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TEMA 4: MULTIPLICACIÓN VEGETATIVA, VARIACIÓN SOMACLONAL Y

PRODUCCIÓN DE HAPLOIDES

1. Totipotencia, competencia y determinación

2. Etapas de la micropropagación

1. Multiplicación del tejido

2. Enraizamiento "in vitro"

3. Ventajas y desventajas de la micropropagación

4. Variación somaclonal. Definición

5. Factores que influyen en la aparición de variación somaclonal

6. Aspectos prácticos de la variación somaclonal

7. Métodos de obtención de haploides

8. Androgénesis

9. Ginogénesis

10. Otros métodos de obtención de haploides

11. Desventajas del cultivo de haploides

1. TOTIPOTENCIA, COMPETENCIA Y DETERMINACIÓN

• Los procedimientos de multiplicación vegetativa de las plantas son extremadamente

variados.

• En principio se puede hablar de tres tipos básicos:

• Estaquillado (Cortar un trozo, generalmente de la base de la planta, y lo metemos en

la tierra y así se obtiene una planta nueva),

• acodo (Tenemos una rama de una planta, la enterramos en tierra, pero todavía

pegada a la planta madre, entonces cuando ya enraíza la cortamos de la planta madre

y ya tenemos una planta nueva).

• e injerto (tenemos un trozo de planta que está enraizada en el suelo y que está viva.

Cortamos una parte del tronco principal y en esa incisión introducimos una nueva

rama de la planta que a nosotros nos interesa. Por lo tanto, tendría la raíz de la

planta vieja y a partir de ahí sería planta nueva),

• Pero dentro de ellos hay infinidad de posibilidades.

• La finalidad de la multiplicación vegetativa es obtener plantas genéticamente

idénticas con respecto a la planta materna y también entre sí, que si se cultivan

en condiciones iguales darán lugar a un mismo fenotipo básico.

• Es especialmente útil en fruticultura y jardinería (plantas ornamentales).

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Así pues, a partir de una planta madre, con la multiplicación vegetativa vamos a obtener

clones de ésta.

Totipotencia

Cada célula de la planta, con la condición de que mantenga su núcleo intacto, es capaz de

regenerar a partir de cualquier célula de la planta, una planta completa. El que formen unos

órganos u otros depende de las condiciones del cultivo y fundamentalmente de la

concentración y tipo de reguladores del crecimiento.

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Ilustración 1. Dependiendo de la procedencia de la epidermis vamos a obtener un tipo de planta u otro:

Si cogemos epidermis de las yemas florares y la metemos en un medio de cultivo, vamos a

obtener solamente yemas florales.

Si procede de la zona subfloral o de la zona media vamos a obtener ramas florales o ramas

vegetativas. En la zona SFZ vamos a obtener más ramas florales porque está más cerca de las

yemas florales. En cambio, en la zona M obtendremos más ramas vegetativas porque está más

cerca de la zona basal.

Si procede de la zona basal vamos a obtener sólo ramas vegetativas.

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Determinación

• Las células vegetales están determinadas, es decir, en virtud de su posición y del

estadio fisiológico de la planta, tendrán un patrón de desarrollo u otro.

• La determinación en las plantas es progresiva y jerárquica. Las plantas están tanto

más determinadas cuanta más edad tienen.

• Cuando para iniciar un cultivo in vitro utilizamos un tejido en un estado

temprano de su desarrollo los cultivos que se obtengan serán más flexibles

para inducir cualquier tipo de órgano

• Los cultivos iniciados a partir de tejidos adultos tienen un destino

prácticamente fijado, porque es un tejido especializado.

• Por lo tanto, a la hora de tomar un esqueje para enraizarlo, es mucho más

fácil que forme raíces si se trata de un tallo joven.

• Células determinadas son aquéllas en las que ya está fijada su futura

diferenciación hacia un fenotipo funcional y anatómico característico, es decir, en

virtud de su posición y del estadio fisiológico de la planta, tendrán un patrón de

desarrollo u otro.

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Los genes y sus productos moldean la ladera genética por la que discurren las

diversas rutas de diferenciación

Competencia

La competencia es un estado de reactividad transitorio de las células, durante el cual se

les puede inducir a la determinación.

P. Ej. Si ponemos en un mismo medio de cultivo dos tipos de explantos diferentes

de Nicotiana: tejidos cercanos al tallo floral o alejados de él,

los primeros darán tallos con flores: Esto se debe a que los tejidos próximos al

tallo floral estaban en un estado de competencia que les permite producir flores en un

medio adecuado

y los segundos darán tallos con hojas: los más alejados no habían alcanzado ese

estado de competencia y por tanto, aunque se pongan en condiciones externas para

florecer no lo harán. Este patrón se puede cambiar.

Una célula está en estado de competencia cuando tiene capacidad para diferenciarse y

seguir un determinado patrón de desarrollo, es decir, alcanzar una función o forma

particulares.

Es el proceso que conduce a la formación de órganos in vitro a partir de un explanto

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Ilustración 2. Tenemos un disco de hoja de Convolvulus por lo tanto es un tejido especializado. Vamos

a meter estos discos de hoja en 3 medios de cultivo: de inducción de tallo, raíz o callo y los vamos tener

entre 3 y 5 días. A partir de ahí cada una de estas células de los discos van a desarrollar un estado de

competencia. Los que hallan estado metidos en medio de tallo van a ser competentes para inducir tallo,

los del medio de raíz han desarrollado competencia para inducir raíz, etc. Si luego lo pasamos a un

medio de cultivo de inducción de tallo, de raíz, entre 10 y 14 días, en este tiempo pasan del estado a

competencia al estado de determinación. De manera una vez pasados estos días, los que han estado en

medio de inducción de tallo, cualquiera que sea el medio de cultivo empleado siempre va a dar tallo.

Una vez que la célula está determinada, se deben poner en un medio de desdiferenciación para estar en

el punto inicial.

2. ETAPAS DE LA MICROPROPAGACIÓN

I. Selección y preparación del explanto

i. Genotipo

ii. Edad

iii. Tipo de explanto

iv. Estado fenológico

v. Historial previo de la planta madre

vi. Tamaño del explanto

II. Establecimiento de un cultivo aséptico

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III. Multiplicación del tejido

IV. Enraizamiento "in vitro" y preparación para la transferencia

V. Transferencia a condiciones "ex vitro"

2.1. Multiplicación del tejido

El objetivo de esta etapa es aumentar el numero de plantas a partir de un fragmento

inicial.

Para ello, el explanto inicial se puede subcultivar y lo normal es hacerlo entre 2 y 6

veces.

