COMPLEJO HOSPITAL, DR. LUIS RAZETTI.

UNIDAD INGENIERO KLEBER RAMIREZ ROJAS Modelos de Sistemas Tumorales. Sistema de tumores slidos trasplantables en animales de experimentacin. Medidas de Crecimiento Tumoral. Ensayos TD50. Otros modelos de sistema tumoral

Modelos del Sistema Tumoral:

Sistemas de tumores slidos trasplantables en animales de experimentacin: Una amplia gama de tumores experimentales de diversos tipos histolgicos han sido desarrollados para estudios radiobiolgico, para producir un gran nmero de tumores prcticamente idnticos, la propagacin por el trasplante de una generacin de los animales a la siguiente se utiliza, lo que hace obligatorio que los animales sean islogos.

Una amplia gama de tumores de diferentes tipos histolgicos se puede cultivar en animales de laboratorio y se propaga por el trasplante. Sistemas tumorales trasplantadas pueden ser altamente cuantitativo, pero en general mientras ms cuantitativo sea el sistema, ms artificial es, porque los tumores son altamente indiferenciado y encapsulado.

Mediciones de crecimiento del tumor.Curacin del tumor ( TCD50 ) de ensayo .La supervivencia de clulas tumorales in vitro determin por la tcnica de ensayo de dilucin.La supervivencia de clulas tumorales por los ensayos de colonias de pulmn.La supervivencia celular tumoral usando en el tratamiento vivo seguido de ensayo in vitro.

MEDIDAS DE CRECIEMIENTO TUMORAL:

( TCD50 ) ENSAYO En los experimentos de este tipo, un gran nmero de animales con tumores de tamao uniforme se dividen en grupos separados , y los tumores se irradian a nivel local con dosis graduadas . Los tumores posteriormente se observan regularmente para la recurrencia o el control local. La proporcin de tumores que son controlados localmente se puede trazar como una funcin de la dosis , y datos de este tipo son susceptibles de un anlisis estadstico sofisticado para determinar TCD50 , la dosis a la que 50 % de los tumores son controlados localmente. Esta cantidad es altamente repetible de un experimento a otro en una cepa endogmica de los animales.La tcnica de ensayo de dilucin: Fue ideado por Hewitt y Wilson , que lo utiliz para producir la primera in vivo, la curva de supervivencia en 1959.

Hill y Bush han ideado una tcnica para ensayar la clonogenicidad de las clulas de un tumor slido irradiado in situ mediante la inyeccin en animales receptores y contando el nmero de colonias pulmonares producidas. Los principios generales del mtodo se ilustran en la Figura 20.6 . El tumor usado en estos estudios fue el sarcoma KHT , que es un tumor trasplantable que surgi originalmente en un ratn C3H , y que se ha propagado en serie a travs de muchas generaciones. PULMN COLONIA DEL ENSAYOLas curvas de dosis -respuesta

El sistema de ensayo de colonias de pulmn

EN VIVO / ensayo in vitro Un nmero limitado de lneas celulares han sido adaptados para que crezcan ya sea como un tumor trasplantable en un animal o como clones en una placa de Petri . Estas clulas se pueden transferir fcilmente a partir de in vivo a in vitro y la espalda. En una generacin que pueden crecer como un tumor slido en un animal, y en la siguiente como una monocapa en una placa de Petri . Los tres sistemas ms comnmente utilizados son un rabdomiosarcoma en la rata ( Hermens y Barendsen ) , un fibrosarcoma en el ratn ( McNally ), y el tumor mamario EMT6 , tambin en el ratn ( Rockwell y Kallman ) .

Xenoinjertos de tumores humanos:Es un trasplante de una especie a otra. En el campo del cncer, esto por lo general se refiere a un crecimiento de tumores humanos trasplantados en un animal de laboratorio. Si el animal receptor cuenta con un sistema inmune normal, un xenoinjerto no debe crecer, pero hay dos formas principales en que se ha logrado el crecimiento:Las cepas de origen animal han sido desarrollados que son congnitamente inmunolgico deficiente.Es posible severamente ratones inmune-suprimir por el uso de radiacin o drogas o una combinacin de ambos, para el punto en el que se aceptan los injertos tumorales humanas.

