UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA Facultad de Ciencias Biológicas

DIAGNÓSTICO MOLECULAR MICROBIOLÓGICO

Dr. Homero Ango Aguilar (*)

I. INTRODUCCIÓN La microbiología, es una de las disciplinas más importantes de las Ciencias Biológicas, la misma que como ciencia biológica básica, ha permitido desentrañar y comprender los más sofisticados procesos físicos y químicos que hay detrás de toda actividad biológica, ayudándonos así a comprender la biología de los organismos superiores, incluyendo al hombre; en tanto que como ciencia biológica aplicada, se relaciona con muchos problemas prácticos importantes en medicina, agricultura, minería e industria. Microbiología Molecular, Diagnóstico Molecular ?? Sí, la microbiología continúa evolucionado rápidamente a través del impacto de los nuevos descubrimientos en biología molecular, genética, bioquímica, inmunología y otras disciplinas. Así tos problemas cotidianos clásicos como el diagnóstico, la patogénesis, la respuesta inmune, la taxonomía, etc., pueden ahora ser abordados desde un punto de vista molecular.

II. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO El diagnóstico microbiológico es una de las principales actividades que realiza el Microbiólogo Clínico, y cuyo principal objetivo es proporcionar información exacta sobre la presencia o ausencia en una muestra de microorganismos patógenos que pudieran participar de un proceso infeccioso y ser causa de la enfermedad en un paciente y, cuando sea relevante, ofrecer información sobre la susceptibilidad de los gérmenes aislados a los antimicrobianos, convirtiéndose de esta manera en un instrumento valioso para el diagnóstico etiológico y el tratamiento adecuado y oportuno. La identificación precisa del germen causante de una infección se ha hecho cada vez más importante ahora que es posible una intervención terapéutica eficaz. La probabilidad de conseguirlo depende de una interacción positiva entre el clínico y el microbiólogo; el clínico debe conocer la complejidad de las pruebas y el tiempo necesario para conseguir un resultado. A su vez el microbiólogo debe comprender la naturaleza del proceso infeccioso del paciente y estar capacitado para ayudar al clínico en la interpretación de los resultados. Un paso fundamental en cualquier diagnóstico es la elección de muestras apropiadas, lo que en último término depende del conocimiento de la patogenia de las infecciones.

2.1. Objetivos del diagnóstico microbiológico

a. Aislamiento e identificación de microorganismos.- La mayoría de los patógenos pueden crecer en medios de cultivos sintéticos o semisintéticos o, en el caso de los virus, en líneas de cultivo celular. Lo que posibilita su identificación, y en el primer caso determinar su sensibilidad a los quimioterápicos.

b. Identificación de un producto microbiano específico.- Las Técnicas distintas del cultivo, que no dependen del crecimiento y la multiplicación de los microorganismos para su detección, pueden proporcionar resultados más rápidos. Entre ellas se incluye la detección de componentes estructurales (antígenos de pared celular) y de productos extracelulares (toxinas). También es posible detectar secuencias genéticas específicas mediante la aplicación de sondas de ADN o la amplificación de los mismos a través de técnicas como la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa).

c. Detección de anticuerpos específicos contra un patógeno,- Esta puede ser la técnica de elección cuando no es posible cultivar el patógeno (Treponema pallidum) o cuando al hacerlo sería peligroso para el personal del laboratorio. La técnica se basa en la detección de los anticuerpos o el incremento del título de estos. 2.2 Evolución del diagnóstico microbiológico a. Etapa morfológica, el primer paso fue dado por Antony Van Leuwenhoek (1676) cuando comunicó a la Real Sociedad de Londres que había logrado observar seres diminutos a quienes llamó "animalículos" hecho que marco el comienzo de la microscopía. La observación microscópica se perfeccionó con los aportes de Abbe (Microscopía de Inmersión, 1879); Heimstadt (Microscopía de Fluorescencia, 1911); Knoll y Ruske (Microscopía Electrónica, 1932) y Zernicke (Microscopía de Contraste de Fase, 1935). Cabe destacar en este punto, lo importante que resultara el uso de colorantes como medio de contraste para lograr una mayor resolución, muchas de ellas muy clásicas, se siguen utilizando hasta nuestros días, la Coloración de Gram (Bacterias Gram Positivas y Gram Negativas), Ziehl Neelsen para el diagnóstico de la tuberculosis, Giemsa para paludismo o malaria y Seller para Rabia a través de la detección de los Cuerpos de Negri.

