minutos usando una

centrífuga

Filtrar el sobrenadante obtenido con discos de filtro.

colectar en un tubo de ensayo estéril para determinar la

actividad bacteriocinas las pruebas de caracterización

fisicoquímica.

Neutralizar el sobrenadante con NaOH 2.5N hasta llegar

a un pH de 6.5 para descartar que la acción inhibitoria se

deba a ácidos orgánicos.


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En placas petri estériles colocar 1 ml de inóculo de la

cepa indicadora y agregar 20 ml de agar Müeller Hinton,

licuado a menos de 50°C y luego homogenizó el inóculo

con el agar.

D. EFECTO DE TEMPERATURA DE CONSERVACIÓN:

Los sobrenadantes con actividad antibacteriana se deben

incubar a 4 °C, 15 °C y 32 °C por 30 días.

Después del periodo de incubación, se determinará la

actividad antibacteriana de los sobrenadantes tratados

Para la temperatura de 4 °C usar una refrigeradora y para

las temperaturas de 15 °C y 32 °C usar estufas graduadas

a las temperaturas indicadas.


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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS: Ratto M. Control

microbiológico de leches y productos lácteos: Métodos

recomendados. Lima, Cleiba – Universidad Nacional Mayor

de San Marcos; 1983González B, Arca P, Mayo B,

Suárez J. Detection, purification and partial characterization

of Plantaricin C, a bacteriocin produced by a

Lactobacillus plantarum strain of dairy origin. Applied and

Environmental Microbiology 1994.Sedano J. Selección de

cepas nativas de Lactobacillus con actividad inhibitoria y

tolerantes al etanol aisladas de masato (Tesis

Licenciatura). Lima, Universidad Nacional Mayor de San

Marcos;

2006.http://www.ugr.es/~anpenet/metodologia.html.X"Queso."

Microsoft® Encarta® 2009.Zamorano – 2002, extrído de :zamo-

oti-02.zamorano.edu/.../getFicha.asp?...

biblioteca.universia, extraído de:

net/ficha.do?id=44756650

6. ANEXOS:


http://www.ugr.es/~anpenet/metodologia.html

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Colonias de bacillus sp.

Colonias obtenidas del aislamiento de bacteriocinas a partir del queso

artesanal.


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