Título de la presentación en un máximo de dos líneas Título de la presentación en un máximo de dos líneas

Diagnóstico de Laboratorio de la

Enfermedad de Chagas

Diferentes Escenarios

María Isabel Jercic Lara majercic@ispch.cl Sección Parasitología

2011

• Se registran casos en todo el territorio

nacional.

• No se tiene registros de casos por

transmisión vectorial en los últimos años. – Certificado de Interrupción 1999

• Encuesta calidad de vida 2010

–Encuesta Prevalencia para la

población general es de 0.7 %

• 119.000 personas aproximadamente

• 0,33 % en Donantes de Sangre.

Antecedentes

Puertas de entrada para la pesquisa de

pacientes infectados con Trypanosoma cruzi

Donantes de

Sangre

1

Tamizaje

Embarazadas

2

- Principal fuente de pesquisa de nuevos

casos.

- Tamizaje en todo el territorio nacional

(2008).

- Se pretende conseguir Certificación de

la interrupción Transfusional de la

infección.

- Principal mecanismo activo de

transmisión de la infección en nuestro

país.

- Iniciativa de algunos SS de incorporar el

tamizaje a embarazadas.

Puertas de entrada para la pesquisa de

pacientes infectados con Trypanosoma cruzi

-Pacientes provenientes de áreas

tradicionalmente endémicas.

-Viajes

-Transmisión oral

- Síndrome de TORCH

- Pacientes inmunocomprometidos

- Estudios pre y post-transplante.

- Apoyar a la evaluación de la situación

de interrupción de la transmisión

vectorial.

- Búsqueda de nuevos casos de

infección por la vía vectorial.

Sospecha

clínica o

descarte de

infección

3

Estudios

Serológicos

4

Exámenes de Laboratorio

Aporte al diagnóstico en

diferentes escenarios

Diagnóstico de

Laboratorio

Diagnóstico Directo

Buscar el parásito

Diagnóstico Indirecto

Buscar Anticuerpos específicos

Diagnóstico Molecular

Buscar material genético

Perfil de marcadores

ETAPA AGUDA ETAPA CRÓNICA

1 2 3 4 5 6 7 8 9 24 36 48

Aproximación en Semanas

IgM

IgG

Directo

DNA

Infección

Diagnóstico Directo

Observación del parásito

Observación Microscópica

Gota Gruesa

Frotis

MicroStrout

Biopsia

Técnicas

más

empleadas

Búsqueda de Anticuerpos

Diagnóstico Indirecto

Tamizaje

ELISA

Aglutinación de Partículas (HAI)

Inmunocromatografía

Confirmación

IFI

Western Blot

Técnicas

más

empleadas

Diagnóstico Molecular

PCR convencional

PCR

Tiempo real

Cuantifica el número de copias

Técnicas

más

empleadas

Selección de los métodos

• Dependerá del tipo de paciente y la etapa

de la enfermedad

–Directos y Moleculares

• Etapa Aguda

–Infección reciente

–Recién Nacidos

–Inmunocomprometidos

– Indirectos

• Etapa crónica

Las entradas más frecuentes

Servicios de Sangre

Persona

aparentemente

sana

Tamizaje

Proceso de

donación

Requiere Confirmación

Métodos Indirectos Diagnóstico Indirecto

TAMIZAJE

REACTIVO

Repetir en Duplicado

REACTIVO

REACTIVO

ENVIAR A

CONFIRMACIÓN

REACTIVO

NO REACTIVO

NO CONCLUYENTE

NO REACTIVO

NO REACTIVO

INFORMAR

INDETERMINADO NO REACTIVO

INFORMAR

Sensibilidad

•<Etapa aguda

•>Etapa crónica

ELISA para la detección de Anticuerpos IgG contra T.cruzi

C

E E

E

E E

E S

S

S

S S S

S

S

S

Técnica de tamizaje, sencilla, rápida y aplicable a un gran número de

personas simultáneamente. No hace diagnóstico de la enfermedad por si

sola, y un resultado positivo no puede ser informado directamente al

paciente o donante.