b. Etapa fisiológica, que tomó gran impulso cuando se comprendió que los microorganismos podían utilizar una gran variedad de sustratos y por tanto podían ser cultivados e identificados en base a su actividad bioquímica; formulándose para ello una amplia gama de medios de cultivo, lo que se vio fortalecida con el uso de agentes gelificantes como el Agar-agar (Miquel, Hesse y Koch; 1888), en este contexto es que Robert Koch plantea sus famosos Postulados de Koch, que fue un instrumento metodológico importante en la determinación del agente etiológico de la enfermedades (Shigella dysenteríae "bacilo de Shiga", Salmonella typhi "bacilo de Eberíh", Brucella melitensis "bacilo de Bruce", etc.).

c. Etapa serológica, auspiciada por el entendimiento de que el hospedero al interactuar con el microorganismo patógeno este pone en marcha un conjunto de mecanismos de defensa naturales y adquiridos, en este último caso mediante mecanismos celulares (LT) y humorales (LB) que desencadenaban la formación de los anticuerpos conocidos también como inmunoglobulinas o gammaglobulinas. Estos conocimientos han permitido detectar en los pacientes la presencia de antígenos o anticuerpos, partiendo del conocimiento de uno de ellos. Uno de las primeras enfermedades en ser diagnosticada fue la Fiebre Tifoidea, a través de la Prueba de Widal (1896), utilizándose para ello una suspensión de Salmonella typhi que detectaba el aumento del título de anticuerpos en el paciente contra los antígenos somáticos "O" y flagelares "H", posteriormente se han estandarizado una gran variedad de pruebas serológicas muy utilizadas hasta la fecha: Prueba de Hudiesson, Brucelosis; Prueba de Weil-Félix; Ricketsiosis; Prueba de VDRL, Sífilis, etc. En los últimos años el uso de los anticuerpos monoclonales (Milstein y Kholer, 1975) ha permitido diseñar pruebas con mayor sensibilidad y especificidad.

d. Etapa molecular, esta se inicia en 1972 con la publicación del primer trabajo sobre clonaje de ADN (Tecnología del ADN Recombinante), investigación por la cual el principal investigador Paúl Berg recibiera el Premio Nobel en 1980. Pocos años después, se han comenzado a utilizar las sondas de ADN basada en la complementaridad y capacidad de hibridización de los ácidos nucleicos, que permite identificar aquellos patógenos difíciles de cultivar, por ejemplo, en forma rápida y con alto grado de especificidad. Sin embargo, desde su descubrimiento en 1983 por Kary Mullis y su introducción en 1985 la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), ha revolucionado los sistemas de diagnóstico, aumentando

significativamente la sensibilidad y especificidad diagnóstica.

III. DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO CLASICO 3.1. Introducción Son todas aquellas técnicas que son utilizadas con mucha frecuencia hasta nuestros días, muchas de ellas descritas en el siglo pasado, y que a pesar de ello nos permite hacer un diagnóstico microbiológico en base a las características morfológicas, fisiológicas y antigénicas de los microorganismos, sin embargo su sensibilidad y especificidad en muchos casos son discutibles. Si bien su uso en el futuro se verá restringido pero tiene garantizada su vigencia por muchísimos años más. 3.2. Principales Técnicas: a. Microscopía y Coloraciones, el examen microscópico de las muestras teñidas y sin teñir es relativamente simple y económico, aunque el cultivo es una técnica mucho más sensible para detectar cantidades pequeñas de bacterias. Una muestra debe contener por lo menos 10 000 microorganismos/mi antes de que sea probable la observación de los microorganismos en un frotis. 1. Coloración de Gram: es una técnica cuyo esta muy difundido en la bacteriología y que nos permite separar a las bacterias en dos grandes grupos, las bacterias Gram positivas que tienen la capacidad de retener el Complejo cristal violeta-lugol, luego de la decoloración con alcohol-cetona y las bacterias Gram negativas que se tiñen de color rojo con el colorante de contraste, la safranina O. En base a lo señalado podríamos decir, en términos generales que "Todos los cocos son Gram Positivos, a excepción de Neisseria y Moraxella, en tanto que todos los bacilos son Gram Negativos a excepción de los géneros de la Familia Bacillaceae (esporulados), Mycobacterium y Corynebacterium" 2. Coloración de Ziehl Neelsen: utilizada específicamente para poner en evidencia a las especies de la Familia Mycobacteriaceae, que no se tiñen fácilmente con las técnicas convencionales debido al alto contenido de lípidos a nivel de la pared celular por lo que es

