Solubilidad de Un Compuesto Con Actividad Fasciolicida

7/26/2019 Solubilidad de Un Compuesto Con Actividad Fasciolicida

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Artculos cientficosSolubilidad de un compuesto con actividad fasciolicida:

evaluacin de ecacia in vitroy en ovinosexperimentalmente infectados con Fasciola hepatica

Solubility of a compound with fasciolicidal activity:evaluation of efcacy in vitroand experimentally on infectedsheep with Fasciola hepatica

Recibido el 28 de enero de 2009 y aceptado el 5 de octubre de 2009.

*Departamento de Ciencias Agronmicas y Veterinarias, Inst ituto Tecnolgico de Sonora, 5 de febrero nm. 818 sur, Colonia Centro,85000, Ciudad Obregn, Sonora, Mxico, Correo electrnico: [email protected]**Departamento de Parasitologa, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, 04510,Mxico, D. F.***Departamento de Nutricin, Laboratorio de Toxicologa, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnomade Mxico, 04510, Mxico, D. F.Departamento de Farmacia, Facultad de Qumica, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, 04510, Mxico, D. F. Facultad de Ciencias Naturales, Universidad Autnoma de Quertaro, Av. de las Ciencias s/n, Quertaro, Quertaro, Mxico.

Departamento de Gentica y Estadstica, Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autnoma de Mxico,04510, Mxico, D. F.Nota: este trabajo forma parte de la tesis doctoral del primer autor.

Abstract

Compound alpha (Ca) is a benzimidazolic derivate which has shown a high fasciolicidal efficacy when it is given by oral via.

Solubilization of Ca would be a suitable alternative to obtain an injectable formulation. The objectives of the present study were

to evaluate the solubility of Ca in order to determine the in vitro fasciolicidal efficacy and experimentally on infected ovines.

The assays of solubility quantified by high-performance liquid chromatography (HPLC) , showed that beta- cyclodextrin (-CD)

and hydroxi-propylbeta-cyclodextrin (HP--CD) solubilized in 0.015% and 1.018% respectively. The solubilization for HP--CDwas calculated as 3.95% for 5.8 mg; 10.76% for HP--CD with methanol, 39.048% for proylene-glycol (PG), 100% for glycerol

formal (GF), and 100% for combined PG and GF and water in proportions of 3:2:5 and 3:2:4. In vitroevaluation using immature F.

hepaticashowed that Ca induced 100% efficacy 24 hours after solubilization with either GF or GF combined with PG and water.

The efficacy insheepwas 56.4 and 68.4% at 1 and 2 mg/kg respectively; whereas 1 mg/kg of sulphoxide metabolite induced an

efficacy of 73.9% . The HPLC assays performed showed no evidence of the sulphoxide and sulphone metabolites. It is concluded

that besides solubility and high in vitro fasciolicidalefficacy, the in vivoresults in sheep showed only a moderate efficacy.

Key words:

COMPOUND ALPHA, HPLC, CICLODEXTRINS, VEHICLES, COSOLVENCE.

Resumen

El compuesto alfa es un derivado bencimidazlico de gran eficacia fasciolicida, que se ingiere va oral, su solubilizacin constituye

una alternativa para obtener una formulacin inyectable. Los objetivos de este estudio fueron: evaluar la solubilidad del com-

puesto alfa, determinar la eficacia fasciolicida in vitro y en ovinos experimentalmente infectados. Los ensayos de solubilidad que

fueron cuantificados mediante cromatografa de lquidos de alta resolucin, mostraron que la betaciclodextrina e hidroxipropil-betaciclodextrina solubilizaron en 0.051% y 1.018% . Esta ltima se evalu con cinco concentraciones, mostr que a 5.8 mg la

solubilidad fue 3.95%; hidroxipropil-betaciclodextrina y metanol, 10.76%; propiln-glicol, 39.048%; glicerol formal, 100%; y gli-

cerol formal con propiln- glicol y agua en proporciones 3:2:5 y 3:2:4, 100%. La evaluacin in vitrocon fasciolas inmaduras mostr

que el compuesto con glicerol formal y la combinacin de vehculos a las 24 horas fueron eficaces en 100%. La eficacia in vivoen

ovinos mostr que el compuesto alfa a dosis de 1 mg/kg fue de 56.46%, a 2 mg/kg de 68.4% y con sulfxido del compuesto alfa

a 1 mg/kg de 73.9%. No se encontr el compuesto alfa ni sus metabolitos sulfxido y sulfona en el suero determinado por medio

del cromatgrafo de lquidos de alta resolucin. Se concluye que a pesar de obtener solubilidad del compuesto alfa y alta eficacia

fasciolicida in vitro, los resultados in vivoen ovinos revelaron eficacia moderada.

Palabras clave: COMPUESTO ALFA, CLAR, CICLODEXTRINAS, VEHCULOS, COSOLVENCIA.

