Tecnologías de DNA recombinante.

A través de la manipulación del dna es que podemos aplicarlo para generación de anticuerpo para terapias, estudios, etc. Además podemos modificar genéticamente algunas plantas para que sean más resistentes a ciertas condiciones, podemos generar microorganismo que participan en procesos de biorremediación (reconstitución del medio ambiente). La terapia génica, diagnóstico a nivel molecular. Tenemos más info sobre la estructura de los genes y su ubicación y gracias a ello podemos realizar estrategias de manipulación del material genético.

Una de las primeras herramientas que se usan en la biología molecular son las enzimas de restricción o endonucleasas. Son proteínas presentes en microorganismos como bacterias y los usan para degradar un dna foráneo (extraño). Estas enzimas reconocen secuencias palindrómicas, estas secuencias son las que tienen la misma lectura en ambas direcciones. Cada una de ellas identifica una secuencia palindrómica específica para esa enzima. Existen ocasiones en donde una secuencia puede ser reconocida por más de una enzima y estas se llaman isómeros. Los tipos de fragmentos que generan estas enzimas cuando cortan. Para ello tenemos E. coli y su enzima Eco R1, esta enzima identifica la secuencia específica porque hay una estructura asociada a la secuencia específica. Y entonces luego que se corta se pueden generar: un extremo cohesivo (el dna cuando se corta genera dos fragmentos los cuales no son parejos entre sí, con extremos libres), y un extremo romo (genera dos fragmentos parejos). Esta propiedad incide en la eficiencia de clonamiento.

Si la secuencia sufre una metilación, la enzima no puede reconocer la secuencia puesto que no esta en su estado nativo y por lo tanto esto es un tipo de restricción. ¿cuántas enzimas hay? Muchas, la diferencias están en la secuencia que identifican y además en la extensión de la secuencia. Algunas pueden reconocer sitios de 4 pb (Iso1) y otras de 20 pb (MTS). La diferencias entre los fragmentos generados es que: es más frecuente encontrar fragmentos cortados de Iso1 que por MTS. Por lo tanto decimos que los fragmentos más comunes son más cortos. Si tengo AGCT y quiero estimar el tamaño

promedio de un fragmento que será cortado con Mst1. Lo calculo primero encontrando la frecuencia de encontrar cada uno de los nucleótidos (para encontrar A es ¼, para encontrar C en ¼ ...) y luego obtengo 1/256... 256 será el tamaño promedio que obtendré en el dna luego de incubar a una temperatura adecuada y condiciones óptimas.

Si tenemos un dna genómico y lo separamos por electroforesis y obtenemos: En un caso así podemos saber que la enzima Iso1 corto el dna de más abajo y la MTS la de más arriba. Si corto con una enzima que tiene

una baja frecuencia de corte (debido a que la secuencia es más larga) se observarán arriba puesto que al ser más pesadas avanzan menos. Lo contrario con el corte de una enzima con alta frecuencia de corte.

Cuando cortamos un dna genómico, obtenemos una población de fragmentos y ahora queremos separarlos por tamaño. Si queremos encontrar un gen A, debemos achicar los fragmento para en uno encontrar el fragmento blanco. Primera herramienta: reducción del dna. Segunda herramienta: separarlos. Esto se hace con un gel (de agarosa o poliacrilamida), los de agarosa se usan para separar fragmentos de mayor tamaño, los de poliacrilamida se usan para fragmentos de menor tamaño (hasta 2000 pb). Con un gel de agarosa, depositamos una especie de peineta la cual deja una especie de bolsillos en donde se carga el dna. Se aplica una corriente con polos puestos en casa extremo (dna es negativo) por lo tanto avanza al positivo. Esto se tiñe con BROMURO DE ETIDIO, el cual se va intercalando entre las bases. Así puedo ver por luz UV los lugares donde este está concentrado (está concentrado donde hay dna), y observo bandas (un fragmento de dna lineal). Si pongo marcadores de tamaño molecular, podré estimar el tamaño de cada banda. Pero no puedo estimar el tamaño si comparo las bandas de dna lineal con un marcador de peso molecular de dna circular, porque no tiene el mismo avance electroforético. La forma que adquiere el dna mientras avanza en la matriz es distinto.

Cómo se visualiza un dna genómico digerido por una proteína de restricción, en diapo vemos. Uno obtiene un chorreado que va desde arriba hasta abajo generalmente, no se ven bandas tan definidas. Tenemos un dna que cargamos en agarosa, si ponemos marcadores de tamaño molecular podemos estimar el tamaño de la banda en cuestión. Que pasa si la cortamos con una enzima bamh1: tenemos en el carril 2 el tamaño del fragmento mayor da “4,5” y el menor “2,5”. Por lo tanto cuantos sitios de banh1 hay en este fragmentos... solo 1 sitio de corte, porque generó dos fragmentos. Si lo corto con pst1 obtengo 5,5 y 1,5 por lo tanto también tengo un sitio de restricción (de corte). Si lo corto con las dos en forma simultánea genero el de 2,5 y a partir del mayor obtengo los

otros dos. Si vemos las posibilidades que hay de ubicar las posiciones de una enzima que tiene este patrón de bandas podemos ordenar las enzimas y determinar la distancia desde el origen a cada punto de restricción. Si hacemos una restricción a dna genómico con muchas enzimas podemos hacer un mapa génico. El sitio de corte solo es modificado por metilación o mutación.RELACION (matemática) ENTRE TAMAÑO MOLECULAR Y AVANCE ELECTROFORÉTICO PARA CALCULAR EL TAMAÑO DEL FRAGMENTO BLANCO con esto se puede calcular el tamaño de los fragmentos.