necesario utilizar medios físicos como el calor; sin embargo luego de este proceso no pueden ser decolorados utilizando decolorantes fuertes (alcohol ácido) por lo que se les denomina Bacilos Alcohol Acido Resistentes (BAAR), en este caso generalmente se utiliza como colorante de contraste el Azul de Metileno, Esta técnica se usa para hacer diagnóstico de tuberculosis (MycobactQlium tuberculosis) y de lepra (Mycobacteríum leprae).

b. Aislamiento e identificación, en este caso en base a las propiedades metabólicas de los microorganismos se han formulados una gran variedad de medios de cultivo, así si los microorganismos no son nutricionalmente exigentes se usan medios comunes (Agar Nutritivo, Agar Soya Triplicase) para su aislamiento, en caso contrario es necesario recurrir a medios enriquecidos (Agar Sangre, Agar Chocolate, Agar Infusión Cerebro Corazón), por otro lado; cuando se requiere aislar agentes patógenos específicos de medios con flora microbiana acompañante que es necesario inhibir se usan medios selectivos, que tienen como parte de sus ingredientes uno o más sustancias inhibidoras (Sales biliares, Colorantes,

Antibióticos, etc), en cambio cuando se sospecha que la cantidad de los gérmenes es baja es necesario utilizar medios de enriquecimiento para luego recién proceder a su aislamiento.

Luego de su aislamiento se procede a la identificación respectiva en base a sus propiedades tiníoreales, capacidad de utilizar azúcares, proteínas, aminoácidos, lípidos y otras sustancias, detección de enzimas como la catalasa, coagulasa, DNAsa, descaraboxilasa, ureasa, etc. En base a estas pruebas se establecen los biotipos.

Cabe mencionar, que hace poco en aquellos casos en el que se pueden cultivar e identificar los gérmenes específicos asociados a una determinada enfermedad, la única forma de establecer un diagnóstico definitivo era a través de esta vía; sin embargo, en muchos casos los gérmenes no pueden ser cultivados y Ja tasa de recuperación a partir de los fluidos biológicos es baja. c. Serología e Inmunología, esta basada en la capacidad que tiene el organismo humano de responder frente a una agresión microbiana formando anticuerpos específicos (Ig M, Ig G) contra los antígenos somáticos, flagelares y/o capsulares presentes en los gérmenes, situación que puede ser detectada y servir de ayuda diagnóstica. Por otro lado también es factible detectar la presencia de antígenos en los fluidos biológicos, para todos estos casos se han diseñado una variedad de pruebas que pasamos a detallar de manera resumida:

1. Aglutinación: Son aquellas en las cuales la reacción antígeno-anticuerpo es corpuscular, es decir la reacción ocurre sobre la superficie de una célula o partícula inerte, la cual tiene adherida a su superficie el antígeno o el anticuerpo; dependiendo de lo cual, se puede identificar anticuerpos o antígenos respectivamente. Los resultados que proporcionan son solamente semicuantitatívos, su procesamiento es más complejo que las técnicas de precipitación, pero tiene la ventaja que se puede valorar visualmente los puntos finales y que son pruebas muy sensibles.

1.1. Aglutinación Directa: Es aquella en la cual una célula o antígeno insoluble aglutina directamente con el anticuerpo específico. El ejemplo clásico es la aglutinación de una suspensión de Salmonella typhí con los anticuerpos formados por un paciente con fiebre tifoidea. 1.2. Aglutinación Indirecta (pasiva): Una célula o partícula inerte es recubierta con un antígeno determinado, el cual de otra manera sería soluble. Ejemplos de esta, sería la aglutinación de látex (factor reumatoideo) o la aglutinación de glóbulos rojos recubiertos con DNA (anticuerpos antinucleares). 1.3. Aglutinación Reversa: Detección de antígenos en presencia de células o partículas inertes a las cuales se les ha adherido anticuerpos específicos. Por ejemplo, la detección del antígeno de superficie (AgHBs) en la sospecha de hepatitis B.