Nunca superar los 6 subcultivos porque un número mayor de subcultivos puede dar lugar

a la aparición de modificaciones genéticas con respecto al material inicial que afectarán

al genotipo final.

Actualmente la multiplicación asexual mediante las técnicas de cultivo in vitro se puede

lograr mediante dos vías distintas:

– a) Organogénesis. Conduce a la diferenciación de meristemos caulinares y/o

radiculares (estructuras que darán origen a tallos y raíces adventicias

respectivamente).

– b) Embriogénesis somática. Da lugar a la formación de embriones no cigóticos, es

decir, estructuras bipolares con un eje tallo/raíz, un embrión somático que pasa por

estadios muy semejantes a los de la embriogénesis cigótica.

En cualquiera de las rutas que hemos mencionado se pueden distinguir dos modelos de

desarrollo:

I) Directo. Los órganos se originan directamente a partir de un explanto que

puede proceder de cualquier parte de la planta.

Este modelo es el que se debe seguir cuando se quiere establecer una línea clonal,

es decir, obtener una gran cantidad de plantas genéticamente idénticas a la planta

madre.

II) Indirecto. A partir de un explanto se induce la formación de un callo y

posteriormente, a partir del callo, se forman órganos o embriones somáticos.

Este modelo es útil para la obtención de variantes somaclonales que pueden

resultar prácticos desde el punto de vista agrícola o de la investigación. Los

variantes aparecen como consecuencia de mutaciones y modificaciones en el grado

de ploidía de las células, debidas a las propias condiciones de cultivo.

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Organogénesis

Consiste en el desarrollo de yemas preexistentes o nueva formación de yemas de tipo

adventicio. Ocurren en tres fases: desdiferenciación, inducción y diferenciación.

Desdiferenciación: Para aumentar capacidad de división y plasticidad. En esta fase ocurre

lo siguiente:

o Activación de la expresión de nuevos genes.

o Inhibición de la expresión de determinados genes.

o Multiplicación celular que conduce a la formación de “meristemoides” (células de

pequeño tamaño, vacuola pequeña, pared celular delgada, núcleo y citoplasma que se

tiñen densamente etc)

Da lugar a células competentes

Inducción: Estímulos físicos y/o químicos modifican el proceso de desarrollo y por tanto la

morfogénesis. A partir de células competentes vamos a poder inducir cualquier órgano.

Termina cuando las células quedan determinadas

Diferenciación: Comienza a formarse el órgano a partir de una o varias células

Organogénesis directa

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Lo que se hace es multiplicar tallos a través de:

o La formación nueva de yemas adventicias.

o A partir del desarrollo de yemas preexistentes: Segmentos nodales o

yemas axilares.

Una yema adventicia es toda aquélla que no está en la axila de una hoja o en el ápice del

tallo

En algunas plantas las yemas adventicias se forman de modo natural a partir de órganos

como raíz (algunos clones de manzano), bulbos (el jacinto cuando sufre una herida en la

base) y hojas (begonia, geranio, violeta africana).

En estos casos el cultivo in vitro puede servir para multiplicar las plantas de modo

considerable. (1)

En las plantas en las que el fenómeno no ocurre de modo natural, se puede inducir

mediante una combinación adecuada de hormonas, siempre que se seleccione un explanto

apropiado

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Ilustración 3. Esquema que muestra un ejemplo de organogénesis directa mediante la formación de

yemas adventicias en hoja de crisantemo. B = medio MS con AIA (2 mg/l) y benciladenina (1.25

mg/l). C = medio MS sin hormonas.

(1) . Como ejemplo, se cita con frecuencia el caso de Begonia hiemalis ya que a partir de un

único segmento de hoja joven de 7 X 7 mm se han conseguido obtener 100 billones de

plantas en un sólo año. Es un método que ha tenido mucho éxito en especies de conífera.

Cuanto más joven es el explanto mayor es la posibilidad de inducir yemas adventicias.

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¿Cuál es la combinación hormonal más adecuada? Normalmente se necesita la presencia de

alguna citoquinina y a veces también auxinas, aunque en ocasiones estas facilitan la

formación de callo.

o BA (Benciladenina o Bencilaminopurina) suele funcionar mejor que kinetina o 2ip incluso

utilizando una concentración menor.

o En general, mayor concentración cuanto más viejo sea el explanto porque tiene menos

capacidad de regeneración. Quizás más importante que la propia concentración de

citoquinina sea su relación con respecto a la auxina.

o En este sentido, se recomienda que la relación auxina:citoquinina sea de 1:10

Algunos casos requieren un especial cuidado a la hora de seleccionar el explanto.

En algunas variedades de geranio el aspecto se debe a la presencia de quimeras

genéticas, es decir, no todas las células tienen la misma composición genética.

Si el explanto procede del meristemo, la quimera se mantiene, pero si lo que se toma

como explanto es un fragmento de peciolo ésta desaparece.[1].

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[1] Cuando hablemos del tema del cultivo de meristemos para la obtención de plantas

libres de virus, veremos como en estos casos desaparecen algunas de las cualidades

fenotípicas de la planta ya que éstas se deben a la presencia de virus.

Organogénesis indirecta a través de callo

• Callo = masa irregular de células que difieren ampliamente en cuanto al grado de

diferenciación y tamaño de células

• Llamamos inducción de callo al proceso que conduce a su formación. Son muchas

como veremos, las aplicaciones de los cultivos in vitro que requieren como primera

etapa la formación de callo:

• Aislamiento de protoplastos

• Generación de variedad somaclonal

• Organogénesis

• Embriogénesis somática

• Cultivos celulares

• Producción de metabolitos secundarios

• Los callos se suelen formar en la naturaleza en respuesta a heridas. In vitro, no

todas las células del callo son capaces de expresar totipotencia y por tanto de

regenerar órganos o embriones.

• En el caso que nos ocupa serán el punto de partida para formar órganos:

• normalmente primero el brote y después las raíces, hasta regenerar una

planta completa.

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La organogénesis indirecta a través de callo tiene un serio inconveniente desde el punto

de vista de la micropropagación:

– En los tejidos de callo se produce inestabilidad cromosómica, debido a su tendencia

a doblar el número de cromosomas o a perder cromosomas individuales, es decir,

cambios genómicos que pueden resultar ser útiles de cara a seleccionar células que

puedan presentar características de interés, pero que en este caso son perjudiciales

ya que como hemos dicho, de lo que se trata es de obtener muchas plantas idénticas

a una planta madre de características conocidas.

