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Tema 4: Estudio seminal

4.1 Estudio seminal bsico

1. Estudio macroscpico: Volumen, licuefaccin, pH, viscosidad y color.

2. Estudio microscpico: Movilidad, recuento, presencia de otras clulas, aglutinacin, vitalidad y

morfologa.

4.2 Estudio seminal complementario

1. Capacitacin espermtica o Recuperacin de Espermatozoides Mviles (REM)

2. Test de fragmentacin de ADN en los espermatozoides

3. Test de separacin espermtica magntica por columnas de Anexina (MACS)

4. FISH en espermatozoides

5. Estudio bioqumico

6. Cultivo seminal

4.3 Congelacin del semen

4.1 Estudio seminal bsico

El objetivo es determinar el potencial frtil mientras que el estudio complementario nos permite

seleccionar aquellos espermatozoides de mayor calidad. El estudio bsico del semen se llama

seminograma. Es una prueba que permite evaluar la calidad del semen con la finalidad de determinar la

fertilidad del varn y detectar problemas de esterilidad.

La muestra de semen debe obtenerse por masturbacin y se debe entregar en un recipiente estril. La

muestra se obtiene tras un proceso de abstinencia de 2-5 das. No debe ser sometida a grandes

temperaturas y deber entregarse en el laboratorio antes de una hora de su entrega. No obstante, hay

otra forma de recogida del semen: por fracciones. El semen tiene dos fracciones: La primera

corresponde a la secrecin de las glndulas bulbouretrales, las prostticas y los testculos y epiddimo por

lo que est muy concentrada en espermatozoides y tiene un pH relativamente alcalino (6,5). Contiene

anticuerpos anti-espermatozoides en caso de que haya una enfermedad de tipo inmune que ataque los

espermatozoides. La segunda fraccin tiene un pH ms alto y tiene menor cantidad de espermatozoides.

Cuando la esterilidad es de tipo autoinmune se recoge el semen por este mtodo. Hay una tercera forma

que se utiliza en caso de eyaculacin retrgrada. En estos casos, el semen en vez de salir de la uretra

sube hacia la vejiga urinaria y el pH de la orina es cido y contiene urea, de tal manera que afecta a los

espermatozoides. El procedimiento de recogida consiste primero en hacerles orinar, luego eyacular y si se

puede recoger la muestra. Por ltimo, se recoge una muestra de orina posteyaculacin, siendo sta la

fraccin ms importante. Los espermatozoides que se recogen rpidamente se alcalinan para que la orina

no los perjudique. El paciente podra haber llevado una dieta alcalina (bicarbonato sdico) durante unos

das antes de recoger la muestra.

1. Estudio macroscpico.

La muestra debe tener un volumen superior a 1,5

ml. Por otra parte, cuando se eyacula, el semen es

un cogulo pero a temperatura ambiente a los 15

min ya es un lquido homogneo. Esta propiedad

se denomina licuefaccin. Cuando llega al

laboratorio (en torno a la hora) debe ser as; si no

la tiene, se ha de informar. El color tambin es

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importante, porque si tiene un color rosceo es indicativo de presencia de hemates y fallo renal. Si es

muy blanco habr muchos leucocitos y puede deberse a una infeccin. Se ha de evaluar tambin la

consistencia o filancia y el pH, que debe ser superior a 7,2. La consistencia se mide con una pipeta

Pasteur: Se toma una muestra de semen y se va dejando caer gota a gota. Debe aparecer entre gota y gota

un filamento que no sea mayor a 2 cm. Si es muy lquido, la filancia es baja y si es muy denso, la filancia es

alta.

2. Estudio microscpico.

a) Movilidad espermtica.

El semen debe llegar antes de la hora desde su obtencin al laboratorio. Se coloca una gota en un porta, se

cubre y se mira al microscopio con un objetivo de 40x. Se observa si la muestra se ha distribuido de forma

homognea por toda la placa; si esto no ocurre se ha de volver a homogeneizar para evitar errores.

Particularmente se observa la parte central del cubre. Los espermatozoides se clasifican segn el grado de

movilidad: inmviles (no se mueven), movilidad no progresiva (se mueven poco, de forma circular y en

crculos pequeitos) y movilidad progresiva (se mueven y desplazan, bien de forma lineal o concntrica

pero en crculos grandes). Cuando la movilidad progresiva es superior al 32% o bien la suma de la

movilidad progresiva o no progresiva es superior al 40% se dice que el semen es normal. Hay que tener

en cuenta que los criterios de normalidad estn establecidos con respecto al recuento de semen en el

cuello uterino; no con respecto a mediciones directas del semen en laboratorio.

b) Recuento de espermatozoides.

