Tema 13: ESTUDI DE L’EXPRESSIÓ GÈNICA

Detecció de molècules especifiques de DNA/RNA

- Northern-Blot: Hibridació en gel d’interferència

- Quantitative RT-PCR

- DNA microarrays

- Xips de DNA

Anàlisi splicing alternatiu

Detecció d’splicing:

- Northern-Blot

- RNAsa prottection assay

Identificació i quantificació de mRNA amb splicing

- Hibridació in situ

Anàlisi de la taxa de transcripció

- Run-on

Estudi dels promotors (amb gens reporters)

- Identificació dels elements reguladors

- Anàlisi funcional del promotor (expressió del gen)

- Identificació de factors de transcripció:

o DNa footprinting

o Gel shift i supershifts assays

o ChIP (cromatinimmunoprecipitació)

o Clonatge dels factors de transcripció

DETECCIÓ DE MOLÈCULES ESPECÍFIQUES DE DNA I RNA

NORTHERN BLOT

És la tècnica clàssica que s’ha utilitzat per detectar la presència d’un mRNA d’una mostra. És una tècnica equivalent

al Southern Blot però enlloc de DNA amb RNA.

(a) Extraiem el RNA de diferents part de l’organisme de teixits humans.

(b) Els correm en un gel d’agarosa.

(c) Els transferim a una membrana de nitrocel·lulosa.

(d) Hibridem amb una sonda marcada.

Es tracta d’un gen d’expressió ubiqua, no obstant, observem que no

s’expressa en tots els teixits ni s’expressa amb la mateixa intensitat.

Podem determinar la mida del RNA amb el Northern Blot, gràcies als

marcadors de PM.

QUANTITATIVE-REAL TYPE-PCR (qRT-PCR)

S’utilitza aquesta tècnica per quantificar el RNA d’una mostra, ja

que ens mesura la quantitat d’aquest d’una forma més precisa

que el Northern.

DNA MICROARRAYS

Les tècniques de Northern i qRT-PCR serveixen per localitzar un RNA concret. Els microarrays serveizen per estudiar

tots els gens alhora.

Es basa en l’ús de suports molt petits, de la mida d’un porta, amb una graderia de pouets. En cadascun d’aquests

pouets dipositem la seqüència de cadascun dels gens de la cèl·lula immobilitzats.

Aquests sistemes funcionen comparant dues mostres, dos porta.

(a) Extraiem mRNAs de dos organismes diferents.

(b) Preparem els cDNA corresponents, marcats cadascun

d’ells amb una fluorescència d’un color diferent.

(c) Barregem, en proporcions equimolars, els cDNA i els

hibridem amb el porta.

(d) Rentem per eliminar el que no hagi hibridat.

Podem veure quins son els gens que s’expressen en cada cas.

Exemple foto: els punts vermells corresponen als gens que s’expressen en el tomàquet madur i els punts verds els que s’expressen en

el tomàquet quan encara és immadur.

XIPS DE DNA

En aquesta tècnica els pouets enlloc de contenir DNA genòmic, conté oligonucleòtids sintètics.

- Les seqüències se sintetitzen directament sobre el suport, in situ.

- La densitat dels punts i de seqüències que es poden posar en aquests pouets és molt més alta que en els

microarrays.

Actualment els microarrays i els xips no s’utilitzen gaire, el més habitual avui dia és fer seqüenciacions massives.

ESTUDI DEL SPLICING ALTERNATIU

Detecció d’splicing

NORTHERN BLOT

Quan estudiem per Northern l’expressió d’un mRNA en un teixit determinat (A) i en un altre

teixit determinat (B), observem que apareixen mRNAs de diferent mida. Per què?

Factors que condicionen la mida d’un mRNA:

Splicing alternatiu: depenent del teixit en el que s’expressi.

Diferent inici de transcripció: depenent del teixit en el que s’expressi (mida diferent

en el primer exó).

L’anàlisi per Northern ens permet conèixer i determinar la mida del mRNA d’estudi. La diferència entre les mides dels

RNA és molt fàcil de veure amb aquesta tècnica mentre que amb una RT-PCR és més difícil.