Javier Arturo Mungua Xchihua* Froyln Ibarra Velarde** Yolanda Vera Montenegro**Ren Rosiles M.*** Antonio Romo Mancillas Jorge Cant Alarcn

Adriana Ducoing Watty


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Introduction

Fascioliosis caused by Fasciola hepatica affectsseveral animal species, particulary ruminants,generating great direct economical losses whenthe young animals die and indirectly because of thelow production of meat and milk, deficient feedconversion that causes a decrease of the growth, poor

fertility and seizure of livers in partial or total mode inslaughterhouses.1-3In order to dicrease or avoid these detrimental

effects the best control is the chemical one, availablein different comercial compounds. One of these istriclabendazole, which has shown greater efficacy ineliminating young and adult forms of the trematode.4However, the excessive use has generated bacterialresistance in Irland and Australia, reason why it requiresnew compounds with similar or better fasciolicidalactivity. In the research of these alternatives, thecompound alpha (Ca) or 5-chloro-2-methylthio-6-(1-naphtyloxy)-1H-benzimidazole5 was synthetized,

showing high in vitro and in vivofasciolicidal efficacyby oral via in sheep6-8 and cattle.9-11 Nevertheless,the Ca does not dissolve completely in water, so it isimportant it solubilization with the purpose to obtainan injectable formulation.

The use of vehicles as cyclodextrins (CD), propylene-glycol (PG) and glycerol formal (GF) could increasethe solubility, chemical stability and bioavailability,and modify the absortion and concentration of severalcompounds in blood.12-13

The Ca solubilized and injected by intramuscularvia will have major effects compared with oraladministration.

The objetives of the present study were to evaluatethe solubility and in vitro efficacy of the compound alpha,as well as efficacy in experimentally infected sheep.

Material and methods

Solubility of the compound alpha

Compound alpha

The compound alpha was synthetized in theDepartamento de Farmacia de la Facultad de Quimica

of the Universidad Nacional Autonoma de Mexico.5

Vehicles

Cyclodextrins* (CD), alpha-cyclodextrins (-CD),hydroxypropyl-alphacyclodextrins (HP--CD),hydroxi-propylbeta-cyclodextrin (HP--CD) andthe cosolvents proylene-glycol*(PG) and glycerolformal** GF) that come from a commercial source.***

Introduccin

La fasciolosis producida por Fasciola hepaticaafecta a varias especies animales, en particulara los rumiantes, en los que ocasiona cuantiosasprdidas econmicas en forma directa cuando muerenjvenes e indirectas por ocasionar baja de produccinde carne y leche, deficiente conversin alimentaria

que causa disminucin del crecimiento, baja fertilidady decomiso de hgados en forma parcial o total en losrastros o mataderos.1-3

Para disminuir o evitar estos efectos detrimentalesel mejor control es el qumico, con ese propsitoexisten en el mercado diferentes compuestos; de ellosel triclabendazol ha mostrado mayor eficacia en virtudde que elimina tanto a formas juveniles como adultosdel trematodo.4 Sin embargo, la sobreutilizacin deeste compuesto ha generado resistencia de las bacteriasen Irlanda y Australia, por lo que se requiere disponerde nuevos compuestos con igual o mayor actividadfasciolicida. En la bsqueda de estas alternativas se

sintetiz el compuesto alfa (Ca) o 5-cloro-2-metiltio-6-(1-naftiloxi)-1H-bencimidazol,5que ha mostrado altaeficacia fasciolicida in vitro e in vivo por va oral enovinos6-8y en bovinos.9-11Sin embargo, su solubilidades mala en agua por lo que es importante realizaresfuerzos para solubilizarlo con el fin de obtener unaformulacin inyectable.

El uso de vehculos como ciclodextrinas (CD),propiln-glicol (PG) y glicerol formal (GF) puedenaumentar la solubilidad, estabilidad qumica ybiodisponibilidad, modificar la absorcin y laconcentracin del compuesto en sangre de diferentescompuestos.12-13

El compuesto alfa solubilizado e inyectado porva intramuscular tendr mayor efecto que cuando seadministra va oral.

Los objetivos de este estudio fueron evaluar lasolubilidad y eficacia in vitrodel compuesto alfa, as comosu eficacia en ovinos experimentalmente infectados.

Material y mtodos

Solubilidad del compuesto alfa

Compuesto alfa

El compuesto alfa se sintetiz en el Departamento deFarmacia de la Facultad de Qumica, de la UniversidadNacional Autnoma de Mxico.5

Vehculos

Ciclodextrinas* (CD): alfaciclodextrina (-CD),*Sigma-aldrich, Estados Unidos de Amrica.


