Stratagene Portfolio en Proteómica: Seleccione la Columna más … · 2015-07-28 · Bioanalizador...

Stratagene Portfolio en Proteómica:

Seleccione la Columna más adecuada

para sus estudios de Bioamarcadores

¿Qué es la Proteómica?

-Proteina + Genoma…………..Proteoma(1994 Marck

Wilkins)

Proteoma

Dotación completa de proteínas, incluyendo las modificaciones hechas a un conjunto particular de proteínas, producidas por un organismo o sistema

Proteómica

Estructura

Función

- 25.000-30.000 genes……………………………………500.000-1.000.000 proteínas!!

¿Qué es un Biomarcador?

“Un biomarcador es un indicador de la presencia o extensión de un proceso

biológico que está directamente relacionado con las manifestaciones

clínicas o las consecuencias de una enfermedad ..”

Cox. Acta Paediatrica 2005; 94 (Suppl 447): 39-42

El estudio y comparación sistemáticos

del proteoma en diferentes situaciones

metabólicas y/o patológicas permite

identificar aquellas proteínas cuya

presencia, ausencia o alteración se

correlaciona con determinados

estadios fisiológicos.

BIOMARCADORES

Diagnosis

+

Evolución de

enfermedades



Inflamación

Proteina C reactiva

TNF-

Fas (Apo-1)

Interleucinas 1,6,18

Estrés oxidativo

Lipoproteínas

Mieloperixidasa

Isoprostanos

Daño miocárdico

Troponinas T, I

CK-MB

Proteínas especificas

Miosin-Kinasa tipo I

Ejemplo;

Biomarcadores en

insuficiencia cardicaca

Las principales áreas de estudio de la proteómica son:

1-Identificación de proteínas y caracterización de sus

modificaciones postraduccionales

2-Proteómica de "expresión diferencial“

3-Estudio de las interacciones proteína-proteína

1-Identificación de proteínas y caracterización de sus modificaciones

postraducionales:

Enorme complejidad(gran número).

-Técnicas más comunes:

A.Electroforesis monodimensional

SDS-PAGE…1ºDesnaturalizar 2ºCargar 3ºMigrar por peso molecular

B.Electroforesis bidimensional

2D-PAGE…Separación por PI + SDS-PAGE……Proteoma complejo

C.Cromatografía Líquida:

-Por hidrofobicidad; Columnas de Fase reversa.

-Por carga eléctrica: Columnas de intercambio iónico

-Por tamaño: Exclusión molecular

Métodos Cromatográficos; Para proteinas/péptidos separaciones.

• Intercambio iónico análisis de Isoformas: Separaciones de carga base.

• Filtración en Gel: Separaciones por tamaño.

• Fase reversa; Separaciones de proteinas intactas y mapeo peptídico.

• IMAC (immobilized metal affinity chrom.)

• Cromatografía de afinidad

• Cromatografía de Interacción Hidrofobica (HIC)

9

3.Interacciones proteína-proteína

Señalización celular

Interacción proteína-proteína

Mutagenesis to

engineer and modify

proteins

Proteomics Sample

Prep for LC/MS • FFPE Protein Extraction

Solution

• PPS Silent Surfactant

• Proteomics Grade Trypsin

Development efforts for

additional sample prep

products and standards in

this area.

Protein Biomarker Application

Fractionate Separate/LC Prep Identify

Reduction of complexity and enrichment

3100 OFFGEL

Agilent 1200

Series Liquid

Chromatography 2100 Bioanalyzer

Agilent 6000

Series Mass

Spectrometry w/

HPLC-Chip

Quality

Control

Sample Prep Simplify/Deplete

Extraction of unique proteins from samples and simplify sample for analysis

Extract protein from

tissue or blood with

FFPE Protein Extraction

Solution or PPS Silent

Surfactant

Blood serum/plasma samples

(or CSF, urine) deplete high-

abundant proteins with

Multiple Affinity Removal

System

Fractionate,

concentrate, and

desalt proteins

with mRP-C18

Digest with

Proteomics

Grade Trypsin

OFFGEL Bioanalyzer

- Separación de proteínas y péptidos de acuerdo a sus puntos isoeléctricos.

- Utiliza un gradiente de pH inmovilizado sobre un gel (IPG)

- Se aplica un potencial, las proteínas migran a través del gel hasta que alcanzan un pH = pI.