RNAsa PROECCTION ASSAY

Necessitem una ribosonda marcada complementaria al RNA que volem quantificar.

(a) Extraiem el mRNA d’una cèl·lula

(b) Afegim les ribosondes marcades

(c) Digerim amb RNAsas: degradaran tot el

RNA excepte els fragments protegits, els de

doble cadena (hibridats).

Obtindrem els fragments hibridats amb la

ribosonda i ribosonda lliure (ja que sempre

la posem en excés).

(d) Desnaturalitzem el producte i el correm en un gel de separació.

Normalment els gels tenen tres carrils:

Carril A: marcador de pesos moleculars

Carril B: sonda sense hibridar. És un control per comprovar que les sondes estan en bones condicions.

Carril C: la mostra (RNA + sonda hibridada).

La intensitat de la banda obtinguda és proporcional a la quantitat de mRNA hibridat. Per tant, aquesta tècnica ens

permet quantificar el RNA i alhora estudiar les variants d’splicing.

Com preparar ribosondas:

Podem preparar ribosondes a partir de plasmidis o bé a partir de productes de PCR.

A partir de plasmidis

Utilitzem vector que tinguin promotors de

bacteriòfags flanquejant la regió de l’insert

(T7/T3/SP6).

(a) Clonem la seqüència de la ribosonda

(complementària al RNA)

(b) Linealitzem el vector

(c) Afegim una cua poliN (nucleòtids marcats)

o Si tallem amb ER1 i transcrivim amb Pol B ribosonda antisense

o Si tallem amb ER2 i transcrivim amb Pol A ribosonda sense

Les sondes sense normalment s’utilitzen com a controls de les sondes antisense.

A partir de productes de PCR

(a) Fem servir la seqüència del plasmidi

com a motlle.

(b) Afegim primers que vagin des d’on

vulguem fins on vulguem. En aquests

primers podem afegir les seqüències dels

promotors de les polimerases dels fags.

(c) (el mateix que l’anterior en quant a ER

i Pol)

Els productes de PCR tenen més versatilitat sobre la zona del gen on vols crear la ribosonda, pots dirigir les sondes

allà on vulguis.

ESTUDI DEL SPLICING ALTERNATIU

Identificació d’splicing i quantificació dels transcrits derivats d’aquest

RNAsa PROTECTION ASSAY

Es basa en dissenyar ribosondes que ens permetin discriminar entre les diferents variants d’splicing.

Partim de les tres possibilitats d’splicing

que poden donar-se.

(a) La regió vermella no hibrida

(b) Ttota la ribosonda hibrida

(c) La regió verda no hibrida

El fragment de ribosonda que no hibridi en

una regió (ha estat eliminada per splicing)

formarà un loop (vermella) o quedarà

desprotegida (verda).

Aleshores afegim amb RNAsa i tot allò que

no estigui protegit (no hibridat, serà digerit. En el cas del vermell, obtindrem dos fragments i en els altres dos casos

obtindrem un sol fragment (però cadascun de mides diferents).

En funció dels resultats obtinguts d’hibridar la nostra ribosonda amb el RNA en el gel podrem esbrinar de quin tipus

de splicing es tracta.

Observem que apareix un sol fragment (carril C), a més, aquesta ribosonda és més petita que la del control (Carril B).

Per tant, podem saber que es tracta del tercer cas, ja que part de la ribosonda ha estat digerida ja que no ha hibridat

i, per tant, no estava protegida.

Per tant, es tracta d’una tècnica qualitativa (quin tipus d’splicing) i quantitativa (intensitat de la banda és proporcional

a la quantitat de RNA.

HIBRIDACIÓ IN SITU

És una tècnica homòloga al Southern però enlloc de treballar sobre seqüències de DNA aïllades ho fa sobre DNA

genòmic immobilitzat sobre un suport.

Permet estudiar la presència d’un RNA en diferents teixits o cèl·lules, ja que el RNA té patrons d’expressió diferents

en funció d’on s’expressió.

Zones sense zones amb hibridació

Sones antisense zones sense hibridació

Permet estudiar la funció dels gens in situ sobre diferents estructures cel·lulars. És on s’empren normalment les

sondes sense.