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Solubility

The formation of Ca aducts with the CD was carriedout using the following procedure: the Ca (2 mg) wasadded to an aqueous solution (2 mL/H2O) with eachcyclodextrins (3 mg) for triplicated,14 it was shakenduring seven days under environmental temperatureconditions. The CD with the best hydrosolubility

properties was evaluated in the concentrations 5.8, 2.9,1.45, 0.725, 0.0362 mg with 2 mg of Ca. Other assayswere done using HP--CD and methanol (MeOH), itwas evaporated at room temperature and resuspendedin water, Ca with PG, CPwith GF and the combinationof cosolvents GF with PG and H2O at a proportion of3:2:5 and 3:2:4. A 3.0 mg concentration of HP--CDand 2.0 mg of Ca was used in each assay by triplicated;each sample was filtered through an acetate of cellulosemembrane, to be injected in the high-performanceliquid chromatography (HPLC) system. The solubilitywas determined in the physical form by the vehiclestransparency with the compound and by the use of

HPLC.15-17

Chromatographic conditions

A chromatographic system with binary pump,autosampler and detector of diodes arrangement(304 nm of wavelength) was used. The movable phaseconsisted in methanol (40), water (40) and acetonitrile(20) in HPLC degree, degasificator in line with helium.The stationary phase consisted of a C18 column of 80 mmin length. The suspension for evaluation was filtered withmembrane 0.45-m, 25 L of sample and the detectionlimit of the equipment was 50 ng/mL.

For the calculation of the compound concentration,an external standard was used; with the addition method,the percentage of recovery of the analytical techniquewas determined in order to establish the percentage ofrecovery of the compound during the extraction.18

In vitroevaluation

Preparation of compounds forchemotherapeutic evaluation

Ten and 50 mg/L of solubilized Ca with GF, PG, GF

combined with PG and H2O (3:2:5 and 3:2:4) and 0.5mg/L with HP--CD were used. They were depositedin vials of 30 mL of capacity. Later, the correspondingdilutions were prepared to obtain the requiredconcentrations for the biological evaluation anti-Fasciola hepatica.

hidroxipropil-alfaciclodextrina (HP--CD), betaci-clodextrina (-CD), hidroxipropil-betaciclodextrina(HP--CD) y los cosolventes propiln-glicol* (PG)y glicerol formal** (GF), que provinieron de fuentecomercial.***

Solubilidad

Se realiz la formacin de aductos del Ca con las CDcon el siguiente procedimiento: el Ca (2 mg) sesuspendi en una solucin acuosa (2 mL/H2O) concada ciclodextrina (3 mg) por triplicado,14 se agitdurante siete das a temperatura ambiente. La CD queproporcion mayor hidrosolubilidad se evalu en lasconcentraciones 5.8, 2.9,1.45, 0.725, 0.0362 mg con 2mg de Ca. Se realizaron otros ensayos utilizando HP--CD y metanol (MeOH), se evapor al medio ambientey se resuspendi en agua, Ca con PG, CPcon GF yla combinacin de cosolventes GF con PG y H 2O enproporcin 3:2:5 y 3:2:4. Se utiliz una concentracinde HP--CD 3.0 mg y de Ca 2.0 mg en cada ensayo

por triplicado; cada muestra se filtr a travs de unamembrana de acetato de celulosa, para ser inyectadoen el cromatgrafo de lquidos de alta resolucin(CLAR). Se determin la solubilidad en forma fsicamediante transparencia de los vehculos con elcompuesto y con el uso del CLAR.15-17

Condiciones cromatogrcas

Se utiliz un sistema cromatogrfico con bombabinaria, automuestreador y detector de arreglo dediodos, con 304 nm de longitud de onda. La fase mvilconsisti en metanol (40), agua (40) y acetonitrilo (20)en grado CLAR, degasificador en lnea con helio. Lafase estacionaria consisti en una columna C18 de 80mm de longitud. La suspensin a evaluar se filtr conmembrana 0.45 m,se inyectaron 25 L de muestray el lmite de deteccin del equipo fue de 50 ng/mL.

Para el clculo de la concentracin del compuestose emple un estndar externo, con el mtodo deadicin se determin el porcentaje de recuperacinde la tcnica analtica para establecer el porcentaje derecuperacin del compuesto durante la extraccin.18

Evaluacin in vitro

Preparacin de compuestos paraevaluacin quimioteraputica

Se utilizaron 10 y 50 mg/L de Ca solubilizado con

*Sigma-aldrich, Estados Unidos de Amrica.**Sigma-aldrich, Estados Unidos de Amrica.***Sigma-aldrich, Estados Unidos de Amrica.Sigma-aldrich, Estados Unidos de Amrica.Millex, Estados Unidos de Amrica.


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Metacercariae

Fasciola hepatica metacercariae were produced inLymnaea humilis snails experimentally infectedwith bovine origin miracidia obtained from a localslaughterhouse.

Articial Excystment of metacercariae

The technique of artificial excystment was carried outas it was described previously.19

Operation of the screening assay

Twenty four well culture plates, solubilized compoundand 0.2 mL with ten Fasciolas per well were used. Thecompounds were tested in concentrations reduced toa third part of 10 and 50 mg/L. Each compound wastested at least in duplicate and in each test run 8 controlwells containing flukes complete medium. Each assaywas run over a period of four days in

a saturated

atmosphere at 37oC under 5% CO2. This procedurewas carried out in agreement with that described byIbarra and Jenkins20and modified by Rivera et al.21

Interpretation of the test

Flukes were examined on days zero, one and fourwith an inverted microscope at 40X. The activity ofcompounds was assessed by comparison of the flukessurvival under treatment with respect to the non-treated flukes (control). All procedures were carriedout in a laminar flow cabinet under aseptic conditions.