Ahora lo que queremos hacer es identificar dentro de la población de los genes separados, encontrar nuestro gen A. Para ello se aplica el SOUTHERN BLOT lo que hace es buscar la ubicación del fragmento en nuestro contexto cromosómico y determinar la cantidad de copias presentes de nuestro gen blanco.Cuando uno comienza sin conocer la naturaleza de la muestra, se usan muchas enzimas para armar un puzzle. Suponemos que vamos a generar una sonda del gen A, o sea un fragmento de dna que tiene la secuencia blanco la marcamos con radioactividad en el extremo 5` (fósforo 32). Si este dna se aparea con un dna homólogo, se emitirá radiación y esta

radiación la vamos a pesquisar. Entonces vamos a transferir esta muestra de dna a mb ductible de plástico con carga, se pasa por capilaridad la muestra a la mb y así obtendremos el dna inmovilizado (porque está fijado) en la mb. Cada posición del dna en este gen nos da cuenta del tamaño. Esta mb se incuba con una sonda radioactiva y todos los que son homólogos entre sí se van a hibridar, por lo tanto le ponemos una placa de rayos X y obtenemos una auto radiografía. Se ven bandas y cada una de ellas nos dice sobre los fragmentos en donde se híbrido nuestra sonda, y podemos conocer el tamaño de nuestro dna genómico y su tamaño molecular.Cuando cortamos con esta otra enzima obtenemos dos fragmentos y por lo tanto la sonda tendrá un extremo de la secuencia blanco por un lado y el otro extremo por otro. Lo que genera dos bandas pero de = tamaño. * para esto se debe conocer el fragmento blanco.

Para perpetuar en el tiempo el fragmento blanco hacemos un clonamiento de dna, para ellos purificamos la región donde esta el fragmento, y este lo incorporamos a un sistema genético para que lo mantenga (un vector de clonamiento: sistema que acepta el dna, es un dna foráneo, y que se incorpora a un sistema biológico y lo va replicando). El vector con los fragmentos blancos incorporados, lo incorporamos a una bacteria (sistema biológico). Si sometemos estas bacterias a un sistema de selección podemos asegurar que la bacteria tiene el vector incorporado, esto se hace con colonias aisladas. No se usa PCR porque, en el caso de que se degrada el dna se pierde todo, en el caso clonamiento es más difícil que sea degradado. Los

2 ATP2 AMP + 2 PPi

vectores son unidades de dna (dna blanco + dna foráneo) que necesitan un sistema biológico para perpetuar en el tiempo. Los vectores tienen un origen de replicación, un marcador de selección (por lo general resistencia a antibióticos) y un sitio de policlonamiento (polilinker) y lo que tiene este sitio es varios sitios de restricción generalmente de corte único, y es en ese sitio donde se introduce el fragmento de dna blanco.

En este plasmidio (nuestro vector) tenemos una región de policlonamiento. El dna blanco los cortamos con una enzima generando extremos cohesivos, se corta con la misma enzima al vector generando los mismos sitios de restricción para que el vector se empalme exactamente con el dna blanco. Aquí tuvimos que incubar al plasmidio (vector) y al dna blanco con la misma enzima. Para que esto se ligue debemos montar una reacción de ligamiento, poner enlaces fosfodiéster entre

estos residuos para restituir la doble hebra, esto depende de ATP y una ligasa. La ventaja de esto es que podemos generar clonamientos dirigidos. En este caso el fragmento,

si el izq es el vector, el fragmento al cortarlo con la misma enzima puede empalmar en una sola posición, esto es el ligamiento dirigido. ¿pero porque el fragmento original que fue cortado del dna del plasmidio no puede volver a insertarse de donde salió en vez de que se inserte nuestro vector? En realidad existe aquella competencia entre que empalme el original y nuestro dna blanco, lo que se hace: para que ocurra el enlace fosfodiéster debe haber un extremo 5`fosforilado ya sea del dna blanco o del dna del plasmidio que fue roto. Generalmente las enzimas de restricción dejando un fosfato en el extremo 5`y el 3`desfosforilado (que no se liga), y para favorecer el ligamiento entre el vector y el dna blanco lo que se hace es fosforilar el vector en su extremo 5`y desfosforilar el dna blanco en el extremo que fue cortado, para que pueda solo ligarse el vector y el dna blanco. Si quieres utilizar este fragmento como sonda no importa la dirección en que será clonado y da lo mismo como se replique. Pero si queremos una replicación en cierta dirección debemos dirigir

la replicación, con señales en el promotor. Tenemos la región de policlonamiento y en las secuencias aledañas a esto hay secuencias conocidas. Si tenemos un partidor que se empalme a esa secuencia conocida, podemos indicar cual secuencias (de las dos complementarias) queremos replicar.