Fundamento del OFFGEL

Punto Isoeléctrico: pH al cual la carga neta de la proteína es cero (se calcula en función del número de cadenas laterales básicas y ácidas)

Fundamento del OFFGEL

Número Muestras: 2 bandejas/ 8 muestras cada una Fraccionamiento en 12 (baja Rs) ó 24 (Alta Rs) Volumen de cada fracción: 150 µl Resolución: 0.1/0.6 pH Capacidad de carga: 50 g – 5 mg/muestra Tiempo de Fraccionamiento: 8 - 24 h Control de temperatura: 5- 60ºC

Instrumentación

• Controlador Local:

– software preinstalado No requiere PC

– métodos preconfigurados

• Datos corriente/voltaje

– Almacén/ exportacion en excel

– Medida para cada muestra individual

• OFFGEL y electroforesis tradicional en

gel (IEF)

Metodología de Trabajo

Aplicación:

Protein Enrichment by OFFGEL Electrophoresis

bLG

bLG

3 x

OFFGEL load OFFGEL Fraction pH 4.8

1 % bLG

0.1 % bLG

0.01 % bLG

no bLG

1 % bLG

0.1 % bLG

0.01 % bLG

no bLG

B-Lactoglobulina

Consumibles

Analisis en gel de

Protein & DNA / RNA

• Proceso manual

• Dificultad de automatizar

• Lento

• No suficiente precisión

• Mala reproducibilidad

• No comparación directa

• No datos digitales

La tecnología lab on-a-Chip integra el análisis típicamente hecho sobre

Gel y Fotómetros de UV para proporcionar datos digitales

cualitativos y cuantitativos en 30-40 minutos.

Bioanalizador 2100

En una sola plataforma se puede medir:

• Tamaño, Cuantificación y Pureza de proteinas (5 -230 kDa)

• Tamaño, Cuantificación y Pureza de fragmentos de ADN(25 – 12000 bp)

• Comprobar la integridad, separación y cuantificación de los ARNs

• Ensayos de fluorescencia con células teñidas(Apoptosis, Transfección, Expresión, )

Mejora la calidad del analisis en gel

mediante la tecnología on-Chip

electroforética…

Dispositivo analítico facil de usar que permite la

separación y cuantificación del ARN,ADN y

proteinas basado en un chip de vidrio desechables

para electroforesis .

1. Cargar muestras 2. Run Analsis 3. Analisis de datos

…reducie el experimento a:

2100 Bioanalyzer Hardware

Exchangeable cartridge

for electrophoresis or flow

cytometry assays

16 pin electrodes

connected to HV-sources

Chip holder with

heater plate

Optics for detection

Selector

Chip

Agilent

Lab-on-a-Chip

Control Activo de Fluidos (Microfluídica)

Volumen de Muestra 1 -4 µl

10 -12 muestras dependiendo de

aplicación.

Separación, tinción, detección de

muestras.

Resultados en 5-30 minutos disponibles

No necesidad de un sistema desecho.

No contaminación cruzada.

Tree view for navigation between

samples and files

Context

menu bar

Customizable

gel-like image

(change order)

Customizable result table

(change order and add

additional columns)

Single gel lane

for selected

E-gram

Task bar with context

sensitive icons for

different actions

Tabs for different

data displays

Access to

setpoint

explorer

Protein LabChip Kits – Specifications (Series II) • Analisis automatizado de 10 muestras de proteinas en menos de 30 minutos

• Dos aplicaciones para diferentes tamaños

– Protein 80: 5 a 80 kDa

– Protein 230: 14 a 230 kDa

-Protein250: 10-250kDa

• Resolución del 10% sobre el rango de tamaño.

• Rango linear dinámico grande:

(e.g. from 15 - 2000 ng/ l CA-II in PBS)

• Sensivilidad equivalente a tinción no-coloidal con Coomassie (R-250)

• Cuantificación relativa y absoluta

• Compatible con variedad de tampones.

Staining, Destaining and Detection Tinción, Desteñido y Detección

proteina

micelas

desteñir

SDS + dye

detección

low background good signal

to noise ratio SDS conc.

below CMC

If no dilution was done the

micelles would result in high

background and low

sensitivity

detection

X

Expresión de proteínas

Protein 230 kit

Purificación de proteínas

Se obtienen resultado de tamaño, pureza y concentración

En un solo experimento, en 45 minutos y con 4µl de muestra

Protein 230 kit

Análisis de la capacidad de las columnas

Protein 230 kit

Análisis de anticuerpos

High sensitive

Protein 250 kit

Glicosilación de proteínas

Protein 230 kit

Immunoprecipitation/Western Blot:

IP/HSP-250

Bioanalyzer

High sensitive

Protein 250 kit

1 2 3 4 5 6 7

Western Blot

1: 1 % PTEN

2: 0.1 % PTEN

3: 0.01 % PTEN

4: 0.001 % PTEN

5: 0.0001 % PTEN

6: E. coli only

7: PTEN only

kDa

260

160 110 80

60

50

40

30

20

1 2 3 4 5 6 7

IP/HSP250

kDa

240

150

95

63

45

28

15

LM

Western Blot con PTEN-GST en E. coli

Advantages of the IP/HSP-250 Method:

- Sensitivity

- Specificity

- Time-to-result: 3 hours

- Cost: less primary & no secondary antibodies

High sensitive

Protein 250 kit

5988-8322EN

5989-3336EN

Bioanalizador aplicación;

Nerea Gonzalez Fernandez

BIOFTALMIK S.L.

Parque Tecnológico

Ed. 800, 2ªPlanta

48160 Derio - Bizkaia - Spain

Tel: +34 944 069659

Fax: +34 946 562 379

www.bioftalmik.com

Su actividad se centra en la plataforma de proteomica así como la unidad de servicio de

diagnóstico clínico.

http://www.bioftalmik.com/





Geles en 2D: Combinación de Offgel y

Bioanalizador

High sensitive

Protein 250 kit

E. coli lysate

(50 g)

OFFGEL Electrophoresis

2100 Bioanalyzer

HiSens Assay

4.3 4.8 5.3 5.8 6.3 6.7 7.2 7.7 8.2 8.7

OFFGEL well pH

kDa

100

70

50

30

15

5

Isoelectric point (pI)

Mole

cu

lar

weig

ht

Protein clean up and labeling

Análisis de variedades

de trigo

Wheat Type A Wheat Type B

Protein extraction

Alkylation with IAA

Acetone precipitated

Labeling at 10 ug/ul total protein (Bradford)

100 ug labeled protein fractionated pH3-10

Fractions undiluted analyzed with 250HSP-Assay Isoelectric point (pI)

Mole

cu

lar

weig

ht

Mercado Biofarmacéutico

• La industria pharma se mueve de NCE A NBE*

• Aproximadamente 2,500 medicinas de biotech están en la fase de descubrimiento, 900 en pruebas preclínicas y más de 1,600 en ensayos clínicos.

• Medicinas de anticáncer: más de 1500.

*NCE = new chemical entity

*NBE = new biological entity

42

Biologic Manufacturing and QA/QC (HPLC)

QA/QC Analysis by LC/MS

• Intact Analysis

– Glycosylation,

– Post Translational Modification

• Peptide Mapping

– Enzymatic digestion of protein into peptides for verification of composition

QA/QC Analysis by LC/UV

• Protein A: Titer Determination

• Ion Exchange: Analysis of acidic and

basic forms of biologic, impurities

• Size Exclusion: Analysis of aggregation

and impurities

• Reverse Phase: Analysis of light and

heavy chains, glycosylation, impurities

Bio-Reactor

producing biologic Purification Step 1 Purification Step 2

Pure Biologic

Formulation

LC/MS verification

of profile changes

43

Multiple Affinity

Removal System

44

http://www.chem.agilent.com/en-

us/products/consumables/columns/lcandlc-

ms/multipleaffinityremoval-human14/pages/default.aspx

http://www.chem.agilent.com/en-us/products/consumables/columns/lcandlc-ms/multipleaffinityremoval-human14/pages/default.aspx







Protein Biomarker Discovery and Validation

Cancer Cells

Blood Vessel Wall

High Abundant

Protein (Albumin)

Leached Protein

(Potential Biomarker)

Agilent Restricted

Why Use Immunodepletion? pI 4-7

Crude serum

Depleted serum

pI 4-7

pI 4-7

Crude serum

Depleted serum

pI 4-7

Crude serum

Depleted serum

pI 4-7

Courtesy of Dr. Tasso Miliotis, Karin Björnhall and Dr. Pia Davidsson, Experimental Medicine/Molecular Sciences, Astra Zeneca, Mölndal, SE

“Removal of these proteins clearly improves the resolution in

the albumin area and increases the intensity of low abundance

proteins”

Agilent Restricted

Proteomics Grade Trypsin – Description &

Feature/Benefits

• Reductive alkylation and affinity purification

• Every lot functionally tested for LC/MS

• Protocols for in-solution and in-gel digestion

• TPCK treated

• Price and pack size

Agilent Restricted

Proteomics Grade Trypsin – Functional QC on

Agilent LC-Chip Q-TOF

Each lot of Agilent Proteomics Grade Trypsin is tested and qualified on Agilent’s 1200 HPLC-