Se puede expresar por millones de espermatozoides por ml de semen o millones de espermatozoides en

el eyaculado total. Para hacer recuento se realizan dos tipos de cmara: cmara de Neubauer y cmara de

Makler. La cmara de Neubauer es un porta que tiene un prisma y dos cuadrculas, una para cada

muestra. Al microscopio, al observar esas cuadrculas vemos una serie de cuadrados grandes, a su vez

divididos en 16 ms pequeos. Cada lado del cuadrado grande mide 1 mm, el rea del cuadrado es 1 mm2,

y al ser su altura de 0,1 mm, su volumen de 0,1 mm3.

El primer paso es diluir la muestra de semen con suero salino (con cloruro sdico al 0,9% o solucin

salina y formol al 35% porque el formol inmoviliza los espermatozoides y permanecen en la ventana de

observacin). La dilucin normal es 1:20 (pero puede oscilar de 1:10 hasta 1:100).

Cuadrado 1

rea = 1 mm x 1mm = 1 mm2

Volumen = 1 mm2 x 0,1 mm = 0,1 mm3 =

1 x 10-4 ml

Cuadrado 3

rea = 0,2 mm x 0,2 mm = 0,04 mm2

Volumen = 0,04mm2 x 0,1 mm = 4 x 10-3

mm3 = 4 x 10-6 ml

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Si la cantidad de espermatozoides es mucha, en vez de observarlos en los cuadrados blancos de las

esquinas, se observa el cuadrado central, que est dividido en 25 cuadrados medianos y cada cuadrado

mediano est dividido en 16 cuadraditos. Contamos los espermatozoides que estn en el cuadrado

mediano, que tiene un lado de 0,02 mm3. El rea es por tanto, 0,04 mm2 y al ser la altura 0,1 mm, el

volumen es 4 x 10-3 mm3.

En cualquier caso, se cuentan los espermatozoides en cada cuadrado y se calcula el volumen que tiene el

cuadrado y ya se tiene el recuento de espermatozoides. El espermatozoide se contabiliza en el cuadrado

donde se encuentra la cabeza y siempre se contabilizan espermatozoides completos; no vale si solo tienen

cabeza o cola. Tambin puede pasar que la cabeza del espermatozoide se encuentre en la lnea que separa

dos cuadrados. En este caso: Si un espermatozoide se ubica sobre la lnea que divide dos cuadrculas

adyacentes, debe ser contado solamente si est en la lnea inferior o hacia la lnea del lado izquierdo de la

cuadrcula a ser evaluada. El clculo de la concentracin de clulas se puede expresar as:

Partculas / l = (partculas contadas) / [(superficie contada (mm)profundidad de la cmara(mm) ] dilucin

Hay otro tipo de cmara que se utiliza especficamente para espermatozoides: Cmara de Makler. Tiene

un volumen total de 0,01 l y la retcula est formada por 100 cuadrados. El lado de un cuadrado grande

tiene un 1mm; la altura es de 0,01 mm. El espacio limitado en una fila de 10 cuadrados es exactamente

una millonsima parte ml. Por lo tanto, el nmero de cabezas de espermatozoides en 10 casillas indica su

concentracin en millones/ml.

En este caso, se consideran los valores normales (es decir, que el semen es frtil) cuando:

La concentracin de espermatozoides es > 15 106 /ml de semen.

El nmero total de espermatozoides en el eyaculado es > 39 106 /eyaculado.

c) Presencia de otras clulas.

En el semen se pueden encontrar otras clulas aparte de espermatozoides. Puede haber clulas epiteliales

pero estas no suponen problema alguno. Si las clulas son redondeadas hay que identificar si son tipo

leucocitos o bien clulas espermatognicas. Para diferenciarlas, basta con teirlas. Tambin se pueden

encontrar clulas anucleadas redondas (son restos de clulas procedentes del epitelio seminfero). Si hay

leucocitos (no puede haber ms de 1 milln) o hemates hay que informarlos. Los hemates se diferencian

muy bien por la doble membrana.

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d) Aglutinacin.

Se da aglutinacin siempre que los espermatozoides mviles estn movidos entre s cabeza-cabeza, cola-

cola o cabeza-cola. Esto es importante informarlo porque cuando es superior al 40% es indicativo de una

posible patologa autoinmune. Si un espermatozoide se encuentra unido a una clula, es agregacin, no

aglutinacin, es decir, no es indicativo de presencia de anticuerpos.

e) Vitalidad.

Es el porcentaje de espermatozoides vivos y mviles. Es importante porque nos permite determinar si los

espermatozoides no se mueven porque son inmviles o porque estn muertos. Segn la OMS, el

porcentaje de espermatozoides vivos debe ser superior al 58%.

Hay varios test para medir la vitalidad, pero los ms usados son los siguientes:

Tincin vital con eosina: Un espermatozoide vivo tiene la membrana ntegra mientras que los

muertos tienen agujeros. Una serie de colorantes ntegros son incapaces de entrar en los

espermatozoides vivos. Con un objetivo de 40x, contabilizamos el porcentaje de espermatozoides

teidos (muertos).