Para obtener un clonamiento debemos incorporar esta reacción de ligación en bacterias y esto lo podemos hacer de tres formas: transformación química, electroporación y transfusión por liposomas. O sea, tenemos una hebra de dna circular que tiene origen de replicación, marcadores de resistencia, hicimos la reacción de clonamiento con ligasa e incorporamos el fragmento a una unidad replicativa. El método de transformación química: uno prepara células que están en un medio CaCl, y por un cambio de temperatura hace que la mb genere poros y por lo tanto entra el vector.

En el método de electroporación, tomamos bacterias y las ponemos en cubetas con electrodos en el interior, incorporamos la mezcla con el vector, generamos una diferencia de potencial y esta genera poros a la célula por donde ingresa el dna. La otra es transfusión por liposomas, en donde el liposoma se fusiona con la mb y se incorpora el vector que iba dentro del liposoma. Al ser incorporado a la bacteria

este es incorporado a la maquinaria de replicación, los vectores se incorporan en varias copias.

Tenemos una sopa de bacteria con el dna y nuestro vector, lo que hacemos ahora es el SCREENING DE COLONIAS, las bacterias las plaqueamos en un medio selectivo, si la bacteria no incorporo el plasmidio es susceptible al marcador de selección que estamos considerando. Si el vector tiene resistencia a ampicilina, solo las bacterias que contienen este vector sobreviven en un medio con ampicilina, las que no incorporaron el vector no tienen la resistencia y mueren. Así solo obtengo las bacterias que tienen el vector. Y con estas bacterias que sobreviven se hace algo parecido a lo que es el Southern Blot, y es que a través de una reacción dirigida con una sonda vamos a detectar la colonia de bacterias que tiene el dna blanco. Esto se llama screening de colonias, los que hacemos es tomar las bacterias y las traspasamos a una mb (ya que no se puede hacer toda la reacción química en la placa). Una vez en la mb la adecuamos a una temperatura en donde se fije el dna blanco de cada posición al punto en donde quedó. Si tenemos la placa con la colonia, la pasamos a la mb y pareciera la imagen invertida de la posición original en la placa. Con esto luego de todo los experimentos para descubrir en cuál de esas posiciones de la mb está el dna que necesito, voy a la placa de la colonia e identifico en que posición estaba. Para esto generamos una replica en la mb, la fijamos en la mb y la marcamos con una sonda radioactiva, los homólogos

hibridarán. Esta interacción específica se revelará con la luz UV en la auto radiografía, esto nos indican que el punto de origen en la placa son los que contienen la copia del dna blanco. Con esto obtengo copias del dna que ando buscando en forma selectiva. Una vez purificado el dna de estas colonias debemos chequear que lo que puso uno es lo correcto, lo que hacemos es cortar el fragmento que conocemos con las mismas enzimas de siempre y así obtenemos un patrón electroforético característico. La otra forma de caracterización es la secuenciación (esta es la prueba inequívoca de la naturaleza del dna).

Hay distintos tipos de vectores, la diferencia principal es la cantidad de pared de bases que aceptan para ser clonados, en general replican en bacterias, algunos pueden codificar proteínas, tienen bacteriófagos (virus de bacterias). Con todo esto del PGH se necesita entidades que acepten grandes segmentos del dna. Uno de ellos son los BAC (cromosoma artificial de bacteria). Los otros son los YAC (cromosoma artificial de levadura) la gracia que tienen es que aceptan grandes segmentos de dna. El

YAC contiene el origen de replicación bacteriano, porque lo que uno tiene es un dna que replica en bacteria. Uno lo compra una vez y tiene el sustrato para cualquier clonamiento en bacterias. Tiene un sitio de policlonamiento, incorporamos el dna blanco que queramos en sitios de corte único en este sitio. Si queremos clonar un fragmento grande de dna vamos a modificar el vector y lo vamos a incorporar en levadura para hacer el screening que habíamos mencionado, así incorporamos el dna a levadura.

Los BAC y YAC lo que hacen es generar genoteca (librería genómica). El dna genómico de un organismo lo

cortamos, lo incorporamos a estos vectores y obtenemos esta gran población de fragmentos que corresponden a parte del dna genómico de este organismo. Cuando uno trabaja con procariontes uno hace estas genotecas (porque no

hay intrones). En eucariontes lo que hace es hacer genotecas de cDNA (dna complementario). Si tenemos intrones el mensajero primario tendrá intrones y exones, para que esto sea codificante debemos hacer splicing para obtener un mensajero maduro en donde fueron removidos los intrones y empalmados los exones. Esto es lo que se hace para generar una genoteca en eucariontes. Por ej para secuencia de la bglobulina, aquí utilizamos una genoteca de cdna. De un cultivo se extrae el rna totales (transferencia, ribosomales y mensajeros), los únicos que codifican para proteínas son los mensajeros. Vamos a tomar ese total de rna y hacemos una reacción de transcripción reversa (RT-PCR), de los totales solo sacamos los codificantes. Los codificantes tienen un poliA y por lo tanto incorporamos un partidor que es un poliT que se complementa y por lo tanto se

hibridan. Si pongo una transcriptaza reversa, generamos un hebra complementaria al mensajero esta hebra es el cdna, la hebra molde seria el rna. Se forma un híbrido (rna-dna) que es inestable, la forma de perpetuas el dna es con una doble hebra de dna, por lo tanto se debe deshacer la hebra de rna y generar un duplex de dna. Esto se llama dna complementario, porque hay una hebra complementaria de rna, y como esta no tiene intrones el cdna es codificante sin intrones. Todas las señales para splicing son conservadas porque el sistema que las reconoce es el mismo, la señal específica es la secuencia de dna, que es la información que uno le otorga.