– Si tantos inconvenientes hay ¿Por qué se usa? Porque en algunas especies es el único

método que funciona. Como consecuencia de sus irregularidades genéticas y

morfológicas, la mayoría de los callos regeneran plantas anómalas.

Casi todos los callos van a generar plantas distintas que la planta madre (aclarar que el que

sean distintas no significa necesariamente que sean peores, sino que pueden ser mejores).

La organogénesis indirecta presenta las siguientes etapas:

a) Inducción de callo

El callo se forma en ocasiones espontáneamente pero lo más normal es que se requiera

un aporte exógeno de hormonas que dependiendo de la planta y del tipo de explanto

puede ser de:

– Sólo auxinas:

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es el caso de las monocotiledóneas.

2,4 -D y 2,4,5 -T, son muy eficaces para la inducción de callo.

– Ej para formar callo de arroz se suele utilizar embriones maduros o

inmaduros y tan sólo 2,4-D en una concentración de 3.5 mg/l

– Ej. Para obtener callo a partir de hoja y tallo de kiwi se utiliza medio MS con

reducciones en la concentración de macronutrientes, a la mitad. Como

hormona se adiciona AIA, 2 mg/l

– Auxinas y citoquininas:

– Ej para obtención de callo a partir de plántula de zanahoria, "flores" de

brócoli, y raíz de zanahoria se suelen utilizar 0.1 mg/l de kinetina y 0.3

mg/l de 2,4-D.

– Para formar callo a partir de hipocótilo de plántula de girasol se utilizan 1

mg/l de 2iP y 0.1 mg/l de ANA

Las temperaturas altas (entre 22 y 28 ºC) suelen favorecer el proceso. Casi

siempre se suele hacer en condiciones de oscuridad.

A medida que el callo se va multiplicando la competencia de las células se va perdiendo y al

final se llega a perder por completo.

Una vez obtenido el callo es conveniente optimizar

– la relación masa de callo/volumen de medio,

– tiempo de repicado, es decir, cuándo lo tenemos que pasar a otro medio

– y condiciones ambientales.

la competencia organogénica se va perdiendo a medida que el callo se repica hasta llegar

a perderla por completo.

b) Organogénesis (Formación de órganos)

En las células del callo puede haber diferencias en cuanto a la coloración, grado de

vacuolización grado de compactación, etc.

La siguiente fase sería la de inducir la formación de órganos a partir del tejido de callo.

– Lo normal es que primero se induzca la formación de tallo y luego la de raíz.

Para facilitar la formación de brotes se utilizan medios ricos en citoquininas (BA suele

funcionar muy bien) y pobres en auxinas.

– En el caso del kiwi, se pasa a un medio MS normal con citoquininas de 3 tipos: IPA

(0.1 mg/l), kinetina (0.1 mg/l) y BAP (0.1 mg/l).

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– En cereales se pueden inducir organogénesis al pasar el callo a un medio carente de

auxinas o sustituyendo 2,4-D por AIA o ANA

Parece que una disminución de la concentración de NH4+ tiene efecto estimulador

Se suelen utilizar concentraciones altas de sacarosa (40 g/l en el caso del kiwi frente a

los 25 g/l que se utilizaban para inducir el callo)

En el callo se pueden distinguir a simple vista y mejor a la lupa, las agrupaciones de

células que darán lugar a la formación de un brote.

– Presentan un aspecto semejante al de las células del cambium y se agrupan formando

lo que se conoce como masas embrionarias o nódulos.

– En estos nódulos comienzan a aparecer células traqueales en lo que es un rudimento

de una conexión vascular entre las células.

Lo normal es transferir los pequeños brotes que se forman a un medio que induzca su

crecimiento.

Los medios para inducir raíces suelen ser

– Pobres en elementos minerales,

– No llevan normalmente vitaminas ni aminoácidos,

– Tienen bajas concentraciones de sacarosa

– Y una elevada relación auxina/citoquinina

Embriogénesis somática

Tras la fecundación del óvulo se forma un zigoto, que al desarrollarse de lugar al

embrión.

Sin embargo es posible que a partir del óvulo se forme un embrión sin necesidad de que

haya habido fertilización. En este caso se forman embriones somáticos.

– Ej. La aplicación de reguladores del crecimiento u hormonas puede actuar como

estímulo para esta embriogénesis.

La embriogénesis somática ocurre cuando a partir de tejidos somáticos que proliferan a

partir de un explanto inicial se desarrollan embriones, es decir, estructuras bipolares

que contienen un eje caulinar y otro radicular.

Los embriones somáticos pasan por estadios muy similares a los embriones cigóticos, y

si se convierten en plantitas diferenciadas presentan un potencial de micropropagación

muy elevado: mayor que el de la organogénesis para regenerar plantas

A partir de tejidos somáticos se desarrollan embriones, es decir, estructuras bipolares

que contienen un eje caulinar (que dará lugar al tallo de la planta) y otro radicular (dará

lugar a la raíz).

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Ventajas

Mayor potencial de regeneración que la organogénesis

Se necesitan menos etapas para regenerar una planta completa.

Los embriones somáticos pueden almacenarse en grandes cantidades de manera

relativamente sencilla.

El coste es relativamente reducido.

Puede ser el punto de partida para la formación de semillas artificiales.

Desventajas

Es más difícil de lograr que la organogénesis

Es muy difícil romper la dormición cuando ésta aparece (aunque es raro que ocurra)

Ilustración 4. A) Embriones somáticos de pino. B) Semill artificial protegida por una cápsula

¿Cuál es el mejor explanto para la embriogénesis somática? ¡Tejidos procedentes de un

embrión cigótico inmaduro!

¿Qué características debe tener el medio?

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Alta concentración de NH4+ y baja relación de nutrientes en general

Aminoácidos tales como Pro, Gln, Asn y Ala

Control de los niveles de auxinas (alta 2,4-D) y etileno (uso de inhibidores)

Bajas intensidades de luz

Embriogénesis somática por vía indirecta

a) El callo se consigue a partir de raíz y con 2,4 D en concentraciones de entre 0.5 y 1

mg/l

b) Algunas masas de células se diferencian en masas proembriogénicas (PEM).

c) Las PEMs se transfieren a medio sin auxinas o con niveles muy bajos se desarrollan

los embriones

Ilustración 5. A partir de un callo comienzan a formarse unas estructuras o masas llamadas masas

proembrionarias. Adicionando auxinas normalmente comienzan a inducirse la formación de estas

estructuras bipolares que luego van a dar lugar a los distintos embriones.

2.2 Enraizamiento “in vitro”

Antes de llevar a condiciones de campo, un explanto debe formar raíces con un tamaño

mínimo de 1 cm.