1.4. Inhibición de la Hemaglutinación: A glóbulos rojos lavados se les adhiere antígeno homólogo al que se pretende identificar y cuantificar (que se encuentra soluble en sangre u otros líquidos tisulares); el anticuerpo específico frente al antígeno se preincuba con el antígeno soluble, consumiendo el anticuerpo, para en un segundo paso añadir los glóbulos rojos sensibilizados y con el antígeno homólogo adherido, inhibiéndose la aglutinación. Es un método muy sensible y especifico y determina concentraciones muy pequeñas de antígeno (0,1 ug/cc, modificado incluso llega a detectar concentraciones tan bajas como 0,001 ug/cc).

2. Precipitación: Son aquellas donde la reacción antígeno anticuerpo no se produce sobre una célula o una partícula inerte, es decir el antígeno es soluble.

2.1. Inmunodifusión: Para realizar la misma se cuenta con un soporte de agar (placa petri, tubo, lamina u otro) donde se colocaran el antígeno y el anticuerpo (siempre es necesario conocer uno de ellos, el desconocido será el que se trata de identificar), ambos migran en todas direcciones y cuando encuentran a su contrario dan una banda de precipitación que puede ser observada a simple vista. 2.1.1. Inmunodifusión Simple: En la cual el antígeno o anticuerpo se mantienen fijos, y el otro reactante se desplaza y se une a él. (Difusión radial simple) 2.1.2. Inmunodifusión Doble: Ambos reactantes se pueden mover uno hacia el otro y precipitar (Inmunodifusión doble angular Ouchterlony). 2.1.3. Microfloculación - V.D.R.L. (Venereal Disease Research Laboratorios): Aún a pesar de haber transcurrido tantos años de que se iniciara la utilización de esta prueba, sigue teniendo vigencia, no es una prueba específica de Treponema pallidum pero es muy

sensible para identificarla. En esencia no corresponde a una reacción de precipitación debido a que se forma un floculo compuesto por el antígeno utilizado y el anticuerpo obtenido del paciente problema. Estas técnicas de precipitación han ¡do paulatinamente siendo reemplazadas por técnicas y métodos más sensibles y automatizados, como Nefelometría, Turbidimetría, ELISA y RÍA.

3. Inmunofiuorescencia: El procedimiento empleado para identificar al complejo antígeno-anticuerpo se basa en la presencia de un anticuerpo específico conjugado con compuestos fluorescentes(Isotiocianato de Fluoresceína, Isotiocianato de Tetrametilrodamina o Auramina "O"); lo cual permite dependiendo de la técnica que se emplee, observar la presencia o no de fluorescencia en un microscopio con fuente de luz ultravioleta, identificando el antígeno específico para el anticuerpo marcado. Con esta técnica prácticamente se puede detectar cualquier antígeno, ya sea en cortes histológicos o en suspensión de células vivas, teniendo una gran especificidad y sensibilidad.

3.1. Inmunofluorescencia Directa: El antisuero conjugado con el fluorocromo se añade directamente a la sección de tejido y/o a la suspensión de células viables; tiene el inconveniente que para la determinación de cada antígeno a identificar hay que obtener un antisuero específico para cada uno de ellos. 3.2. Inmunofluorescencia Indirecta: En este caso se parte del conocimiento básico que el organismo cuando se encuentra frente a un antígeno extraño elabora mediante su sistema

inmunológico anticuerpos específicos, por lo tanto bastaría contar con un antisuero humano o de la especie en la cual se este tratando de detectar el antígeno que este conjugado con un fluocromo. La ventaja de este procedimiento es que no es necesario contar con antisueros específicos para cada antígeno a detectar, sino se requiere solamente de antigamaglobulina (antisuero) dirigida contra los anticuerpos (gamaglobulina) producidos en el organismo donde se los esta tratando de detectar, lo que permite detectar si se han producido anticuerpos frente a un determinado antígeno en una especie dada. Otra ventaja de la técnica de inmunofluorescencia es que permite el mareaje de células y por ende identificación de poblaciones celulares, con la ayuda de instrumentos como el Citómetro de Flujo (FACS: fluorescence-activated cell sorter), que permiten separar a las poblaciones celulares midiendo la intensidad de fluorescencia de cada célula y posteriormente son separadas de acuerdo a su brillo fluorescente particular y propio y por tanto cuantificadas.

