TESIS: CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE...
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1 UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS Biología Experimental CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE UNA MUTANTE CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENASA (Δmdh) DE Streptomyces coelicolor TESIS QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE: MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS PRESENTA: NELLY ARACELI ABURTO RODRÍGUEZ TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARIA ELENA DEL CARMEN FLORES CARRASCO Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. BERTHA MARÍA JOSEFINA GONZÁLEZ PREDAJO Instituto de Fisiología Celular, UNAM DR. LUIS SERVÍN GONZÁLEZ Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM MÉXICO, D.F. ABRIL 2015
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Biología Experimental
CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE UNA MUTANTE
CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENASA (Δmdh) DE Streptomyces
coelicolor
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
NELLY ARACELI ABURTO RODRÍGUEZ
TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARIA ELENA DEL CARMEN FLORES CARRASCO Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. BERTHA MARÍA JOSEFINA GONZÁLEZ PREDAJO Instituto de Fisiología Celular, UNAM DR. LUIS SERVÍN GONZÁLEZ Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM
MÉXICO, D.F. ABRIL 2015
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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
Biología Experimental
CARACTERIZACIÓN FISIOLÓGICA Y BIOQUÍMICA DE UNA MUTANTE
CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENASA (Δmdh) DE Streptomyces
coelicolor
TESIS
QUE PARA OPTAR POR EL GRADO DE:
MAESTRA EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
PRESENTA:
NELLY ARACELI ABURTO RODRÍGUEZ
TUTORA PRINCIPAL DE TESIS: DRA. MARIA ELENA DEL CARMEN FLORES CARRASCO Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM COMITÉ TUTOR: DRA. BERTHA MARÍA JOSEFINA GONZÁLEZ PREDAJO Instituto de Fisiología Celular, UNAM DR. LUIS SERVÍN GONZÁLEZ Instituto de Investigaciones Biomédicas, UNAM
MÉXICO, D.F. ABRIL 2015
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Dr. Isidro Ávila Martínez Director General de Administración Esco lar, UNAM. Pr esente
COORDINACiÓN
Me permito informar a usted que en la reunión ordinaria del Comité Académico del Posgrado en Ciencias Biológicas, celebrada el día 19 de enero de) 2015, se aprobó el siguiente jurado para el examen de grado de MAESTRA EN CIENCIAS BIOLOGICAS de la alumna ABURTO RODRIGUEZ NELLY ARACELI con número de cuenta 30500035-8 con la tesis titulada " CARACTERIZACiÓN FISIOLOGiCA y BIOQuíMICA DE UNA MUTANTE CARENTE DEL GEN DE MALATO DESHIDROGENESA (Amdh) DE Streptomyces coelicofor', realizada bajo la dirección de la DRA. MARíA ELENA FLORES CARRASCO :
Presidente:
Voca l;
Secretario:
Suplente:
Suplente:
ORA. LUISA ALVARINA ALBA LOIS
DRA. GLORIA DiAl RUIZ
OR LUIS SERVIN GONZÁLEZ
ORA. SILVIA GUZMÁN BELTRÁN
ORA. RaMINA MARIA DE LA PAl RODRIGUEZ SANOJA
Sin otro particular, me es grato enviarle un cordial saludo.
ATENTAMENTE " POR MI RAZA HABLARA EL ESPIRITU"
Cd. Universitaria, D.F., a 18 de marzo del 2015.
DRA. MARiA DEL CORO ARIZMENDI ARRIAGA COORDINADORA DEL PROGRAMA
COORDINACiÓN
Unidad de l'osgrado • Coordinación del Posgrado en Ciencias Biológic.."ls Ed ifi cio S , 1 eL Pi:so. Circuito de Posgrados Cd. Universitaria Delegación Coyollcán C. P. 04510 México, D.F. TeL 5623 7002 http://pcbiol.posgrado.unam.mx
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AGRADECIMIENTOS
Al posgrado de Ciencias Biológicas, UNAM.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por el apoyo económico brindado mediante la beca número 288715 para la realización de este trabajo.
A la Dirección de Asuntos del Personal Académico por el apoyo financiero del proyecto PAPIIT IN206313 titulado “El ciclo de los ácidos tricarboxílicos en Streptomyces coelicolor”.
A mi comité tutoral:
Dra. María Elena Flores Carrasco.
Dra. Bertha María Josefina González Pedrajo.
Dr. Luis Servín González.
Gracias por su apoyo, orientación y comentarios para mejorar este trabajo.
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AGRADECIMIENTOS
A la Dra. Toshiko Takahashi Iñiguez por la asesoría técnica para la realización de este trabajo.
A la M. en C. Gabriela González Cerón por la asesoría técnica para la realización de este trabajo.
7
AGRADECIMIENTOS
A mis padres por estar siempre a mi lado para darme motivación y alegría para seguir adelante en los momentos difíciles.
A mi hermano por todas las risas compartidas que en muchas ocasiones me ayudaron a olvidar los problemas.
A mi tía Chole por todo su amor, su tiempo y su ternura. Siempre te extrañaré. Fuiste y serás mi ejemplo de valentía.
A mis viejas amigas Sandra y Abigail por escucharme y entenderme siempre.
A mi nueva amiga Tóshiko por su comprensión, atención y cariño. También por todas las emociones y charlas que compartimos, las cuales hicieron más agradable mi estancia en el laboratorio.
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DEDICADA A:
Mis padres, el amor y la
confianza incondicionales
Mi tía Chole, mi
segunda madre
Mi hermano, la chispa
de diversión
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CONTENIDO.
RESUMEN................................................................................................................................................ 11
ABSTRACT. ............................................................................................................................................. 12
INTRODUCCIÓN. ................................................................................................................................... 13
ANTECEDENTES. ................................................................................................................................. 15
1. EL GENERO Streptomyces. ........................................................................................................ 15
1.1. Ciclo de vida. .......................................................................................................... 16 2. METABOLISMO. ............................................................................................................................ 17
2.1. Consumo de nutrientes. ......................................................................................... 18 2.2. Respiración celular. ................................................................................................ 21 2.3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos....................................................................... 25 2.4. Rutas anapleróticas. ............................................................................................... 29
3. MALATO DESHIDROGENASA (MDH). ................................................................................... 31
3.1. Isoformas de MDH. ................................................................................................ 31 3.2. Malato:quinona oxidoreductasa (MQO). ................................................................ 32 3.3. Otras funciones de MDH. ....................................................................................... 33 3.4. Estructura de MDH. ................................................................................................ 34 3.5. Regulación de la actividad enzimática de MDH. ................................................... 36 3.6. Regulación de la expresión del gen mdh............................................................... 36 3.7. La MDH de Streptomyces coelicolor. .................................................................... 37
OBJETIVO GENERAL. ......................................................................................................................... 39
OBJETIVOS PARTICULARES. .......................................................................................................... 39
MATERIALES Y MÉTODOS. .............................................................................................................. 40
1. MICROORGANISMOS. ................................................................................................................ 40
2. MEDIOS DE CULTIVO. ................................................................................................................ 40
3. OBTENCIÓN DE LA CEPA MUTANTE NULA NO POLAR S. coelicolor Δmdh. ........... 42
3.1. Obtención del cósmido StD1-Δmdh. ...................................................................... 42 3.2. Transformación de la cepa E. coli BW25113/pIJ790 con el cósmido StD1-Δmdh..... .................................................................................................................. 42
3.3. Obtención del cassette aac(3)IV-OriT del plásmido pIJ784 para sustituir al gen bla. 42 3.4. Sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh por el cassette aac(3)IV-OriT. . 44 3.5. Conjugación de E. coli ET12567/pUZ8002/StD1-Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT y S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV-OriT. ................................................................................... 44
4. COMPROBACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LA CICATRIZ EN EL GENOMA DE LA MUTANTE NULA S. coelicolor mdh::aac(3)IV-OriT. .................................................................. 44
4.1. Purificación de ADN. .............................................................................................. 44 4.2. Amplificación de ADN por PCR. ............................................................................ 45
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5. SUSPENSIÓN CONCENTRADA DE ESPORAS DE LAS CEPAS S. coelicolor M145 y Δmdh. ...................................................................................................................................................... 46
6. PRE-GERMINACIÓN DE ESPORAS. ...................................................................................... 46
7. CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO. ................................................................................................ 46
8. CUANTIFICACIÓN DE CRECIMIENTO. .................................................................................. 46
9. EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS. ........................................................................................... 46
10. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE MDH. ................................................................................... 47
11. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE IDH. ..................................................................................... 47
12. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE α-KGDH. ........................................................................... 47
13. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN EL EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS. .......... 48
14. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS. ...................................................................................... 48
RESULTADOS. ....................................................................................................................................... 49
1. OBTENCIÓN DE LA MUTANTE NULA NO POLAR Streptomyces coelicolor Δmdh. . 49
2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. ...................................................................................................................................................... 51
3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IDH Y α-KGDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh. ................................................................................................................................... 53
4. CRECIMIENTO DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh EN DIFERENTES FUENTES DE CARBONO. .................................................................................................................................... 56
5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh.......... 58
DISCUSION. ............................................................................................................................................ 65
CONCLUSIONES. .................................................................................................................................. 69
BIBLIOGRAFIA. ...................................................................................................................................... 70
11
RESUMEN.
La malato deshidrogenasa es una enzima que cataliza la interconversión entre malato y oxaloacetato, última reacción del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. En organismos aeróbicos este ciclo provee energía e intermediarios que sirven como precursores para la síntesis de compuestos a través de otras vías metabólicas. En Streptomyces coelicolor se ha estudiado que la falta de enzimas que llevan a cabo las reacciones iniciales de este ciclo afecta tanto su diferenciación como la producción de antibióticos. Con el fin de determinar el impacto de la carencia de una enzima clave en este ciclo, el objetivo de este trabajo fue caracterizar fisiológica y bioquímicamente a una mutante carente de malato deshidrogenasa de esta bacteria.
Para lograr este objetivo, se obtuvo una mutante sin el gen que codifica para la malato deshidrogenasa de S. coelicolor. Posteriormente la mutante y la silvestre se crecieron en medio mínimo líquido con diferentes fuentes de carbono durante 72 h. Cada 24 h se tomaron muestras de los cultivos para medir el crecimiento y la actividad de malato deshidrogenasa, isocitrato deshidrogenasa (IDH) y α-cetoglutarato deshidrogenasa (α-KGDH). Además ambas cepas se crecieron en medio mínimo sólido con diferentes fuentes de carbono durante 7 días y cada 24 h se observó la formación de esporas y la producción de antibióticos.
En cuanto al crecimiento, los resultados obtenidos muestran que la mutante es capaz de crecer en todas las fuentes de carbono probadas. Sin embargo, cuando se empleó glucosa y casaminoácidos como fuente de carbono el crecimiento de la mutante disminuyó a la mitad de lo observado en la silvestre. Con respecto a la actividad de las enzimas, únicamente en casaminoácidos se observaron diferencias, siendo mayor la actividad de IDH y menor la de α-KGDH en la mutante. En relación a las características morfológicas, en presencia de casaminoácidos en el medio la mutante tuvo un retraso y una disminución en la producción de esporas y antibióticos.
En conclusión, la enzima malato deshidrogenasa no es indispensable para la sobrevivencia de S. coelicolor. La ausencia de esta enzima desequilibra el flujo del carbono a través del ciclo de los ácidos tricarboxílicos y afecta la producción de esporas y antibióticos en esta bacteria.
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ABSTRACT.