A veces se llevan directamente al invernadero sumergiéndolos unos segundos en IBA.

¿Cuáles son las hormonas óptimas o que se necesitan para producir raíces?

Auxinas: IBA e ANA, aunque también es importante considerar el AIA.

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Poliaminas: Putrescina

Estas hormonas lo que hacen es activar el enraizamiento.

Las que inhiben el enraizamiento y por lo que tanto no se pueden poner nunca para la

inducción de raíces son:

Giberelinas

Citoquininas

ABA

Ilustración 6.Efecto sobre el enraizamiento (Rooting %) de putrescina (PUT), giberelinas (GA3) y

ambas conjuntamente (PUT + GA3 ) frente a plantas control (C).

¿Qué concentración de agar sería la óptima para un medio de enraizamiento? La

concentración óptima de agar sería de 0,8%

¿Y cuál la de sacarosa? La concentración óptima sería de un 3%.

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Ilustración 7. Efecto de la concentración de elementos minerales (en la etapa de crecimiento de las

raíces) sobre algunos parámetros relacionados con el enraizamiento “in vitro” de explantos de olivo.

El óptimo se considera ½ porque los explantos enraizados con ¼ mostraban síntomas de clorosis.

Tamaño y posición del explanto

Mejores resultados en explantos grandes.

A veces es mejor la posición apolar

Condiciones ambientales

En general mejor la oscuridad porque de este modo se evita la degradación de las

auxinas.

En general mejor altas temperaturas salvo que se deseen romper fenómenos de

dormición

La técnica de microinjerto seriado es la técnica que a veces se usa para mejorar la

capacidad de enraizamiento en plantas en las que es muy difícil de conseguir.

Necesitamos poner un embrión y que éste eche raíces. Cortar la parte que daría lugar al

tallo y sobre éste introducir la planta que nos interesa enraizar. Una vez que la tenemos

(esto se llama microinjerto), tenemos que dejarla crecer durante 30 días. Una vez

tengamos esta planta tenemos que volver a repicar una 2ª, 3ª e incluso hasta una 7ª vez.

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3. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LA MICROPROPAGACIÓN

Ventajas

Para algunas plantas la multiplicación vegetativa es la única posible (producen pocas

o ninguna semilla). Por ejemplo el ajo.

En un tiempo y espacio cortos se puede conseguir una gran cantidad de plantas

genéticamente idénticas a partir de un único individuo elite o de un ejemplar raro:

Posibilidad de multiplicar plantas genéticamente modificadas.

Se pueden obtener plantas libres de patógenos: Facilita el paso de las fronteras

entre estados.

Las plantas pueden tener un aspecto más frondoso.

Para las orquídeas es el único método de propagación vegetativa comercialmente

rentable.

Proporciona plantas muy vigorosas.

Se puede eliminar el efecto estacional.

Se simplifica el proceso de multiplicación.

Posibilidad de multiplicar plantas genéticamente modificadas

Desventajas

Se pueden producir alteraciones genéticas.

Regresión posible al estadio juvenil

Necesidad de diseñar un protocolo de transferencia a condiciones "ex vitro".

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Exceso de homogeneidad genética de los cultivos

Con el paso del tiempo puede ocurrir una pérdida de capacidad de regeneración de

la planta

4. VARIACIÓN SOMACLONAL. DEFINICIÓN

Larkin y Scowcroft propusieron en 1981 el término de variación somaclonal para la

variación que se produce en las plantas regeneradas de cultivos de células y tejidos sin

que se hayan aplicado agentes mutagénicos.

Los cambios pueden afectar:

– a las características morfológicas y bioquímicas de la planta,

– o al número y estructura de los cromosomas y, por tanto, al contenido de ADN.

Es importante tener claro que no se puede predecir el tipo de variantes somaclonales

que se forman, es decir, siempre es algo al azar.

Lo que si es posible, es crear las condiciones para que se seleccionen sólo los variantes

que tengan unas determinadas características de interés.

Dentro de la variación somaclonal podemos considerar:

1. Cambios genéticos

Son aquéllos que suponen una alteración en la secuencia de ADN. En algunos casos

como la zanahoria se ha demostrado que si los cultivos en suspensión se mantienen

diploides permanecen totipotentes pero aquéllos que muestran alteraciones en el

número de cromosomas pierden su capacidad regenerativa.

Alteración en los cromosomas:

– Causas porsibles

Debidos a alteraciones en la formación del huso acromático,

en la separación de los cromosomas durante la anafase

o incluso fusión de núcleos

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Cambios en el número de cromosomas:

– Poliploidía. Consiste en la presencia de 3 o más juegos de cromosomas en cada

núcleo

– Aneuploidía. Alteración en el número de cromosomas. Este concepto excluye

aquéllos cambios que suponen la adquisición de un número haploide (o múltiplo del

número haploide) de cromosomas. Ej una especie que tiene como 2n=48, origina

variantes con 47, 24, 72 cromosomas. Sólo es aneuploide aquel variante que tiene

47 cromosomas, porque no es un múltiplo de 48. El de 72 es un poliploide y el de

24 es haploide.

Cambios en la estructura de los cromosomas (No lo ha explicado)

Alteraciones en el ADN extranuclear

– Es decir, del contenido del ADN de cloroplastos y mitocondrias.

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Por ejemplo, existen variantes somaclonales de maíz con esterilidad

masculina, resistentes a un patógeno denominado Helminthosporium maydis.

El hongo fabrica una toxina que impide el funcionamiento correcto de las

mitocondrias. Estas plantas tienen alterada la estructura de su ADN

mitocondrial y por tanto el hongo no puede actuar sobre estas mitocondrias.

Curiosamente, los variantes somaclonales han perdido también la esterilidad

masculina.

También se han descrito somaclones en los que la alteración está en el ADN

cloroplastidial.

Mutaciones génicas

– Que afectan a unos pocos genes e incluso a un único gen. No se detectan hasta

que se obtienen plantas por autopolinización ya que tienen carácter recesivo.

Amplificación génica

– El herbicida fosfinotricina es tóxico para las plantas porque inhibe la glutamina

sintasa, (el enzima que cataliza el paso de ácido glutámico para dar

glutamina).

– En alfalfa se han conseguido plantas entre 20 y 100 veces más resistentes al

herbicida. Para ello se ha cultivado alfalfa en presencia de fosfinotricina. La

causa es que ha aumentado entre 3 y 11 veces el número de copias del gen que

codifica la glutamina sintasa y como consecuencia la cantidad de enzima ha

aumentado entre 3 y 7 veces.