Chip combined with Agilent’s 6000 Series Mass Spectrometry instrumentation

Agilent Restricted

Agilent Multiple Affinity Removal System

“Original” Top-6

Human Serum

Spin Tube format

Mouse-3

“High Capacity” Top-6

Human Serum

Spin Tube format

Level-II

Human-14

FY2004 FY2006 FY2005

“High Capacity”

Top-7 Human Plasma

Original MARS

Selectivity (specific Ab-Ag recognition, no Pr-Pr complex)

Reproducibility (run-to-run and lot-to-lot of product)

Reliability and increased productivity (quick and easy)

Recovery of sample (minimal loss)

Increasing Capacity and Depth

While Maintaining Performance

FY2007

Agilent Restricted

• Simple two buffer

system

• 10 minute protocol

• Reproducible

• Low collection volumes

• Only need centrifuge

• Robust

Multiple Affinity Removal System

LL LL

LLLL LLLL

L

HL

L

L

H H

H

H

H H

H

H

H

HH

LL

HHLL

LL

LL

HH HH

HH

HH

HH HH

HH

HH

HH

HHHH

HH H

HHH

HH

HH

HHHH HH

HHHHHH

HHHH

HHHH

LL LL

LLLL LLLL

Low Abundant

Proteins

HH H

HHH

HH

HH

HHHH HH

HHHHHH

HHHH

HHHH

High Abundant

Proteins

Total Serum/Plasma

Protein

Agilent Restricted

L L L

L L L L

6% Remaining

for Analysis

Albumin

IgG Transferrin

Fibrinogen

1-Antitrypsin

IgA

1-Acid

Glycoprotein

Haptoglobin

15%

2-Macroglobulin

IgM

Apolipoprotein AI

Complement C3

Transthyretin

H

H

L L L

H H

H

H H H

H L L

L L

Apolipoprotein AII

Human-14 Column - Aids in analysis of

plasma/serum proteome

94% of HAP depleted Only 85% of HAP depleted

Human-7 Human-14

Dilute 6-8 L human plasma

sample to 200 L with Buffer

A. Consult cartridge certificate

for true sample capacity. Filter

through 0.22 m spin filter.

Remove cartridge cap and plug

and remove buffer from top of

resin bed with transfer pipette.

Never let frits or resin bed run

dry.

Add 200 L diluted plasma sample.

Cap cartridge loosely or leave

open. Place in 1.5 mL collection

tube labeled “Flow-through

fraction 1” (F1). Centrifuge 30 sec

at 200 x g.

Add 400 L Buffer A. Centrifuge 1

min at 200 x g. Collect in F1

tube.

Place spin cartridge in new collection

tube labeled “Flow-through fraction 2”

(F2). Add 400 L Buffer A. Centrifuge

1 min at 200 x g. Collect in F2 tube.

Remove spin cartridge from F2

tube and attach luer-lock adapter

tightly to top of cartridge.

Fill 5 mL Luer-Lok™ plastic syringe

with 2 mL Buffer B and attach to

Luer-Lok adapter. Slowly push

Buffer B through cartridge to elute

bound proteins into new collection

tube. Save eluate with targeted

high-abundance proteins for

analysis or discard.

Fractions F1 and F2 can be

analyzed individually or combined.

Concentrate and analyze these

fractions containing low-

abundance proteins.

Fill new 5 mL plastic syringe with 4

mL Buffer A and attach to Luer-Lok

adapter. Slowly push Buffer A

through cartridge to re-equilibrate

the cartridge for the next sample or

store wetted with Buffer A (at 4°C).

Re-cap both ends for storage.

2. Remove Buffer 1. Dilute and

Filter Sample

3. Apply Sample 4. Wash and

Collect Flow-

through F1

5. Wash and

Collect Flow-

through F2

6. Prepare for

Elution

7. Elute Bound

Fraction

8. Re-Equilibrate 9. Analyze

F1 + F2

F1 F1 F2

F1 + F2

• Simple two buffer

system

• 10 minute protocol

• Reproducible

• Low collection volumes

• Only need centrifuge

• Robust

MARS-14 Spin Column Process

OFFGEL Incremento de la sensibilidad en MS ejemplo de trabajo

Incremento de 4x en la

detección de proteínas tras

el fraccionamiento con el

OFFGEL

OFFGEL

Serum Proteomics Workflow – Front to Back

Blood Sample

from Patient

Serum/Plasma

sent to lab

Remove High

Abundant

Protein

Fractionation of

Proteins via

mRP

Fractionation of

Proteins and/or

Peptides via

OGE

Trypsin enzyme

digestion of

proteins into

peptides

1-D (Reverse Phase)

or 2-D (Ion Exchange

+ Reverse Phase)

Chromatography

Mass Spectrometer +

Software ID peptides

and verify presence of

protein (quantitation)

min0 5 10 15 20 25 30 35

No1rm.