Los fragmentos generados por YAC y BAC deben unirlos y armar el mapa genético. Porque debemos lograr poner en línea la secuencia total del cromosoma que estemos analizando. Esto se hace cortando el dna genómico con varias enzimas con el fin de generar fragmentos en donde se solapen los cuales son idénticos. En el fondo es buscar cual de los clones tiene la cola del anterior esto se llama “caminar por el cromosoma”. Así se generan genotecas, esto se hace en el pc con programas especiales que lo hacen automáticamente.

Para el práctico de proyecto genoma humano utilizamos páginas madre donde uno va a buscar diferentes tipos de información. Se despliegan de ella muchísimas ventanas y uno de las más utilizadas es una plataforma que nos va a permitir el estudio del genoma mediante las secuencias nucleotídicas que ya hemos incorporado a las bases de datos que se generaron por los proyectos de secuenciaciones del genoma. Existen muchísimas secuencias nucleotídicas y de proteínas en la red. Existen también páginas donde podemos acceder colocando palabras claves, a publicaciones, informaciones bibliografías o dentro de lo que es proteínas acceder y estudiar tanto dominios de estructuras como de estructuras tridimensionales. Comparando las estructuras o dominios que son conservados de un organismo a otro. A través de estas comparaciones podemos ir infiriendo estructuras con grados de probabilidad. Intentamos estudiar ahora genomas completos que expresan en forma coordinada en el tiempo. Con toda esta información entonces podemos llegar a estudiar al mapa génico, como es el de los humanos, donde tienen un “condi” empalmado con otro, donde estas secuencias se repiten y ahora podemos tener la información de todo un segmento donde varios genes se encuentran entre pequeñas barras negras q son los exones (dibujo pagina web). En estas páginas podemos tb acceder a la información específica de ciertos mensajeros, donde en la pantalla que se despliega obtenemos lo siguiente: número o código q identifica específicamente a esta definición, las referencias de su publicación, el año, el tamaño, entre otros. y en el caso de secuencias modificantes entrega la secuencia en un formato internacional que se denomina “fasta”, y podemos ir viendo en la secuencia que nos entrega que el largo total, el organismos del cual se extrae, entre que pares de bases se extiende, el código q identifica la proteína (son diferentes q el del gen). Al alinear secuencias podemos comprar entre organismos y ver que en cierta secuencia hay regiones similares entre ella por lo que seguramente haya un dominio conservado. Cada alineamiento entre la secuencia blanco que hemos incorporado y cada una de ellas tiene un valor probabilística, pareciéndose mas a unas q a otras. Con toda esta información lo q estamos intentando hacer es estudiar el sistema biología de una forma más global y esto es a través de lo que se denomina genómica y posteriormente de lo que es proteómica. La Genómica es el estudio de la expresión conservada de muchísimos genes (secuencias codificantes) y no codificantes a nivel global.

Inicialmente podemos identificar el cromosoma en el cual se encuentra inserto un gen o una secuencia blanco q estamos estudiando, a través de un FISH (fluorescence in situ hibridization). Para esto se tiene una secuencia blanco, se toma una placa metafásica y utilizamos el mismo principio que Southern Blot, hibridación entre DNA y una sonda, donde esta ultima va de antemano marcada con fluorescencia. Dentro de la placa metafísica obtenemos puntos fluorescentes en los cromosomas donde esta dando respuesta la sonda, indicando la ubicación de la secuencia blanco. Si para una anomalía contamos con

algún marcador que ha este nivel me detecta alteraciones cromosomicas, tenemos automáticamente un sistema de diagnostico. Dentro del DNA tb tenemos secuencias que están altamente repetidas dentro los cromosomas, regiones silentes que generalmente no van a ser codificantes. Estas secuencias tienden a ser (unas mas q otras) tan variables que permiten hacer estudios de genéticos, son marcadores. Tenemos regiones denominadas mini-satélites q generalmente están ubicadas en los telómeros, regiones microsatélite q están distribuidas a lo largo de todo el cromosoma dentro de las cuales destacan dos regiones, una alfa que es la que generalmente esta la anomalías para Klinesfelter y se ubica hacia los centrómeros mientras q la beta hacia los telómeros. Sobre la base de la naturaleza de las distintas repeticiones es q se han diseñado mas o menos 5 o 6 aproximaciones para utilizarla experimentalmente como marcadores. Si se tiene una familia de plantas y deseamos saber cuál es más resistente de otros. Al cruzar plantas entre si utilizando plantas transgénicas, podemos cultivarlas pero debemos tener un “algo” q nos indique cual es la mas resistente. Quizás a través de estas secuencias no vamos a conocer que genes lleva, pero al menos nos dice cual será mas resistente.RFLP