Los cinco ensayos de uso comn:Son tumorales medidas del retardo de crecimiento.

curacin tumor (TCD50) de ensayo.

La supervivencia celular tumoral determinadas por la tcnica de ensayo de dilucin.La produccin de colonias pulmonares

Y en el tratamiento vivo seguido de ensayo in vitro.

CaractersticasVentajas

Conservan cariotipos humanos a travs de pasos en serie Hay una tendencia a que el tumor a ser rechazado, por lo que la observacin de control del tumor como un punto final puede ser engaosa. Retraso en el crecimiento y la supervivencia celular estudios, por otro lado, son probablemente menos afectada.Mantienen algunas de las caractersticas de respuesta de los tumores humanos de origen individual2. Las clulas tumorales humanas hacen sufrir cambios cinticos y seleccin de clulas si se trasplantan en ratones. Tienen grandes ventajas sobre tumores de ratnAunque las caractersticas histolgicas de los tumores de origen humano son generalmente bien mantenidos por xenoinjertos, el tejido estromal es de origen ratn.Las clulas tumorales humanas hacen sufrir cambios cinticos y seleccin de clulas si se trasplantan en ratonesHay una tendencia a que el tumor pueda ser rechazado

Retraso en el crecimiento y la supervivencia celular estudios

Son probablemente menos afectada

Fraccin de clulas hipxicas en xenoinjertos es mucho el mismo que en tumores de ratn

El sistema de esferoideLos esferoides se irradian intacto y entonces se separan en clulas individuales mediante el uso de tripsina y agitacin suave antes de ser sembradas en placas de Petri a ensayar para la integridad reproductiva de las clulas individuales; Esferoides maduros consisten en tres poblaciones de clulas con diferentes radiosensibilidad. Comenzando desde el exterior y trabajando hacia el centro

Esferoides de clulas tumorales HumanosMuchos tipos de clulas tumorales humanas pueden ser cultivadas como esferoides, con un amplio espectro de las apariencias morfolgicas y tasas de crecimiento. En general, las clulas de especmenes quirrgicos desglosados forman esferoides si se cultivan en suspensin lquida por encima de una superficie no adherente, que puede ser una capa delgada de agar o gel de agarosa o de la parte inferior de una placa de cultivo no preparado para el cultivo celular.corte transversal esferoide

COMPARACIN DE LOS DIFERENTES SISTEMAS DE TUMOR MODELO La curacin del tumor ( TCD50 ) y los sistemas de retardo de crecimiento cuotala ventaja adicional de que se dejan in situ inalteradas despus del tratamiento. En las otras tcnicas, el tumor debe ser removido, picada, y se prepar en una suspensin de una sola clula por el uso de una enzima, tal como tripsina, antes de que se evalu la supervivencia. El procedimiento de romper el tumor y disolviendo parcialmente la membrana celular con una enzima digestiva pueden influir en los resultados. La determinacin de TCD50 es quizs ideal para producir los datos pertinentes a la radioterapia clnica. La tcnica de ensayo de dilucin permite la supervivencia celular clonognico a ser evaluada sobre una gran gama de dosis y para los tumores que no pueden ser cultivadas en cultivo. Sin lugar a dudas, la tcnica ms rpida y eficiente es el vivo / tcnica in vitro, que combina el realismo de la irradiacin in vivo con la velocidad y la eficiencia de la siembra in vitro para evaluar la supervivencia clonognica. Xenoinjertos de tumores humanos hasta ahora se han utilizado en una escala mucho ms limitada. Esferoides representan un modelo intermedio ms importante entre monocapas de clulas en cultivo y tumores in vivo. Esferoides celulares humanas slo se han utilizado en una escala limitada, pero est claro que las clulas conservan muchas de las caractersticas del tumor a partir de los cuales se tomaron.

La apoptosis en TumoresLa muerte celular programada o apoptosis, tambin se produce en ambos tejidos normales y tumores, de forma espontnea y como resultado de la irradiacin. Generalmente se piensa que las clulas irradiadas mueren en el intento siguiente o una mitosis posterior, esta no es la nica forma de muerte celular. La susceptibilidad a la induccin de la apoptosis tambin puede ser un factor importante que determina la radiosensibilidad, porque la muerte celular programada que parece ser un efecto temprano prominente en tumores radiosensibles de ratn y esencialmente ausente en los tumores radiorresistentes. La apoptosis tambin est involucrado en la muerte celular por una amplia gama de frmacos citotxicos usados en la terapia del cncer.

