DNA Presentacion
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8/19/2019 DNA Presentacion
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FUNDAMENTOSDEL DNA
18 Febrero 2016
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Nobel 1962
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Almacenamiento de información genética
1869 Miescher aisló una sustancia con fósforo de núcleos decélulas, que llamó nucleína
Laboratorio Hoppe-Seyler
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Principio de transformación
Streptococcus pneumoniae
Frederick Grifth
La sustancia pasa desdela bacteria muerta a laviva =FACTOR DE
TRANSFORMACIÓN
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1944
¿DNA O PROTEÍNA?
Realizaron el experimento conlas bacterias de GrifthStreptococcus pneumoniae
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Experimento para la conrmación (1952)
Alfred D. Hershey y Martha Chase
https://www.youtube.com/watch?v=inysl_ydfzQ
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Composición del DNA
Erwin Chargaff
Composición del DNA! La composición del DNA generalmente varía de una
especie a otra.! El DNA aislado de diferentes tejidos de la misma
especie tiene la misma composición de bases.! La composición de bases de DNA no cambia en un
organismo con la edad, estado nutricional o cambiode ambiente.
! En todo el DNA, el número de adenosinas, es igual ael número de timinas (A = T) y el número deguanosinas es igual al número de citosinas (C = G)
! A+G = T+C
Humanos A=30.9 T=29.1 G=19.9
C=19.8
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DNA
Polímero de deoxironucleótidosSe encuentra en cromosomas, mitocondria y
cloroplastos
BASEAZÚCAR
FOSFATO
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Los nucleosidos y bases analógas pueden tener usos como
Anticancerígenos
Su ecacia radica en que seune de forma irreversible ala enzima timidilato sintasa ,esencial para la síntesis denucleótidos de timina .
Leucemia linfoblástica aguda (LLA)
Agentes Antirretrovirales
Azidotimina
Aprobado en 1987 como un medicamento indicado para personasinfectadas con el VIH por su efecto retardador de la extensión de lainfección por VIH,
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La secuencia del DNA siempre se sintetiza del 5` a 3´
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La estructura secundaria del DNA es unaDOBLE HÉLICE
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! 2 cadenas antiparalelas quegiran sobre el mismo eje
! Los grupos fosfato de lascadenas envuelven la periferia
! Bases ocupan el núcleo
f o r m a n d o b a s e scomplementarias A-T, G-C! Se mantiene unida por puentes
de hidrógeno
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2 puentes de hidrógeno entre A-T3 Puentes de hidrógeno entre C-G
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Apilamiento
Las bases nitrogenadas en el DNA sonplanares y tienen tendencia a apilarse
Fuerzas de apilamiento
Interacciones hidrofóbicas y fuerzas devan der Waals
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Formas estructurales del DNA
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Estructura terciaria
El DNA de doble hélice se enrolla alrededor de las histonas
El DNA se une a para formar bras llamadas nucleosomas (10 nm)
Nucleosomas contienen 146 nucleótidos
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Nucleosoma
Son unidades globulares repetidas de cromatina que consiste en un complejo histona y D
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Compactación del DNA en el cromosoma
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EN RESUMEN
! El DNA esta formado pro 4 bases A, G, T, C, que se encuentran en formaciónlineal por arreglos de enlaces fosfodiéster.
! El DNA está organizado en 2 cadenas antiparalelas por el emparejamiento delas bases A-T y G-C en cadenas complementarias. Estas cadenas forman unadoble hélice alrededor de un eje central.
! Las 3x10 9 pares de bases del DNA humano están organizadas en 23cromosomas
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REPLICACIÓN
Proceso de duplicación de la cadena de DNA(Síntesis de una nueva cadena idéntica)
Participantes
Doble hélice del DNA
DNA Polimerasa I y III
Helicasa
Topoisomerasa
SSB Primasas y ligasas
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Características generales
1. Complementariedad entre las bases del DNA
Recordemos….
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2. Proceso semiconservativo
Cada una de las dos cadenas sirven de molde para la síntesis de nuevas cadenas
3. Dirección de replicación 5´- 3´
4. Primer (cebadores)
Pequeñas unidades de RNA (20 nucleótidos)
5. Primasa
Enzima que introduce el primer
6. DNA polimerasa
Participan en la polimerización del DNA
7. Origen de Replicación
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8. Replicación Bidireccional
FRAGMENTOS DE OKASAKI
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DNA pol I DNA pol II DNA pol III
Estructura Monómero109 kD
Monómero90 kD
Multiméro900 kD
Función
Elongación,
corrección yreparación
Elongación,
corrección yreparación
Elongación,
corrección yreparación
AusenciaAfecta la
reparación delDNA
Ninguna conocida Incompatible con lavida
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PCRReacción en cadena de la DNA polimerasa
Técnica desarrollada en 1985 por Kary B. MullisPremio Nobel Química 1993
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Técnica de Biología Molecular que tiene por objetivo la amplicación directa de un geno fragmento de DNA
Amplica millones de fragmentos pequeños de DNA hasta 10 Kb en períodos cortos
Amplicación
Detección
PCR
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FUNDAMENTOS
Mimetiza el proceso de replicación
Complementaridad
Capacidad del DNA para desnaturalizarse y renaturalizarse
PARTICIPANTES
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PARTICIPANTES
1. Molde (Template) DNA
2. Primers
3. DNA PolimerasaMicroorganismos arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth).Generalmente se emplean mezclas del polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (Pfu, Vent).