4. Técnicas de Turbidimetría: Tal como su nombre lo indica, en esta técnica se utiliza el concepto que un antígeno o un anticuerpo que es soluble no produce turbidez en una solución, en cambio cuando se forma el complejo antígeno-anticuerpo la solubilidad del mismo desaparece y se produce turbidez, la cual puede ser medida mediante instrumentos denominados turbidímetros, lo cual permite incluso de acuerdo al nivel de turbidez cuantificar la concentración del antígeno o el anticuerpo que estamos tratando de detectar.

5. Técnicas de Inmunoensayo: Son técnicas en las cuales se emplean reactivos marcadores para detectar antígenos y/o anticuerpos. Tal vez son las técnicas que más se han desarrollado en los últimos tiempos debido a su alta sensibilidad y especificidad. Además, son pruebas económicas en el uso de reactivos, es más hay equipos que permiten casi automáticamente la detección y/o cuantificación de los antígenos y/o anticuerpos a detectar. 5.1. Radioinmunoensayo (RÍA): El anticuerpo conocido es conjugado con un elemento radioisotópico, lo cual permite cuantificar posteriormente si es que se ha producido la reacción antígeno anticuerpo mediante una cámara gama. Es un inmunoensayo sumamente sensible y específico. Su desventaja principal es que requiere de equipo costoso. Otros inconvenientes son que los reactivos que se utilizan son radioisótopos, y se requiere de infraestructura especial, entre otros. 5.2. Enzimoinmunoanálisis (ELISA): La unión covalente de enzimas a las moléculas de anticuerpos produce una herramienta inmunológica que posee alta sensibilidad y especificidad. Esta técnica llamada ELISA debido a las iniciales de Enzyme Linked Immuno Sorbet Assay, utiliza un anticuerpo conocido que es conjugado con una enzima (peroxidasa, fosfatasa), la cual de producirse la reacción antígeno-anticuerpo y luego de añadir el sustrato específico produce una modificación de color que puede ser visualizada a simple vista o cuantifícada mediante la ayuda de un espectrofotómetro. En este caso en base a la naturaleza del antígeno se puede hablar de ELISA de Primera Generación, cuando se utilizan antígenos nativos, ELISA de Segunda Generación, antígenos obtenidos por Tecnología del ADN Recombinante y Tercera Generación, antígenos obtenidos por Ingeniería de Proteínas (Péptidos Sintéticos). 5.2.1. ELISA directa, utilizada para la detección de antígenos. En este caso el antígeno queda atrapado por los anticuerpos conocidos (policlonal) adheridos a la microplaca , lo que es puesto en evidencia ai agregar un segundo anticuerpo (monoclonal) marcado con una enzima que al actuar sobre el sustrato dará una reacción coloreada proporcional a la cantidad de antígeno presente originalmente.

5.2.2. ELISA indirecta, utilizada para la detección de anticuerpos. En este caso con un antígeno conocido se recubren los pozos de las placas de microtitulación a la que se le agrega el suero problema, que en caso de estar presente los anticuerpos correspondientes dará lugar a la reacción antígeno-anticuerpo, la que se pondrá en evidencia al adicionar el conjugado (Anti IgG o Anti IgM + Enzima) que al reaccionar con el sustrato provocará el desarrollo de una reacción coloreada proporcional a la cantidad de anticuerpo presente inicialmente. 5.3. Quimioluminiscencia (CLIA): El anticuerpo se encuentra marcado directamente con sustancias químicas luminiscentes (compuestos quimioluminiscentes) o indirectamente las mismas son sustratos de enzimas que están conjugadas a anticuerpos específicos que actúan sobre ellas; ocasionando finalmente si se forma el complejo antígeno-anticuerpo la emisión de luz que es detectada por luminómetros. En el comercio actualmente existen equipos que utilizan esta tecnología para detectar antígenos y/o anticuerpos, su sensibilidad y especificidad es casi comparable a la del radioinmunoensayo, 5.4. Electroquimiolumimscencia (ECL): Está basado en la utilización del Rutenio marcado y de la Tripolylamina (TPA). La emisión de luz del Rutenio marcado es consecuencia de la aplicación de un voltaje a la solución de la muestra, de tal modo a que el Rutenio trivalente es reducido a Rutenio divalente con la ayuda de un agente oxidante (DPA). La ventaja que tiene esta metodología es que se elimina cualquier interferencia asociada a la adición de otros reactivos. 5.5. Western Blotting: La técnica tiene la finalidad de separar al antígeno proteico que queremos detectar de probable contaminación con otros antígenos, para ello se realiza en primera instancia una separación analítica mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con sulfato de sodio (PAGE), permitiendo de ese modo la migración de las diferentes proteínas en el gel en función a sus tamaños moleculares. Posterior a la separación obtenida en el gel, se transfiere el mismo a una membrana de soporte (nitrocelulosa) por acción capilar o por electroforesis (blotting), obteniendo en la misma una réplica del conjunto de moléculas separadas en el gel. Una vez obtenida la impregnación de la película de nitrocelulosa (Western Blotting) con el antígeno desdoblado en sus determinantes antigénicos y conociendo todos ellos como componentes específicos del antígeno que queríamos caracterizar, la película de nitrocelulosa se puede utilizar para detectar la presencia de anticuerpos específicos frente a los determinantes antigénicos impregnados en la misma, para ello podemos utilizar anti-anticuerpos marcados con enzima y luego con la adición del sustrato específico detectar la unión del anticuerpo de la muestra problema al determinante o a los determinantes antigénicos presentes en la película de nitrocelulosa.