Statistic analysis

The obtained data was submitted to an analysis ofvariance (ANOVA) to determine the differences inefficacy between concentrations and groups of theevaluated compounds. The data was analyzed by theNemenyi test using the SAS statistical package.22

In vivoevaluation in sheep

Animals

A population of 24 male, ten-month old Pelibueysheep, free of fluke, were used. They were allocatedunder conventional confinement, fed on balancedfood and water ad libitum,at the Universidad Autonomade Queretaro, Mexico.

Infection

On day zero, the animals were infected with 250

GF, PG, GF combinado con PG y H2O (3.2:5 y 3:2:4)y 0.5 mg/L con con HP--CD, que se depositaronen viales de 30 mL de capacidad. Posteriormente seprepararon las diluciones correspondientes con lafinalidad de obtener las concentraciones requeridaspara la evaluacin biolgica anti-Fasciola hepatica.

Metacercarias

Las metacercarias deFasciola hepaticafueron producidasen caracoles Lymnaea humilis a partir de la infeccincon miracidios de origen bovino obtenidos de un rastrolocal.

Tcnica de desenquistamiento

Se realiz la tcnica de desenquistamiento artificial taly como fue descrita previamente.19

Operacin de ensayo para escrutinio

Se utilizaron cajas de cultivo de 24 pozos, compuestosolubilizado y 0.2 mL con diez Fasciolas por pozo. Loscompuestos se probaron a concentraciones terciadasde 10 y 50 mg/L. Cada compuesto se evalu porduplicado y se cont, como testigo, por lo menos conocho pozos que contenan slo Fasciolas. Cada ensayose mantuvo en incubacin durante cuatro das a 37Cbajo una atmsfera de CO2al 5%. Este procedimientofue realizado de acuerdo con lo descrito por Ibarra yJenkins20y modificado por Rivera et al.21

Interpretacin de la prueba

Las Fasciolas fueron examinadas los das cero, unoy cuatro con un microscopio invertido a 40X. Laactividad de los compuestos se midi por comparacinde la sobrevivencia de las fasciolas bajo tratamientorespecto de las fasciolas testigo no tratadas. Losprocedimientos se realizaron en condiciones aspticascon una campana de flujo laminar.

Anlisis estadstico

Los datos obtenidos fueron sometidos a anlisis devarianza para determinar diferencias de eficacia entre

concentraciones y grupos de los compuestos evaluados.Se utiliz la prueba de Nemenyi apoyado con el usodel paquete estadstico SAS.22

Evaluacin in vivo en ovinos

Animales

Se utilizaron 24 ovinos Pelibuey machos de diez meses


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metacercariae of Fasciola hepatica. The 15 day cystswere kept at 5C prior to infection.

Fecal analysis

On days 8, 70 and 90, fecal samples were collectedand they were analyzed in the search of the trematodeeggs using the sedimentation test.

Blood samples

The blood samples were collected, conserved andprocessed for serum extraction and further injectionin the HPLC.18,22

Conduction of the experiment

Four groups of six animal each were selected, each onebased on the Fasciola egg counts from samples takenon day 8.23

Treatments

Group 1 received a dose of 1 mg/kg/IM of thecompound alpha solubilized with GF + PG and H2O(3:2:4), with a concentration of 10.86 mg/mL.

Group 2 received 2 mg/kg/IM of the compoundalpha solubilized with GF+PG and H2O (3:2:4), with aconcentration of 10.86 mg/mL.

Group 3 received 1 mg/kg/IM of the sulfoxidemetabolite of the compound alpha solubilizedwith GF+PG and H2O (3:2:4), with 8.9 mg/mL ofconcentration.

Group 4 was used as infected control withouttreatment.

Euthanasia was practiced 15 days after theadministration of the solubilized compound alpha;each liver was collected to count and measuretrematodes.

Evaluation

The efficacy was determined considering the presenceof eggs or Fasciolas in the treated group with respectto the control group.24

E = XC XT 100 XC

whereE= Efficacy percentageXC= Average number of Fasciolas in the control groupXT= Average number of Fasciolas in the treated group

de edad, libres de fasciolosis, alojados en corrales deencierro convencional, alimento balanceado y agua alibre acceso en la Universidad Autnoma de Quertaro.

Infeccin

Previa semana de adaptacin, el da cero los animalesse infectaron con 250 metacercarias deFasciola hepatica,

que tenan 15 das de enquistadas y conservadas enrefrigeracin a 5C.

Anlisis fecal

Se recolectaron muestras fecales los das 8, 70 y 90para la bsqueda de huevos del trematodo por mediode la tcnica de sedimentacin.