Prueba hipoosmtica: Un espermatozoide vivo tiene una membrana semipermeable y si se

introduce en un medio hipoosmtico se hincha. Por tanto, aquellos que no se hinchen, estn

muertos.

f) Morfologa.

Se toma una gota de semen, se coloca en un porta y se realiza una extensin con la punta de la pipeta. Se

emplea un fijador, un colorante cido que tie las partes bsicas del espermatozoide y un colorante bsico

que tie el ncleo. Se lava, se deja secar y se examina al microscopio con un objetivo de 100x.

La morfologa normal se caracteriza por lo siguiente:

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No hace falta especificar concretamente la alteracin, simplemente comentar el porcentaje de

espermatozoides que tienen la zona de la cabeza, intermedia o cola alterada. Segn la OMS, si ms de un

4% de los espermatozoides presenta una morfologa normal es aceptable la muestra.

NOTA: En las diapositivas, como curiosidad hay una tabla con los valores adecuados segn la OMS para

los parmetros nombrados.

A continuacin se adjunta una tabla con la nomenclatura correspondiente a algunas de las alteraciones

que hemos comentado:

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4.2 Estudio seminal complementario

1) Capacitacin espermtica o Recuperacin de Espermatozoides Mviles (REM)

Esta capacitacin es a nivel de laboratorio y se refiere a seleccionar aquellos espermatozoides que tienen

mejor movilidad y mayor velocidad (no confundir con la capacitacin fisiolgica del tema anterior). Es

ms correcto referirse a esta tcnica como Recuperacin de Espermatozoides Mviles (REM) para evitar

confusin porque no podemos asegurar que la poblacin de espermatozoides seleccionada se encuentre

capacitada y sea capaz de fertilizar un ovocito. Nos centraremos en dos tcnicas: Se suele utilizar swim-

up cuando se trata de muestras normosprmicas (cantidad normal de espermatozoides), pero que an

as no se consigue que se d el embarazo y el mtodo en gradiente cuando son oligosprmicas

Mtodo de migracin (swim-up): Se emplean medios tamponados y sumplementados con

albmina y antibitico (HTF).

Se basa en que aquellos espermatozoides que presenten ms movilidad van a ser capaces de subir al

sobrenadante. Se tiene la muestra de semen y se la evala mediante recuento y movilidad. A continuacin

se realiza el swim-up: Se diluye el mismo volumen de semen y medio tamponado. Esta mezcla se alicuota

en 4 tubos que se centrifugan (con el objetivo de lavar el semen) a pocas revoluciones durante 10 min.

Con cuidado se retira el sobrenadante a cada tubo y se desecha. Otra vez se aade medio a cada tubo con

mucho cuidado por las paredes del tubo para no mezclar el sedimento del espermatozoide. Se deja

incubar a 37 en estufa y un porcentaje de CO2 del 5% (condiciones de la vagina) de forma inclinada

durante 1 o 2 horas. Al inclinar el tubo a 45, los espermatozoides ms mviles ascienden al

sobrenadante. Con ayuda de una pipeta Pasteur, recogemos ese sobrenadante constituido por

espermatozoides mviles (capacitados). Los sobrenadantes de los tubos se mezclan y se valoran los

parmetros establecidos.

Mtodo de centrifugacin en gradientes de densidad: Se emplean medios con gradiente de

densidad.

Se utilizan soluciones de distinta densidad y los espermatozoides ms mviles van a ser capaces de

atravesar las soluciones de mayor densidad. Se toma la muestra de semen y se valora. En un tubo cnico

se colocan dos soluciones de densidad distinta (la solucin ms densa, al 80%, se pone primero y encima

la otra solucin, al 40%) y finalmente el semen. Al centrifugar los espermatozoides se irn al fondo, pero

aquellos ms mviles podrn atravesar las capas ms densas. En la parte superior queda el plasma

seminal, luego espermatozoides inmviles y restos celulares, a continuacin espermatozoides algo ms

mviles y en el fondo del tubo cnico los espermatozoides ms mviles. Con una pipeta Pasteur, se

extraen los espermatozoides mviles del fondo.

Los espermatozoides recuperados se evaluarn en la cmara:

1. concentracin (millones/ml)

2. El % de espermatozoides movilidad progresiva (PR)

3. se calcular el REM segn la frmula:

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Los resultados de la evaluacin sirven para determinar qu tipo de tcnica de inseminacin es ms

adecuada utilizar:

Inseminacin artificial con semen del cnyuge

Fecundacin in vitro

Inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides

Si el recuento espermtico es muy bajo no podremos capacitar la muestra y se emplea el mtodo de

centrifugacin y concentracin.