Cuando los antígenos presentes en la nitrocelulosa han sido obtenidos por Ingeniería Genética, se habla de Recombinat Immuno Blot Assay más conocido como RIBA.

IV. DIAGNÓSTICO MOLECULAR MICROBIOLÓGICO

4.1. Introducción Técnicas recientes diseñadas en base a los avances logrados en la biología molecular, la genética y la bioquímica respecto de la compresión de la organización y funciones que cumple el genoma (ADN-procariotas y eucariotas ó ARN-virus) y otras moléculas relacionadas con la información genética como es el ARN (procariotas, eucariotas y virus), así como de la clara comprensión a nivel molecular de los procesos de replicación, transcripción, retro-transcripción y traducción. Basados en estos principios de han diseñado pruebas para identificar en el genoma de los microorganismos secuencias específicas relacionadas con la identidad, capacidad fisiológica, patogenicidad y resistencia de estos a los diversos antimicrobianos. Estas pruebas han demostrado tener una alta Especificidad y sensibilidad y corren el camino de convertirse en la pruebas de oro (referencia) para establecer el diagnóstico microbiológico. Dentro de las limitaciones para su uso masivo están la falta de personal capacitado, infraestructura adecuada y los elevados costos que se irán reduciendo con el correr de los años, haciéndolos accesibles a las mayorías.

4.2. Principales Técnicas a. Sondas de ADN, una de las herramientas analíticas más importantes de las que disponen los microbiólogos clínicos es la hibridación de ácidos nucléicos. Esta técnica no detecta un organismo entero o sus productos, sino que detecta la presencia o ausencia de secuencias de ADN específicas que se asocian con un organismo específico. Para identificar a un organismo a través del análisis del ADN, el microbiólogo clínico debe disponer de una sonda de ácidos nucléicos para ese microorganismo, es decir una sola hebra de ADN que contenga secuencias características del organismo. La sonda puede tener una longitud de hasta varias kilobases, sin embargo los oligonucleótidos sintéticos de 20 bases o menos son más específicos. Cuando un microorganismo, en una muestra clínica, contiene secuencias de ADN complementarias a las de la sonda pueden hibridarse las dos secuencias (siguiendo una preparación adecuada de la muestra para dar lugar a un ADN monocatenario del organismo), formándose una molécula híbrida de dos cadenas. Para detectar que ha ocurrido una reacción, se marca la sonda con una molécula indicadora, un isótopo radioactivo, una enzima o un compuesto fluorescente, que pueden medirse en cantidades pequeñas tras la hibridación. Según el indicador utilizado, se pueden detectar cantidades tan pequeñas como 0,25 ug de ADN por muestra. Las sondas de ácidos nucléicos ofrecen muchas ventajas sobre las pruebas inmunológicas clínicas. Los ácido nucléicos son muchos más estables que tas proteínas a altas temperaturas, alto pH, solventes orgánicos y otros compuestos químicos. Esto significa que una muestra clínica puede tratarse previamente para eliminar el material que más interfiera y dejar libre el ácido nucléico. Además las sondas son entidades más definidas que los anticuerpos; la composición de una sonda se puede comprobar con precisión mediante el