Muestras de sangre

Las muestras de sangre se recolectaron, conservaron yse procesaron para la extraccin del suero y posterior

inyeccin en el CLAR.18,22

Conduccin del experimento

Se seleccionaron cuatro grupos de seis animales cadauno con base en los conteos de huevos de Fasciola delas muestras de heces tomadas el da 8.23

Tratamientos

El Grupo 1 recibi dosis de 1 mg/kg/IM del compuestoalfa solubilizado con GF con PG y H2O (3:2:4), conconcentracin de 10.86 mg/mL.

El Grupo 2 recibi dosis de 2 mg/kg/IM delcompuesto alfa solubilizado con GF con PG y H2O(3:2:4), con concentracin de 10.86 mg/mL.

Al Grupo 3 se le administr 1 mg/kg/IM desulfxido del compuesto alfa solubilizado con GF conPG y H2O (3:2:4), con concentracin de 8.9 mg/mL.

El Grupo 4 se utiliz como testigo infectado sintratamiento.

El sacrificio de los animales se realiz 15 dasdespus de la administracin del compuesto alfasolubilizado; se tom cada hgado para revisin,recoleccin, conteo y medicin de los trematodos.

Evaluacin

La eficacia se determin con base en la presencia dehuevos o Fasciolas presentes en el grupo tratado conrespecto al grupo testigo:24

E = XC XT 100 XC


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Statistical analysis

An analysis of variance of the obtained data was usedto determine possible significant differences betweengroups and treatments.

The comparison of Fasciolas means, of thetreated and control groups, was carried out by theKruskal Wallis test, which determined the difference

in the reduction of adult Fasciolas.25The analysis wasachieved with the use of the statistical package SAS1990.

In order to analyze the results and comply withthe normality supposed and variance homogenity,the transformation of Box and Cox of the numberof eggs after treatment was carried out, using thetransformation of [(final eggs) ) 0.2 -1)]/0.008615735.

Results

Solubility of the compound alpha

Table 1 shows that HP--CD and -CD did notsolubilize CA, the -CD solubilized in 0.051%, HP--CD in 1.018%; HP--CD with 5.8 mg in 3.95%,HP--CD and methanol in 10.76%, PG in 39.048%,GF in 100%, the combinations GF+ PG and H2O inproportions 3:2:5 and 3:2:4 en 100%. The limit ofdetection of the chromatographic equipment was 50ng/mL, demonstrating that the technique used wasvalidated to detect the solubilized Ca.

In vitroevaluation

Table 2 shows that the solubilized CA with HP--CD,PG in 96 hours did not eliminate the flukes, with GF100% and the combination of GF+PG and H2O inboth concentrations had fasciolicidal efficacy of 100%at 24 hours. Likewise, all the controls kept alive during96 hours.

In vivoevaluation in sheep

The reduction of eggs is perceptible in Table 3; theaverage reduction of eggs of F. hepatica after andbefore the treatment was: Group 1, 89.16 and 14.66epg; Group 2, 30.33 and 16.66 epg; Group 3, 24.83

and 23.16 epg; Group 4, 125 and 133.5 eggs per gram(epg), respectively.

The amount of epg after treatment was notsignificantly different (P > 0.05) between treatments.

The reduction average of the amount of adultFasciolas per group was: Group 1, 36.29; Group 2,37.79; Group 3, 33.96 and Group 4, 74.96; however,there was no significant difference in the number of

dondeE = Porcentaje de efectividad,XC = Promedio de Fasciolas en el grupo testigo,XT = Cantidad promedio de Fasciolas en el grupo tratado.

Anlisis estadstico

La informacin obtenida se someti a anlisis de

varianza con la finalidad de determinar posiblesdiferencias significativas entre grupos y tratamientos.La comparacin de medias del nmero de Fasciolas

recolectadas del grupo tratado y testigo se realiz pormedio de la prueba de Kruskal-Wallis, que determinla diferencia de la reduccin de Fasciolas adultas.25Elanlisis se realiz con el paquete estadstico SAS 1990.

Para el anlisis de los resultados y cumplir conlos supuestos de normalidad y homogeneidad devarianzas, se realiz la transformacin de Box y Coxdel nmero de huevos despus del tratamiento,utilizando la transformacin de [(huevos finales) 0.2-1)]/0.008615735.

Resultados


El Cuadro 1 muestra que las HP--CD y -CD nosolubilizaron al compuesto alfa, las -CD solubilizaronen 0.051%, HP--CD en 1.018%; HP--CD con 5.8 mgen 3.95%, HP--CD y metanol en 10.76%, PG en39.048.5%, GF en 100%, la combinacin GF con PG yH2O en proporciones 3:2:5 y 3:2:4 en 100%. El lmitede deteccin del equipo cromatogrfico fue de 50ng/mL, lo cual demuestra que la tcnica fue validadapara detectar el compuesto alfa solubilizado.

Evaluacin in vitro

En el Cuadro 2 se observa que el Ca solubilizado conHP--CD, PG en 96 horas no elimin las Fasciolas,con GF 100% y la combinacin GF con PG y H 2O enambas concentraciones tuvo eficacia Fasciolicida de100% a las 24 horas. Asimismo, todos los testigos semantuvieron vivos durante 96 horas.