Exemple d’aquesta tècnica:

Embrió de Drosophila: hibridem amb una sonda per veure el patró d’expressió d’un RNA (eve). Com a control s’utilitza

un gen constitutiu (TER94).

Observem que en el control queda tot marcat mentre que

en el RNA d’eve es veuen uns patrons d’expressió molt

marcats i diferentciats.

ANÀLISI DE LA TAXA DE TRANSCRIPCIÓ

La taxa de transcripció varia en funció del gen i de la localització

cel·lular en la que es doni. En pot haver-hi que es tradueixen molt

ràpid, es degraden molt ràpid, altres ho fan més lentament, etc.

Amb aquesta tècnica podem veure els que està passant dins del nucli de la cèl·lula a temps real.

RUN-ON

És una tècnica molt complicada ja que hem de treballar amb nuclis aïllats.

(a) Aïllem nuclis

(b) Afegim condicions adients (buffers).

(c) Afegim nucleòtids radioactius.

En el moment d’aïllar els nuclis tota la maquinària

transcripcional es deté. Un cop afegim els buffert, tot

torna a funcionar. D’aquesta manera, en afegir els

nucleòtids marcats, veurem la diferència entre el

creixement de les cadenes de RNA (ja que tot el que

sigui radioactiu s’ha començat a transcriure en el

mateix moment).

(d) Extraiem el RNA del nuclis

(e) Hibridem amb un gen prèviament clonat (A)

(f) Desnaturalitzem els híbrids i els correm en un gel

(g) Passem a filtre de nitrocel·lulosa i fem una autoradiografia

Segons la intensitat del punt (quantitat de RNA hibridat), significarà que hi ha una taxa de transcripció major o menor.

Si és molt intens, taxa elevada, si és molt claret, taxa baixa.

Exemple d’aquesta tècnica:

En aquest experiment es vol estudiar l’expressió d’un gen que es pensa que respon a

situacions d’estrès oxidatiu. En unes cèl·lules es va fer l’experiment en condicions normals

i en l’altre sota la presència de peròxid d’hidrogen. En hibridat el RNA (ja corregut al gel

i tot) amb un clon específic de DNA, veiem que en el cas de condicions normals hi ha molt

poc RNA però en condicions d’estrès oxidatiu han augmentat els nivells d’aquest. Per tant,

aquest gen sí respon a aquest tipus d’estrès, augmentant la seva expressió.

ESTUDI DELS PROMOTORS

GENS REPORTER

Els gens reporters són gens bacterians o d’altres organismes que fem servir per identificar que altres processos s’han

donat i en quina mesura.

Podem fusionar aquests reporters a la regió reguladora del nostre gen, d’aquesta

manera podem clonar-los a la regió estructural del gen.

El que podem fer són gens quimèrics amb la regió reguladora del gen d’interès

amb gens reporters

Poden funcionar de forma transitòria o estable (si s’introdueixen al genoma).

Assaig CAT

Es basa en un enzim, el clorofenicol acetil transferasa (marcat radioactivament, C14). Quan es fa l’assaig s’acetila el

clorofenicol, de manera que corre diferent en el gel.

TLC: cromatografia en capa fina

El problema d’aquesta tècnica és que hem de treballar amb radioactivitat. Avui dia s’ha substituït per fluorescència.

Alta sensibilitat i especificitat

In vivo

Assaig Luciferasa

S’utilitza quan l’activitat del promotor és baixa ja que és molt més sensible que CAT.

Està basat en la luciferasa, un enzim que emet llum, llum que podem quantificar amb un lluminòmetre. L’inconvenient

d’aquesta tècnica és que aquests aparells són molt cars.

Es poden fer servir vectors que ja porten el gen Luc intrínsec en la seva seqüència.

Identificació dels elements reguladors

Sabem on està l’inici de transcripció i la seqüència upstream d’aquest, però no sabem quins elements la regulen ni

quins factors de transcripció interaccionen

Identificació dels elements reguladors emprant Gens Reporter

Es busca quines parts de la seqüència reguladora són importants en la regulació de l’expressió del gen. Es basa en

construccions d’aquesta seqüència en les quals manca alguna regió.