4. Mg++
5. Deoxynucleótidos dNTP´s
6. Buffer
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MOLDE O TEMPLADO
Es la molécula que contiene la región de DNA que quiere amplicar
Se requiere poca cantidad
No se requiere puro
Tiene que se libre de altas concentraciones de EDTA
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Deben ser especícos para la secuencia a amplicar
Deben tener idealmente entre 40-50% CG
Deben evitar estructuras secundarias
Generalmente su longitud debe variar entre 18 y 30 pb
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Los primers se ligan a su secuencia complementaria en el DNA target* Un primer compuesto por solo 3 letras, ATT, por ejemplo, tiene una alta probabilidadde encontrar complemento mas de una vez
*A medida que el cebador crece en nucleótidos, la probabilidad de que una secuencia de letras se encuentre repetida se vuelve más remota.
Por ejemplo
Características de un buen Primer
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Características de un buen Primer
Temperatura de fusión (Tm) en el intervalo de 50ºC a 65ºC
Temperatura a la cual el 50% de las cadenas seencuentran separadas
Que no formen horquillas > a 3pb
Bajo contenido de GC para evitar exceso de anidad no complementaria
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Sólo puede existiruna zona complementaria en el DNA donde el primer se una, lo cuasignica que el primer debe ser irrepetible
La composición de las bases afecta la especicidad de la hibridación así como su temperatLa composciión aleatoria de bases es lo mejor.Evitar primers con secuencias de conformación GCGCGC o ATATAA
Un contenido de G+C alrededor de 40-50% nos proporcionará una buena temperatura dealineamiento
Temperatura de hibridación
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Temperatura de hibridación
Se calcula usando la temperatura de fusión (Tm) de los primers
Thibridación = Tm_primer - 4 ºC
Si los primers son complementarios entre si, y se hibridan entre ellos en lugar del DNAmuestra, la eciencia de la PCR se verá afectada drasticamente
La temperatura de hibridación debe ser mutuamente compatible. La máxima diferencia
permisible en la temperatura de los 2 primeros es de 3ºC.
RESUMEN
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RESUMEN
ESPECIFICIDAD: Asegurar que a secuencia complementaria sea única
LONGITUD: 17-28 Bases
COMPOSICIÓN DE BASES: El contenido promedio (C+G) en el intervalo de 40-50% yregiones ricas en (A+T) y (G+C)
TM : intervalo de 55-70ºC
Minimizar la posibilidad de formación de estructuras secundarias, horquillas y dímeros
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La muestra del DNA, Taq o Pfu, el tampón, los núcleotidostrifosfato y los cebadores son vertido en tubos de paredesdelgados y estos puestos en un termociclador de PCR
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CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCGM A F P I P A R Q L F I
CATTTAACCAAGA ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATCD G E W R E P I K K N R U P V
GAC GGA GAG TGG AGA GAA CCC ATT AAA AAA AAT CGC ATA CCC GTCI N P S T E E I I G D I P A A
ATC AAT CCG TCC ACT GAA GAA ATC ATC GGT GAT ATT CCG GCA GCCT A E D V E V A V V A A R R A
ACG GCT GAA GAT GTG GAG GTT GCG GTG GTG GCA GCT CGA AGA GCCF R R N N W S A T S G A H R A
TTT AGG AGG AAC AAT TGG TCA GCA ACA TCT GGG GCT CAT CGT GCCT Y L R A I A A K I T E K K D
ACA TAC TTG CGT GCT ATT GCT GCT AAG ATA ACA GAA AAA AAA GATH F V K L E T I D S G K P F D
CAT TTC GTT AAA CTG GAA ACC ATT GAT TCT GGG AAA CCT TTT GATE A V L D I D D V A S C F E Y F
GAA GCA GTG CTG GAC ATT GAT GAC GTT GCT TCA TGT TTT GAA TAT TTTA G Q A E A L D G K Q K A P V
GCC GGA CAA GCA GAA GCT CTT GAT GGT AAA CAA AAG GCT CCA GTCT L P M E R F K S H V L R Q P
ACC CTG CCT ATG GAA AGG TTC AAA AGT CAT GTT CTC AGG CAG CCCL G V V G L I S P W N Y P L L M
CTT GGT GTT GTT GGA TTA ATA TCC CCA TGG AAT TAC CCA CTT CTA ATGA T W K I A P A L A A G C T A
GCT ACA TGG AAA ATT GCT CCA GCA CTT GCT GCT GGG TGT ACA GCTV L K P S E L A S V T C L E F