análisis de su secuencia. Las sondas de ácidos nucléicos son también muy sensibles. Con la tecnología actual es posible detectar menos de 1 ug de ácido nucléico por muestra. Lo que equivale aproximadamente a 100 000 células bacterianas o partículas de virus. Aunque las sondas utilizadas de esta manera no son tan sensibles como el cultivo directo, donde pueden detectarse de 1 a 10 células por muestra, la metodología de las sondas puede resultar útil en aquellas situaciones en las que el cultivo del organismo sea difícil o prácticamente imposible. En la mayoría de las pruebas clínicas, se tratan colonias procedentes de placas de cultivo o de piezas de tejido infectado, tratados con un álcali fuerte (NaOH) con el fin de lisar las células y desnaturalizar parcialmente el ADN, con lo que se forman moléculas monocatenarias. Después, esta mezcla se adhiere a un filtro o se deja en solución, y se añade la sonda marcada. Se deja que la hibridación tenga fugar a una temperatura adecuada para la formación de un dúplex estable, por lo que es necesaria una considerable homología entre la secuencia del ADN blanco y el ADN sonda. Tras un lavado para eliminar cualquier ADN sonda que no ha hibridado, la intensidad de la Hibridación se mide utilizando una molécula indicadora unida a la sonda, Dependiendo del tipo de mareaje de la sonda, se medirá la radioactividad, la actividad enzimática o la fluorescencia de un cromógeno unido. Se han comercializado sondas de ácidos nucléicos para identificar varios de los principales patógenos microbianos y se usan habitualmente para la detección de Neisseria gonorrhoeae y Chlamydia trachomatis. Sin embargo, además de su utilidad clínica, las sondas han encontrado una enorme aplicación en la industria de los alimentos y en los organismos sanitarios oficiales que controlan los alimentos.

b. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Es un procedimiento para la amplificación de ADN "in vitro" que utiliza una ADN polimerasa estable al calor proveniente de una bacteria termófila (Thermus aquaticus). El calor se usa para romper los enlaces de hidrógeno del ADN en dos moléculas de cadena sencilla, cada una de las cuales es copiada por la polimerasa. Partiendo de un pequeño oligonucleótido que sirve como cebador para amplificar el ADN blanco; la polimerasa copia el ADN completo al cual se asocia el cebador. Después de un ciclo de una sola copia, las dobles cadenas recientemente se separan nuevamente por incremento de la temperatura, y se inicia un nuevo ciclo de copiado. En condiciones apropiadas teóricamente con 20 ciclos, se puede obtener un incremento de un millón de veces del ADN blanco, sin embargo por ineficiencias en la reacción se usa 30 a 40 ciclos lo que garantiza una adecuada concentración de ADN blanco amplificado. La metodología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa se puede resumir en tres etapas: 1. Etapa de Pre-PCR, en la que se extrae y purifica el ADN blanco. 2. Etapa de PCR, en la que se realiza la amplificación del ADN Blanco, la misma que se da en tres pasos:

a. Denaturación, en la que el ADN blanco, por efecto de la temperatura, se separa en dos

hebras. La temperatura y el tiempo de denaturación depende del tamaño y el contenido de G+C de la secuencia del ADN blanco.

b. Hibridización, donde los cebadores específicos se unen a los extremos a los extremos con secuencias complementarias del ADN blanco. Generalmente la temperatura ideal de hibridización (Th) es igual a 5°C por debajo de la temperatura "melting" (Tm) del cebador.

c. Extensión, en el que se inicia la síntesis de la nueva hebra de ADN por la acción de la polimerasa. El tiempo de exposición depende de la longitud y concentración de la secuencia blanco y de la temperatura usada para la extensión.

3. Etapa de Post-PCR, en la que se realiza el análisis de los productos amplificados mediante electroforesis en gel de agarosa, tinción con bromuro de etidio, observación del producto en un transiluminador de luz UV y el registro fotográfico correspondiente.

El empleo de la PCR ha sido muy útil en diversos campos, con ella ha sido posible estudiar el ADN de animales pre-históricos, momias, analizar enfermedades de origen genético, En la medicina, ha sido posible la determinación del sexo de embriones humanos para fertilización "in vitro", Análisis de HLA y ADN de tejidos previos a trasplantes, diagnóstico de desórdenes genéticos prenatalmente, diagnóstico de enfermedades autoinmunes, etc. Pero quizás el campo de mayor aplicación y utilidad es en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, activas o silentes. En especial, aquellas enfermedades cuyo diagnóstico aún son difíciles por las técnicas convencionales.