Evaluacin in vivoen ovinos

En el Cuadro 3 se aprecia la reduccin de huevos: elpromedio de huevos de Fasciola hepatica eliminadosantes y despus del tratamiento fue: Grupo 1, 89.16y 14.66 h/g/h; Grupo 2, 30.33 y 16.66 h/g/h; Grupo3, 24.83 y 23.16 h/g/h; Grupo 4, 125 y 133.5 h/g/h,respectivamente.

La cantidad de huevos por gramo de heces despus


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Cuadro 1

PORCENTAJE DE SOLUBILIDAD DEL COMPUESTO ALFA UTILIZANDO

DIFERENTES VEHCULOS

SOLUBILITY PERCENTAGE OF THE COMPOUND ALPHA USING

DIFFERENT VEHICLES

Compound alpha/mg Vehicle Solubility percentage*

2 Water LDD

2 Alpha cyclodextrin with water 0

2 Hydroxy propyl alpha cyclodextrin with water 0

2 Beta cyclodextrin with water 0.051

2 Hydroxy propyl alpha cyclodextrin with water 1.018

2 Hydroxy propyl alpha cyclodextrin with water 3.95

2 Hydroxy propyl alpha cyclodextrin with methanol plus water 10.76

2 propylene glycol with water 39.048

2 Glycerol formal with water 100

2 Glycerol formal with propylene glycol and water/3:2:5 ml 100

2 Glycerol formal with propylene glycol and water/3:2:4 ml 100

*Mean determinated by high-performance liquid chromatography

LOD = Limit of detection. A concentration below 50 ng/mL is not detected

Cuadro 2

EFICACIA FASCIOLICIDA in vitroDEL COMPUESTO ALFA SOLUBILIZADO

CON DIFERENTES COSOLVENTES

In vitroFASCIOLICIDAL EFFICACY OF THE COMPOUND ALPHA SOLUBILIZED

WITH DIFFERENTS COSOLVENTS

Dose mg/L

10 Efcacy % 50 Efcacy %

Compound/vehicle 24 hours 96 hours 24 hours 96 hours

Ca with hydroxypropyl-betacyclodextrin / 0.5 mg/L 60 60 60 60

Ca with PG 50 60 50 60

Ca with PG 30 40 30 40

Ca with GF 100 100 100 100

Ca with GF 100 100 100 100

Ca with GF combined PG and H2O /3:2:5 100 100 100 100




Triclabendazole with GF 100 100 100 100

GF with H2O / 2 ml 0 0 0 0PG with H2O / 2 ml 0 0 0 0

Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin/ 5.6 mg/L with

H2O/ 2 ml0 0 0 0

RPMI medium / 1.6 ml 0 0 0 0

Ca = Compound alpha PG= Propylen glycol RPMI= Culture medium

GF = Glycerol formal H2O = Water


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Fasciolas per ovine between treatments but it was withrespect to the control group (P < 0.05).

Even when the mean size (length) of the Fasciolasfrom the groups varied, the difference was only numeric.The efficay percentage was: Group 1, 51.48%; Group2, 49.58%; Group 3, 54.6%. The analysis of the meanlength of the Fasciolas shows no significant difference,so there are differences between the treatments andthe control group (P < 0.05).

The Ca kinetic determinated by HPLC showedthat in all serum samples no Ca was detected or its

sulphoxide and sulphone metabolites, the limit ofdetection of the equipment was 2ng/mL.

Discussion

Solubility of Ca

The technique to determine the solubility of Ca wasvalidated in the HPLC, demonstrating that it is asuitable method to separate components in a mixtureand is very specific for the recognition of one or severalanalites of interest; in addition, it allows an excellentseparation of the individual components to recognize

them easily.14,26,27The hidrosolubility of HP--CD detected by theHPLC is due, in general, to the stechiometry of themajority of the complexes formed with CD is inrelation 1:1,28 the increase of solubility joined to theincrease of HP--CD concentration is the result of agreater amount of HP--CD molecules than that of Ca,which favors the formation of aducts between bothcompounds.

del tratamiento no fue estadsticamente significativaentre tratamientos (P > 0.05).

En la reduccin de Fasciolas adultas se hall que elnmero promedio de Fasciolas por grupo fue: Grupo1, 36.29; Grupo 2, 37.79; Grupo 3, 33.96; Grupo 4,74.96. El anlisis del nmero de fasciolas por ovinomuestra que no hay diferencia significativa, por lo cualno hay diferencias entre los tratamientos pero s entrestos y el testigo (P < 0.05).

En el tamao promedio (longitud) de las Fasciolas delos grupos, aunque vari, slo hubo diferencia numrica.

El porcentaje de eficacia fue: Grupo 1, 51.48%; Grupo2, 49.58%; Grupo 3, 54.6%. El anlisis de la longitudtotal promedio de las Fasciolas muestra que no haydiferencia significativa, por lo cual hay diferencias entrelos tratamientos y con el testigo (P < 0.05).