Si la muestra es una biopsia testicular se recoge en una placa de Petri con medio tamponado el tejido

testicular y se dilacera con dos portas estriles. Luego se busca la presencia de espermatozoides mviles.

En caso de que no haya, lo comunicaremos al urlogo para que tomen nuevas muestras de distintas zonas

o del otro testculo y si se confirma, se realiza estudio anatomopatolgico. Si encontramos

espermatozoides dividiremos la muestra en dos fracciones:

la 1 se congela y se conserva para utilizar ms adelante si fuera necesario (centrifugacin y

resuspensin e igual protocolo que el semen)

la 2 para microinyectar los vulos obtenidos (centrifugacin y resuspensin)

2) Test de Fragmentacin del ADN Espermtico

La fragmentacin del ADN espermtico es una de las alteraciones que afecta al gameto masculino y est

relacionado con defectos genticos. Se relaciona principalmente con problemas en la implantacin y el

desarrollo embrionario, es decir, puede haber fecundacin, pero el embrin no progresa; hay aborto. Este

test se realiza a parejas con antecedentes de varios abortos. Las causas de la fragmentacin son:

a) Produccin excesiva de radicales libres en las clulas del epiddimo que daan el ADN.

b) Se produce una maduracin incorrecta de los espermatozoides en el epiddimo (no se condensa

bien, etc).

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c) Fallo en el mecanismo de apoptosis durante la espermatognesis. Al fallar a apoptosis, no se

eliminan aquellos espermatozoides con ADN fragmentado.

d) Causas externas: Radio y quimioterapia, enfermedades inflamatorias, exposicin a altas

temperaturas.

El vulo en ocasiones puede reparar el dao, pero depende del porcentaje de ADN fragmentado, de la

lesin, etc.

Hay varias tcnicas, pero nos centraremos en la SCD (tcnica de dispersin de la cromatina

espermtica, Halosperm). Se incuban los espermatozoides en un medio cido y desnaturalizante. El

medio libera las protenas del ADN, la molcula compactada se desenreda y tambin se rompe la

membrana. Si el ADN no est fragmentado, las hebras de ADN quedan como una maraa deshilachada (en

este caso medimos el halo de dispersin) y si est fragmentado, los fragmentos de ADN se dispersan y

no queda casi halo. Se ha de calcular el porcentaje de ADN fragmentado y no fragmentado. Si el

porcentaje de espermatozoides es mayor del 30% es patolgico. La desventaja es que al haber teido la

muestra, los espermatozoides no fragmentados no se pueden recuperar. Solo sirve para diagnstico.

3) Tcnica de Separacin Espermtica por Columnas de AnexinaV (MACS)

Esta tcnica permite eliminar aquellos espermatozoides que se encuentren en pre-apoptosis y apotosis

(con ADN fragmentado), seleccionando los espermatozoides sanos. Se utilizan unas bolas magnticas

acopladas mediante una molcula de anexina V a un anticuerpo anti-fosfatidilserina. Al incubar las bolas

magnticas con semen, los espermatozoides en pre-apoptosis y apoptosis que expresan fosfatidilserina

en el exterior por la rotura de la membrana quedan pegados a las bolas. Si ahora eluyes la muestra por un

tubo sometido a un imn las bolitas son captadas y recuperas solo espermatozoides sanos.

4) FISH de Espermatozoides

Es una tcnica de anlisis citogentico que consiste en marcar, con sondas de ADN fluorescente,

cromosomas especficos en el ncleo de los espermatozoides en estadio de interfase. Al observarlo al

Microscopio de Fluorescencia vamos a poder determinar si la dotacin cromosmica es correcta.

Actualmente se estudian los cromosomas 13, 14, 18, 21, X e Y. Hay dos tipos de sondas: centromricas o especficas del locus (se suelen utilizar para los cromosomas 13 y 21).

a. Haploide normal: si aparece una seal nica para cada cromosoma analizado.

b. Dismico: presentan dos seales para un cromosoma concreto y una seal para el resto de

cromosomas analizados.

c. Diploide: si presenta dos seales para cada cromosoma analizado.

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4.3 Congelacin del semen

Los espermatozoides se congelan en N2 lquido para que no pierdan su capacidad fecundante, aunque al

descongelar si es cierto que pueden perder algo de movilidad. Los medios crioprotectores son medios

isotnicos con el plasma seminal, buena capacidad amortiguadora y pH en torno a 7. Hay dos tipos de

medios:

Medios penetrantes (DMSO, metanol): Entran dentro del espermatozoides e intercambian el

medio por el agua del interior, expulsando esta.

Medios no penetrantes (glicerol, yema de huevo): Recubren el espermatozoide con una

pelcula, protegindolo de la formacin de cristales.

b)

a)

c)

b)