Cadascuna d’aquestes construccions les posen en una cèl·lula i estudiem l’expressió del gen reporter estudiant la

activitat luciferasa.

Cal sempre partir d’un control d’expressió basal del gen reporter. El vector sense promotor serà el que en doni

aquesta expressió basal (background expression)

Observem que en delecionar la seqüència entre -1380 i 100 la activitat augmenta molt, de manera que podem deduir

que es tracta d’una regió d’unió a repressors.

Observem que la activitat torna a disminuir en eliminar la seqüència entre -341 i -258, així com en eliminar la

seqüència entre -226 i -141, de manera que podem deduir que són llocs d’unió d’activadors.

Anàlisi funcional del promotor (expressió del gen)

Anàlisi funcional emprant Gens Reporter

Es tracta de l’anàlisi funcional dels elements reguladors que actuen en cis amb el promotor per una tècnica de

mutagènesi in vivo. S’analitza l’expressió d’uns elements relativament ja coneguts d’un gen.

Partim de la seqüència reguladora de la qual ja s’han descrit possibles candidats a ser elements implicats en la

regulació (posicions -84/-68/-34). Per saber el paper funcional d’aquests, generem un seguit de construccions en les

quals hi manquen o estan modificats aquests elements (amb tècniques de mutagènesi in vivo). Es deleciona un

element i es mantenen els altres dos, i es mira que passa.

Un cop fetes les construccions, es transfecten i es mesura la activitat CAT.

Cal partir d’un control WT amb activitat luciferasa 100%, per tal de poder comparar els resultats la disminució de

l’activitat en les nostres construccions.

Observem que es redueix la activitat a la

meitat quan eliminem el -84 o el -68.

No obstant, quan més cau la activitat és

quan eliminem el -34 o els dos anteriors

alhora.

De manera que necessitem almenys un dels

dos primers (-84 o -68) i el tercer (-34) per

tenir expressió del nostre gen.

Gens reporter en l’anàlisi espaial i temporal de l’expressió gènica

S’estudia el patró de gens en organismes sencers. Es tracta d’estudiar l’expressió d’un gen determinat en l’espai i en

el temps, és a dir, on i quan s’expressa.

Exemple dels ratolins transgènics (Reporter LacZ): es vol estudiar

un gen d’expressió específica de cartílag. Són gens que s’expressen

en llocs concrets d’aquets en moments concrets del

desenvolupament. Tenim aquest gen fusionat amb el gen de LacZ.

Observem el color blau de LacZ allà on s’expressa el gen del

cartílag.

Exemple de plantes transgèniques (Reporter Gus): s’estudien dos gens

que s’expressen en arrels. Tenim aquests gens fusionats amb Gus.

Observem el color blau en arrels, el que no podem distingir be és quin

gen s’expressa en una zona específica.

Visualització de l’expressió in vivo

Si utilitzem tècniques emprant com a gen reporter la GFP, podem mesurar els gens que s’expressen in vivo en zones

molt concretes de l’organisme.

Són tècniques molt sensibles.

Identificació dels factors de transcripció

DNA FOOTPRINTING

És una tècnica que ens permet identificar la interacció entre una proteïna (FT) i el DNA.

El requeriment és t enir el DNA marcat en un dels extrems perquè tots els fragments que es generin tinguin el mateix

extrem i els puguem visualitzar en el gel.

(a) Col·loquem un primer per amplificar el fragment,

primer que està marcat radioactivament.

(b) Incubem el DNA amb la proteïna que creiem que està

interaccionant amb ell.

(c) Fem el footprintig: afegim DNAsa I que farà una

digestió parcial a l’atzar, la qual talla sense restricció

(tallarà nucleòtid a nucleòtid).

Acabarem tenint tota una bateria de fragments de longituds

diferents de tota la seqüència excepte de la zona que es troba

protegida per la proteïna (interacció DNA-proteïna).

Si correm la barreja en un gel, apareixeran tot un seguit de

bandes corresponents als fragments obtinguts, amb longituds

ascendents.