C. Reacción en Cadena Ligasa (LCR), en la década de los años 80' la técnica de PCR apareció como un importante avance para el tamizaje genético y para la identificación temprana de microorganismos a través de la amplificación de su ADN. Tiempo después, hacia los inicios de 1991, Franelas Barany, Biólogo de la Universidad de Cornell, Manhattan, desarrollo una nueva técnica de tamizaje genético denominado Reacción en Cadena Ligasa, que viene revolucionando los diagnósticos por reconocimiento del ADN, en muchos casos con mayor eficacia que la PCR, sobre la cual ha demostrado tener claras ventajas. La LCR utiliza una enzima termoestable proveniente de Thermus aquaticus dando lugar amplificaciones específicas de secuencias genéticas de un millón a más veces en cuestión de algunas horas. La PCR amplifica una determinada extensión de ADN, pero no puede decir nada acerca de una secuencia específica del fragmento amplificado, y para hallar exactamente qué es lo que se ha amplificado y saber si existe una mutación en ese fragmento, se requieren de múltiples análisis enzimáticos o lograr la secuencia completa de ADN. En contraste, la virtud de la técnica de LCR es que puede amplificar sólo los fragmentos del ADN que tengan exactamente la secuencia que se quiere observar y logrando además, simultáneamente, la amplificación y la detección del ácido nucléico deseado. Estos recursos de la LCR permitirán el hallazgo de las zonas mulantes que ocasionan las enfermedades genéticas, identificar el polimorfismo del ADN para el mapeo genético y revelar la secuencia genética de un microorganismo o su sensibilidad a las drogas, sin necesidad de hacer cultivos.

La LCR utiliza pequeños fragmentos de ácido nucléico (oligonucleótidos) que debe insertar en forma específica en una secuencia complementaria de un ADN blanco. Se diseña dos juegos de oligonucleótidos, para que complementen perfectamente con la mitad izquierda y la otra mitad derecha, respectivamente, de la secuencia blanco. Ambos juegos se añaden a la muestra en prueba junto con una ligasa. Si la secuencia blanco está presente, los oligonucleótidos cubrirán las respectivas mitades de la extensión de sus con sus extremos colindantes. La ligasa interpreta la pequeña ruptura entre ambos terminales como una muesca con necesidad de repararse, de modo que sigue la huella y suelda el terminal del oligo permanentemente, creando un fragmento de tamaño normal de ADN complementario de la secuencia blanco. La PCR utiliza oligos que definen el fragmento que será amplificado; en cambio, la LCR utiliza pares de oligos que cubren completamente la secuencia blanco. La clave para la utilidad de la LCR es que la enzima ligasa puede libremente ignorar o no hacer caso a los oligos colindantes y no llevar a cabo la amplificación. Sin embargo, aún cuando la técnica de la LCR ha mostrado buenas amplificaciones con mayor rapidez y precisión que la PCR, ambas técnicas no son excluyentes; puesto que combinando la alta sensibilidad de la PCR con la excelente especificidad de la LCR, puede lograrse en óptimas condiciones un total y cabal tamizaje genético.

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Clinical Microbiology Laboratory. Annu.Rev.Microbiol.1996. 50:349-73 (*) Hormero Ango Aguilar, Biólogo-Microbiólogo egresado de la Facultad de Ciencias Biológicas

de la Universidad Nacional de San Cristóbal de Huamanga-Ayacucho-Perú (UNSCH), Magister en Microbiología - Universidad Nacional Mayor de San Marcos (UNMSM), Doctor en Salud Pública - Universidad Nacional Federico Villarreal (UNFV). Especializado en Inmunología y Microbiología en la Universidad de Guadalajara y Universidad Autónoma de México; Gestión de la Calidad en PUCP, UNALM (Perú) y CALILAB (Argentina) y QUIK LTDA (Bogotá - Colombia); Ciencia, Tecnología y Sociedad (Cartagena de Indias – Colombia) e Instituto Nacional de Salud (Perú).

“Con perseverancia en la investigación, se termina por adquirir eso que me gusta llamar el

INSTINTO DE LA VERDAD"

Louis Pasteur

27.DIC.1822 - 28.SET.1895