The malate dehydrogenase is an enzyme that catalyzes the oxidation of malate to oxaloacetate, reversible and last reaction in tricarboxylic acid cycle. In aerobic organisms this cycle provides energy and the intermediaries serve as precursors for the synthesis of secondary metabolites through other biosynthetic pathways. In Streptomyces coelicolor the lack of enzymes that catalyze initial reactions of this cycle impacts both differentiation and antibiotic production. To determine the impact of the lack a key enzyme in the tricarboxylic acid cycle, the aim of this study is perform a physiological and biochemical characterization of a mutant lacking malate dehydrogenase of S. coelicolor. To achieve this aim, a S. coelicolor mutant without the gene coding for malate dehydrogenase was obtained by utilizing PCR targeting. Later the mutant and wild type strains were grown in liquid minimal medium with different carbon sources for 72 h. Every 24 h, samples of culture were taken to measure growth and enzymatic activity of malate dehydrogenase, isocitrate dehydrogenase (IDH) and α-ketoglutarate dehydrogenase (α-KGDH). Furthermore, both strains were grown in solid minimal medium with different carbon sources and every 24 h the formation of spores and antibiotic production were observed. The mutant strain was able to grow in all tested carbon sources. However. when glucose or casaminoacids were used as carbon source the mutant strain grew less than the wild type strain. In regard to enzymatic activity, differences were observed only on casaminoacids, wherein in mutant strain the activity of IDH was higher and the activity of α-KGDH was lower than wild type strain. Respecting morphological characteristics, when casaminoacids were used as carbon source the mutant strain growth was delayed and decreased formation of spores and antibiotic production. In conclusion, the enzyme malate dehydrogenase is not essential for survival of S. coelicolor. The lack of this enzyme unbalances the carbon flux through tricarboxylic acid cycle and reduced the formation of spores and antibiotic production in S. coelicolor.
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INTRODUCCIÓN.
El género Streptomyces produce metabolitos secundarios que tienen diversas
actividades biológicas. Los metabolitos más caracterizados son los antibióticos. Un
60% de estos compuestos son producidos por distintas especies de este género
(Demain, 2006). La especie modelo es Streptomyces coelicolor, la cual produce
dos antibióticos pigmentados: actinorodina y undecilprodigiosina (Bentley et al.,
2002).
Los antibióticos son sintetizados en vías biosintéticas específicas que necesitan
compuestos y cofactores provenientes del metabolismo primario (Borodina et al.,
2008). La vía central del metabolismo primario es el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos, el cual es la principal fuente de energía y además sus
intermediarios pueden ser usados como precursores para la biosíntesis de otros
compuestos (Nelson & Cox, 2013).
En S. coelicolor se demostró que la expresión de las enzimas del ciclo de los
ácidos tricarboxílicos está asociada a la etapa de crecimiento (Novotna et al.,
2003). Por otro lado, se observó que la falta de enzimas de este ciclo afectan la
producción de antibióticos y la diferenciación morfológica (Viollier et al., 2001a;
Viollier et al., 2001b). Además se sugirió que los estreptomicetos dependen de
este ciclo no solo para la producción de ATP sino como una fuente principal de
precursores para el metabolismo (Wu et al., 2005).
La malato deshidrogenasa (EC 1.1.1.37) es la última enzima de este ciclo que
cataliza la conversión reversible de malato a oxaloacetato usando NAD o NADH
como cofactor. La expresión del gen mdh es mayor durante la proliferación y
disminuye en la fase estacionaria, es decir, está relacionada al crecimiento,
cuando S. coelicolor crece en medio con glucosa (Mendoza, 2008).
A pesar de la importancia de los estreptomicetos, hasta la fecha se conoce muy
poco acerca de su metabolismo primario (Van Keulen et al., 2011), especialmente
del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Debido a que este ciclo es una vía central en
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el metabolismo y está relacionado con varios procesos fisiológicos es importante
conocer la regulación y las propiedades de las enzimas que participan en él. Por
esta razón estamos interesados en estudiar el papel de la enzima malato
deshidrogenasa en el ciclo y en el crecimiento de S. coelicolor, a través de la
eliminación del gen.
Además, en este trabajo se estudiaron los perfiles de crecimiento de S. coelicolor
y los perfiles de actividad de malato deshidrogenasa y otras enzimas que
participan en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos como isocitrato deshidrogenasa
(IDH) y α-cetoglutarato deshidrogenasa (α-KGDH). Además se observaron las
características morfológicas de la mutante de S. coelicolor en medio sólido.
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ANTECEDENTES.
1. EL GENERO Streptomyces.
Los estreptomicetos son bacterias importantes en la industria porque producen
una gran cantidad de enzimas hidrolíticas y metabolitos secundarios (Hodgson,
2000) con diversas actividades biológicas tales como, antibacterianos, antifúngicos
antitumorales, insecticidas, herbicidas, antihelmínticos e inmunosupresores
(Challis, 2014).
Debido a esta importancia, hasta la fecha se conocen las secuencias genómicas
completas de varias especies de Streptomyces, entre las cuales están
Streptomyces coelicolor (Bentley et al., 2002), Streptomyces avermitillis (Ikeda et
al., 2003), Streptomyces griseus IFO 13350 (Ohnishi et al., 2008), Streptomyces
bingchenggensis (Wang et al., 2010), Streptomyces cattleya NRRL 8057 (Barbe et
al., 2011), Streptomyces lividans 66 (Cruz-Morales et al., 2013), Streptomyces
fulvissimus (Myronovskyi et al., 2013), Streptomyces collinus Tü 365 (Rückert et
al., 2013) y Streptomyces albulus NK660 (Gu et al., 2014). Los cromosomas de
estas bacterias son lineales, tienen un porcentaje de G-C mayor al 70% y miden
entre 6 y 11 Mb. Además el cromosoma presenta una estructura, en la cual, los
genes esenciales están en el centro del cromosoma y los genes adaptativos en los
brazos (Hopwood, 2003).
Ensayos de microarreglos mostraron que en condiciones de crecimiento no
limitantes de S. coelicolor, los genes codificados en la región central se expresan
más que los codificados en los brazos, mientras que en fase estacionaria la
expresión de genes se distribuye a lo largo del cromosoma (Karoonuthaisiri et al.,
2005)
Los estreptomicetos habitan en el suelo, donde hay muchos otros
microorganismos compitiendo por los nutrientes, lo que hace un ambiente pobre u
oligotrófico. Por esta razón, los estreptomicetos son oligotrofos facultativos, ya que
pueden vivir en ambientes pobres o ricos en nutrientes. Además el suelo tiene
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fuentes de carbono muy variadas, por lo cual estos organismos desarrollaron
muchas rutas degradadoras de carbohidratos (Hodgson, 2000).
1.1. Ciclo de vida.
Los estreptomicetos no son móviles y debido al ambiente en el que viven es
necesario tener estrategias para consumir la mayor cantidad de nutrientes y
cuando éstos se acaben poder colonizar nuevos espacios. Por esta razón, estos
organismos tienen un ciclo de vida complejo, en el que se pueden distinguir tres
etapas de diferenciación, micelio vegetativo, micelio aéreo y esporas (Fig. 1). La
señal para la diferenciación es la limitación de nutrientes (van Wezel et al., 2007).
Fig 1. Ciclo de vida de Streptomyces coelicolor (Angert, 2005).
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La especie Streptomyces coelicolor A3(2) se ha usado como modelo para este
grupo bacteriano. Esta especie produce varios metabolitos secundarios, entre
ellos, los antibióticos undecilprodigiosina, actinorodina, antibiótico dependiente de
calcio (CDA, por sus siglas en ingles) y metilenomicina. Los genes de la
biosíntesis de la metilenomicina están en el plásmido SCP1 (Bentley et al., 2002).
En Streptomyces, las vías y la regulación del metabolismo secundario han sido
extensamente estudiadas. Sin embargo, se conoce muy poco acerca de su
metabolismo primario a pesar de que éste es el productor de los precursores
necesarios para la síntesis de metabolitos secundarios (Borodina et al., 2008; van
Keulen et al., 2011).
2. METABOLISMO.
El metabolismo es la transformación de compuestos orgánicos dentro de una
célula mediante un conjunto de reacciones catalizadas por enzimas, que forman
las vías metabólicas. El metabolismo se divide en anabolismo y catabolismo
(Nelson & Cox, 2013).
El anabolismo es la fase de síntesis de compuestos grandes y complejos a partir
de precursores pequeños y sencillos, esta fase necesita un gran aporte de
energía. En contraste, el catabolismo es la fase donde los compuestos grandes y
complejos son degradados a moléculas pequeñas y sencillas, en esta fase se
libera energía que se conserva en forma de ATP (Berg et al., 2012).
Las vías anabólicas y catabólicas están coordinadas de manera recíproca, es
decir, cuando una vía anabólica está activa, la vía catabólica está reprimida y
viceversa (Nelson & Cox, 2013). Para realizar esta coordinación es necesario
regular a las enzimas que catalizan reacciones no compartidas entre vías. La
regulación se da por disponibilidad de sustrato y reacciones alostéricas de las
enzimas que catalizan reacciones irreversibles en cada vía (Nelson & Cox, 2013).
18
En S. coelicolor se realizaron análisis proteómicos y metabolómicos durante el
crecimiento diaúxico en glutamato/maltosa y se observó que los genes que
codifican enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos se expresan más en la
primer fase de crecimiento exponencial y se reprimen en respuesta a la falta de
nutrientes en las fases de transición y estacionaria. Además los genes
involucrados en el procesamiento de proteínas se expresan más en las fases de
transición y estacionaria debido a la falta de nitrógeno (Novotna et al., 2003).
2.1. Consumo de nutrientes.
En el suelo hay una gran variedad de biopolímeros (quitina, xilano y celulosa) que
pueden ser utilizados como fuente de carbono. Los estreptomicetos habitan en el
suelo por lo que en su genoma tienen la información necesaria para usar un
amplio espectro de sustratos incluidos los biopolímeros (Bentley et al., 2002), que
son degradados por enzimas extracelulares y llevados al interior de la bacteria por
medio de transportadores específicos que reconocen mono o disacáridos
(Hodgson, 2000). Debido a que los estreptomicetos pueden degradar estos
compuestos son importantes en el reciclaje del carbono (Bertram et al., 2004).
En S. coelicolor se describieron 45 permeasas ABC (casete de unión a ATP) para
transportar celobiosa, celotriosa, α-glucósidos, lactosa, maltosa, maltodextrinas,
ribosa, alcoholes de azúcar, xilosa y β-xilósidos. Mientras que la galactosa es
transportada por una permeasa dependiente de sodio y el glicerol entra por
difusión facilitada (Bertram et al., 2004). El glutamato y la N-acetil glucosamina se
transportan por sistemas de fosfo-transferasas que favorecen su uso (Nothaft et
al., 2003). La glucosa entra mediante una permeasa MFS (superfamilia principal
de facilitadoras) llamada GlcP, la cual esta codificada en dos genes glcP1 y glcP2
(Fig. 2) (van Wezel et al., 2007).
19
Fig. 2. Esquema general de los sistemas de transporte de carbohidratos de Streptomyces coelicolor. Los azúcares representativos para cada transporte son fructosa (Fru) para PTS, maltosa (Mal) para ABC, glucosa (Glc) para simporte y glicerol (Gly) para difusión facilitada (Bertram et al., 2004).
El uso de una determinada fuente de carbono puede influir en el crecimiento, la
morfogénesis y la producción de antibióticos. Por esta razón, las bacterias han
desarrollado mecanismos para regular el uso de las diversas fuentes de carbono
coordinadamente, de manera tal que las fuentes preferenciales se ocupen primero
(Parche et al., 2000).
La capacidad de detectar y seleccionar las fuentes de carbono preferenciales
ofrece una ventaja selectiva porque aumenta la probabilidad de supervivencia
(Gubbens et al., 2012). El consumo preferencial de carbohidratos es regulado por
un proceso conocido como represión catabólica por carbono (RCC) (Titgemeyer &
Hillen, 2002; van Wezel et al., 2007). En bacterias modelo como Escherichia coli o
Bacillus subtilis los sistemas fosfotransferasa (SFT) tienen un papel principal en la
RCC (Brückner & Titgemeyer, 2002).
20
En estreptomicetos se ha encontrado que la producción de enzimas hidrolíticas
está reprimida por glucosa (Butler et al., 1999). No obstante, esta represión no
está relacionada con un SFT, sino que se realiza por medio de la enzima glucosa
cinasa (Glk) (Guzmán et al., 2005; van Wezel et al., 2007). Mutantes que no tienen
el gen glkA, que codifica para la glucosa cinasa, son incapaces de crecer en
glucosa y no presentan control catabólico (Kwakman & Postma, 1994), además la
restauración de la actividad de la enzima por la introducción de un gen glk de
Zymomonas mobilis no restablece el control catabólico (Angell et al 1994; van
Wezel et al., 2007).