Activación de transposones inactivos

Los transposones son secuencias de ADN capaces de moverse en el interior

del genoma de la planta y modificar de este modo su expresión génica.

De los somaclones observados deben estudiarse la progenie sexual de las

plantas en las que se han observado modificaciones.

Dichas plantas se deben cultivar en invernadero y someterse a

autopolinización

2. Cambios epigenéticos

Son aquéllas alteraciones fenotípicas que no son el resultado de una alteración en la

secuencia de ADN.

– Ej. Cuanto mayor es el grado de metilación del ADN de un gen, menor es su

expresión.

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Se ha propuesto la hipótesis de que una gran parte de las mutaciones que se

observan como consecuencia de los cultivos in vitro está directa o indirectamente

relacionadas con el estado de metilación del ADN.

Los cambios epigenéticos son heredables por mitosis pero no por meiosis.

Frecuentemente están dirigidos, es decir, ocurren de modo regular en respuesta a

inductores específicos o a ciertas condiciones de cultivo y revierten cuando se

modifican estas condiciones.

– Sin embargo, a veces la alteración fenotípica puede mantenerse durante largos

periodos y varias generaciones celulares e incluso aunque se modifiquen las

condiciones inductivas.

Ej. Para cultivar parénquima de médula de tabaco es necesario añadir auxina

y citoquinina. En cultivo prolongado se puede conseguir que pierdan la

necesidad de citoquinina y cuando estos cultivos se propagan mantienen su

carácter de habituación (no necesitan citoquinina), pero si a partir de uno de

estos cultivos se regeneran plantas completas, las células habituadas

revierten al estado que necesita citoquinina

Características Genético Epigenético

Frecuencia con la que

ocurre Baja. 10

-5-10

-7 de

cada generación de

células

Alta. 10-3 de cada

generación de células

Naturaleza del cambio Al azar Dirigido

Estabilidad de los cambios Normalmente

estable

Estable, pero en ocasiones

puede haber un elevado

grado de reversión

Transmisión sexual del

cambio

Si No

5. FACTORES QUE INFLUYEN EN LA APARICIÓN DE VARIACIÓN SOMACLONAL

El tipo de explanto

El uso de explantos con tejidos quiméricos preexistentes pueden ser una buena

fuente de variación. Las quimeras son mosaicos genéticos.

o Esto quiere decir que en una misma planta hay células con diferente

constitución genética debido a cambios durante el desarrollo del ADN

nuclear.

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Las células de los meristemos apicales, mantienen el nivel de ploidía, ya que una vez

que han duplicado su ADN llevan a cabo inmediatamente los procesos de mitosis y

meiosis. No son buenas candidatas para la variación somaclonal.

Sin embargo, las células diferenciadas o que comienzan a diferenciarse pueden

sufrir procesos de endorreduplicación (en la cual se duplica el ADN pero luego no

tiene lugar el proceso de división celular), que alteren su número cromosómico.

Puesto que estas células han perdido la capacidad de división, este cambio

cromosómico pasa desapercibido. Por lo tanto serían buenas candidatas para

producir variantes somaclonales.

o Si mediante cultivo in vitro se consigue que estas células puedan dividirse y

regenerar una planta completa, esta será genéticamente distinta de la

planta madre.

Como consecuencia de lo dicho, es más fácil que aparezca variación somaclonal en

cultivos en los que el explanto inicial estaba formado por tejidos diferenciados.

o Como toda regla, esta también tiene sus excepciones. Por ejemplo, en

patata, los protoplastos obtenidos a partir de tejido de cotiledón tienen

una mayor frecuencia de poliploides que los obtenidos a partir de hoja.

El cultivo de protoplastos induce en muchas ocasiones inestabilidad genética. Esto

se debe a que los explantos son muy pequeños y por tanto necesitan pasar mucho

tiempo en el medio de cultivo para regenerar plantas completas.

Nota: Un protoplasto es una célula vegetal sin pared y tiene sólo la membrana plasmática.

Estas células se utilizan cuando nosotros queremos tener híbridos interespecíficos.

La especie y el genotipo de la planta.

Se considera que las gimnospermas son más estables que las angiospermas.

Los callos de coníferas procedentes de embriones cigóticos, son masas de

embriones en los primeros estadios de formación, por tanto tejidos

organizados. Algo parecido ocurre con algunas monocotiledóneas.

En general la frecuencia de cambios depende de las variaciones preexistentes en el

genotipo. Hay variedades que genotípicamente, dentro de la misma especie,

presentan variaciones.

En el arroz hay variedades estables que muestra un porcentaje de

variantes somaclonales con un 0-1% y variedades inestables que oscilan

entre el 10-27% de variantes somaclonales cultivándola en las mismas

condiciones.

Kalanchoe es una especie ornamental que se usa mucho para inducir

variación somaclonal.

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Nivel de ploidía

En patatas y raíngeas (Lolium multiflorum). Las variedades diploides muestran

estabilidad, mientras que las tetraploides generan numerosos aneuploides durante

el cultivo de tejidos.

La explicación razonable es que los poliploides están “tamponados”, es decir, que

tienen varios juegos de cromosomas. Si en uno de los cromosomas se produce una

modificadción genética, la planta siempre tiene el otro juego de cromosomas para

poder generar una nueva planta lo que da lugar a variaciones genéticas.

Las especies poliploides como el maíz o la patata sufren más modificaciones en los

cultivos in vitro que los diploides o haploides.

Ej. La cebada que es diploide sólo da lugar a un 1% de aneuploides mientras

que el trigo hexaploide, cultivado en idénticas condiciones, produce entre

un 10-40% de aneuploides.

Esto se debe a que las plantas poliploides que pierden un cromosoma tienen más

posibilidad de compensar esta pérdida que las que sólo tienen dos juegos de

cromosomas.

El procedimiento del cultivo

En algunas especies como Lolium o Lanium, la variación observada en plantas

procedentes de cultivos embriogénicos es mucho menos que si procede de cultivos

organogénicos.

La mayor parte de la variación somaclonal in vitro procede de la fase del callo,

- En realidad es una respuesta de la planta frente a heridas, las cuales se ha

demostrado que activa los elementos transponibles y estimulan la inducción de

enzimas presentes durante el estrés.

Cuando las plantas se regeneran a partir de callos, protoplastos o células en

suspensión el número de alteraciones genéticas es mucho mayor que cuando se

hace a través de organogénesis directa.

- El tiempo de cultivo es mucho menor en este último caso. Además, en un cultivo de

protoplastos se pueden producir fusiones.