GTA CTT AAG CCA TCC GAG TTG GCA TCT GTG ACT TGT CTA GAA TTCG E V C N E V G L P P G V L N
GGT GAA GTT TGC AAC GAA GTG GGA CTT CCT CCA GGC GTG TTG AATI L T G L G P D A G A P L V S
ATC TTG ACA GGA TTA GGT CCA GAT GCT GGT GCA CCA TTA GTA TCAH P D V D K I A F T G S S A T
CAC CCC GAT GTT GAC AAG ATT GCC TTT ACT GGG AGT AGT GCC ACTG S K V M A S A A Q L V K P V
GGA AGC AAG GTT ATG GCT TCT GCT GCC CAA TTG GTT AAG CCT GTTT L E L G G K S P I V V F E D
ACA TTA GAA CTT GGG GGT AAA AGT CCT ATT GTA GTG TTT GAA GATV D I D K V V E W T I F G C F W
CTA GAA GTT GGA GCT GTT TGG GTT AAT TGC TCA CAA CCA TGC TTT GTTQ A P W G G I K R S G F G R E
CAA GCT CCT TGG GGA GGC ATC AAG CGT AGT GGT TTT GGA CGT GAAL G E W G I Q N Y L N I K Q V
CTT GGA GAA TGG GGT ATC CAG AAT TAC TTG AAT ATC AAG CAG GTGT Q D I S D E P W G W Y K S P
ACT CAA GAT ATT TCT GAT GAA CCA TGG GGA TGG TAC AAG TCT CCT
TGA
DNA POLIMERASA
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DNA POLIMERASA
Taq polimerasaComete un error por cada 10000 nucleótidos
Temperatura 72ºCNo posee actividad correctoraNecesita Mg2+ como cofactor
Mg2+ en altas concentracionesafecta la especicidad,
amplicaciones inespecícas,forma complejos con los dNTP´s
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¿CÓMO SE HACE?
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Diseño del Primer
Extracción del DNA
PCR
DETECCIÓN
¿CÓMO SE HACE?
ETAPAS
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ETAPAS
Desnaturalización Alineamiento
ExtensiónELONGACIÓN FINAL
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¿Cómo podríamos monitorear la PCR?
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Microscopiade polímero de
agarosa
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Uso de “colorantes”
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1 BROMURO DE ETIDIO
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1. BROMURO DE ETIDIOEs un agente intercalante
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Syber SafeBromuro de Etidio
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CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCG
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CGTTGCGTGCTCGCCTTACCCTCTCAACTCAATTTCTTCAACCCAATTTCTTCGM A F P I P A R Q L F I
CATTTAACCAAGA ATG GCG TTC CCA ATT CCT GCT CGT CAG CTA TTC ATCD G E W R E P I K K N R U P V
GAC GGA GAG TGG AGA GAA CCC ATT AAA AAA AAT CGC ATA CCC GTCI N P S T E E I I G D I P A A
ATC AAT CCG TCC ACT GAA GAA ATC ATC GGT GAT ATT CCG GCA GCCT A E D V E V A V V A A R R A
ACG GCT GAA GAT GTG GAG GTT GCG GTG GTG GCA GCT CGA AGA GCCF R R N N W S A T S G A H R A
TTT AGG AGG AAC AAT TGG TCA GCA ACA TCT GGG GCT CAT CGT GCCT Y L R A I A A K I T E K K D
ACA TAC TTG CGT GCT ATT GCT GCT AAG ATA ACA GAA AAA AAA GATH F V K L E T I D S G K P F D
CAT TTC GTT AAA CTG GAA ACC ATT GAT TCT GGG AAA CCT TTT GATE A V L D I D D V A S C F E Y F
GAA GCA GTG CTG GAC ATT GAT GAC GTT GCT TCA TGT TTT GAA TAT TTTA G Q A E A L D G K Q K A P V
GCC GGA CAA GCA GAA GCT CTT GAT GGT AAA CAA AAG GCT CCA GTCT L P M E R F K S H V L R Q P
ACC CTG CCT ATG GAA AGG TTC AAA AGT CAT GTT CTC AGG CAG CCCL G V V G L I S P W N Y P L L M
CTT GGT GTT GTT GGA TTA ATA TCC CCA TGG AAT TAC CCA CTT CTA ATGA T W K I A P A L A A G C T A
GCT ACA TGG AAA ATT GCT CCA GCA CTT GCT GCT GGG TGT ACA GCTV L K P S E L A S V T C L E F
GTA CTT AAG CCA TCC GAG TTG GCA TCT GTG ACT TGT CTA GAA TTCG E V C N E V G L P P G V L N
GGT GAA GTT TGC AAC GAA GTG GGA CTT CCT CCA GGC GTG TTG AATI L T G L G P D A G A P L V S
ATC TTG ACA GGA TTA GGT CCA GAT GCT GGT GCA CCA TTA GTA TCAH P D V D K I A F T G S S A T
CAC CCC GAT GTT GAC AAG ATT GCC TTT ACT GGG AGT AGT GCC ACTG S K V M A S A A Q L V K P V
GGA AGC AAG GTT ATG GCT TCT GCT GCC CAA TTG GTT AAG CCT GTTT L E L G G K S P I V V F E D
ACA TTA GAA CTT GGG GGT AAA AGT CCT ATT GTA GTG TTT GAA GATV D I D K V V E W T I F G C F W
CTA GAA GTT GGA GCT GTT TGG GTT AAT TGC TCA CAA CCA TGC TTT GTTQ A P W G G I K R S G F G R E
CAA GCT CCT TGG GGA GGC ATC AAG CGT AGT GGT TTT GGA CGT GAAL G E W G I Q N Y L N I K Q V