La glucosa cinasa (Glk) es producida constitutivamente en cultivos de S. coelicolor
crecidos en glucosa y manitol. Sin embargo, la actividad de esta enzima en
glucosa es más alta que la observada en manitol. Además la Glk forma un
complejo con el transportador de glucosa GlcP para que el consumo de este
carbohidrato sea eficiente (van Wezel et al., 2007). La formación de este complejo
puede tener influencia sobre la represión catabólica por carbono (Chávez et al.,
2009).
En un estudio proteómico en S. coelicolor se demostró que la glucolisis y la vía de
las pentosas fosfato son inducidas por glucosa aunque no esté presente la enzima
GlkA. En contraste, la gluconeogénesis, sistemas de transporte de manitol y
glicerol, algunas enzimas anapleróticas y producción de antibióticos se encuentran
reprimidas por glucosa a través de GlkA. Esto nos indica que la GlkA no es la
única vía por la cual se ejerce el control catabólico por glucosa (Gubbens et al.,
2012).
El SFT y la RCC pueden controlar otros procesos celulares. En S. coelicolor la
limitación de nutrientes es la señal que promueve la diferenciación morfológica y
metabólica, esto sugiere que hay un vínculo directo entre el uso del carbono, la
producción de metabolitos secundarios y el desarrollo (van Keulen et al., 2011).
Las mutantes nulas de los genes del SFT (ptsH, ptsI y ccr) no desarrollan micelio
aéreo ni esporas (Rigali et al., 2006).
21
El SFT de la N-acetil glucosamina tiene comunicación cruzada con el regulador
pleiotrópico DasR (Nothaft et al., 2010; Rigali et al., 2008). Concentraciones altas
de este compuesto inhiben la diferenciación morfológica y la producción de
antibióticos de S. coelicolor en condiciones ricas de nutrientes y las activan en
medios pobres (van Wezel et al., 2009).
2.2. Respiración celular.
En organismos aerobios, la respiración celular es el proceso por el cual la célula
consume O2 y glucosa para producir CO2 y H2O. Este proceso se divide en tres
etapas: glucólisis, ciclo de los ácidos tricarboxílicos; y cadena respiratoria y
fosforilación oxidativa (Nelson & Cox, 2013).
La glucólisis se divide en dos fases, en la primera fase una molécula de glucosa
es oxidada hasta formar dos moléculas de gliceraldehído-3-fosfato usando dos
moléculas de ATP. Posteriormente el gliceraldehído-3-fosfato es convertido a
piruvato generando cuatro moléculas de ATP y dos de NADH (Berg et al., 2012).
En Streptomyces aureofaciens se estudió la regulación transcripcional del gen gap
que codifica para la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH).
Estos estudios mostraron que en ausencia de glucosa la transcripción se induce al
inicio de la formación del micelio aéreo, mientras que en presencia de glucosa la
transcripción ocurre durante la formación del micelio aéreo (Kormanec et al.,
1997).
En S. coelicolor se han encontrado tres genes (pfkA1, pfkA2 y pfkA3) que
codifican para la enzima fosfofructocinasa (van Keulen et al., 2011). Análisis de
expresión mostraron que la pfkA2 es la de mayor actividad, mientras que las otras
dos tienen una actividad menor y juegan un papel específico en el metabolismo de
esta bacteria (Siebring, 2010). En mutantes nulas en el gen pfkA2 se observó una
mayor producción de antibióticos y mayor flujo a través de la vía de las pentosas
fosfato (Borodina et al., 2008).
22
La vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) es la vía principal para la oxidación de la
glucosa, sin embargo, la vía de Entner-Doudoroff (ED) y la vía de las pentosas
fosfato (PPP, por sus siglas en inglés) también oxidan la glucosa (Fig. 3). En la vía
ED, la glucosa-6-fosfato es convertida a gliceraldehído-3-fosfato y piruvato por
medio de 3 reacciones, mientras que en la PPP, la glucosa 6-fosfato es convertida
a gliceraldehído-3-fosfato y fructosa-6-fosfato por medio de ocho reacciones
generando NADPH. El uso de estas vías es determinado por la necesidad de la
célula por pentosas, NADPH y ATP (Berg et al., 2012; Nelson & Cox, 2013).
Estas vías están conservadas en la mayoría de los seres vivos, sin embargo, el
flujo de carbono que pasa a través de éstas es diferente en cada organismo y
depende de las condiciones de crecimiento. Los flujos metabólicos de las
bacterias Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas, Sinorhizobium meliloti,
Rhodobacter sphaeroides, Zymomonas mobilis y Paracoccus versutus fueron
analizados y posteriormente comparados con los flujos de las bacterias modelo E.
coli y B. subtilis. Mediante este análisis comparativo se encontró que el
metabolismo de las bacterias modelo no es cuantitativamente representativo
porque se encontraron diferencias en el flujo a través de la vía de Entner-
Doudoroff y la de las pentosas fosfato (Fuhrer et al., 2005).
Los actinomicetos metabolizan la glucosa principalmente por la EMP y la vía de
las pentosas fosfato (Gunnarsson et al., 2004). Análisis de flujo metabólico en
Streptomyces lividans, mostraron que la distribución de los flujos entre estas vías
es afectada por la tasa de crecimiento y la fuente de carbono. El flujo a través de
la PPP incrementa cuando la tasa de crecimiento incrementa (Avignone Rossa et
al., 2002). La misma tendencia fue observada en S. coelicolor (Obanye et al.,
1996).
En S. coelicolor se encontró que el principal papel de la PPP es la generación de
precursores de biomasa (Borodina et al., 2008; Obanye et al., 1996). Sin embargo,
en S. antibioticus, la PPP es la vía principal durante el crecimiento exponencial
(Butler et al., 2002).
23
La primera enzima de la PPP es la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, que es
codificada por el gen zwf. Dos genes que codifican para esta enzima (zwf1 y zwf2)
se encontraron en S. coelicolor, mostrando que la proteína Zwf2 es la de mayor
actividad (Ryu et al., 2006), sin embargo, las mutaciones sencillas de cualquiera
de los dos genes incrementan la actividad de la enzima debido a la pérdida de la
regulación cruzada entre los dos genes (Bushell et al., 2006). En S. lividans, la
falta de los genes zwf1 o zwf2 incrementa cuatro veces la transcripción de los
genes involucrados en la producción de antibióticos (Butler et al., 2002).
La vía de ED es activa en varios actinomicetos como Nonomuraea, Streptomyces
tenebrarius y Mycobacterium smegmatis. Esta vía no está activa en S. coelicolor
debido a la falta del gen pgd que codifica para una enzima única de esta vía, la 6-
fosfogluconato deshidratasa (Borodina et al., 2005; Gunnarsson et al., 2004).
El producto final de las vías anteriores es el piruvato, compuesto que puede seguir
tres rutas diferentes: fermentación, ciclo de los ácidos tricarboxílicos o
gluconeogénesis. Cuando la célula necesita energía, el piruvato es descarboxilado
para generar acetil-CoA (Nelson & Cox, 2013).
En el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, el acetil-CoA es condensado con
oxaloacetato para formar citrato que a su vez es convertido a oxaloacetato
mediante una serie de siete reacciones. En este ciclo se producen dos moléculas
de CO2, tres de NADH, una de FADH2 y una de nucleósido trifosfato (ATP o GTP)
(Berg et al., 2012).
En la cadena respiratoria, el NADH y el FADH2 son oxidados generando protones
y electrones que son transferidos al O2 por medio de varias moléculas
acarreadoras. Durante la transferencia de electrones se libera energía que es
conservada en forma de ATP gracias a la fosforilación oxidativa (Berg et al., 2012).
24
Fig. 3. Rutas principales del catabolismo de la glucosa. Embden-Meyerhof-Parnas (flechas negras), Entner-Duodoroff (flechas azules) y la vía de las pentosas fosfato (flechas rosas). GAP: gliceraldehido-3-fosfato, DHAP: dihidroxiacetona fosfato, Glk: glucosa cinasa, Pgi: fosfoglucosa isomerasa, Pfk: fosfofructo cinasa, Fba: fructosa-1,6-bifosfato aldolasa, Tpi: triosa-fosfato isomerasa, Gap: gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa, Pgk: fosfoglicerato cinasa, Pgm: fosfoglicerato mutasa, Eno: enolasa, Pyk: piruvato cinasa, KDPG: 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato, Zwf: glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, Pgd: 6-fosfogluconato deshidratasa, KDPGal: 2-ceto-3-deoxi-6-fosfogluconato aldolasa, S7P: sedoheptulosa-7-fosfato, E4P: eritrosa-4-fosfato, Pgl: 6-fosfoglucono-lactona, Ghd: 6-fosfogluconato deshidrogenasa, Rpe: ribosa-5-fosfato epimerasa, Rpi: ribosa-5-fosfato isomerasa, Tai: transaldolasa, Tkt: transcetolasa.
25
2.3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
El ciclo de los ácidos tricarboxílicos es la ruta central del metabolismo porque en
este ciclo convergen tanto vías catabólicas de carbohidratos, aminoácidos y
ácidos grasos como vías anabólicas de aminoácidos y nucleótidos. Además este
ciclo es el principal productor de energía y poder reductor en los organismos
aerobios (Nelson & Cox, 2013).
Al inicio del ciclo, un grupo acetil es condensado con oxaloacetato para formar
citrato, compuesto de seis carbonos (C6). El citrato es transformado a isocitrato
(C6), que posteriormente es descarboxilado generando una molécula de CO2 y
formando α-cetoglutarato, compuesto de cinco carbonos (C5). El α-cetoglutarato
es descarboxilado generando otra molécula de CO2 y formando succinil-CoA,
compuesto de cuatro carbonos (C4). A continuación el succinil-CoA es
transformado a succinato, compuesto que es deshidrogenado para formar
fumarato. El fumarato es hidratado y forma malato. Finalmente el malato es
deshidrogenado y forma oxaloacetato, compuesto con el que vuelve a iniciar el
ciclo (Fig. 4). Cinco de los pasos de este proceso generan energía que es
conservada en NADH, FADH2 y ATP o GTP (Nelson & Cox, 2013).
El ciclo de los ácidos tricarboxílicos no se realiza igual en todos los organismos,
principalmente se han reportado variaciones en las dos reacciones que
transforman α-cetoglutarato a succinato. En Helycobacter pylori se reportaron que
las enzimas α-cetoglutarato:ferrodoxina oxidoreductasa y una succinil-
CoA:acetoacetil-CoA transferasa son las que catalizan estas reacciones
(Corthésy-Theulaz et al., 1997; Hughes et al., 1998). Mientras que en
Mycobacterium tuberculosis se reportaron la α-cetoglutarato descarboxilasa que
genera semialdehído succínico y una deshidrogenasa que produce succinato (Tian
et al., 2005). Además en H. pylori y en Corynebacterium glutamicum se encontró
la enzima malato:quinona oxidoreductasa, la cual cataliza la oxidación de malato a
oxaloacetato (Kather et al., 2000; Molenaar et al., 2000)
26
El flujo de carbono en este ciclo se regula principalmente a dos niveles: la
producción de acetil-CoA a partir de piruvato (piruvato deshidrogenasa) y la
entrada del acetil-CoA al ciclo (citrato sintasa). Debido a que el acetil-CoA puede
ser producido en otras vías, la regulación del flujo se da en las reacciones
catalizadas por IDH y α-KGDH. Estas enzimas pueden ser reguladas por tres
factores: disponibilidad de sustrato, acumulación de productos y reacciones
alostéricas (Nelson & Cox, 2013).