La cintica del Ca determinado por el CLAR mostrque en todas las muestras de suero no se encontr elCa ni sus metabolitos sulfxido y sulfona, el lmite dedeteccin del equipo fue de 2 ng/mL.

Discusin


La tcnica para determinar la solubilidad del compuestoalfa fue validada en el cromatgrafo de lquidos de altaresolucin, por lo cual se demuestra que se trata de unmtodo adecuado para separar componentes en unamezcla y es muy especfico para el reconocimiento deuno o varios analitos de inters; adems, permite unaexcelente separacin de los componentes individualespara reconocerlos fcilmente.14,26,27

Cuadro 3

COMPUESTO ALFA: EFICACIA FASCIOLICIDA CON TRES DIFERENTES FORMULACIONES

INYECTABLES EN OVINOS

FASCIOLICIDAL EFFICACY OF COMPOUND ALPHA ADMINISTERED IN THREE DIFFERENT

INJECTABLE FORMULATIONS IN SHEEP

Group Formulation Dose mean epg*Efcacy

(%)

Adult fasciolas

collected

Efcacy

(%)

Length of

fasciola (mm)

(n=6) mg/kg IMBefore

Treatment

After

Treatment

Egg

reduction(mean SD)**

Reduction

of

Fasciolas

(mean SD)*

1 ***Ca 1 89.16 14.66 89 36.29a 4.74 51.48 35.94a 5.28

2 Ca 2 30.33 16.66 87.52 37.79a 5.33 49.58 37.56a 5.94

3 ****SO2 1 24.83 23.16 82.65 33.96a 5.51 54.6 35.49a 6.14

4 Control 125.5 133.5 ---- 74.96b 7.5 ----- 73.50b 8.36

*epg = eggs per gram of feces

**Different literals in rows indicate signicant difference between treatments (P < 0.05)

***Ca = Compound alpha

****SO2= sulphoxide metabolite of compound alpha


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9Vet. Mx., 41 (1) 2010

The HP--CD with methanol improved the solubilityof the compound alpha in 10.95%, the obtainedsolubility was low due to the size of the cyclodextrincavity,29its low solubility in water of 18.5 g/L at 25C 17for pharmaceutical compounds with molecular weightsbetween 200 and 800 g/mol30and aqueous solubilityof 60% (w/v),27joined to the molecular weight of Caand the stechiometry of the majority of the complexes

formed with CD, that is in relation 1:1, which decreasesthe formation of aducts. This result contrasts with theprevious observations where HP--CD increased thewater solubility of albendazole.14,26

The PG did not show a suitable solubility due to thevehicle density, but its use with HP--CD increases thesolubility of compounds.31

With GF and the combinations of vehicles a 100%of concentration was obtained; because it is a binarysolvent that solubilizes a great variety of hydrophobicand hydrophilic compounds, uses cosolvency toincrease the compounds solubility to an acceptableconcentration for intramuscular formulations and

improves the bioavailability of the little polar activeprinciples and also can be used in high doses of morethan 4 000 mg/kg in rats. 31-33

The suitable solubility obtained by the vehiclescosolvence has been used successfully in theformulation of ivermectins and rifampicin.34,35

In vitroevaluation

Previous studies show that the compound alpha hashigh efficacy in vitroagainstF. hepatica,6-8thus solubilitywith the used vehicles does not affect the efficacy of thecompound when obtaining 100% of efficacy againstthe trematode.

In vivo evaluation in sheep

The low efficacy obtained with the solubilized Ca isbecause by oral route there is a ruminal preactivationof the sulphoxide and sulphone metabolites. The Capasses to the plasma in suitable concentration to exertcertain efficacy in sheep and goats. 6,7,11 Is probablethat Ca remains in the tissue compartment when isinjected intramuscularly, little compound passes to thesanguineous torrent and arrives in low concentration

to the liver to be metabolized in sulphoxide andsulphona; this behavior is associated with its physico-chemical characteristics that favors a low volume ofdistribution, thus at greater dose the concentrationand the fasciolicidal efficacy increases.

It should be considered that in the site of injectionthe disposition of the deposited compound dependson the balance between variables, such as: compoundaffinity with the formulated vehicle, injected volume,

La hidrosolubilidad de la HP--CD detectada porel CLAR se debe a que, en general, la estequiometrade la mayora de los complejos formados con CD esen relacin 1:1,28el aumento de solubilidad aunado aincremento de la concentracin HP--CD es resultadode mayor cantidad de molculas de HP--CD que deCa, lo que favorece la formacin de aductos entre losdos compuestos.