Requisitos de calidad:

100% Sensibilidad

> 90% Especificidad

Nombre del

Reactivo Fabricante Nº Lote Sensibilidad % Especificidad % Concordancia % Año

CHAGATEST ELISA

recombinante v3 WIENER LAB., ARGENTINA 906536 100 98,8 99,2 2000

TEST ELISA PARA

CHAGAS II

BIOS CHILE, INGENIERIA

GENETICA S.A 800602 100 98,8 99,3 2002

INMULITE CHAGAS

IgG

DIAGNOSTIC PRODUCTS

CORPORATION LKCS 10105 96,9 76,4 85,3 2003

TEST ELISA PARA

CHAGAS III

BIOS CHILE, INGENIERIA

GENETICA S.A 1140703 100 100 100 2003

BIOELISA CHAGAS BIOKIT S.A C 1403 100 100 100 2003

ELISA Chagatek BIOMERIEUX BRASIL S.A 50201 100 97,3 98,6 2006

*SMART COMB

CHAGAS Ab

SMARTEST

DIAGNOSTICS, ISRAEL 708282 98,9 70,7 84,7 2007

TEST ELISA PARA

CHAGAS III

BIOS CHILE, INGENIERIA

GENETICA S.A 231007 100 100 100 2008

ARCHITECT CHAGAS Abott Diagnóstics 94154HN00 100 100 70 2011

CHAGASTEST ELISA

recombinante v

4.0

WINER LAB

ARGENTINA 1008049150 100 90 84 2011

Reactivos Evaluados 2000 – 2011

Confirmación

Laboratorios reconocidos

IFI

Laboratorio de Referencia

IFI

WB

En Chile no se realiza en los Servicios

de Sangre

Hospital de Iquique

Hospital de La

Serena

Hospital Van

Buren Hospital

Universidad

Católica

Hospital San Borja

Arriarán

Hospital Gustavo

Fricke

Técnicas realizadas por Centros

Reconocidos por el Laboratorio de

Referencia de Parasitología del

Instituto de Salud Pública (ISP)

Su resultado positivo valida el

resultado de la prueba de tamizaje y

puede ser informado al paciente

Examen de Confirmación

Laboratorios Reconocidos

Requisitos de calidad

100% Sensibilidad

> 95% Especificidad

Se pueden emplear Se emplean hoy

Inmunofluorescencia Indirecta

F

Confirmación

Laboratorios reconocidos

IFI

Laboratorio de Referencia

IFI

WB

En Chile Instituto de Salud Pública

Técnicas realizadas por el

Laboratorio de Referencia de

Parasitología del Instituto de Salud

Pública (ISP).

Su resultado positivo valida el

resultado de la prueba de tamizaje y

puede ser informado al paciente

Examen de Confirmación

Requisitos de calidad

100% Sensibilidad

98% Especificidad

Se acepta 2 % No concluyentes

Se pueden emplear Se emplean hoy

Inmunofluorescencia Indirecta

Western blot

Enzimoinmuno ensayo IgG

Embarazada

en 2º trimestre

Tamizaje

Laboratorio

Embarazada

Infectada

confirmada

Confirmar

Resultado

Positivo

Estudio

Infección

transplacentaria

Tamizaje mujeres embarazadas

Laboratorio

reconocido

Recién Nacido o Lactante Hijo de madre con Enfermedad de Chagas

2 ml de sangre con anticoagulante o Guanidina

PARA PCR (K-N)

Positivo en 2 ocasiones

No Detectable

2ª muestra segundo mes de

vida

Positivo en 2 ocasiones

CONFIRMADO

No Detectable

3ª muestra 9°

mes de vida

Positivo

CONFIRMADO

No Detectable

DESCARTADO

1 ml de sangre PARA EXAMENES DIRECTOS

NEGATIVO

ESPERAR RESULTADO PCR O SEGUMIENTOM

CON EXAMENES INDIRECTOS

POSITIVO CONFIRMADO

TRATAMIENTO Y SEGUIMIENTO

Reacción en cadena de la polimerasa para T. cruzi

(PCR)

Técnica que detecta y amplifica secuencias de DNA específicas para

Trypanosoma cruzi

Estudio Serológico

Niños Menores de 5 años

Estudio

familiar y de

caso índice

Muestra de

Sangre en

papel filtro

Algoritmos de Laboratorio

Consideraciones Especiales

Diagnóstico Directo

POSITIVO

INFORMAR

NEGATIVO

Si sigue la sospecha

REPETIR o enviar al ISP

Sensibilidad

•>Etapa aguda

•<Etapa crónica

Búsqueda de Anticuerpos

Diagnóstico Indirecto

Tamizaje

Confirmación

Métodos Moleculares

> de 9 meses < de 9 meses

inmunocomprometidos

Sensibilidad

•>Etapa aguda

•<Etapa crónica

Menores de 9 meses e

inmunocomprometidos

Muestra con DNA detectable

Positivo Se requieren una 2ª para confirmar

resultado

No detectable Seguimiento

Límite de

detección

Partidores

empleados

K-N

Mayores de 9 meses

Paciente con serología Positiva

confirmada

Positivo

No detectable

Límite de

detección

Partidores

empleados

Mayores de 9 meses

Paciente con serología Negativa

Positivo Se requieren una 2ª para confirmar

resultado

No detectable Límite de

detección

Partidores

empleados

Inmunocomprometidos

Algunas Cifras

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

5000

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011

Diagnósticos Confirmaciones

Total de Muestras analizadas para búsqueda de Anticuerpos

contra Trypanosoma cruzi por el ISP.