La expresión de los genes que codifican para las enzimas del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos no es constitutiva ni coordinada. En E. coli estas enzimas se
reprimen total o parcialmente en condiciones anaeróbicas, además las enzimas
citrato sintasa, succinato deshidrogenasa y α-KGDH están sujetas a represión
catabólica por glucosa (Nimmo, 1987). También se reportó que la IDH controla el
flujo entre el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y ciclo del glioxalato mediante
fosforilación (LaPorte & Koshland, 1982).
En C. glutamicum se han reportado varios reguladores transcripcionales y post-
transcripcionales de los genes que codifican para enzimas del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos. Uno de los reguladores es la fuente de carbono porque la
transcripción de los genes gltA (citrato sintasa), acn (aconitasa), sdhCAB
(succinato deshidrogenasa) y fum (fumarasa) es más alta cuando la bacteria crece
en acetato en lugar de glucosa. Otros reguladores son las proteínas DtxR y RipA,
las cuales reprimen la transcripción de aconitasa y succinato deshidrogenasa
cuando hay limitación de hierro. Además se encontró que la proteína OdhI no
fosforilada reprime al complejo α-KGDH (Bott, 2007).
27
Fig. 4. Ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Los átomos de carbono sombreados provienen del acetil CoA (Nelson & Cox, 2013).
Mediante análisis in silico se calculó la frecuencia de uso de codones de las
secuencias genómicas de S. coelicolor y S. avermitillis y se determinó que los
genes que codifican enzimas involucradas en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y
en la glucólisis tienen uso preferencial de codones y por ello están altamente
expresados (PHX) en estos organismos (Wu et al., 2005). En contraste, en B.
subtilis, Haemophilus influenzae, Synechocystis, Vibrio cholerae y E. coli estos
genes no son PHX (Karlin et al., 2001). Esto nos podría indicar que el ciclo de los
ácidos tricarboxílicos juega un papel muy importante en el ciclo de vida de
Streptomyces.
28
En S. coelicolor se obtuvieron mutantes que no tienen los genes citA y acoA que
codifican para la citrato sintasa y la aconitasa, respectivamente. En estas
mutantes se observó deficiencia en la diferenciación morfológica y síntesis de
antibióticos. En la ausencia del gen citA, las deficiencias se debieron a una
acidificación del medio causada por acumulación de ácidos orgánicos (Viollier et
al., 2001a). Sin embargo, la ausencia del gen acoA es la principal responsable de
estas deficiencias (Viollier et al., 2001b). Esto nos indica que este ciclo está
relacionado con la diferenciación morfológica y el metabolismo secundario de esta
bacteria.
En organismos aerobios, el ciclo de los ácidos tricarboxílicos es una vía anfibólica
porque participa en procesos catabólicos y anabólicos. En este ciclo se generan
intermediarios que son precursores de la síntesis de varios compuestos. El
oxaloacetato y el α-cetoglutarato son precursores de los aminoácidos aspartato y
glutamato. Posteriormente estos aminoácidos son usados para sintetizar otros
aminoácidos y nucleótidos. El oxaloacetato también es convertido a glucosa. El
succinil-CoA y el citrato son precursores de porfirinas y ácidos grasos o esteroles,
respectivamente (Nelson & Cox, 2013). Además, en S. coelicolor el acetil-CoA es
uno de los precursores para la síntesis de actinorodina y undecilprodigiosina (Fig.
5) (Ryu et al., 2006).
Fig. 5. Precursores de la síntesis de antibióticos en S. coelicolor. ACCasa, acetil-CoA
carboxilasa. Modificado de Ryu et al., 2006
29
2.4. Rutas anapleróticas.
El oxaloacetato, α-cetoglutarato, succinil-CoA y citrato abandonan el ciclo para
servir de precursores en vías biosintéticas, sin embargo, son repuestos por
reacciones anapleróticas. En condiciones normales, la salida y reposición de estos
compuestos en el ciclo están en balance, por lo que sus concentraciones
permanecen constantes (Nelson & Cox, 2013).
Cuando las concentraciones de oxaloacetato o cualquier otro intermediario son
bajas, el piruvato o el fosfoenolpiruvato (PEP) es carboxilado para generar más
oxaloacetato o malato. Las reacciones de carboxilación son reversibles y
catalizadas por las enzimas piruvato carboxilasa, PEP carboxicinasa, PEP
carboxilasa y enzima málica (Fig. 6) (Nelson & Cox, 2013).
Fig 6. Rutas anapleróticas de oxaloacetato. MDH, malato deshidrogenasa; MQO, malato:quinona oxidoreductasa; EM, enzima málica; PEPC, fosfoenolpiruvato carboxilasa; PEPS, fosfoenolpiruvato sintasa y PC, piruvato carboxilasa.
30
En Pseudomonas putida, la producción de oxaloacetato se da principalmente por
la vía del piruvato. En esta vía actúan la enzima málica para formar piruvato y
posteriormente la enzima piruvato carboxilasa genera oxaloacetato (del Castillo et
al., 2007). En E. coli, el oxaloacetato puede reponerse por la vía del PEP. En esta
vía intervienen la enzima málica para formar piruvato, posteriormente el piruvato
es convertido a PEP y finalmente la enzima PEP carboxilasa genera oxaloacetato
(van der Rest et al., 2000).
En varios estreptomicetos, incluyendo S. coelicolor, se ha reportado que la PEP
carboxilasa es la enzima involucrada en la formación anaplerótica de oxaloacetato
(Hodgson, 2000). También se han encontrado enzimas málicas activas en S.
aureofaciens (Hodgson, 2000) y S. coelicolor (Rodriguez et al., 2012).
En S. coelicolor las enzimas anapleróticas no solo están activas durante la
gluconeogénesis. Cuando la bacteria crece en presencia de glucosa como única
fuente de carbono se puede detectar actividad de PEP carboxilasa. De hecho, la
actividad de esta enzima se incrementa durante la producción de actinorodina
(Bramwell et al., 1993).
El ciclo del glioxalato es una vía anaplerótica que usa acetato como fuente de
fosfoenolpiruvato para la síntesis de carbohidratos. En esta vía, el acetil-CoA es
condensado con oxaloacetato para formar citrato, el cual es convertido a isocitrato.
Posteriormente el isocitrato es convertido a succinato y glioxalato por la enzima
isocitrato liasa. El glioxalato es condensado con acetil-CoA para formar malato por
medio de la enzima malato sintasa. Finalmente, el malato es oxidado a
oxaloacetato y el ciclo vuelve a empezar. El oxaloacetato producido también se
usa para sintetizar glucosa (Nelson & Cox, 2013).
En varias especies de estreptomicetos, incluyendo S. coelicolor, se demostró la
presencia de malato sintasa al crecerlos en compuestos de dos carbonos como
acetato, sin embargo, no se encontró actividad de isocitrato liasa en esta bacteria
(Hodgson, 2000).
31
3. MALATO DESHIDROGENASA (MDH).
La MDH (EC 1.1.1.37) es la última enzima del ciclo de los ácidos tricarboxílicos.
Esta enzima cataliza la interconversión entre malato y oxaloacetato usando NAD
(P)+ como cofactor (Fig. 7). El equilibrio de esta reacción está desplazado hacia la
formación de malato en condiciones termodinámicas estándar. Sin embargo, la
concentración de oxaloacetato dentro de la célula es muy baja, lo que favorece
que la reacción se realice hacia la formación de oxaloacetato (Nelson & Cox,
2013).
Fig. 7. Reacción catalizada por la enzima MDH (Nelson & Cox, 2013).
Esta vía no es la principal en la generación de oxaloacetato. En P. putida y
Pseudomonas fluorescens se ha observado que el flujo a través de MDH es muy
bajo y en su lugar se usa la vía del piruvato (Fuhrer et al., 2005). De hecho, en P.
putida el 80% del oxaloacetato es generado a partir de piruvato (Del Castillo et al.,
2007).
3.1. Isoformas de MDH.
En eucariontes se han reportado varias isoformas de MDH, las cuales se
distribuyen en diferentes organelos celulares y participan en diferentes rutas
metabólicas (Gietl, 1992a). En células animales hay dos isoformas: una
mitocondrial y una citosólica, sin embargo, en plantas hay isoformas de esta
32
enzima en glioxisomas, peroxisomas, cloroplastos, mitocondrias y citosol (Gietl,
1992b). En Sacharomyces cerevisiae hay tres isoformas de esta enzima: la
mitocondrial (MDH1) que participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, la
citosólica (MDH2) que participa en la gluconeogénesis y la peroxisomal (MDH3)
que participa en el ciclo del glioxalato (Gibson & McAlister-Henn, 2003).
En bacterias también se han reportado isoformas de esta enzima pero su
diferencia es la especificidad por el cofactor o su número de subunidades. En
Methanobacterium thermoautotrophicum hay dos isoformas de MDH, una es
específica de NAD+ y cataliza la interconversión de malato y oxaloacetato, la otra
puede usar tanto NAD+ como NADP+ pero solo cataliza la reducción del
oxaloacetato (Thompson et al., 1998). En R. sphaeroides 2R también hay dos
isoformas, una dimérica (74 kDa) que participa en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos y una tetramérica (148 kDa) que participa en el ciclo del citramalato,
vía alterna al ciclo del glioxalato (Eprintsev et al., 2009).
3.2. Malato:quinona oxidoreductasa (MQO).
La MQO (EC 1.1.99.16) es una enzima asociada a membrana que cataliza la
oxidación de malato a oxaloacetato usando NAD+ como grupo prostético y
quinonas como aceptores de electrones (Molenaar et al., 2000). Esta enzima se
ha encontrado en diversas bacterias como Pseudomonas, Azotobacter,
Mycobacterium, Micrococcus, Bacillus y C. glutamicum (Molenaar et al., 1998).
Posteriormente también se reportó en E. coli, P. aeruginosa y H. pylori (Kather et
al., 2000; Kretzschmar et al., 2002; van der Rest et al., 2000).
Esta enzima cataliza la misma reacción que la MDH, sin embargo, los aceptores
de electrones son diferentes. Debido a la diferencia de los aceptores, la energía
libre de Gibbs (ΔG°´) de la reacción catalizada por ambas enzimas es muy
diferente. La oxidación de malato catalizada por MDH tiene una ΔG°´=+28.6
Kj/mol, en contraste, esta misma reacción catalizada por MQO tiene una ΔG°´= -
55 o -18.9 Kj/mol dependiendo si el aceptor es ubiquinona o menaquinona. Esto
33
indica que si las dos enzimas están presentes al mismo tiempo catalizan las
reacciones opuestas (Molenaar et al., 2000).
En C. glutamicum y E. coli tanto la MDH citosólica como la MQO membranal están
presentes. En C. glutamicum la eliminación del gen mqo resulta en mutantes que
no crecen en glucosa, sin embargo, estas mutantes pueden crecer si se agrega
nicotinamida en el medio debido a que los niveles de NAD+ aumentan
favoreciendo la actividad de MDH (Molenaar et al., 2000). En contraste, en E. coli
la eliminación del gen mdh resulta en mutantes que no crecen en glucosa, sin
embargo, la MQO puede restablecer parcialmente sus funciones (van der Rest et
al., 2000).
En H. pylori no se ha encontrado un gen que codifique para la MDH, por lo que su
ciclo de los ácidos tricarboxílicos se lleva a cabo mediante MQO (Kather et al.,
2000). En P. aeruginosa la MQO es importante para el crecimiento en etanol y
acetato como fuente de carbono (Kretzschmar et al., 2002).
3.3. Otras funciones de MDH.
Debido a que la reacción hacia la formación de oxaloacetato es desfavorable, se
ha sugerido que la MDH tiene otras funciones dentro de la célula (Molenaar et al.,
1998).
Se ha demostrado que esta enzima es importante en la protección del estrés
oxidante (Oh et al., 2002; Singh et al., 2008). En una mutante de E. coli que no
tiene el gen que codifica para la MDH se observó una mayor sensibilidad al H2O2 y
a la radiación γ, esta sensibilidad disminuyó cuando se le agregaba oxaloacetato
al medio (Oh et al., 2002). Además en P. fluorescens la MDH, la enzima málica y
la piruvato carboxilasa participan en una vía que protege de ambientes oxidantes.