(Polimorfismo de la longitud de fragmentos obtenidos por corte en la doble hebra de DNA) Tomando un DNA de un organismo con un tipo de anemia. En un paciente normal estén dos sitios de restricción para el ST1 en cambio en el individuo enfermo carece de sitio de restricción. Si tomamos el DNA de un paciente normal, lo cortamos con ST1 vamos a generar dos fragmentos, en cambio en el paciente enfermo solo 1. Si ese DNA lo corremos en un gel haciendo un Southern Blot utilizando una sonda común para ambos genes al revelarlo vamos a encontrar el siguiente patrón de bandas (fotito clase). Esa diferencia entonces en la longitud de las bandas va a ser RFLP. Los típicos casos de criminalística, tenemos marcadores individuales. En estos casos se corre la muestra de sangre de la victima y sangre encontrada en la ropa de un sospechoso. Este ultimo encontramos marcadores de sangre que son idénticos. Se elabora cortando el DNA separándolos por tamaño y se corre disponiéndose en distintas ubicaciones dependiendo de su tamaño (largo de la secuencia). Se puede tb asociar la técnica de PCR con RFLP. RFLP consistía en cortar un

fragmente de DNA en dos secuencia mediante una enzima. Con PCR vamos a amplificar los fragmentos de DNA blanco y posteriormente se corta con una enzima de restricción. Para este PCR tenemos que conocer la secuencia blanco para poder determinar los partidores y la enzima de

restricción. Esta misma técnica de RFLP puede utilizarse para estudiar ligamiento e identificar los alelos. La sonda identifica una secuencia donde puede haber recombinación. Por lo tanto si se realiza un PCR de un fragmento completo en algún caso vamos a encontrar diferentes tamaños dependiendo de la región donde ocurrió el ligamiento (recombinación). Otro tipo de secuencias q se repiten considerablemente son secuencias minisatélite o variables repetidas en “tanden”, hay secuencias de esta naturaleza de mas menos 20-40 pb q repiten varias veces el mismo cassette. Eso significa q por inserción de alguna de estas secuencias se inactive un gen o produzca anomalías o puede q quizás no lo modifique funcionalmente pero permite identificar individuos, pk la cantidad de copias es diferentes. Un hijo puede tener en cada cromosoma homólogo cantidad de repeticiones diferentes heredades de cada padre. (ejemplo clase) entonces un patrón electroforético va a determinar el largo de las secuencias que es característico para cada individuo. Se utiliza para criminalística y test de paternidad, donde el hijo tiene q compartir bandas con el padre y con la madre.

Obviamente no todas con uno ni con el otro, ya que debe cumplir con las “leyes” de segregación gamética. Para codificar las regiones que flanquean estas repeticiones utilizamos solamente un partidor, por lo tanto la secuencia sobre la cual este se va a alinear tiene q estar ubicar en una dirección contraria para q exista amplificación. Si es q existe una enfermedad en q alguno de los sitios se muto quizás el partidor no empalme por lo q no amplificara una secuencia, entonces una banda no amplificara, dándonos cuenta de una anomalía. Si es q existe una inserción, el tamaño de la banda va a variar siendo mayor y lo contrario si ocurre una deleción. Si estamos seleccionando una planta, algo no esta indicando o nos dice que incide en q sea mas o menos resistente. Se clona directamente esa secuencia teniendo un fragmento más grande. En un gel se observa esto viendo que bandas se comparten entre todos los individuos de una progenie a estudiar, pero si no se comparte entre todos o presentan variaciones podemos hablar de un marcador. Las secuencias microsatélite son ricas en residuos G-C, son muchas repeticiones de 2 bases Ej.: GCGCGCGC, pueden alguna de ellas incidir y generar algún tipo de enfermedad pk se incorporan estas secuencias de repetición en secuencias funcionales generando alguna anomalía o enfermedad. La cantidad de repeticiones en estas secuencias puede variar, porque la enzima polimerasa al replicar tiende a resbalarse, confundiéndose ocurriendo muchas veces. Los microsatélite permiten estudiar marcadores alelos y ver como ellos segregan. (ejemplo profe). Sirviendo para criminalística, pedigrí, ligamiento.Los mas avanzado es poder legar a detectar el cambio en solo un nucleótido. Llegamos a determinar en fragmentos pequeños cambios en solo un nucleótido. Ese cambio en tan solo una sola base determina q al separar una hebra de DNA muchas veces genera en por ejemplo un heterocigoto una hebra de DNA normal y otra con un nucleótido diferente. Si se corre en un gel especial denaturante de poliacrilamina se corre en bandas electroforéticas (avance electroforético) se observaran diferencias a pasar de tener las secuencias un mismo tamaño, esto va a significar que va a existir al menos un cambio de nucleótidos. Hay ciertas posiciones en las secuencias q son blancos de mutaciones no todas con la misma probabilidad. SNP cambia en tan solo un nucleótido, es posible determinarlo por un southern blot. Para diagnosticas enfermedades mediante este método es necesario conocer la enfermedad, partidores y la enzima. La expresión concertada de genes es posible pesquisarla con otras técnicas en las células. En una célula alterada por sobre una célula normal, si sabemos que hay genes q se expresan de manera diferente entre una y otra, los estudiamos. Observando molecularmente el mecanismo concertado entre ellas. En este caso se toma la célula y se le extrae el RNA, poli-ARNA (se purifican todos los mensajeros) generando RNA complementarios, generando una sonda q va a identificar estos RNA. Vamos a generar todas la sondas (con alguna marca) y nos dará cuenta del total de los mensajeros q están siendo expresados en un momento en la célula. se va a hibridar en un soporte en el cual están distribuidos todos los genes de esa célula, obteniendo un resultado donde se va a ver fundamentalmente tres colores. Esto significa, q existe un microchip (dibujo) de material sobre el cual un robot va poniendo arreglos de oligonucleotidos (sondas). Este soporte contiene en cada uno de estos cuadrantes los oligonucleotidos que dan cuenta de un gen. Probablemente dentro de esta distribución tb hayan en alguna región controles, es decir, oligonucleotidos de otra región del gen q me de cuenta del mismo gen. Se híbrida este chip con toda la población de sondas, con los DNA con oligonucleotidos q tenemos fijos en la matriz. si este mensajero no esta siendo expresado en esta célula, no va a quedar apareado y se va perder. no va estar representada la expresión del gen. lo q se ve en total. Se compara la expresión génica de células en distintos estadios, por ejemplo, los mensajeros presentes en un mensajero de células en replicación y mensajeros expresados en células que no se están duplicando. El resultado final entonces son “spot” en cada uno de estos cuadrantes (q para este ejemplo son dos, uno