2000 – 2011 (Octubre)

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Confirmadas Positivas Negativas

Porcentaje de confirmación de muestras con tamizaje positivo

para Trypanosoma cruzi

75%

80%

79%

92% 94% 91% 86%

91%

87%

85%

90%

De 100 muestras con tamizaje positivo, en promedio se confirman solo 86 de ellas.

Porcentaje de Muestras no concluyentes ISP 1,9 %

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010

Nuevas muestras Muestras concluidas

2,4 %

2,5 %

2,1 %

1,6% 2% 3,1% 2,8%

1,2%

1%

1,1%

0,7%

Western blot

Porcentaje de muestras no concluyentes de las

Confirmaciones serológicas ISP para Trypanosoma cruzi

2000 – 2010 (Mayo)

Análisis de distribución Territorial

Uso de nuevas

herramientas

Resultados interesantes

Evaluación de la carga parasitaria mediante

una reacción en cadena de polimerasa en

tiempo real en pacientes infectados con

Trypanosoma cruzi posterior al tratamiento

con Nifurtimox

Profesor guía:

• Beatriz Cancino F.

• Rodrigo Villarroel V.

Facultad de Ciencias de la Salud

Escuela de Tecnología Medica

Área de Parasitología

Tesista: Carolina Oyarzun A.

43%

27%

7%

5%

5%

3%

2%

2% 2% 2% 2%

Hosp. Dr. Juan Noe Crevanni

Hosp. Regional Dr. Ernesto Torres Galdames

Hosp. Regional San Jose del Carmen de Copiapo

Hosp. de Enfermedades Infecciosas Dr. Lucio Cordoba L.

Hosp. Dr. Antonio Tirado Lanas de Ovalle

Hosp. Regional de Rancagua

Hosp. de Litueche

Hosp. Militar

Hosp. Ricardo Valenzuela Saez de Rengo

Hosp. San Camilo

Hosp. San Juan de Dios de Santiago

Resultados

54 pacientes 157 muestras

11 centros hospitalarios

Curva estándar

CP CP

Muestra de

fragmentos

clonados de la

región 121-122

Curva de melting

Producto

especifico

Dímeros

de primers

12%

67%

13%

8%

Carga Parasitaria variable Disminuye Mantiene Aumenta

Conclusión

La detección a través de la técnica qPCR es un

método más sensible en comparación a la

técnica PCR convencional.

La qPCR es una técnica útil para el seguimiento

de la carga parasitaria en aquellos pacientes

tratados con Nifurtimox.

Alumno: Esteban Rodríguez Profesor guía: Beatriz Cancino

Estandarización e implementación de una

PCR múltiplex para la determinación de

Trypanosoma cruzi I y II,

en Muestras clínicas y Triatominos

Facultad de ciencias de la salud

Escuela de Tecnología Médica

Área de Parasitología

Materiales y Métodos

• Para realizar este trabajo se utilizó de base el realizado por Liarte

et.al.(2009), que permitió diferenciar, en una misma PCR, el grupo

de parásito presente en muestras clínicas y triatominos.

• Primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4, dirigidos contra el DNA satélite

del genoma del parásito.

• Si bien esta clasificación no es la vigente, se empleó porque

– Permite en un solo paso, en poco tiempo obtener resultado

– El Grupo I identificado es el mismo de la nueva clasificación

– El Grupo II identificado corresponde a:

• Grupo II actual más los Grupos III, IV, V y VI

• El Grupo de muestras caracterizado como II será posteriormente

estudiado por Hibridación por Southern blot

Analizado por el método estadístico X2, que demostró que los resultados

no son estadísticamente significativos (p=0,52015)

Pacientes agudos

58%

42%grupo I %

grupo II %

Distribución de los grupos por tipo de paciente

Resultados

Resultados analizado por el método X2, que demostró que los resultados

son estadísticamente significativos (p=0,024136)

Mepraia spinolai

77%

23%

grupo I

grupo II

Triatoma infestans

96%

4%

grupo I

grupo II

Distribución de grupos I y II en los Triatominos

Conclusiones • Se demostró que la PCR múltiplex es una buena

herramienta epidemiológica para determinar el grupo I y II de Trypanosoma cruzi, usando los primers Díaz 7, Díaz 8 y TcSat 4.

• Su especificidad diagnóstica es de un 100%

• Se demostró también que existe una mayor frecuencia del grupo I del parásito en muestras clínicas y triatominos.

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majercic@ispch.cl