Esta vía consiste en consumir NADH, compuesto pro-oxidante, por medio de la
enzima MDH y producir NADPH, compuesto antioxidante, por medio de la acción
de la enzima málica (Singh et al., 2008).
34
La MDH interacciona con otras proteínas para facilitar al paso de los sustratos en
diferentes vías. En B. subtilis se observó que la MDH interactúa con otras dos
enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, IDH y citrato sintasa formando un
metabolón, particularmente se forma un complejo MDH-IDH que aumenta la
actividad de IDH (Meyer et al., 2011; Bartholomae et al., 2013). En E. coli se
reportó que la MDH interactúa con el complejo I de la cadena respiratoria para la
transferencia directa del NADH (Amarneh & Vik, 2005). Además en S. cerevisiae
se reportó que la MDH citosólica (MDH2) interactúa con la PEP carboxicinasa y la
fructosa-1,6-bifosfatasa favoreciendo el flujo a través de la gluconeogénesis
(Gibson & McAlister-Henn, 2003).
3.4. Estructura de MDH.
Las secuencias de aminoácidos de las MDH de varios organismos eucariontes y
procariontes tienen una identidad de 55-60% (Musrati et al., 1998). A pesar de que
las secuencias de aminoácidos no estén muy conservadas entre especies, la
estructura secundaria (40% α-hélices, 20% hojas-β y 40% asas) y la estructura
terciaria de esta proteína es casi idéntica en la mayoría de las especies (Hung et
al., 2013; Maloney et al., 2004)
La mayoría de las formas procariontes de esta enzima son homólogas con la MDH
mitocondrial, sin embargo, la MDH de Thermus flavus es homóloga a la MDH
citoplásmica (Kelly et al.,1993) y la de Thermus thermophilus es más similar en
secuencia de aminoácidos a la MDH cloroplástica NADP-dependiente (Hung et al.,
2013).
En procariontes esta enzima se puede encontrar de dos formas: homodimérica y
homotetramérica. Cada subunidad está formada por 11 hojas β y de 9 a 12 α-
hélices; y se pliega en dos dominios, un N-terminal en donde está el sitio de unión
a cofactor y un C-terminal que contiene al sitio activo (Fig. 8) (Hung et al., 2013;
Irimia et al., 2004). Se ha sugerido que la dimerización es crítica para la actividad
de la enzima. La estabilidad de la unión entre subunidades se da a través de
puentes de hidrógeno y contactos hidrofóbicos (Breiter et al., 1994).
35
El dominio de unión a cofactor está formado por una hoja β de seis hebras
rodeadas por α-hélices en el N-terminal. El sitio de unión a cofactor tiene un
potencial positivo mientras que el resto de la proteína es negativo (Hall &
Banaszak, 1993). El dominio de unión a sustrato consta de 5 hojas beta torcidas
antiparalelas rodeadas por 8 alfa-hélices (Hung et al., 2013). El sitio activo de la
proteína se encuentra en medio del sitio de unión a cofactor y del de unión a
sustrato (Kim et al., 1999; Lee et al., 2001).
Cuando se forma el complejo ternario solo se da un cambio conformacional en una
asa flexible que cierra el sitio activo, bloqueando la salida del sustrato y
protegiéndolo del solvente (Hall & Banaszak, 1993; Hall et al., 1992; Dalhus et al.,
2002). La posición del sustrato y el sitio activo cambian cuando el cofactor es
agregado, el malato rota para acomodarse con el cofactor y la His177 (Hall et al.,
1992). La actividad catalítica es controlada por una asa (Lee et al., 2001).
Fig. 8. Estructura tridimensional de la enzima MDH de T. thermophilus (Hung et al., 2013).
36
3.5. Regulación de la actividad enzimática de MDH.
La actividad de las MDH puede ser regulada por retroalimentación. Las MDH de
Archaeoglobus fulgidus, Salinibacter ruber y Sacharopolyspora erythraea se
inhiben en presencia de altas concentraciones de oxaloacetato (Langelandsvik et
al., 1997; Madern & Zaccai, 2000; Mendoza, 2005), en contraste, la MDH de S.
aureofaciens no se inhibe en presencia de este sustrato (Mikulásová et al., 1998).
Las MDH de M. thermoautotrophicum, A. fulgidus y E. coli también se inhiben por
la presencia de NADH (Langelandsvik et al., 1997; Thompson et al., 1998).
Se ha observado que la actividad de esta enzima puede regularse por fuente de
carbono o fase de crecimiento. En C. glutamicum las actividades de MDH y MQO
responden a la fuente de carbono, resultando en una actividad 3.4 y 3.1 veces
mayor en acetato que en glucosa (Molenaar et al., 2000). En S. erythraea crecida
en fructosa la actividad llega a su máximo valor a las 72 h de cultivo y después
disminuye, mientras que en glucosa la actividad se mantiene constante a lo largo
del cultivo. En S. coelicolor crecido en MM con glucosa como fuente de carbono la
actividad de la enzima aumenta hasta las 36 h y después disminuye, esto nos
indica que esta enzima está relacionada a la fase de crecimiento o a la presencia
de glucosa en el medio de cultivo (Mendoza von der Borch, 2008).
3.6. Regulación de la expresión del gen mdh.
La expresión del gen mdh está regulada por represión catabólica en varios
organismos. En T. thermophilus la expresión de este gen es mayor al crecer en
malato que en glucosa como fuente de carbono, aunque en las dos condiciones se
observa expresión basal del gen (Park & Kilbane, 2004). En E. coli el gen se
expresa 10 veces más en piruvato que en glucosa en condiciones aeróbicas (Park
et al., 1995). En S. erythraea la expresión se mantiene constante en glucosa,
mientras que en fructosa se induce la expresión (Mendoza von der Borch, 2005).
En Talaromyces emersonii este gen se expresa más cuando crece en mono o
disacáridos como fuente de carbono, en contraste a lo que pasa en oligo o
37
polisacáridos revelando mayor actividad metabólica en fuentes de carbono más
sencillas (Maloney et al., 2004).
La expresión del gen mdh también puede ser regulada por otros factores. En E.
coli la expresión del gen es regulada negativamente por la proteína ArcA
especialmente en anaerobiosis y la disponibilidad de grupos hemo (Park et al.,
1995). En S. coelicolor la expresión de este gen está asociada al crecimiento
porque la transcripción aumenta en fase de crecimiento exponencial y disminuye
cuando la bacteria deja de crecer usando glucosa y fructosa como fuente de
carbono ((Mendoza von der Borch, 2008)
3.7. La MDH de Streptomyces coelicolor.
Los genes que codifican para las enzimas involucradas en el ciclo de los ácidos
tricarboxílicos no se encuentran juntos en el genoma de esta bacteria (Fig. 9). El
gen mdh que codifica para la enzima MDH de S. coelicolor está ubicado en la
región central del cromosoma en el SCO 4827, la secuencia tiene 990 pb que
corresponden a 329 aminoácidos (StrepDB, 2014).
Fig. 9. Ubicación en el cromosoma de los genes que codifican para las enzimas del ciclo
de los ácidos tricarboxílicos. Las líneas anaranjadas representan 1000 SCO´s y las líneas azules representan los genes que codifican para la enzima indicada en cada caso
(Mendoza, 2008).
38
El SCO4827 está rodeado por los SCO´s 4823-4830 (Fig. 10). Estos no codifican
para proteínas relacionadas con el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y solo a dos
se les conoce su función. El SCO4824 codifica a una proteína bifuncional
tetrahidrofolato deshidrogenasa/ciclohidrolasa que participa en el metabolismo de
moléculas con un solo carbono y el SCO4828 genera la proteína betaína aldehído
deshidrogenasa involucrada en el metabolismo de aminoácidos (StrepDB, 2014).
Los otros cinco SCO´s codifican para posibles proteínas que aún no ha sido
comprobada su función. El SCO4823 que se encuentra a 3709 pb rio arriba del
gen mdh es una posible secuencia blanco de regulación por BldA, los SCO4825 y
4826 codifican para proteínas de membrana, el SCO4829 codifica para una
oxidoreductasa y el 4830 para una transportador ABC de glicina-betaina de unión
a ATP (StrepDB, 2014).
Fig. 10. Contexto genómico del gen mdh (SCO 4827). Las flechas rojas indican posiciones de transposones reportados para S. coelicolor. Tomado de StrepDB, 2014.
39
OBJETIVO GENERAL.
Caracterización fisiológica y bioquímica de una mutante nula del gen malato deshidrogenasa de Streptomyces coelicolor (Δmdh).
OBJETIVOS PARTICULARES.
Obtener la mutante cicatrizada Streptomyces coelicolor Δmdh. Medir la actividad de MDH en la mutante S. coelicolor Δmdh. Medir la actividad de IDH y α-KGDH en la mutante S. coelicolor Δmdh. Medir el crecimiento de la mutante S. coelicolor Δmdh en diferentes fuentes
de carbono. Observar las características morfológicas de la mutante S. coelicolor Δmdh
en medio sólido con diferentes fuentes de carbono.
40
MATERIALES Y MÉTODOS.
1. MICROORGANISMOS. S. coelicolor M145, la cual no tiene los plásmidos SCP1 y SCP2 (Bentley
et al., 2002).
La mutante nula Δmdh::aac(3)IV que tiene un gen de resistencia a
apramicina en lugar del gen mdh cromosomal. Esta sustitución de genes
se realizó siguiendo el protocolo ReDirect como se muestra en la figura
11 (Gust et al., 2002).
La mutante nula no polar Δmdh, la cual ya no tiene el gen de resistencia
a apramicina en el cromosoma y que se obtuvo siguiendo el protocolo
ReDirect (Gust et al., 2002), con ligeras modificaciones sugeridas por el
Dr. Luis Servín.
La cepa E. coli BW25113/pIJ790 se usó para la recombinación mediada
por el sistema λ-RED.
La cepa E. coli ET12567/pUZ8002 se usó para la conjugación con la
mutante nula S. coelicolor Δmdh:: aac(3)IV.
2. MEDIOS DE CULTIVO.
Medio LB. Triptona 10 g/L, NaCl 10 g/L y extracto de levadura 5 g/L.
Medio 2xYT. Triptona 16 g/L, NaCl 5 g/L y extracto de levadura 10 g/L.
Medio mínimo. MOPS 20.93 g/L, NaCl 5 g/L, K2HPO4 0.3 g/L,
MgSO4·7H2O 0.5 g/L, FeSO4·7H2O 0.02 g/L, ZnSO4·7H2O 0.05 g/L,
MnCl2·4H2O 0.001 g/L, CoCl2·6H2O 0.001 g/L, CaCl2 0.001 g/L,
PEG8000 50 g/L.
Con casaminoácidos (MMCA). Casaminoácidos 5 g/L.
Con glicerol 0.028 M (MMGLI). (NH4)2SO4 2 g/L y glicerol 0.028 M.
Con glucosa (MMGLU). (NH4)2SO4 2 g/L y glucosa 0.028 M.
Medio MS. Manitol 20 g/L, harina de soya 20g/L y agar 20 g/L.
41
Fig. 11. Esquema de los pasos del protocolo ReDirect. El cassette aac(3)IV-OriT se
obtuvo del plásmido pIJ773. Las imágenes enmarcadas son los pasos para obtener el cósmido StD1-Δmdh. Modificado de Gust et al., 2002.
42
3. OBTENCIÓN DE LA CEPA MUTANTE NULA NO POLAR S. coelicolor Δmdh.
3.1. Obtención del cósmido StD1-Δmdh.
El gen de resistencia a apramicina fue eliminado del cósmido StD1-
Δmdh::aac(3)IV siguiendo la metodología del ReDirect (Gust et al., 2002) para
obtener el cósmido StD1Δmdh (ver fig. 11).