para cada célula), apareciendo colores diferentes para un mismo gen en las dos células a comparar, entonces cuando se superponen el rojo con el verde (de cada cuadrante) da amarillo. La iluminación con láser da color amarillo, pero si es predomina uno de los dos colores quiere decir q este gen predomina mas en la célula de un estadio (Ej.: cel en proliferación) antes que la otra. Entonces este gen es mayor mente expresado en una célula q en otra, si el color fuera amarillo entonces se expresarían en = grado. De esta manera se puede determinar q genes se expresan prioritariamente una cierta condición sobre otra.

Otro tipo de herramienta son generar animales o organismo q se han modificado genéticamente. El objetivo de esto es generar modelos de enfermedades, como son los ratones knock out, baterías o animales transgénicos q puedan producir proteínas que tengan algún tipo de uso industrial o clínico, tenemos el caso de clonamiento de dolly y lo ultimo q es terapia génica.Con las misma herramientas que se nombraron anteriormente vamos a producir estos organismos; enzimas de restricción, marcadores de selección, secuencias promotoras especificas para una especie por sobre la otra, etc.…Formación de knock out, se utilizan en este ejemplo constructos en el cual vamos a generar un fenómeno en la célula de recombinación homologa y lo q se hace es q aquel gen q se quiere anular su función en el animal lo vamos a incorporar mutado, de tal forma q sea inactivo. Entonces se remplaza el gen por su forma copia mutada inactiva. Esto se hace a través del mecanismo de recombinación homologa. Se tiene en este caso por ejemplo células de un ratón q van a ser modificadas. Lo q se hace es agregar en este constructo un exon q vaya …. Si se inserta un fragmento (caset) tan grande dentro de un gen inmediatamente se inactiva. Si se mezcla este fragmento de DNA con la célula de un organismo q deseamos modificar pueden ocurrir varias posibilidades: q el fragmento q se incorpore no se inserte dentro del DNA cromosómico pasando inadvertido, permaneciendo = el constructo. Puede ocurrir tb q nuestro fragmento a incorporar se inserte en otro q no deseamos incorporar o q este fragmento se inserte y quede rodeado por dos exones. nuestro constructo q estamos construyendo en forma artificial exógena q lleva un “caset q codifica para la inactivacion de una proteína”. Si es q ocurre recombinación homologa, significa q la copia del gen en el cromosoma de las cel del ratón va a quedar la secuencia de los exones, pero ahora interrumpida por esta secuencia. En este caso se elimina la función de este gen en la célula huésped. Como selecciono esto? PK De alguna forma hay q limpiar esta célula, de dos situaciones para quedarme con la primera. Aquí se utilizan los sistemas de selección. Si en un caso el fragmento (q otorga resistencia ante cierta solución a la cel) no es incorporado, las células al no tener resistencia, si se coloca en el cultivo esta solución la célula se va a morir, por lo tanto solo las células q hayan incorporado esta secuencia va a prevalecer, independiente de si incorporaron el costructo en forma homologa o al azar. Aun tenemos dos situaciones donde se puede haber incorporado nuestro constructo de manera inespecífica a cualquier gen o como se quiere, específicamente mediante precombinación homologa, al gen q deseamos. Que va a pasar? Cuando ocurre la recombinación homologa dos secuencias se pierden o fragmentos del contracto se pierden. Si ocurre recombinación homologa entre estos dos exones (DIBUJO!!!) este segmento va a ser incorporado incompleto. Si este segmento se inserta en un gen de forma inespecífica, se incorporara el total de la secuencia, lo q permitirá la segunda selección. Ej.: una secuencia expresa para una quinasa, si en medio se coloca una sustancia q es el "Glan istrio", esto es el análogo de una base nucleotídica q es fosforilada y se incorpora al DNA q replica, pero es inactiva, por lo tanto la célula se muere. Con estos dos sistemas de selección me aseguro q una población de células lleven mi constructo en el lugar especifico deseado, es decir, q haya ocurrido recombinación homologa.