0

500

1000

1500

2000

2500

Plasma

Injection Elution 1 ml/min

Re-equilibration

Flow-through

Fraction

Bound Fraction

0.125 ml/min

4.6 mm ID x 100 mm column

Overlay of chromatograms from run 1, 50, 100, 150 &

200 on a Human 14 column

Column performs

reproducibly for 200+ runs

Great reproducibility after 200 uses – nearly identical performance

Agilent Restricted

Salt Steps: sample (0), 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800,

900, 1000, 1500, 2000 mM sodium chloride.

- RP Mobile Phase: [A]-H2O w\0.1% FA, 3% ACN & [B]-ACN w\ 0.1%

FA, 3% H2O – 500 nL/min

- Enrichment Mobile Phase: H2O w\0.1% FA, 3% ACN – 5 μL/min

- RP Gradient: 0% B @ 4 min., 8% B @ 4.25 min., 35% B @ 39 min.,

50% B @ 44 min., 95% B @ 44.1 min.,

95% B @ 46 min., 0% B @ 47 min.

5989-7839EN

Publication Number 5988-9911EN

Sergio Alonso y Carlos Martínez Laborde

Lab. Fisiopatología Vascular.

Unidad de Proteómica.

2ª planta edif. Terapia.

Hospital Nacional de Parapléjicos (SESCAM)

Finca la Peraleda s/n.

45071 Toledo.

España.

Telf: 925396826

mRP (Macroporous Reverse Phase) Column

mRP Column

High Recovery Protein

Fractionation

mRP-C18 Protein Fractionation Column

Reverse Phase column for protein separation and

fractionation. The silica based particles and recommended LC

methods have been optimized for: • Highest recoveries of protein samples (95% - 99% of loaded

sample)

• Highest resolution separations

• Reproducibility

• High sample loading capacity (3X higher than most standard RP

columns)

Key Applications: • Positioned to be used after MARS protein depletion for further

fractionation

• Will simultaneously concentrate & de-salt (mass spec ready)

• Used for variety of sample types and purposes (whole cell

lysates and for recovery of membrane protein fractionation)

Comparison of mRP with ZORBAX SB300-C8

Sample: 270ug flow-through (6M urea/5.0% AcOH) of immunodepleted human serum from Multiple Affinity Removal System column

Columns: Panel A – Zorbax SB300-C18 (300 A, 5.0um), 4.6 mm x 50 mm i.d., SS; Panel B – mRP-C18 (macroporous, 5um), 4.6 mm

x 50 mm i.d., PEEK, 0.75mL/min., DAD 280nm

Mobile Phase & Conditions: A-0.1% TFA/water, B-0.08%TFA/ACN, Temp 80° C, gradient:5-30%B in 5min., 30-55%B in 33min., 55-100%B in 4min.

1D SDS PAGE: Collected 36 fractions (1.0 min. time slices) from immunodepleted human serum RP separation

Sample: 270ug flow-through (6M urea/5.0% AcOH) of immunodepleted human serum from Multiple Affinity Removal System column

Columns: Panel A – Zorbax SB300-C18 (300 A, 5.0um), 4.6 mm x 50 mm i.d., SS; Panel B – mRP-C18 (macroporous, 5um), 4.6 mm

x 50 mm i.d., PEEK, 0.75mL/min., DAD 280nm

Mobile Phase & Conditions: A-0.1% TFA/water, B-0.08%TFA/ACN, Temp 80° C, gradient:5-30%B in 5min., 30-55%B in 33min., 55-100%B in 4min.

1D SDS PAGE: Collected 36 fractions (1.0 min. time slices) from immunodepleted human serum RP separation

mRP-C18

min 0 10 20 30 40 50

mAU

0

5

10

15

20

25

30

Acid-glycoprotein Apolipoprotein A1

complement component C4

hemopexin

Retention Time

SB300-C8

min 0 10 20 30 40 50

Norm.

0

10

20

30

40

Ab

sorb

ance

(2

80

nm

)

Retention Time

Ab

sorb

ance

(2

80

nm

)

Significant improvement in resolution – more defined fractions

Publication Number 5989-0228EN

Agilent BioSeparations Selection Guide

5990-3534EN

Currently being

updated with

new BioHPLC

columns!

Gracias por su atención!

GANADOR DEL SORTEO….

[email protected]

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