En algunas especies el número de alteraciones es alto cuando se cultivan en forma de

suspensiones celulares pero estas disminuyen si se cultivan en forma de callo sobre

un medio sólido.

El número de variantes aumenta con la edad del callo y también su proporción.

Una baja frecuencia de transferencia proporciona mayor nº de variantes

somaclonales

27

La edad del subcultivo.

El número de variantes aumenta con la edad del callo

Medio de cultivo y temperatura

El estado físico del medio de cultivo también influye en el nivel de variación

obtenida.

o Un mismo explanto puede tener diferente comportamiento si se le cultiva

en un medio sólido o en medio líquido. En un medio líquido puede sufrir

procesos de agitación los cuales afectan a la división celular de las plantas

Un medio que proporciona unas condiciones de crecimiento supraópticas puede

hacer que la probabilidad de sufrir alteraciones se multiplique.

Otro factor importante es la temperatura, que puede inducir inestabilidad en el

cariotipo o puede incrementar el número de plantas albinas (porque afecta a los

cloroplastos, a nivel de la expresión de su ADN).

Reguladores del crecimiento

Respecto a la composición del medio, concentraciones altas de auxinas sintéticas

(2,4 D) aumentan la variabilidad.

El 2,4D ejerce profundos efectos sobre la respiración celular, el consumo de

azúcares y en el control de la división celular. Esta auxina induce la formación

de poliploides.

El AIA y el ANA producen cambios epigenéticos en la planta ya que aumentan la

metilación de la citosina durante el cultivo in vitro. Los sectores del ADN donde la

citosina está metilada en posición 5 son puntos importantes de variación.

En algunos casos se ha observado un grado distinto de variación somaclonal

dependiendo de algunos componentes adicionados al medio de cultivo:

– En respuesta a que el N estuviera en forma orgánica o inorgánica

– Las concentraciones elevadas de Cl2Ca la inducen.

Un medio que proporcione unas condiciones de crecimiento supraóptimas puede hacer

que la probabilidad de sufrir alteraciones se multiplique.

6. ASPECTOS PRÁCTICOS DE LA VARIACIÓN SOMACLONAL

Para que una planta que presenta variación somaclonal tenga un uso agronómico se

necesitan ciertos requisitos:

– El nuevo carácter, o el carácter modificado debe tener alguna ventaja.

– El carácter mejorado debe de ir acompañado del resto de las características

fenotípicas presentes en las plantas de partida, es decir, que no cambie al resto.

28

– El carácter mejorado debe heredarse de modo estable a través de las sucesivas

generaciones.

Se pueden seguir dos estrategias diferentes:

Selección de variantes a nivel de la planta.

– Consiste en regenerar plantas a partir de cultivos celulares, protoplastos o callos

en presencia del agente tóxico seleccionador y examinar de entre ellas las que se

pueden considerar como variantes somaclonales.

Ventaja: Se trabaja ya con plantas y se evita la posibilidad de que una

característica que se expresaba en las células desaparezca en la planta.

Estamos trabajando directamente sobre el organismo que a nosotros nos

interesa, que es la planta completa.

Inconveniente: Se necesita mucho espacio para poder analizar las

características de las plantas.

Selección a nivel celular.

– Células procedentes de cultivo in vitro se someten a un medio selectivo para

determinar su tolerancia a factores como presencia de patógenos, temperaturas

extremas, compuestos tóxicos para la planta y aquéllas células que sobrevivan en

el medio se utilizan para regenerar plantas resistentes a esas condiciones

adversas.

Ventaja: En poco espacio físico y también de tiempo se pueden cultivar millones

de células y explorar sus posibilidades.

Inconveniente: A menudo células que in vitro resisten condiciones muy

adversas luego regeneran plantas que no mantienen esa característica.

Se puede hacer selección en una única etapa o en etapas múltiples:

1. Selección en una única etapa

– El agente selectivo, se pone en el medio a concentraciones extremadamente

altas.

– Ventajas:

Es el método más simple,

da resultados más claros

en él existen muy pocas posibilidades de que algunas variantes pasen

desapercibidas.

– Puede tener la desventaja de que se hace crecer a las células en un medio muy

extremo, lo que puede hacer que tengan muy poco vigor, porque las hemos

sometido a un compuesto muy tóxico.

29

2. Selección en etapas múltiples

– Se utiliza cuando el anterior no funciona.

– El agente selectivo se pone inicialmente en concentraciones bajas y se van

elevando paulatinamente en sucesivos subcultivos de modo que se favorece el

crecimiento de las plantas o células resistentes

– Con este método no se seleccionan células tan resistentes pero tiene la ventaja

de que se desarrollan con más vigor

¿Qué se ha conseguido seleccionando varientes somaclonales?

Plantas con flores más atractivas. Ej en geranio

Plantas con mejores características agronómicas.

– Ej. Plantas de tomate que tienen un mayor % de peso seco en sus frutos

Mayor contenido en determinados compuestos de interés.

– Ej. Aumento del contenido de triptófano en plantas de maíz

Tolerancia al frío

Tolerancia a herbicidas.

– Ej tolerancia de la alfalfa a la fosfinotricina

Tolerancia a las elevadas concentraciones de cloruro sódico en el medio (plantas más

tolerantes a la salinidad).

– Se han conseguido plantas de tabaco que pueden crecer en un medio con una

concentración del 0.88% de ClNa, es decir de 8.8 g/l. Estas plantas se ha

conseguido que mantengan la resistencia tras sucesivas generaciones sexuales.

Resistencia a una gran cantidad de patógenos.

7. CULTIVO DE HAPLOIDES. INTERÉS

Plantas haploides son aquéllas cuyas células tienen una sola copia de cada uno de los

cromosomas característicos de la especie. Se pueden encontrar espontáneamente

en la naturaleza.

La primera descripción de una planta haploide se realizó en zanahoria en 1922.

Posteriormente se han encontrado en lino, arroz o algodón, pero siempre en

proporciones muy bajas

– Ello impide que esta característica se pueda utilizar en los programas de mejora

que siguen métodos convencionales.

En las plantas existe una alternancia entre dos generaciones:

– Esporofito diploide en el que hay esporangios. En ellos, y mediante meiosis, se

producen las esporas haploides que al germinar producirán un gametofito.

30

– Gametofito haploide que produce gametos. Por fusión de dos gametos se

produce un zigoto diploide que da lugar al esporofito y de este modo se cierra el

ciclo.