En la prctica, puras cepas puras de ratas o ratones son utilizados y se mantienen en el apareamiento hermano - hermana, que tambin cumple la funcin de reducir la variabilidad entre los animales a un mnimo. El tumor de un animal donante se extrae aspticamente y, si es posible, preparado en una suspensin de una sola clula; esto se logra mediante la separacin de las clulas con una enzima tal como tripsina y luego forzndolos a travs de una malla de alambre fino. Para efectuar un trasplante, 104 a 106 clulas se inoculan por va subcutnea en cada uno de un gran grupo de animales receptores de la misma cepa. El sitio de los trasplantes es muy variable; se utiliza el flanco o la parte posterior comnmente, pero a veces un tumor especial requiere un sitio particular, tal como el cerebro. Algunos tumores no pueden ser manejados de esta manera y deben ser propagadas mediante el trasplante de un pequeo trozo de tumor en lugar de un nmero conocido de clulas individuales; esto es obviamente menos cuantitativas.En cuestin de das o semanas, dependiendo del tipo de tumor y el linaje de los animales, los tumores palpables aparecen en los animales receptores que son uniformes en tamao, tipo histolgico, y as sucesivamente. Cientos de miles de animales se pueden utilizar, lo que hace posible el diseo de estudios altamente cuantitativos de la respuesta del tumor a diferentes radiaciones, regmenes de fraccionamiento, sensibilizadores, y combinaciones de radiacin y agentes quimioteraputicos.

*Cada uno de estos mtodos se discute brevemente. Medicin del crecimiento tumoral es posiblemente el punto final ms simple de usar y consiste en la medicin diaria de cada tumor para llegar a un dimetro medio. Para los experimentos de crecimiento del tumor, un gran nmero de tumores trasplantados se preparan como se ha descrito previamente.Cuando han crecido a un tamao determinado (por ejemplo, un dimetro de 8 a 10 mm en las ratas o de 2 a 4 mm en ratones), son tratados de acuerdo con el plan del experimento particular. La figura 20.1 ilustra la variacin del tamao del tumor con el tiempo para los controles no irradiados y tumores recibieron una sola dosis de rayos x. Los tumores no tratados crecen rpidamente a un ritmo relativamente uniforme; el tratamiento de radiacin provoca una contraccin temporal del tumor, seguido de rebrote. FIGURA 20.1 El patrn de respuesta de un tumor a una dosis de rayos x. El tamao del tumor, ya sea el dimetro medio o el volumen, se representa como una funcin del tiempo despus de la irradiacin. Dos ndices diferentes de respuestas tumorales han sido utilizados por diferentes investigadores. Retraso en el crecimiento representa el tiempo despus de la irradiacin que se necesita para que el tumor vuelva a crecer al tamao en el momento de la irradiacin. Alternativamente, el ndice de dao por radiacin puede ser el tiempo necesario para que el tumor crezca de un tamao A especificada en el momento de la irradiacin en cierta especificado mayor tamao de B. Tpicamente, esto puede ser de 9 a 25 mm de dimetro para los tumores de rata. Esta cantidad se muestra como TCON para los animales de control no irradiados y TX- RAY para tumores irradiados con una dosis ( D ) de radiografas . De cualquier ndice de respuesta tumoral se puede trazar como una funcin de la dosis de radiacin.