3.2. Transformación de la cepa E. coli BW25113/pIJ790 con el cósmido StD1-Δmdh.
A 60 µl de E. coli BW25113/pIJ790 electrocompetente se le adicionó 1 µl del
cósmido StD1-Δmdh, se mezcló por pipeteo, y se colocó en una celda de
electroporación para darle un pulso de 1600 V. Posteriormente se agregó 1 ml de
LB y se incubó a 30°C durante 1 h. Al finalizar este tiempo se centrifugó a 5000
rpm por 10 min y se resuspendió en 1 ml de LB sin antibióticos. Se realizaron
diluciones seriadas y se sembró en placas de LB con cloramfenicol (25 µg/ml),
kanamicina (50 µg/ml) y ampicilina (100 µg/ml). Para verificar la presencia del
cósmido en la cepa, se purificó ADN y se realizó una electroforesis (ver fig. 12).
3.3. Obtención del cassette aac(3)IV-OriT del plásmido pIJ784 para sustituir al gen bla.
5 µl del plásmido pIJ784 se digirieron con 3 µl de las enzimas EcoRI y HindIII Fast
Digest (Fermentas) para obtener los fragmentos de 3000 y 1400 pb. Para
comprobar la digestión se llevó a cabo una electroforesis horizontal en agarosa de
bajo punto de fusión al 0.6% durante 12 h a 10 V. El fragmento de 1400 pb correspondiente al cassette se obtuvo del gel, se colocó
en un tubo y se fundió a 50°C durante 10 min. A los 450 µl de agarosa fundida se
les agregó 45 µl (1/10 vol.) de NaCl 5M y se incubó durante 5 min a 50°C,
posteriormente se agregaron 234 µl (2/3 vol) de fenol saturado con NaCl y se
incubó a 37°C, el tubo se agitó por 30 s y se centrifugó a 14,000 rpm durante 7
min. A continuación, a la fase acuosa se le agregaron 800 µl (1 volumen) de
fenol/cloroformo, se agitó por 15 s y se centrifugó a 14,000 rpm durante 7 min.
43
Fig. 12. Esquema del proceso para obtener la mutante nula no polar S. coelicolor Δmdh. El gen bla es el gen de resistencia a ampicilina, el cassette aac(3)IV-OriT obtenido del plásmido pIJ784 ya tiene los oligonucleótidos que flanquean al gen bla. Modificado de
Gust et al., 2002.
44
Se pasó la fase acuosa a otro tubo y se repitió el paso anterior sólo con
cloroformo. La fase acuosa se cambió de tubo, se le agregó 1 volumen de
isopropanol y se dejó 2 h a -20°C. La mezcla anterior se centrifugó a 14,000 rpm
durante 10 min, se eliminó todo el sobrenadante, se dejó secar y se resupendió en
5 µl de agua. El fragmento purificado se mantuvo a -20°C.
3.4. Sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh por el cassette aac(3)IV-OriT.
Para llevar a cabo la sustitución del gen bla del cósmido StD1-Δmdh, primero se
realizó la transformación de la cepa de E. coli BW25113/pIJ790/StD1-Δmdh con el
cassette acc(3)IV-OriT como se mencionó en el inciso 2. Posterior a la
electroporación, se agregó 1 ml de LB y se incubó a 37°C durante 1 h para
favorecer la recombinación entre el gen bla y el cassette. Las bacterias se
centrifugaron y se resuspendieron en 1 ml de LB. Se realizaron diluciones y se
sembraron en placas de LB con kanamicina (50 µg/ml) y apramicina (50 µg/ml). La
sustitución del gen bla se verificó por digestión con las enzimas BamHI y SstI. La
cepa de E. coli ET12567/pUZ8002 se transformó con el cósmido obtenido StD1-
Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT como se mencionó anteriormente (ver fig. 12).
3.5. Conjugación de E. coli ET12567/pUZ8002/StD1-Δmdh/bla::aac(3)IV-OriT y S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV-OriT.
La conjugación entre estas cepas se realizó como lo indica el protocolo ReDirect
(Gust et al., 2002).
4. COMPROBACIÓN DE LA FORMACIÓN DE LA CICATRIZ EN EL GENOMA DE LA MUTANTE NULA S. coelicolor mdh::aac(3)IV-OriT.
4.1. Purificación de ADN. 25 µl de una suspensión de esporas de las colonias ApraS y KanS se inocularon en
25 ml de medio LB e incubaron durante 24 h a 30°C con agitación rotatoria a 200
rpm. Posteriormente 5 ml del cultivo se utilizaron para inocular 25 ml de medio LB
con glicina al 0.5% y se incubaron otras 24 h en las mismas condiciones. El cultivo
se centrifugó a 5000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente, el pellet se lavó
45
dos veces con 10 ml de Tris 0.1 M (pH 7.0)-sacarosa 10%, se resuspendió en 1 ml
del mismo buffer, se agregó 1 mg de lisozima y se incubó 15 min a temperatura
ambiente para la formación de protoplastos. Finalmente, la purificación de ADN se
realizó con el kit Fungal/bacterial DNA extraction siguiendo las instrucciones del
fabricante (Zymo Research).
4.2. Amplificación de ADN por PCR.
Para comprobar la presencia de la cicatriz en el cromosoma se llevó a cabo un
PCR. La amplificación del DNA se realizó con los primers mdh1 (5´-
TGACGGCTGGATCGATCTCT-3´) y mdh2 (5´-AAGGGTCTTATGGGTGCAGG-3´)
mismos que se encuentran a 90 y 85 pb de distancia del gen mdh,
respectivamente. Después de la amplificación, los productos de PCR se
observaron en un gel de agarosa al 0.8%, esperando amplicones de 1175 pb en la
cepa silvestre, 1552 pb en la mutante sustituida y 266 pb en la mutante
cicatrizada (Fig. 13).
Fig 13. Ubicación de los oligonucleótidos mdh1 y mdh2 con respecto al gen mdh. El
cassette aac(3)IV-OriT y la secuencia cicatriz (C) sustituyen al gen mdh en el cromosoma, por lo que el tamaño de los fragmentos es diferente.
46
5. SUSPENSIÓN CONCENTRADA DE ESPORAS DE LAS CEPAS S. coelicolor M145 y Δmdh.
La suspensión de esporas se realizó siguiendo la metodología reportada
anteriormente (Mendoza von der Borch, 2008). La suspensión de esporas en
glicerol al 20% obtenida se almacenó a -20°C por tiempo indefinido.
6. PRE-GERMINACIÓN DE ESPORAS.
De la solución concentrada de esporas se tomó un ml. Las esporas se lavaron dos
veces usando 1 ml de agua estéril y se resuspendieron en 100 µl de agua. Para la
pre-germinación, los 100 µl de esporas lavadas se utilizaron para inocular 100 ml
de medio 2xYT y se incubaron durante 12 h a 30°C con agitación rotatoria a 200
rpm. Las esporas germinadas se recuperaron por centrifugación a 5000 rpm por
10 min a temperatura ambiente y se resuspendieron en 14 ml de agua estéril.
7. CULTIVO EN MEDIO LÍQUIDO.
Para obtener crecimiento disperso de S. coelicolor en medio líquido, los matraces
se siliconizaron con Sigmacote (Sigma-Aldrich) y se les pusieron resortes de acero
inoxidable. Un ml de las esporas germinadas se usó para inocular 100 ml de
medio mínimo con: a) casaminoácidos 5 g/L (MMCA), b) glucosa 0.028 M
(MMGLU) y c) glicerol 0.028 M (MMGLI). Los cultivos se incubaron a 30°C en
agitación rotatoria a 200 rpm durante 72 h.
8. CUANTIFICACIÓN DE CRECIMIENTO.
Cada 24 h se tomaron 5 ml de cultivo para medir la cantidad de proteína total por
el método de Lowry usando albumina sérica bovina como estándar de acuerdo a
la metodología reportada anteriormente (Flores & Sánchez, 1985).
9. EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS.
Cada 24 h se tomaron muestras de 70 ml del cultivo, los cuales se centrifugaron a
10,000 rpm por 10 min a 4 °C. El micelio se lavó dos veces en amortiguador Tris-
Cl 0.01 M pH 7.5 y se resuspendió en 1 ml de este buffer por cada gramo de
47
pellet. El micelio se sonicó en frío (equipo Vibra-Cell modelo 9130) durante 1 min
en intervalos de 10 s. Posteriormente, la muestra se centrifugó a 14,000 rpm
durante 10 min a 4 °C. El extracto libre de células (ELC) obtenido se usó para el
ensayo de las actividades enzimáticas.
10. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE MDH.
La actividad se midió por la disminución de la absorbancia a 340 nm debido a la
oxidación del NADH. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador Tris-
Cl pH 7.5, 0.1 mM de NADH, 0.2 mM de ácido oxaloacético y ELC en un volumen
final de 1 ml (Mendoza, 2005). La reacción se inició por la adición del ELC. La
actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADH oxidado por minuto por ml de
extracto. La actividad se midió por duplicado. La actividad específica se reportó
como µmoles de NADH oxidado por minuto por mg de proteína.
11. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE IDH.
La actividad se midió por el aumento de la absorbancia a 340 nm debido a la
reducción del NADP+. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador
Tris-Cl pH 7.5, 0.05 mM de NADP+, 1.5 mM de ácido isocítrico, 2 mM de MnSO4 y
ELC en un volumen final de 1 ml. La reacción se inició por la adición del ELC por
duplicado. La actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADPH producido por
minuto por ml de extracto. La actividad específica se reportó como µmoles de
NADPH oxidado por minuto por mg de proteína.
12. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE α-KGDH.
La actividad se midió por el aumento de la absorbancia a 340 nm debido a la
reducción del NAD+. La mezcla de reacción contenía 0.01 M de amortiguador Tris-
Cl pH 7.5, 0.5 mM de NAD+, 2 mM de ácido α-cetoglutárico, 5 mM de MgCl2, 0.2
mM de tiamina pirofosfato, 0.04 mM de coenzima A y ELC en un volumen final de
1 ml. La reacción se inició por la adición del ELC y se realizó por duplicado. La
actividad volumétrica se reportó en µmoles de NADH producido por minuto por ml
48
de extracto. La actividad específica se reportó como µmoles de NADH oxidado por
minuto por mg de proteína.
13. CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNA EN EL EXTRACTO LIBRE DE CÉLULAS (ELC).
La cantidad de proteína se determinó por el método de Bradford (Bradford, 1976)
usando albumina sérica bovina como estándar. La concentración de proteínas se
reportó en mg de proteína por ml de extracto.
14. CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS.
De la suspensión concentrada de esporas se tomó una muestra con el asa
bacteriológica y se sembró por estría en cajas de los diferentes medios (MMCA,
MMGLI, MMGLU, LB y MS). Para comparar la mutante (Δmdh) con la silvestre
(M145) las cajas se dividieron a la mitad y cada una de las cepas se sembró en
una mitad. Los cultivos se observaron cada 24 h durante 7 días. Las
características que se observaron fueron la formación de micelio basal, micelio
aéreo, esporas y producción de antibióticos.
49
RESULTADOS.
1. OBTENCIÓN DE LA MUTANTE NULA NO POLAR Streptomyces coelicolor Δmdh.
El estudio del metabolismo primario en general y de las enzimas del ciclo de los
ácidos tricarboxílicos en particular, es de gran interés ya que es poco lo que se
conoce (van Keulen et al., 2011). En este sentido, en el laboratorio de la Dra.
Flores se obtuvo, por el método del ReDirect, una mutante nula Δmdh::aac(3)IV
que confiere la resistencia a apramicina (Gust et al., 2002) con el objeto de
establecer que tan importante es este gen para el crecimiento y el metabolismo del
carbono de esta bacteria. Sin embargo, el tener un gen de resistencia a
antibióticos en lugar del gen mdh generaba dudas de si el efecto observado se
debía a la falta del gen mdh o a la polaridad generada por el gen aac(3)IV . Por
esta razón se obtuvó la mutante nula no polar, usando la técnica del ReDirect
modificada para poder obtener la mutante carente del gen de MDH.