Entonces en un ratón q incorporo la secuencia no va a ocurrir un spliccing para el gen q estamos trabajando, ya q en vez de tener un intron va a tener el gen de resistencia para neomisina (por ejemplo) quitándole la función al gen. ¿pero pk. habría de codifican entonces para el gen de resistencia a la neomisina?Las células q tengo ya cultivadas se las incorpora a blastocitos de ratón, pk son células están “fem”, quiere decir q conservan su forma no diferencial, su forma no esta completamente diferenciada, por lo tanto se pueden incorporar estas células a nivel de blastocito y posteriormente se coloca este blastocito en una madre caritativa. Finalmente lo q ocurrirá es el nacimiento de un ratón quimérico y q va a llevar tanto las células de forma nativa como las células q nosotros estamos q han sido ya tratadas, anulando la expresión de un gen deseado. Lo q va a ocurrir cuando tengamos varios de estos ratones de quimera maduros, se realizan cruzamientos entre ellos y dentro de la población se va a heredar este gen (forma mendeliana), tendremos entonces la posibilidad de ¼ q uno de los ratones de la F1 lleve el homocigoto del gen mutado, o sea, gen inactivo. Por lo tanto este ratoncito se cuida mucho, pk es el primer ratón transgenico. El cual se utilizara entonces como modelo de enfermedades. Tenemos tb obtención de proteínas sintéticas, para utilizarlas con fines terapéuticos, industriales, alimentarios, etc. Tenemos dos sistemas para obtener proteínas recombinantes: una es un sistema bacteriano, donde un plasmidio de origen de replicación bacteriano tiene clonado una secuencia de cDNA. Al cDNA se le denomina a toda la secuencia q codifica para un mensajero maduro. La bacteria si tiene río arriba de esto las señales de inicio de trascripción va a generar su mensajero. Si ese mensajero lleva la secuencia de inicio de traducción propiamente, la bacteria va a ir haciendo proteínas, lo q se obtiene finalmente es una proteína recombinante. Y esa proteína puede ser una de eucacarionte, pp. la secuencia q se inserta dentro del plasmidio se elige. Si se tiene una proteína q va a codificar para la insulina humana, quizás esta proteína si es sintetizada en procariontes no va a ser tan activa ni funcional como en eucariontes, ya q el plegamiento y la q estructuren la forma 3D de la proteína no sea la misma. PK?? Si es q aquí no se obtiene resultado de esto lo q se hace es utilizar una levadura, q es un sistema eucarionte. En bacteria por ejemplo se produce la hormona del crecimiento humano, lo único q se ha tenido q hacer es remover, de el gen para la hormona, los primeros nucleótidos q corresponden a un sistema eucarionte, por lo q no le va a hacer nada. Lo q hay q hacer entonces es remplazar esto, diseñando en laboratorio las secuencia q va a identificar el huésped q en este caso va a ser bacteria. Qué más podemos hacer: Tenemos bacteria por un lado. Qué pasa si la proteína no se pliega en forma nativa para un sistema eucarionte superior. Tenemos la clase de hacer animales trasgénicos, desde peces a vacas, a lo que quieran. En este caso qué se hace: Lo que se incorpora tiene 2 alternativas. Podemos nuevamente hacer algo similar a lo que hicimos con el knock out , que es incorporar células que llevan ahora un transgen. Qué es un transgen? Que va a dar origen a un transgenico, es un gen q normalmente un organismo no lo contiene, otorgándole una caracteristica diferente. Lo q se desea es q esta caracteristica se perpetué en el tiempo, y la única manera lograble es q el gen q estamos incorporando vaya a la línea germinal. Si ese transgen termina en una célula somática, solo se va a tener mientras viva el organismo, pero no va a ser heredable, perdiéndose la línea. Como podemos hacerlo perpetuar? Haciendo miles de inyecciones hasta q por azar una de este transgen vaya a la línea germinal y se exprese. Como podemos incorporar esto? Mediante células q ya lo contengan, como se nombro anteriormente, incorporándose a nivel de blastocito. Lo q suele hacerse es inyectar huevos de peces en estadios de una célula. Lo q se hace en laboratorio es colocar los huevos en ranuras, q son canales de azarosa, y el ancho conside justo con el diámetro del huevo por lo tanto se alinean y en lupa con un microinyector incorporar el DNA. Una vez en el núcleo tenemos la suerte ojala de q esto se incorpore en el DNA cromosómico. Si esto se incorpora y además va a dar a una célula germinal tenemos