Dos mtodos diferentes se han utilizado para anotar la respuesta del tumor. Barendsen y sus colegas han utilizado retraso en el crecimiento, que se ilustra en la Figura 20.1, como el tiempo despus de la irradiacin para que el tumor vuelva a crecer al tamao que tena en el momento de la irradiacin. Claramente, este ndice de respuesta slo es adecuado para los tumores que se encogen significativamente despus de la irradiacin. Para los tumores que no se contraen de manera obviamente, un ndice ms conveniente de retraso en el crecimiento es el tiempo que tarda el tumor irradiado a crecer hasta cierto tamao especificado despus de la exposicin, en comparacin con los controles. De cualquier ndice de retraso del crecimiento aumenta como una funcin de la dosis de radiacin. Figura 20.2A muestra las curvas de crecimiento para una rabdomiosarcoma ratas irradiadas con varias dosis de rayos X o neutrones rpidos. En la Figura 20.2B, retraso en el crecimiento se expresa como una funcin de la dosis de radiacin.*. Utilizaron una leucemia linfoctica de origen espontneo en ratones. Una suspensin de una sola clula puede prepararse a partir del hgado infiltrado de un animal con enfermedad avanzada y el tumor trasplantado mediante la inyeccin de nmeros conocidos de clulas en las cavidades peritoneales de ratones receptores , que posteriormente desarrollan leucemias. La leucemia se puede transmitir , en promedio, por la inyeccin de slo dos clulas ; esta cantidad , el nmero de clulas necesarias para transmitir el tumor en un 50% de los animales se conoce como TD50 . La tcnica de ensayo de dilucin se convirti en la base para obtener una curva de supervivencia de las clulas in vivo.*Los cambios de volumen de rabdomiosarcomas en ratas despus de la irradiacin . La curva 1 representa el crecimiento de los tumores de control no irradiadas . Curvas 2 , 4 , 6 y 7 se refieren a tumores irradiados con 10 a 40 Gy ( 1.000-4.000 rad) de rayos X 300 kV . Curvas 3 y 5 se refieren a tumores irradiados con 4 y 8 Gy ( 400 y 800 rad ) de 15 MeV d + Camisas neutrones rpidos . Retraso en el crecimiento de los rabdomiosarcomas en ratas como una funcin de la dosis de rayos X (curva 2 ) o neutrones rpidos (curva 1 ) : B . A y C indican las dosis de neutrones y rayos X , respectivamente , requiere para "curar" 90 % de los tumores , calculado sobre la base de las curvas de supervivencia celular. B indica la observada TCD90 para radiografas. Tenga en cuenta el buen acuerdo entre los valores calculados y observados de la TCD90 para radiografas. ( De Barendsen GW , Broerse JJ: radioterapia experimental de un rabdomiosarcoma rata con 15 neutrones MeV y 300 kV rayos X : . I. Efectos de las exposiciones individuales Eur J Cancer . 5: 373-391 , 1969 , con permiso)*Los tumores se irradiaron in situ, despus de lo cual se retiran y se hicieron en una preparacin de clulas individuales por un tripsinizacin combinado y procedimiento mecnico . Un nmero conocido de clulas luego se mezcla con un gran nmero de clulas tumorales irradiadas en gran medida y se inyecta por va intravenosa en ratones receptores . Alrededor de 3 semanas ms tarde estos ratones se sacrifican , y las colonias formadas en los pulmones son fcilmente contable. El nmero de colonias pulmonares es una medida del nmero de clulas supervivientes clonognicas en la suspensin inyectada.

FIGURA 20.5 Las curvas de dosis -respuesta in vivo, utilizando la tcnica de ensayo de dilucin , por diversos tumores murinos en condiciones oxigenadas y de hipoxia. ( De Berry RJ : En la forma de las curvas de dosis-respuesta de rayos x para la supervivencia reproductiva de las clulas de mamferos Br J Radiol 37 : . . 948-951 , 1964 , con permiso)La tcnica colonia de pulmn no se limita a la sarcoma KHT pero se ha usado con otras clulas tumorales. Por ejemplo, la demostracin de la ausencia de reparacin de dao potencialmente letal despus de la irradiacin de neutrones implic el uso de la carcinoma de pulmn de Lewis, y la fraccin de clulas supervivientes fue ensayada por contando colonias pulmonares.

*La tcnica colonia de pulmn no se limita a la sarcoma KHT pero se ha usado con otras clulas tumorales. Por ejemplo, la demostracin de la ausencia de reparacin de dao potencialmente letal despus de la irradiacin de neutrones implic el uso de la carcinoma de pulmn de Lewis, y la fraccin de clulas supervivientes fue ensayada por contando colonias pulmonares.