Después de la conjugación entre E. coli ET12567/pUZ8002/StD1-Δmdh y la
mutante S. coelicolor Δmdh::aac(3)IV se obtuvieron cuatro colonias que fueron
sensibles a kanamicina y apramicina, lo que indicaba el probable intercambio del
gen acc por el de la secuencia cicatriz del cósmido StD1-Δmdh. De una de estas
colonias se purificó ADN y se amplificó por PCR una región utilizando iniciadores
que flanqueaban al gene de mdh. Para confirmar la presencia de la cicatriz en el
genoma de S. coelicolor el ADN de la cepa mutante no polar Δmdh se comparó
con el de la cepa silvestre (gen de mdh) y el de la cepa nula polar (cassette
aac(3)IV).
El gen mdh mide 990 pb, el cassette aac(3)IV-OriT tiene 1365 pb y la secuencia
cicatriz tiene 81 pb. Los oligonucleótidos mdh1 y mdh2 están ubicados a 90 pb rio
arriba y 85 pb rio abajo del gen mdh. Por lo tanto se esperaban bandas de 1165
pb para el gen mdh, de 1557 pb para el cassette aac(3)IV-OriT y de 256 pb para la
secuencia cicatriz (ver fig. 13).
50
Como era de esperarse, en la cepa Δmdh se observa una banda de
aproximadamente 256 pb correspondiente a la secuencia cicatriz, mientras que en
la cepa Δmdh::aac(3)IV hay una banda de 1557 pb que corresponde a la
secuencia del gen aac(3)IV y en la cepa silvestre amplificó una banda de 1165 pb
correspondiente al gen mdh (Fig. 14).
Fig. 14. Fragmentos de ADN de la cepa silvestre M145 (carril 2), mutante Δmdh::aac(3)IV
(carril 3) y mutante no polar Δmdh (carril 4). 10 µl de la reacción de PCR descrita en Material y Métodos se cargaron en un gel de agarosa 0.8% y se corrieron durante 1.5 h a
80 V. Carril 1, marcador de peso molecular de 1 Kb (Fermentas).
1 2 3 4
250
1500
1000
10000
51
2. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE MDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh.
Después de sustituir el gen mdh por la secuencia cicatriz era importante
establecer que la mutante no tuviera actividad de MDH. Para esto, la cepa
mutante S. coelicolor Δmdh y la cepa silvestre S. coelicolor M145 se cultivaron en
medio líquido durante 72 h y la actividad se midió como se menciona en
Materiales y métodos.
Como se esperaba, en la mutante S. coelicolor Δmdh no hay actividad de la
enzima MDH en ninguna de las fuentes de carbono usadas (Fig. 15). En contraste,
en la cepa silvestre S. coelicolor M145 el perfil de actividad de esta enzima es
modificado por la fuente de carbono.
En presencia de casaminoácidos 0.5% como única fuente de carbono y nitrógeno,
la actividad de esta enzima llegó al punto máximo a la 24 h y después disminuyó
(Fig. 15A). En glicerol 0.028 M el punto máximo de actividad se alcanzó a las 24 h
como en el caso anterior, sin embargo, la disminución de la actividad en este caso
fue muy rápida (Fig. 15B). En contraste, al crecer en glucosa 0.028 M como fuente
de carbono, la actividad de esta enzima aumentó durante todo el tiempo del cultivo
(Fig. 15C).
52
Fig. 15. Perfiles de actividad de la enzima MDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh)
fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria 200 rpm; cada 24 h se hicieron extractos libres de células, se midió la actividad enzimática y la cantidad de proteína por el método de Bradford.
Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes realizados por duplicado, las barras representan el error estándar.
53
3. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE IDH Y α-KGDH EN LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh.
Se ha reportado en B. subtilis que la MDH interactúa con la enzima IDH que
también participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos; esta interacción resulta
en el aumento de la actividad de IDH (Bartholomae et al., 2013). Por esta razón se
decidió evaluar la actividad de IDH y su enzima subsecuente la α-KGDH, además
al ver la actividad de estas enzimas se podría saber si el flujo de carbono es
afectado por la falta de la enzima MDH.
La actividad de IDH en la cepa S. coelicolor Δmdh fue menor que en la cepa
silvestre en presencia de casaminoácidos como fuente de carbono, mientras que
en las otras dos fuentes probadas la actividad de esta enzima fue igual en las dos
cepas (Fig. 16). En casaminoácidos, la IDH alcanzó su actividad máxima a las 24
h y después disminuyó en las dos cepas, sin embargo, en la cepa mutante S.
coelicolor Δmdh la actividad de IDH fue menor (Fig. 16A). En glicerol y glucosa, la
enzima tuvo el mismo perfil que el observado en casaminoácidos, sin embargo, en
estas condiciones la actividad de esta enzima en las dos cepas fue igual (Fig. 16B
y C). Además, la actividad de esta enzima de ambas cepas fue mayor en glicerol
que en las otras dos fuentes de carbono probadas.
La actividad de la α-KGDH fue mayor en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh que
en la cepa silvestre S. coelicolor M145 en presencia de casaminoácidos, mientras
que en glucosa y glicerol el perfil de actividad de esta enzima fue igual en las dos
cepas (Fig. 17). En casaminoácidos, la α-KGDH alcanzó su máxima actividad a las
24 de cultivo y después disminuyó en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh, en
contraste en la cepa silvestre S. coelicolor M145 la actividad de esta enzima fue
muy baja (Fig. 17A). En glucosa y glicerol la actividad de esta enzima fue igual
entre las dos cepas y el perfil de actividad fue igual al observado en
casaminoácidos (Fig. 17B y C). Esta enzima tiene la mayor actividad en
casaminoácidos en la cepa silvestre.
54
Fig. 16. Perfiles de actividad de la enzima IDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh)
fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria 200 rpm; cada 24 h se hicieron extractos libres de células, se midió la actividad enzimática y la cantidad de proteína por el método de Bradford. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes hechos por duplicado, las
barras representan el error estándar.
55
Fig. 17. Perfiles de actividad de la enzima α-KGDH. Las cepas silvestre (M145) y mutante (Δmdh) fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria 200 rpm; cada 24 h se hicieron extractos libres de células, se midió la actividad enzimática y la cantidad de proteína por el método de Bradford. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes hechos por duplicado, las
barras representan el error estándar.
56
4. CRECIMIENTO DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh EN DIFERENTES FUENTES DE CARBONO.
La MDH participa en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos y tiene un papel muy
importante en el crecimiento y desarrollo de S. coelicolor, por lo tanto era
necesario evaluar si la falta de esta enzima afectaba el crecimiento de esta
bacteria. Para esto, la cepa mutante S. coelicolor Δmdh y la cepa silvestre S.
coelicolor M145 se cultivaron en medio líquido en presencia de diferentes fuentes
de carbono.
La cepa mutante S. coelicolor Δmdh creció en todas las fuentes de carbono
probadas, sin embargo, en glucosa y casaminoácidos la mutante creció menos
que la cepa silvestre S. coelicolor M145 (Fig. 18). En casaminoácidos se observó
el mayor crecimiento para las dos cepas.
En casaminoácidos, las dos cepas empezaron la fase exponencial de crecimiento
a las 24 h y llegaron a fase estacionaria a las 48 h, sin embargo, la cepa mutante
creció aproximadamente la mitad de lo que creció la cepa silvestre (Fig. 18A). En
glicerol, en esta condición la cepa mutante S. coelicolor Δmdh creció igual a la
silvestre S. coelicolor M145 y las dos cepas crecieron exponencialmente hasta las
48 h, punto en el que empezaron la fase estacionaria (Fig. 18B). En glucosa, la
cepa mutante S. coelicolor Δmdh alcanzó la fase estacionaria a las 24 h de cultivo
mientras que la cepa silvestre S. coelicolor M145 siguió creciendo
exponencialmente hasta las 48 h (Fig. 18C). En esta condición la cepa mutante S.
coelicolor Δmdh creció la mitad de lo que creció la cepa silvestre S. coelicolor
M145. El mayor crecimiento para las dos cepas se observó en casaminoácidos.
57
Fig. 18. Perfiles de crecimiento de la cepa silvestre M145 y la mutante Δmdh. Las cepas silvestre
(M145) y mutante (Δmdh) fueron cultivadas en medio mínimo con A) casaminoácidos 0.5%, B) glicerol 0.028 M y C) glucosa 0.028 M durante 72 h a 30°C y agitación rotatoria de 200 rpm. Cada
24 h se tomaron 5 ml de muestra y se cuantificó la cantidad de proteína total por el método de Lowry. Los resultados son el promedio de dos experimentos independientes hechos por duplicado,
las barras representan el error estándar.
58
5. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE LA MUTANTE S. coelicolor Δmdh.
Con objeto de establecer si la falta del gen mdh tiene relación con la
diferenciación morfológica y la producción de antibióticos en esta bacteria como
sucedió con la mutante carente de aconitasa de este mismo microorganismo
(Viollier et al., 2001b), las cepas S. coelicolor Δmdh y S. coelicolor M145 se
sembraron en diferentes medios sólidos durante siete días y cada 24 h se observó
la formación de micelio vegetativo, micelio aéreo y esporas, además de la
producción de antibióticos.
Los resultados mostraron que en medio mínimo con casaminoácidos como fuente
de carbono y nitrógeno (MMCA), la cepa mutante S. coelicolor Δmdh tuvo colonias
más pequeñas, también se retrasó en la formación de esporas y en la producción
de antibióticos (Fig. 19). La mutante Δmdh formó micelio vegetativo a las 72 horas,
micelio aéreo a las 96 h y esporas a las 120 h, a diferencia de la cepa silvestre S.
coelicolor M145 que formó micelio vegetativo a las 48 h, micelio aéreo a las 72 h y
esporas hasta las 96 h (Fig. 19A). Por otro lado, la cepa mutante S. coelicolor
Δmdh empezó a producir antibióticos a las 120 h mientras que la cepa silvestre S.
coelicolor M145 los produjo a las 72 h (Fig. 19B). La cepa mutante S. coelicolor
Δmdh tiene deficiencias en el desarrollo que no se reestablecen con el tiempo de
cultivo en este medio.
En medio mínimo con glicerol como fuente de carbono (MMGLI) la cepa mutante
S. coelicolor Δmdh se desarrolló igual que la cepa silvestre S. coelicolor M145
(Fig. 20). Las dos cepas formaron micelio vegetativo hasta las 72 h, micelio aéreo
a las 96 h y esporas a las 120 h (Fig. 20A). A este último tiempo ambas cepas
empezaron a producir antibióticos (Fig. 20B). En este medio, la falta de esta
enzima no afecta el desarrollo de la mutante S. coelicolor Δmdh, esto coincide con
lo observado en crecimiento en medio líquido.
59
Fig. 19. Características fenotípicas de las cepas silvestre (WT) y mutante (Δmdh) crecidas en MM con casaminoácidos. Ambas cepas se sembraron en placas de medio mínimo con casaminoácidos
0.5%, se incubaron a 30°C durante 7 días y cada 24 h se observaba la formación de micelio, esporas (A) y producción de antibióticos (B). Se realizaron tres repeticiones y se muestran las cajas
de un experimento representativo.
48h
120 h
~mdh wr
48h
• B 120 h
72h
144h
72h
• 144h
96h
168h
96 h
• 168 h
60
Fig. 20. Características fenotípicas de las dos cepas, silvestre (WT) y mutante (Δmdh) crecidas en MM con glicerol. Las dos cepas se sembraron en placas de medio mínimo con glicerol 0.028 M, se incubaron a 30°C durante 7 días y cada 24 h se observaba la formación de micelio y esporas (A) y
producción de antibióticos (B). Se realizaron tres experimentos y se muestran las cajas de un experimento representativo.
48h 72h 96 h
120 h 144h 168 h
4mdh wr
48h 72h 96 h
B 120 h 144h 168 h
61
En medio mínimo con glucosa como fuente de carbono (MMGLU) la cepa mutante
S. coelicolor Δmdh se diferenció igual que la silvestre, sin embargo, se retrasó en
la producción de antibióticos. Las dos cepas formaron micelio aéreo a las 72 h y
esporas a las 120 h de cultivo (Fig. 21A). La producción de antibióticos se retrasó
en la cepa mutante S. coelicolor Δmdh presentándose a las 96 horas, en tanto que
la cepa silvestre S. coelicolor M145 los produjo a las 72 h (Fig. 21B). En este
medio la cepa mutante S. coelicolor Δmdh tuvo un retraso de 24 h en la
producción de antibióticos, sin embargo, al final del tiempo de cultivo su fenotipo
fue similar al de la cepa silvestre S. coelicolor M145.
