Tecnología del ADN recombinante.pdf
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Tecnologa del ADN
recombinante
Viridiana Lechuga Rosas
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Clonacin de DNA
En 1970 surgen tcnicas que
permiten aislamiento del DNA
Enzimas de restriccin
Ingeniera gentica
Tcnicas del DNA recombinante
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Clonacin
1. Preparacin del DNA
2. Preparacin del vector
3. Unin del DNA al vector
4. Incorporacin del DNAr
5. Propagacin celular y seleccin
6. Expresin del DNA (opcional)
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Enzimas de restriccin
Endonucleasas Tijeras moleculares
Cortan la doble cadena de DNA a travs del esqueleto de fosfatos sin daar las
bases
Especificidad
Proteger a los organismos contra la invasin de DNA extraos
Las enzimas de restriccin no pueden cortar DNA metilado
Permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias
palindrmicas
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Enzimas de restriccin
Tipo I Tipo II
Cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del sitio
de restriccin
No se utilizan en investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es
preciso.
Reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la molcula de
DNA con absoluta precisin dentro de la
secuencia reconocida.
Se usan ampliamente en investigacin de DNA recombinante puesto que cortan en
sitios especficos.
Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II son simtricas (palindrmicas)
Nombran Tres letras tomadas del gnero y especie de la bacteria donde se aisl
Seguida por el serotipo
Nmero romano
Escherichia coli cepa RY13 Eco RI
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DNA metilado
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Enzimas de restriccin tipo II
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Ligasas
Cataliza la formacin de enlaces fosfodister entre bases de DNA
Grupo fosfato en 5
Grupo OH en 3'
Extremos salientes complementarios
Extremos rasurados
Los extremos no compatibles son imposibles de ligar
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Purificacin del DNA
Rompimiento de la estructura que lo contiene y eliminacin de cualquier
sustancia contaminante o molcula unida a l.
Protenas, membranas, sales, etc.
Mtodos
Disolventes
Precipitaciones
Origen de DNA
Tamao y estructura
Uso de molcula
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Purificacin del DNA Pasos Objetivos Mtodos
Lisis Liberar los componentes
internos de la clula
Detergentes fuertes y desnaturalizantes para
lisis de clula
Mtodos para separar el ncleo del
citoplasma
Separacin inicial Remover los
contaminantes
mayoritarios
Precipitacin de cidos nucleicos
Tratamiento con enzimas especficas
Purificacin Remover contaminantes Extraccin
Purificacin final Remover contaminantes
residuales
Mtodos especficos
Confirmacin Determinar pureza y
concentracin
Espectroscopia con luz UV
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Vectores
Portador de DNA que se unir al fragmento que se quiere clonar
Extracromosomales
Replicacin autnoma (replicones )
Plsmidos, virus y bacterifagos
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Unin de vector o inserto
Cortar vector con mismas enzimas de restriccin
Unin con ligasas
DNA recombinante (DNAr)
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Amplificar el DNA de inters
Vectores de insercin
Expresin del DNA por parte de la clula anfitriona
Vectores de expresin
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El vector original tiene sitios de restriccin adecuados para unirlo con el mismo inserto de DNA
Mtodo directo
El vector original no tiene los sitios de restriccin adecuados para unirlo con el inserto de DNA
Policonector
Mtodo indirecto
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Obtencin de fragmentos de DNA
Mtodos
Digestin por enzimas de restriccin Fragmentos de longitud pequeo
Rompimiento mecnico del DNA Fragmentos largos (10000 pb)
Sntesis enzimtica de DNA PCR
Sntesis qumica de DNA Formacin de enlaces fosfodister en
direccin 3-5'
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Formacin del DNA recombinante
DNA que sufre clonacin
Combinar dos fragmentos de DNA de orgenes diferentes
Vector + inserto
Unin covalente in vitro
Ligasa
Productos secundarios no deseados
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Incorporacin de DNA recombinante
Clula anfitriona
Clulas especializadas
Procariticas Eucariticas
Transformacin El inserto de DNA permanece unido a
plsmido
Recombinarse con el DNA del cromosoma
Expresin de una protena Levaduras
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Mtodos de introduccin del DNAr
La permeabilidad de la membrana no permite el paso de DNAr
Mtodo pasivo (facilitar su captacin)
Mtodo activo (directo)
Transformacin (bacterias anfitrionas)
Trasfeccin (virus como vectores)
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Mtodo de introduccin de DNAr
Fsico-qumico Incubacin con CaCl a 0C 37-43 C
Incorporacin pasiva de DNA Interaccin de cationes Fosfato clcico DEAE-dextrano
Agente qumico PEG( polietilenglicol)
Liposomas Fusin con membrana
Vectores vricos Transfeccin
Electroporacin Apertura de poros transitorios en la membrana
Biolstica bombardeo Microesferas recubiertas con DNAr Pistolas de genes
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Deteccin y seleccin de clones
recombinantes Necesario conocer que clulas introducen el material clonado
Mtodos
Mtodo de hibridacin Deteccin de una secuencia del DNA clonado
Sonda marcada
Mtodo inmunoqumicos Deteccin de protena codificada Anticuerpo especfico
Mtodos genticos o de seleccin fenotpica Cambios en clula anfitriona Genes marcadores
Genes que codifican una protena detectable
Genes de resistencia a un antibitico Genes que complementan defectos
nutricionales
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Asociaciones