Observarem un forat que correspon a la zona en que la DNAsa I

no pot tallar ja que la proteïna està interaccionant amb el DNA.

Com que tenim l’extrem 5’ marcat, podem mapar la posició de la interacció amb molta precisió.

En la imatge tenim dos experiments en paral·lel, un es el control (sense interacció) i l’altre en el qual afegim el DNA i

les proteïnes. Si observem la imatge podem veure la regió en la qual s’uneixen les proteïnes.

EMSA (assaig de retardament/Gel Shift Assay)

Aquesta tècnica ha desplaçat la tècnica del footprinting. Aquest assaig

es pot aplicar quan ja tenim identificat i localitzat el promotor al DNA.

Es sintetitzen unes sondes marcades específiques complementària a

una regió del gen que ens pensem que pot interactuar amb un FT. Es

basa en la observació que un DNA migra més lentament en un gel si

es troba unit a proteïna.

Tècnica:

(a) D’una banda tenim les sondes marcades específiques.

(b) D’altra banda necessitem els FT cel·lulars, els quals obtenim

a partir d’aïllar i lisar el nucli cel·lular.

(c) Barregem ambdós estractes, de manera que un FT

determinat s’unirà a la nostra sonda.

(d) Analitzem aquest producte d’interacció en un gel.

Carril 1: sonda sola, sense barrejar amb els FT

Carril 2: sonda + FT, producte de la interacció

Observem doncs una banda en el carril 1 que correspon a la nostra sonda i dues bandes en el carril 2 corresponents

a la nostra sonda i l’altra corresponent al complex sonda-FT (la més retardada).

Normalment s’afegeixen carrils addicionals per tal de donar especificitat al resultat. Es fiquen competidors no marcats

per tal de minimitzar unions inespecífiques, i anar així acotant i definint el nostre FT.

- El mateix fragment de DNA però sense marcar

- DNA que no tingui res a veure amb el nostre

- El mateix fragment de DNA però amb mutacions

- Oligonucleòtids sintètics

- Anticossos contra FT coneguts (SUPERSHIFT)

Exemple d’un assaig sencer:

Carril 1: sonda marcada sola

Carril 2: producte d’interacció sonda-FT

Carril 3: competidor específic en excés (mateix fragment de

DNA però sense marcar) ens eliminarà el retardament.

Carril 4: el mateix fragment de DNA però amb mutacions.

Carril 5: anticòs (major retardament ja que està la

sonda+FT+Ac).

ChIP (Chromatin Immunoprecipitació)

Aquesta tècnica permet estudiar la interacció DNA-proteïna in vivo.

Està dissenyat per estudiar la interacció amb factors de transcripció

coneguts, ja que es basa en l’ús d’anticossos.

(a) Partim de cèl·lules aïllades a les quals se lis aplica un

tractament que manté units els factors de transcripció al DNA.

(b) S’extreu el DNA de la cèl·lula, de manera que surten també els

FT que hi estan units.

(c) Tallem el DNA en trossos petits.

(d) Tractem aquests fragments amb un anticòs contra un FT

particular i immunoprecipitem.

D’aquesta manera, de tots els fragments genòmics, estém seleccionant

aquells que estan interaccionant amb el nostre FT.

(e) Un cop recuperem aquests fragments específics, apliquem un

tractament per separar el FT del DNA.

Un cop separats, podem fer diverses coses:

- Es pot mirar si la seqüència de DNA amplificant-lo per PCR té fragment allà.

- Podem fer una banda quantitativa: veure com interacciona aquella seqüència abans i després de la

interacció.

- Estudis a gran escala: array, seqüenciació, etc.

CLONATGE DELS FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ

Tenim un vector que te clonada tota la seqüència de la

regió promotora (estudiada amb els anterior experiments),

normalment en tàndem (moltes repeticions de la

seqüència). El vector també té colonat tot el sistema

reporter.

Tenim també una proteïna de fusió que conté d’una banda

el FT que suposadament reconeix la regió reguladora i

d’altra banda un AD (activador del gen reporter).

D’aquesta manera, si hi ha activitat del gen reporter (observem colònies blaves per activació de LacZ) significarà que

el FT s’ha unit a la regió reguladora.