En medio LB, la cepa mutante S. coelicolor Δmdh creció y produjo antibióticos
igual que la cepa silvestre S. coelicolor M145. A las 48 h las dos cepas formaron
micelio vegetativo y a las 96 h empezaron a producir actinorodina (Fig. 22B), sin
embargo, en este medio ninguna de las dos cepas formaron micelio aéreo ni
esporas (Fig. 22A). Además se observó que la cepa mutante S. coelicolor Δmdh
tuvo color amarillo.
En medio MS, la cepa mutante S. coelicolor Δmdh creció igual que la cepa
silvestre S. coelicolor M145 pero produjo antibióticos antes. Las dos cepas
formaron micelio aéreo a las 48 h y esporas a las 72 h (Fig. 23A), tiempo en el
cual, la cepa mutante S. coelicolor Δmdh produjo actinorodina, mientras que la
cepa silvestre S. coelicolor M145 produjo un pigmento naranja (probablemente
undecilprodigiosina) a las 96 h e inició la producción de actinorodina hasta las 120
h (Fig. 23B). La cepa mutante S. coelicolor Δmdh no tuvo deficiencias en el
desarrollo ni en la producción de antibióticos, de hecho, esta cepa produjo
actinorodina antes que la cepa silvestre S. coelicolor M145.
62
Fig. 21. Características fenotípicas de las dos cepas, silvestre (WT) y mutante (Δmdh) crecidas en
MM con glucosa. Las dos cepas silvestre (WT) y mutante (Δmdh) se sembraron en placas de medio mínimo con glucosa 0.028 M, se incubaron a 30°C durante 7 días y cada 24 h se observaba
la formación de micelio y esporas (A) y producción de antibióticos (B). Se realizaron tres experimentos y se muestran las cajas de un experimento representativo.
48 h
120 h
iJmdh wr
48 h
B 120 h
\ \
72 h 96 h
144 h 168 h
72 h 96 h
144 h 168 h
63
Fig. 22. Características fenotípicas de las dos cepas, silvestre (WT) y mutante (Δmdh) crecidas en medio LB. Las dos cepas silvestre (WT) y mutante (Δmdh) se sembraron en placas de medio LB, se incubaron a 30°C durante 7 días y cada 24 h se observaba la formación de micelio y esporas
(A) y producción de antibióticos (B). Se realizaron tres experimentos y se muestran las cajas de un experimento representativo.
48h 72h 96h
120 h 144h 168h
48h 72h 96 h
B 120 h 144h 168 h
64
Fig. 23. Características fenotípicas de las dos cepas, silvestre (WT) y mutante (Δmdh) crecidas en medio MS. Las dos cepas silvestre (WT) y mutante (Δmdh) se sembraron en placas de medio MS,
se incubaron a 30°C durante 7 días y cada 24 h se observaba la formación de micelio y esporas (A) y producción de antibióticos (B). Se realizaron tres experimentos y se muestran las cajas de un
experimento representativo.
tJmdh wr
48 h 72h 96h
A 120 h 144h 168 h
--
tJmdh wr
48h 72h 96 h
B 120 h 144h 168 h
65
DISCUSION.
El ciclo de los ácidos tricarboxílicos es necesario para el crecimiento, la
diferenciación morfológica y la producción de antibióticos en S. coelicolor (Viollier
et al., 2001a). En este trabajo se observó la importancia de la enzima malato
deshidrogenasa en el crecimiento, el balance del ciclo de los ácidos tricarboxílicos,
la diferenciación morfológica y la producción de antibióticos en S. coelicolor por
medio de la construcción de una mutante que no tiene el gen mdh que codifica
para esta enzima.
La mutante creció en glucosa, glicerol y casaminoácidos como fuente de carbono.
En Streptomyces las vías de transporte de glucosa, glicerol y aminoácidos son
conocidas. La glucosa es transportada a través de simporte por la enzima GlcP, el
glicerol es transportado por difusión facilitada y los aminoácidos son transportados
por medio de permeasas específicas dependientes de ATP (Bertram et al., 2004;
D’Huys et al., 2011).
La glucosa y el glicerol son degradados a través de la glucólisis aunque entran a
esta ruta en diferentes sitios; la glucosa entra desde el inicio como glucosa-6-
fosfato mientras que el glicerol entra a la mitad como gliceraldehído-3-fosfato. A
diferencia de los aminoácidos que son degradados por diferentes rutas hasta
formar acetil-CoA e intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos como
oxaloacetato y α-cetoglutarato (Hodgson, 2000; Nelson & Cox, 2013).
Específicamente el glutamato es degradado hasta formar α-cetoglutarato, este
aminoácido se debe considerar porque es el que se encuentra en mayor
proporción en la mezcla de casaminoácidos y es el que se asimila de manera
preferencial en Streptomyces (D’Huys et al., 2011).
La eliminación del gen que codifica para la MDH disminuyó a la mitad el
crecimiento de esta bacteria en presencia de glucosa y casaminoácidos como
fuente de carbono (Fig. 18A y C). En glucosa, ésto puede deberse a que el
organismo tiene una disminución de la concentración de oxaloacetato, lo que
66
disminuye la producción de aminoácidos (aspartato y asparagina) y por lo tanto
limita la síntesis de proteínas. Aunque el oxaloacetato se puede producir por rutas
anapleróticas, algunas de ellas (piruvato carboxilasa, PEP carboxicinasa y las
enzimas málicas) están reprimidas catabólicamente por glucosa (Gubbens et al.,
2012). Sin embargo, en casaminoácidos este resultado es sorprendente porque la
bacteria podría sintetizar proteínas porque está consumiendo aminoácidos y
además las enzimas anapleróticas no están reprimidas, lo que nos sugiere que la
disminución del crecimiento en la mutante no solo se debe a la falta de
aminoácidos sino a un déficit energético generado por la pérdida de dos moléculas
de NADH o por el desbalance del flujo del carbono a través del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos. En contraste, las dos cepas crecen igual en glicerol como fuente de
carbono (Fig. 18B) debido a que las enzimas que participan en las rutas
anapleróticas para la formación de oxaloacetato no están reprimidas y el flujo
metabólico es igual que en la cepa silvestre porque en esta fuente carbono se
produce menor cantidad de intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos
(Tarhan et al., 2011).
Como se esperaba la cepa mutante S. coelicolor Δmdh no tuvo actividad de MDH.
En contraste la cepa silvestre S. coelicolor M145 si presentó actividad de esta
enzima (Fig. 15), además la actividad puede relacionarse con el crecimiento de la
bacteria en las diferentes fuentes de carbono (Fig. 18). La actividad de MDH no
está asociada al crecimiento en ninguna de las fuentes de carbono probadas. En
casaminoácidos y glicerol, la enzima alcanza su actividad máxima a las 24 h de
cultivo, tiempo en el cual la bacteria comienza a crecer exponencialmente, esto es
similar a perfiles de actividad de esta enzima reportados para otras fuentes de
carbono como fructosa, maltosa, malato y acetato (Mendoza von der Borch, 2008).
Por el contrario, en glucosa la actividad de la enzima aumentó progresivamente
hasta las 72 h de cultivo a pesar de que la bacteria deja de crecer a las 48 h, esto
es diferente a lo reportado donde la actividad de esta enzima aumenta en fase de
crecimiento exponencial y disminuye en fase estacionaria (Mendoza von der
Borch, 2008; Novotna et al., 2003). Sin embargo, en esos estudios, la bacteria
67
crecía en medios de cultivo con dos fuentes de carbono, lo que podría modificar el
perfil de actividad.
En la fuente de carbono casaminoácidos se encontraron diferencias de las
actividades de IDH y α-KGDH entre la cepa mutante S. coelicolor Δmdh y la cepa
silvestre S. coelicolor M145 (Figs. 16A y 17A), en la cepa mutante disminuyó la
actividad de IDH y aumentó la actividad de α-KGDH. El consumo de glutamato
aumenta la concentración de α-cetoglutarato en el citoplasma de las dos cepas.
En la mutante se acumula el α-cetoglutarato lo que favorece la actividad de α-
KGDH por exceso de sustrato e inhibe la actividad de IDH por exceso de producto,
este tipo de inhibición en esta enzima ya se ha reportado para S. erythraea
(Alvarado & Flores, 2003), en esta cepa se tiene este efecto porque tiene un
desbalance en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos debido a la acumulación de
malato. En contraste, la cepa silvestre puede controlar el exceso de α-
cetoglutarato porque no hay acumulación de malato y por lo tanto las enzimas del
ciclo de los ácidos tricarboxílicos están en equilibrio.
La cepa mutante S. coelicolor Δmdh mostró deficiencias en la formación de micelio
aéreo y esporas al crecer en casaminoácidos como fuente de carbono (Fig. 19A).
Este fenómeno puede deberse al desequilibrio metabólico y energético de la
mutante generado por la acumulación de ácidos orgánicos dada por la interrupción
del ciclo de los ácidos tricarboxílicos. Resultados similares se han observado en
mutantes de S. coelicolor interrumpidas en los genes que codifican para enzimas
del ciclo de los ácidos tricarboxílicos como la citrato sintasa y la aconitasa, donde
demuestran que estos resultados se deben parcialmente a la acidificación del
medio causada por acumulación de ácidos orgánicos provenientes de este ciclo
(Viollier et al., 2001a) o a la acción quelante del citrato, sustrato de la enzima
aconitasa (Viollier et al., 2001b).
En presencia de casaminoácidos y glucosa como fuente de carbono la cepa
mutante S. coelicolor Δmdh mostró un retraso en la producción de actinorodina
respecto a la cepa silvestre (Figs. 19B y 21B). Este fenómeno puede deberse a
que la acumulación de ácidos orgánicos provenientes del ciclo de los ácidos
68
tricarboxílicos sea una señal de que hay suficiente energía y por lo tanto no se
induce el metabolismo secundario o alguno de estos ácidos pueda tener un efecto
negativo sobre la expresión de genes involucrados en la síntesis de este
antibiótico. Un resultado similar se observó en una doble mutante de S. coelicolor
que no tiene las enzimas málicas, donde demuestran que el activador
transcripcional actII-ORF4 tiene una baja expresión y por lo tanto la expresión de
los genes de síntesis de este antibiótico está disminuida (Rodriguez et al., 2012).
Este resultado nos sugiere que un intermediario del ciclo de los ácidos
tricarboxílicos, posiblemente malato, tenga un efecto represor sobre la producción
de actinorodina, sin embargo, se necesitan más estudios para demostrarlo.
La cepa mutante S. coelicolor Δmdh formó micelio aéreo, esporas y produjo
antibióticos igual que la cepa silvestre S. coelicolor M145 cuando crecen en medio
mínimo con glicerol como fuente de carbono y en medio MS (Figs. 20 y 23). En
estas condiciones no hay acidificación ni acumulación porque el glicerol disminuye
la producción de intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Tarhan et al.,
2011) y el manitol es una fuente de carbono no acidogénica (Viollier et al., 2001).
69
CONCLUSIONES.
La presencia de la enzima MDH no es necesaria para la sobrevivencia de
S. coelicolor.
La falta de la enzima MDH en S. coelicolor disminuye la actividad de IDH y
aumenta la de α-KGDH cuando los casaminoácidos son empleados como
fuente de carbono y nitrógeno.
La ausencia de la enzima MDH en S. coelicolor afecta su crecimiento,
diferenciación morfológica y producción de antibióticos cuando los
casaminoácidos son empleados como fuente de carbono y nitrógeno.
La carencia de la enzima MDH disminuye el crecimiento de S. coelicolor en
medio líquido usando glucosa como fuente de carbono.
70
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