El gametofito masculino es el grano de polen, un organismo microscópico

con vida independiente que tiene tan sólo dos células una vegetativa (más

grande) y otra generativa (mucho más pequeña) que tienen funciones

radicalmente diferentes

El gametofito femenino está constituido por el saco embrionario. Un

conjunto de 7 células, una de las cuales, la central, tiene dos núcleos

- Mediante el cultivo de haploides lo que se pretende es que las esporas haploides

en lugar de producir un gametofito, formen un esporofito pero con una dotación

cromosómica n en lugar de la normal que es 2n

8. INTERÉS DEL CULTIVO DE HAPLOIDES

Puesto que tienen un único juego de cromosomas, todos sus alelos, incluso los recesivos,

se expresan fenotípicamente, lo que es interesante de cara a la selección.

Las plantas haploides son estériles pero a través de la duplicación de sus cromosomas,

bien de modo espontáneo o bien inducida por la aplicación de colchicina, se pueden

obtener plantas homocigóticas diploides.

– Estas plantas forman gametos idénticos[1] (salvo que haya habido

entrecruzamiento desigual. Si ocurre genera gametos con “más o menos

información” que otros, pero que sean viables). Si se cruzan dos plantas de estas

características todos sus descendientes son genéticamente idénticos aunque

heterocigotos

En plantas poliploides resulta muy difícil conseguir homocigotos pero la producción de

"haploides" permite trabajar con un menor nivel de ploidía.

– Ej a partir de un tetraploide se puede conseguir plantas diploides.

[1] Los gametos serán iguales salvo que haya habido un entrecruzamiento desigual, es

decir, que haya ocurrido entre partes no homólogas del cromosoma. A veces esto puede

ocurrir y dar lugar a gametos con "más o menos información" que otros, pero que sean

viables. Hay que tener en cuenta que muchos genes están repetidos.

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Mediante la inducción de haploides se puede seleccionar un sexo en concreto e incluso

formar diploides que sean supermachos o super hembras.

– Ej. En el espárrago es mayor el vigor de las plantas macho. Los haploides pueden

ser machos Y o hembras X. Si se duplican los cromosomas se obtienen individuos

YY (supermachos).

A partir de una planta haploide se pueden obtener protoplastos que se fusionen y den

lugar a diploides. Los protoplastos de haploides se pueden manipular genéticamente y

– Cualquier modificación que altere el fenotipo se expresará.

Los ciclos de selección se acortan mucho y esto es de gran interés para los

mejoradores.

7. MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE HAPLOIDES

Los métodos más comunes para la obtención de haploides son:

- el cultivo de anteras y microesporas (androgénesis)

- y el de ovarios u óvulos(ginogénesis)

Aunque también existen otros.

8. ANDROGÉNESIS: ESTRUCTURA DE LA ANTERA Y FORMACIÓN DEL POLEN

En el estambre hay un filamento, tejido conectivo y la antera. Esta última si la

cortamos en sección vertical veremos que tiene dos lóbulos cada uno de ellos con dos

microsporangios. En la microsporogénesis, en los 4 tejidos esporogénicos, que es

donde están las células madres del polen, se produce la meiosis.

– Cada célula madre da lugar a 4 células haploides que permanecen agrupadas

formando tétradas y rodeadas de una gruesa pared de calosa, que cuando se

rompe libera las microsporas.

– La microspora crece, sufre mitosis y da lugar a 2 células desiguales, una

vegetativa, más grande y otra generativa, más pequeña. Estas dos células

constituyen el grano de polen.

– El núcleo generativo se divide de nuevo dando dos núcleos espermáticos. Esta

segunda mitosis puede retrasarse hasta la formación del tubo polínico.

32

Sin embargo, los haploides que se obtienen in vitro pueden haber seguido 4 pautas

diferentes de desarrollo:

1. La microspora sufre una división mitótica y da lugar a dos células idénticas que

continúan dividiéndose hasta producir polen pluricelular que originará una nueva

planta.

2. La microspora sufre una división desigual que da lugar a dos células

– Una vegetativa, más grande

– Una generativa, más pequeña

– La célula vegetativa se sigue dividiendo y da lugar a un polen multicelular al que

prácticamente sólo ha contribuido la célula vegetativa

3. La microspora sufre una división desigual que da lugar a dos células: una vegetativa y

otra generativa, pero al contrario que en el caso anterior, la célula generativa es la

que va a originar el polen multicelular ya que la vegetativa o no se divide o lo hace

muy pocas veces. En esta vía, se forma una estructura similar al suspensor en el polo

radicular del futuro embrión.

4. Se forman dos células una vegetativa y otra generativa pero ambas siguen

dividiéndose y contribuyen en igual medida a la formación del polen multicelular.

Los granos de polen multicelular terminan por romper la cubierta externa y en

ocasiones pasan por etapas de desarrollo similares a las de un embrión cigótico, es decir,

estadios globular, corazón, torpedo y cotiledonar hasta originar una planta adulta.

No obstante, cuando se cultivan las anteras, la masa multicelular del polen forma un

callo que posteriormente, dará lugar a plántulas.

Para que la androgénesis tenga lugar es necesario que el grano de polen se encuentre en

un estado de desarrollo muy preciso, que varía según la especie.

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- En la célula madre de la microspora se expresan genes específicos del esporofito

pero antes de que ocurra la meiosis que dará lugar a la microspora, los productos

de estos genes ya se han eliminado del citoplasma.

- También hay genes específicos del gametofito pero éstos no se expresan hasta

después de la primera mitosis.

- Es por esto que en el intervalo de antes e inmediatamente después de la primera

mitosis, la microspora presenta una gran plasticidad y se le puede inducir hacia la

formación de embriones haploides.

- Poco a poco el polen se va programando hacia la formación del gametofito

masculino y a las 24 h. de haber ocurrido la mitosis el proceso ya es irreversible.

34

Cultivo de anteras

Mediante este método se han obtenido haploides a partir de más de 130 especies.

La planta de la que se van a extraer las anteras es conveniente que sea joven y se

trabaje rápido ya que se calcula que no deben pasar más de dos horas entre la

extracción de las anteras y su siembra.

– Una vez que se ha desinfectado la yema floral, esta se pasa a condiciones estériles

y se extrae la antera. Es conveniente asegurarse del estado de desarrollo del

polen y para ello lo mejor es tomar uno de los estambres de la flor y observarlo al

microscopio.

– Si el estado es el adecuado [1], se toman los otros estambres, se les retira el

filamento y se siembran en el medio. A veces la presencia de pequeñas partes del

filamento reducen drásticamente las posibilidades de éxito.