La HP--CD con metanol mejor la solubilidad delcompuesto alfa en 10.95%, la solubilidad obtenida fuebaja debido al tamao de la cavidad de la ciclodextrina,29su solubilidad baja en agua de 18.5 g/L a 25C17paracompuestos farmacuticos con pesos molecularesentre 200 y 800 g/mol30y una solubilidad acuosa del60% (w/v),27 aunado al peso molecular del Ca y laestequiometra de la mayora de los complejos formadoscon CD, que es en relacin 1:1, lo cual disminuye laformacin de aductos. Este resultado contrasta con lasobservaciones previas en donde la HP--CD aument lasolubilidad en agua del albendazol.14,26

El PG no mostr una adecuada solubilidad debido

quiz a la densidad del vehculo, pero su uso con HP--CD aumenta la solubilidad de compuestos.31

Con el GF y las combinaciones de vehculos se obtuvo100% de concentracin; pues es un solvente binario quesolubiliza gran variedad de compuestos hidrofbicose hidroflicos, utiliza cosolvencia para incrementar lasolubilidad de compuestos en concentracin aceptablepara formulaciones intramusculares y mejora labiodisponibilidad de los principios activos poco polares,puede ser usado a altas dosis de ms de 4 000 mg/kg enratas.31-33

La adecuada solubilidad obtenida por lacosolvencia de los vehculos ha sido utilizada con xitoen la formulacin de ivermectinas y rimfampicina.34,35

Evaluacinin vitro

Estudios previos muestran que el compuesto alfa tienealta eficacia in vitrocontraF. hepatica,6-8por lo cual lasolubilidad con los vehculos utilizados no afecta laeficacia del compuesto al obtenerse 100% de eficaciacontra el trematodo.

Evaluacin in vivo en ovinos

La baja eficacia del Ca solubilizado se debe a quepor va oral tiene una preactivacin en rumen ensus metabolitos sulfxido y sulfona, el primero, pasaa plasma en concentracin adecuada para teneralta eficacia en ovinos y caprinos.6,7,11 Es probableque el Ca al ser inyectado va intramuscular quedeen el compartimiento tisular, poco compuesto pasaal torrente sanguneo y llega baja concentracin alhgado para ser metabolizado en sulfxido y sulfona;


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10

depth of the application site, perfusion in the injectedmuscle, vehicle absorption, as well as certain reactionin the application site, liposolubility of the compound,distribution of the compound associated with theused vehicle, physico-chemical forces of the tissuein movement and muscular contraction, so that thecompound be released from the vehicle, crosses thecapillaries and spreads in the blood in order to be

absorbed.36-40

The used vehicles, as GF and PG, can reduce theparticle size, thus favor the solubility and stabilityof the emulsions w/w, 41 but they did not improvethe distribution of the compound in the vascularcompartment to arrive at the liver to be metabolizedin sulphoxide and sulphona, which were present inplasma and had an effect against the adults of Fasciolahepatica, but in plasmatic concentrations below thedetection limit of HPLC, that was 2 ng/mL.

The differences of the fasciolicidal efficacy betweenoral and intramuscular route is due to the ruminalpreactivation exerted on its sulphona and sulphoxide

metabolites when CA is given by oral via and, this lastpasses to plasma in suitable concentration exertinghigh efficacy, as it has been reported when it isadministered in sheep and cattle.6,7,11

The combination of GF+PG and water solubilizesCa in 100% showing highin vitrofasciolicidal efficacy,but it was not consistent under in vivo conditions insheep. Further studies should be conducted to obtaina suitable injectable formulation aimed to improve theefficacy of Ca againstFasciola hepatica.

Referencias

este comportamiento est asociado a sus caractersticasfisicoqumicas que favorecen un volumen dedistribucin bajo, por lo cual a mayor dosis aumenta laconcentracin y la eficacia fasciolicida.

Se debe considerar que en el sitio de inyeccin ladisposicin del compuesto depositado depende delbalance entre variables, como afinidad del compuestocon el vehculo formulado, volumen inyectado,

profundidad del sitio de aplicacin, perfusin delmsculo inyectado, absorcin de vehculo, as comoreaccin en el sitio de aplicacin, liposolubilidad delcompuesto, distribucin del compuesto asociado conel vehculo utilizado, fuerzas fisicoqumicas del tejidoen movimiento y contraccin muscular, para que elcompuesto se libere del vehculo, atraviese los capilaresy se difunda en la sangre para ser absorbido.36-40

Los vehculos utilizados, como el GF y PG, puedenreducir el tamao de la partcula, por lo cual favorecenla solubilidad y estabilidad de las emulsiones w/w,41pero no mejoraron la distribucin del compuestoen el compartimiento vascular para llegar al hgado

y ser metabolizado en sulfxido y sulfona, los cualesestuvieron presentes en el plasma al tener efecto contraadultos de Fasciola hepatica, pero en concentracionesplasmticas por debajo del lmite de deteccin delCLAR, que fue de 2 ng/mL.

Las diferencias de la eficacia fasciolicida entre lasvas oral e intramuscular se deben a que por va oral serealiza una preactivacin en rumen en sus metabolitossulfona y sulfxido, este ltimo pasa a plasma enconcentracin adecuada para tener alta eficacia,como se ha notificado en ovinos y bovinos cuando seadministra.6,7,11

La combinacin de GF con PG y agua, solubiliza en100% al Ca, con alta eficacia fasciolicida in vitro, perono fue consistente bajo condiciones in vivo en ovinos.Se requiere adecuar la formulacin para mejorar laeficacia contraFasciola hepatica.

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