eventualmente un transgenico. Por ejemplo: lo q se hizo en un ratón fue q se incorporo un DNA q codifica para una hormona, pero este promotor responde a la presencia de metales pesados, por lo tanto es un promotor inducible, el cual en el momento en q se le coloca la condición se activa el promotor. Si es q esta en ausencia de metales pesados esa hormona jamás se va a sintetizar. Lo q se hace nuevamente es incorporar ese DNA en el huevo, si es q se incorpora en la línea germinal. lo q va a ocurrir si se incorpora mas metal es q se producirá mas hormona de crecimiento por lo tanto este ratón va a crecer mas. Por lo tanto si tratamos una población de animales una parte con metal y otra sin metal lo q se obtendrá será un grupo de ratones pequeños y otro de ratones grandes. Aquel transgenico q ha sido tratado con metal será grande y si e pequeño puede tratarse de un transgenico q no ha sido tratado con metal (por lo tanto no ha sobre expresado la hormona) o un ratón nativo. En la acuicultura se intenta tener salmones lo mas grande posible, con mayor musculatura lisa… mas pesados… mas plata $$$. Por lo tanto lo q se hace es un constructo empalmando secuencias con enzimas de restricción. Se hace colocando un promotor fuerte q tenga varios inicios de trascripción para q haya mas mensajeros de una hormona q permita q el pez crezca mas. En otro ejemplo se tiene una oveja la cual en su leche tiene una proteína x, de promotor beta lactoglobulina. Se le ha colocado un promotor, se ha incluido en el huevo, se genera un animal transgenico y resulta q ahora esta proteína x sale en la leche. Entonces una fabrica mientras pueda cuidar la oveja, tiene la producción constantemente andando.Se tiene otro ejemplo similar, pero diferente donde se genera un animal. El caso de la oveja dolly. Se tiene un huevo al cual se le extrae el núcleo y se le incorpora el nucleo de la madre el cual ya es diferenciado. Todo el núcleo q se coloca es capaz de ser introducido en una oveja de una especie distinta, generándose el clon de la madre. Esto q significa? q todo este núcleo q se coloca en conjunto con este citoplasma tiene el total de la información para generar en este caso (como lleva la info exacta de la madre) un clon de la madre. El problema q existió con la dolly fue q tenia la misma edad de la madre, eso significa, q probablemente las modificaciones estaban presentes en el núcleos q se utilizo, ya iba diferenciada. Lo q de alguna forma repercute en la edad de lo q es la dolly. Ya hay modificaciones de metilacion, q generalmente ocurre en los promotores. promotores pueden haber quedado apagados y nunca se activaron en su momento por lo tanto la edad q llevaba la hija era la edad de la madre. Terapia génica, su fundamento es no hacer una diagnostico de la enfermedad, sino reponer la anomalía. Si es q la falla se encuentra en una enzima o gen especifico, la idea de estos es introducir de alguna forma en el individuo esta copia y reponer la falta. Como funciona? Se tiene un transgen q se puede incorporar al huevo o a células y atacar lo q es la terapia germinal a un blastocisto esto naturalmente en animales. Aquí lo q se incorpora es el trasgen tal cual se vio anteriormente, donde se incorpora ese trangen en células huésped. Y esas células q ya se sabe q son modificadas y q llevan el transgen la incorporan a este blastocito. Este ultimo al ser introducido dentro de una madre va a generar un animal q va a expresar esta información. Para esto nos tenemos q valer de q la info q estemos poniendo se exprese en el momento q se debe y en el tejido q se debe. Por lo tanto los contructos q aquí se generan son distintos, tienen q llevar secuencias tejido especificas y temporalmente determinados ojala. Lo q se hace normalmente y es muy básico, uno de los tantos sistemas q se tienen. Se puede incorporar este gen aun paciente, por ejemplo niños burbuja, q tienen problemas en una enzima. Lo q se hace es tomar células … se les incorpora el transgen y se introducen las células de nuevo y se espera q la incorporación de este DNA genere la respuesta q repone la falla. Esto se denomina terapia génica ex vivo. In vivo quiere decir q se incorpora de alguna forma el transgen en el DNA genomico del individuo, muchas veces se utilizan virus para esto. Los cuales no producen problemas virales la secuencia q tienen para introducirse en la cel es lo q se utiliza para introducir el transgen. Se pueden hacer dos tipos de terapia; una más bien somática y otra mas bien apuntando a la línea germinal. Lo q se genera a

la larga es un organismo transgenico en la línea germinal, mientras q una terapia somática solamente va a ir a una población de tejidos a reponer la falla. Para poder introducir en eucariontes la secuencia q deseamos el virus necesita ciertas proteínas básicas para introducción a la célula por lo tanto se conservan y las q pueda adolecer son las q se reemplazan por el transgen q deseamos introducir. A los niños burbuja se les daba en los años 70 una proyección de vida de dos años aprox., pp. no pueden montar respuestas inmunes. Lo q se hizo fue introducir a las células el gen normal especifica para esta enzima, adenosina de aminasa de la sangre. Se repuso la copia normal del gen. el constructo fue hecho en un retro virus q sea virulento, se le sacaron las secuencias de replicación del virus, pero se mantuvo las secuencias q generan el sistema de ingresion de la célula. Estas células q fueron seleccionadas introdujeron nuevamente en las células de la medula del chico. Estas células fueron capaces de recuperarse siendo capaz de generar nuevamente una respuesta inmune.Finalmente sabes q los seres humanos nos diferenciamos muy poco respecto al genoma del mono (98 y algo % iguales). Ojala se utilice todo este tipo de información en beneficios tanto de lo q es natualeza como de convivencia con otro seres valen tanto como nosotros.