– Para la observación microscópica del estado de desarrollo de las microsporas se

utiliza acetocarmina (45 ml de acético glacial, 55 ml de agua destilada y 0.5 g de

carmina)

[1] En el estadio uninucleado tardío se observa un núcleo y una vacuola claramente

desarrollada

Cuando las flores son muy pequeñas se retira tan sólo cáliz y corola y cultivamos el

resto.

– Este método tiene el inconveniente de que si en el medio de cultivo se ponen

hormonas lo más probable es que también se produzca proliferación de los tejidos

diploides.

Es bastante común que haya que alternar entre luz (12-18 h) y oscuridad (12 a 6 h)

Después de 3 a 8 semanas se habrán podido producir plántulas todas ellas

genéticamente diferentes por lo que habrá que dejarlas crecer, sacarlas ex vitro,

analizar sus características y multiplicar vegetativamente las más interesantes.

El principal problema del cultivo de anteras para la obtención de haploides es que

también se originan plantas a partir de otros tejidos con diferente nivel de ploidía.

Además, debido a la mezcla de callo de diferentes procedencias, se pueden regenerar

plantas quiméricas en las que haya células con diferente grado de ploidía

35

Cultivo de polen aislado

En este caso, la androgénesis se produce a partir de una única célula y se evita el

problema que se da en el cultivo de anteras. Hay también otras ventajas entre las que

se encuentran:

- Los granos de polen están en contacto directo con el medio de cultivo, cosa que no

ocurre con el cultivo de anteras ya que hay tejidos de ésta que se interponen.

– Al no estar presente la antera faltan también algunas sustancias, como el ABA,

que ésta produce y que tienen carácter inhibidor.

– La formación de embriones es más fácil de observar

– En ocasiones la maduración de los granos de polen de una antera no es simultánea

y los primeros en madurar pueden inhibir la maduración de los otros con lo que la

"cosecha" de polen disminuye. El aislamiento del polen puede evitar este

problema y permite seleccionar, mediante centrifugación en gradiente de

densidad, los que estén en mejores condiciones de dar lugar a una planta haploide.

– Las microsporas aisladas se pueden modificar genéticamente bien por

introducción de ADN foráneo bien por exposición a agentes mutagénicos. De este

modo se puede obtener una planta haploide con alteraciones genéticas.

En algunas plantas se ha llegado a comparar la eficacia, en términos de obtención de

embriones viables, entre el cultivo de polen aislado y el de anteras y la del primer

método es 60 veces mayor que la del segundo.

9. GINOGÉNESIS

Consiste en el desarrollo de una planta a partir de células del gametofito femenino

sin que estén implicados procesos de fecundación.

Se llevó a cabo por primera vez en 1976 y desde entonces se ha conseguido en

especies que pertenecen a más de 10 familias.

En la mayoría de los casos, la célula que sirve de punto de partida es la ovocélula pero

también se ha conseguido a partir de alguna de las sinérgidas[1]

Las plantas regeneradas pueden haberse producido directamente o también a través

de una etapa previa de callo.

[1] Cada una de las dos células de breve vida que están junto a la ovocélula en el gametofito

femenino

Si comparamos este método con los de androgénesis, la ginogénesis es más difícil y

existe una menor probabilidad de éxito pero puede ser útil:

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– Para aquéllas plantas en las que no se han conseguido haploides por

androgénesis. Ej melón, remolacha azucarera y cebolla

– En aquéllas plantas que presentan esterilidad masculina

– En algunas especies los haploides obtenidos por androgénesis son albinos en

una gran proporción. Para algunos autores la aparición de albinismo se debe a la

pérdida de ADN del cloroplasto que posiblemente ocurra porque se produce

recombinación intramolecular entre secuencias de ADN repetitivo.

- En algunas plantas como el arroz la eficacia del método es mayor por

ginogénesis que por androgénesis.

Dentro de la ginogénesis se recolectan los ovarios, se esterilizan muy bien con una asepsia

superficial y suave y a continuación se extraen los óvulos que hay en el interior. Si cada

ovario tiene un solo óvulo es más fácil de extraer y no necesitaremos una lupa

estereoscópica para extraer esos óvulos que hay dentro del ovario.

Cultivo del ovario

- Una nueva técnica descrita para Prunus persica por Piuts et al. describe la

perforación con pequeños orificios de estos órganos inmediatamente antes de

emplazarlos en el medio de cultivo.

- En el caso de cultivar el ovario directamente el protocolo es más sencillo. Sólo

hay que cuidar que la asepsia del mismo no le afecte funcionalmente.

- Existe una técnica que consiste en cortar secciones del ovario e introducir la

sección basal en el medio de cultivo.

- En Tulipa, la probabilidad de éxito comprada con el cultivo de óvulos es similar,

pero se prefiere ésta última porque consume menos tiempo.

Diploidización de haploides

Como ha hemos dicho, los haploides son estériles, es decir, no pueden producir

gametos. Esto se debe a que al no haber cromosomas homólogos no puede existir el

apareamiento típico de la meiosis.

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En ocasiones al inicio del desarrollo de plantas haploides se produce espontáneamente

una duplicación de los cromosomas que conduce a la diploidía. Este fenómeno es

especialmente común en las plantas que proceden de un grano de polen y puede estar

entre el 20 y el 70 %.

Existe además, la posibilidad de aumentar este porcentaje mediante métodos

artificiales que implican el empleo de colchicina.

La colchicina es un compuesto que inhibe la formación del huso acromático y por tanto,

dificulta la separación de los cromosomas que acaban de replicarse. De este modo, la

célula duplica su dotación cromosómica.

El tratamiento con colchicina se puede hacer en distintos estadios de desarrollo.

11. DESVENTAJAS DEL CULTIVO DE HAPLOIDES

Hasta el momento se han conseguido buenos resultados casi exclusivamente en un grupo

reducido de familias: Brassicaceae, Poaceae (Gramíneas) y Solanaceae (Pimiento,

tomate, berenjena…). Cuando se consiguen buenos resultados es con un alto coste

económico

Bajo rendimiento. Se considera que sólo el 5-8 % de los granos de polen entran en

proceso de desarrollo y de ellos tan sólo una proporción muy baja termina por

regenerar plantas haploides. Esto da muy poca base de trabajo para los mejoradores.

En los cereales una parte importante de los haploides presenta albinismo, es decir, no

sintetizan clorofila.

– Es posible que la falta de clorofila se deba a que en condiciones de anaerobiosis

aumentan lactato deshidrogenasa y alcohol deshidrogenasa y estos enzimas puede

lesionar los plastidios.

Se pueden producir alteraciones genéticas que modifican las cualidades agronómicas de

las plantas de origen.