FIGURA 20.6 El sistema de ensayo de colonias de pulmn. El tumor se irradia in situ, despus de lo cual se escinde y se convierte en una suspensin de una sola clula . Un nmero conocido de clulas se inyectan por va intravenosa en animales receptores . Alrededor de 3 semanas ms tarde, los animales receptores son sacrificados y las colonias que se han formado en los pulmones se cuentan. El nmero de colonias pulmonares es una medida del nmero de clulas supervivientes clonognicas en la suspensin inyectada. ( Desde la colina de RP , Bush RS : . El efecto de la irradiacin continua o fraccionada en un sarcoma murino Br J Radiol 46 : . 167-174 , 1973 , con permiso)*Los pasos a seguir en este mtodo se ilustran en la figura 20.7 . Este mtodo combina muchas de las ventajas de la in vitro y en tcnicas in vivo .P.355Los tumores son tratados in vivo en un entorno natural , de modo que la respuesta celular es modificado por los diversos factores que son importantes en la determinacin de la respuesta bruto tumor. Despus del tratamiento, se elimina cada tumor y se prepar en una suspensin de una sola clula , y la concentracin de clulas se cont en un hemocitmetro o contador de clulas electrnico. Nmeros conocidos de clulas pueden entonces ser transferidos a cpsulas Petri que contenan medio de crecimiento fresco, y la proporcin de clulas clonognicas pueden determinarse contando colonias 10 das despus. La velocidad , precisin y economa relativa del sistema in vitro sustituye a los gastos y molestias de los animales receptores en la tcnica de ensayo de dilucin.

FIGURA 20.7 El principio de la vivo / sistema de ensayo in vitro utilizando el rabdomiosarcoma en la rata. El tumor slido en el animal puede ser retirado y las clulas tumorales se ensay para la formacin de colonias en placas de Petri . Esta lnea celular puede ser transferido de ida y vuelta entre el animal y la placa de Petri . (Cortesa de los Dres . GW Barendsen y JJ Broerse . )

*Es importante reconocer que ni el tipo de husped falla completamente para rechazar las clulas tumorales humanas: procesos de rechazo estn todava presentes, y estos complicar la interpretacin de los estudios teraputicos tumorales situ.A pesar de las limitaciones, una amplia variedad de clulas tumorales humanas han crecido como xenoinjertos en animales inmunodeficientes. Steel ha estimado que ms de 300 tumores humanos individuales han sido investigados en esta manera. Los tumores de mama y de ovario generalmente han sido difciles de injerto, con injerto de melanomas y tumores de colon y los bronquios son relativamente exitoso.*

En los cinco ensayos, las clulas pueden ser irradiadas in situ con todo el realismo y la complejidad de las condiciones in vivo. Si curacin del tumor (TCD50) o retraso en el crecimiento se anot, el tumor se deja sin molestias despus del tratamiento. Esto evita la desagregacin de los artefactos que participan en el tumor, especialmente en el estudio de algunos productos qumicos o la hipertermia, en el que los efectos de la membrana celular son importantes. La tcnica de ensayo de dilucin, el ensayo de colonias de pulmn, y el ensayo in vivo / in vitro todos miden la fraccin de clulas supervivientes; es decir, que son ensayos clonognicos. Ellos requieren menos animales y por lo tanto son ms eficientes que el marcador de curacin del tumor o retraso en el crecimiento. Los tres ensayos requieren, sin embargo, que una suspensin de una sola clula se prepar a partir del tumor, y esto puede resultar en artefactos*En consecuencia, los xenoinjertos de clulas tumorales humanas no son mucho ms vlido que los tumores murinos para cualquier estudio en el que el aporte vascular juega un papel importante. Por ejemplo, el p.356fraccin de clulas hipxicas en xenoinjertos es mucho el mismo que en tumores de ratn *Figura 20.8 La correlacin entre la respuesta de xenoinjertos de tumores humanos y tasas de remisin completa clnica a la quimioterapia . La ordenada es el retraso en el crecimiento observado en nueve y cincuenta y siete lneas de xenoinjertos tratados con los frmacos utilizados clnicamente que resultaron ms eficaces en los xenoinjertos . ( Acero GG : Qu tan bien xenoinjertos de mantener las caractersticas de respuesta teraputica del tumor fuente en el paciente donante En Kallman RF [ ] : ? . Roedores tumores en Experimental del Cncer Terapia Nueva York , Pergamon , 1987 , con permiso.