CTT GGA GAA TGG GGT ATC CAG AAT TAC TTG AAT ATC AAG CAG GTGT Q D I S D E P W G W Y K S P
ACT CAA GAT ATT TCT GAT GAA CCA TGG GGA TGG TAC AAG TCT CCT
TGA
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VECTORES DE CLONACIÓN
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Los vectores de clonación son moléculas transportadoras que transeren y replican fragmentos de ADN quellevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante . Para que sirva de vector, una molécula debe sercapaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que tener secuencias de
reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar .
PLÁSMIDOSSon ampliamente usados, proceden de moléculas de DNA de doble cadena extracromosóy se replican autonómamente dentro de la célula
pUC18Es un plásmido muy usado, es derivado del pBR322, 10,000 pb
Bacteriofago20, 000 pb
Cósmidos
Plásmido-lambda 50,000 bp
YACSon cromosomas de levadura 100 kb a 1000kb
Plásmido
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Plásmido
1. ORIGEN DE REPLICACIÓNCapaz de hacer copias exactas de si mismo independiente del cromosoma del hosp
2. MARCADORES DE SELECCIÓN
Permite aislar a las células que poseen el gen deseado, generalmente resistencia a uantibiótico
3. SITIO DE CLONACIÓN MULTIPLE (SCM)Sitios de enzimas de restricción en regiones no esenciales. Permite abrir al plásmidinsertar DNA.
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Restricción
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Las endonucleasas se denominanenzimas de restricción , debido aque es la forma de defensa de las bacterias contra la invasión povirus, es decir, restringen la invasión por el DNA viral.
Enzimas de restricción
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Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que
los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.
Permiten cortar DNA de hebra doble donde reconocen secuencias palindrómicas (secu
8/19/2019 DNA Presentacion
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Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuque se leen igual en ambas direcciones)
Nomenclatura Ejemplo Corresponde a:E Escherichia Género de la bacteria
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E Escherichia Género de la bacteriaco coli Especie de la bacteriaR RY13 Cepa de la bacteriaI La primera enzima identificada Orden de identificación de la enzima
E
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Extremos romos
Extremos cohesivos
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Extremos cohesivos
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TRANSFORMACIÓN
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CAMBIO HEREDABLE EN UNA CÉLULA U ORGANISMO PRODUCIDO POR LA INTRODUCCIÓN DE UN DNA EX
Puede ser
NATURAL (se han encontrado aproximadamente 40 especiesque pueden realizar este proceso)
ARTIFICIAL (INDUCIDA)
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El “caballito de batalla” es la bacteria Escherichia coli
Es una técnica fundamental en biología molecular: clonación y generarorganismos transgénicos
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Preparar células competentes de
E coli
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Preparar células competentes de E. coli
3 mL medioLuria
Incubar toda la
noche a 37 ! C
A= 0.6 – 0.8 a 600 nm
Preparar células competentes de
E.
coli
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5000 r.p.m.
5 min4 ! C
3 mL NaCl
Resuspender
5 mL CaCl 2
Resuspender
Preparar células competentes de
Incubar 20 min2500 r.p.m 7
min
!"#$#%&!()*+,+-,+&
LA TRANSFORMACIÓN SE REALIZARÁ POR CHOQUE
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1 hr 42 ! C70 s
Inmediatamente enhielo
1 mL medio SOC
Incubar a 37 ! Ccon agitación por 45 min
QTÉRMICO
Al final de la transformación
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a de a t a s o ac ó
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Células
transformantes
Células
no
transformantes
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