resume la correlacin entre el retraso del crecimiento en el xenoinjerto y la remisin clnica del paciente donante. En la figura, el retraso en el crecimiento en xenoinjertos para una mxima tolerada tratamiento con los agentes quimioteraputicos individuales que estn en uso clnico comn contra la enfermedad se representa frente a la tasa de respuesta clnica completa para esa categora de tumor. La correlacin entre estos parmetros es bueno. Los tumores testiculares son los ms sensibles en xenoinjertos o en la clnica; smallcell cncer de pulmn y los tumores de mama ocupan una posicin intermedia; y los otros tres tipos de tumores no responden, ya sea clnicamente o experimentalmente. Esta consistencia de acuerdo entre las respuestas del paciente y de xenoinjertos a los agentes quimioteraputicos es alentador para una variedad de tipos de tumores humanos probados. *clulas asncronas aerbicos en bicicleta, acclicas clulas - G1 como gaseosas , y acclicas clulas hipxicas - G1 similares. Muy grandes esferoides pueden contener aproximadamente 20 % de clulas hipxicas , similar a muchos tumores de animales. Por trypsinizing suavemente los esferoides durante perodos de tiempo variables , el esferoide puede ser pelado como una cebolla y estas tres poblaciones de clulas separa. esferoide de 800 micras que contiene aproximadamente 8 104 clulas.

*Slo si se forma el esferoide y crecido a un tamao determinado puede ser transferido a un recipiente de cultivo spinner y se cultiv de la misma manera comoFIGURA 20.10 Microfotografa de un corte transversal esferoide . Tenga en cuenta el rea de necrosis central. El esferoide se cultiv durante 15 das y fue 520 micra de dimetro; el borde viable tena un espesor medio de aproximadamente 200 micras . (Cortesa del Dr. R. M. Sutherland. )*En todos los sistemas trasplantables descritas, el tumor se trata in situ, con todo el realismo y la complejidad del entorno in vivo , tales como clula a contacto celular y la presencia de clulas hipxicas , factores que no se pueden simular plenamente en una placa de Petri .

2. Aunque este paso no parece afectar a la evaluacin de los efectos de la radiacin, que puede resultar en artefactos en el caso de otros agentes, tales como frmacos quimioteraputicos o la hipertermia, en el que la membrana celular puede estar implicada en la respuesta celular.3. Por esta razn, en las pruebas y evaluacin de un nuevo frmaco, un sistema de tumor que implica la determinacin de retraso en el crecimiento o TCD50 siempre est incluido. Por la misma razn, estos mismos sistemas son muy caros debido a que requieren un gran nmero de animales para la cantidad de informacin producida.4. Sin duda, es el ms caro; para producir un solo valor TCD50 para una de las lneas en la figura 20.3, de seis a ocho grupos de hasta diez animales deben ser mantenidos y observados durante semanas. La misma informacin se puede obtener en 10 das con uno o dos ratones y seis placas de Petri utilizando la tcnica vivo / in vitro en.5. Es, tambin, es relativamente caro, porque todo un grupo de animales receptores debe ser utilizado y se mantuvo durante semanas para obtener la misma informacin obtenida a partir de una placa de Petri.6. La desventaja concomitante es que cualquier tumor que se puede cambiar de placa de Petri de animal en vas alternas es tan indiferenciado y anaplsico que se parece muy poco a un tumor espontneo en el ser humano.

FIGURA 20.11 tumores trasplantables en pequeos animales de laboratorio han proporcionado datos cuantitativos invaluable , pero han tambin " nos llev por el sendero del jardn " en varias ocasiones. Tumores trasplantables tienden a ser de crecimiento rpido, indiferenciada , y altamente antignica y se cultivan como tumores encapsulados en el msculo o debajo de la piel , no en sus sitios de origen . Por todas estas razones , son muy artificial, y la atencin se deben utilizar en la interpretacin de resultados.Esferoides son mucho menos costosos que los xenoinjertos en animales inmunosuprimidos y realizan la misma funcin.

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