REVENCYT-RedidiCiencia.Desarrollo de Leishmania mexicana ...

Rojas Moreno Elina María

Desarrollo de Leishmania mexicana en lutzomyia youngi : fases de diferenciación hasta

metaciclicos

Universidad de Los Andes-Núcleo Universitario Rafael Rangel-Trujillo-Postgrado en Protozoología.

1991. p. 132

Venezuela

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DESARROLLO DE Leishmania mexicano EN Lufzomyia youngi:

FASES DE DIFERENCIACION HASTA METACICLICOS

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UNIV[RSIDAD DE lOS ANDIES MU~IDA - VENEZUELA

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José Vicente .••••• Wedi hama Miguel ••••••• Manashi y Mahu Mis hijas Aha nohu shori

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES NUCLEO UNIVERSITARIO "RAFAEL RANGEL"

DESARROLLO DE Leishmania mexicana EN Lutzomyia youngi: FASES DE DIFERENCIACION HASTA METACICLICOS

Tesis presentada ante la Ilustre Universidad de Los Andes por la Lic. ELINA M. ROJAS M., para optar al titulo de

Magister Scientiarum. Mención: PROTOZOOLOGIA

Dirigida por: Dr. Servio Urdaneta-Morales

Trujillo, 1991

1 N O 1 C E

Pág

DEDICATORIA •••••••••••••••••••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••

PROLOGO. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • i i

RESUMEN. • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • i i i

SUMMARY •••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••••••••• iv INTRODUeeiON GENERAL •.•.••••••••.••••.••••••••••••••••••••••••••••• MATERIALES Y METODOS GENERALES..................................... 9

e A P I T U L O I Desarrollo de lesiones tarsales en hámsteres por leishmania mexicana y la infección de Lutzomyia youngi alimentadas sobre ellas ............................................................... 13

e A P I T U L O II La excreción de pormastigotos de Leishmania mexiéana-por lutzomyoa youngi y la conclusión de la fase exponencial de desarrollo de los parásitos en el vector ...•••••.•••.••••.•••••.•••• 24

e A P I T U L O III Estadio terminal de Leishmania mexicana en ~a hipofaringe de lutzomyia youngi experimentalmente infectados •••••••••••••••..••• 37

e A P I T U L O IV Influencia de sacáridos simples o asociados sobre la presencia de un estadio hipofaríngeo de Leishmania mexicana en Lutzomyia young1 . .••.•••..•........••.•......•..••••••••••••••••••••••••• , . • • . . 45

e A P I T U L O V Promasrigotos metacíclicoss de Leihmania mexicana en Lutzomyia youngi y su resistencia a la actividad lítica de complemento humano y de cobayo. • . . • . • • • • • • • . . . • . . . • . • • • • • • • • • • • • • . • • • • • • • • • • • • • • 55

C A P I T U L O VI Papel de la saliva de lutzomyia youngi en la infectividad y. transmisión de leishmanias •••.•..•••.••••••••••••••••••••••••••.•••• ~6

DISCUSION FINAL ••••••••••••••.•.••••.••••••••••••••••.•••••••••••••• 75

CONCLUSIONES. • • • • • • • • • • • • • • • • . • . • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • 85

REFERENCIAS ••••.••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••.••••••• 86

.. i

P R O L O G O

Esta tesis es un esfuerzo para contribuir a resolver un problema fundamental en la transmisión de las leishmaniasis.

Cuando escribimos nuestro seminario sobre "Mecanismos de transmisión de protozoos por vectores artropodos", percibimos la situación de excepción en que se hallaban las leishmanias y el Endotrypanum, ambos transmitidos por Phlebotominae.

La intervención de los Phlebotominae como vectores de otros protozoos (v.gr. Plasmodium floridanfJ$>, Trypanosoma boca,gei y T. vastatrix) nos hizo sospechar que las tribulaciones del Prof. Dr. Robert Bray, en su "Travelers in PeriP (En Parasitol. Tapies, 1981, 48-53 pp) no debían ser tales, si partíamos de que en la int'erpretación de fenómenos mas generales, los esquemas naturales se repiten ••• Natura .!J.2!l faci saltes. Por ello, Endotrypanum y Leishmania no debían ser la excepción a la regla general, todos los hemoprotozoos que contaminan a sus vectores por vía bucal, son transmitidos por vía salival.

Al abordar este tema contamos con la colaboración de muchos allegados, la cual resolvió en algún modo los inconvenientes que en este país de subdesarrollo nos salían al paso constantemente. La gentileza de la Dra. Olinda Delgado del Instituto de Medicina Tropical "Félix Pífano", de Caracas, nos proporcionó 1 a cepa de Leishmania mexicaJl'a MH-86 que sirvió como material de base para este estudio; el interés de la Dra. Palmira Guevara de la U.C.V. en su intento por identificar al parásito y adiestrarnos en el manejo de su fina tecnología taxonómica; el Dr. Servio Urdaneta con su permanente interés crítico, catalizando mis angustias, con constante motivo e incentivo para la realización de un trabajo que pudiera satisfacer sus exigencias académicas; Dr.J.V. Scorza, en todo momento,con su estrecha cercanía, tras el seguimiento de mi trabajo.

•• i i

Agradezco a mis compañeros de labor que pueden confirmar, con su testimonio, los hechos esenciales que transmitimos y de los cuales no pudieron tener una reproducción fotográfica documental por carecer de los medios adecuados: Ricardo González, Yesid Solarte, Elio Moreno, Dalmiro Cazarla, Milagros Oviedo e Itamar Galfndez. Al amigo Gregario Ulloa del Laboratorio para Estudios de Malaria del M.S.A.S., por su paciencia con fotomicroscopio y al Técnica Fotográfico del IVIC. Sr. Jorge Rivas por la preparación de material fotográfico. A la Dra. Hilda Pérez, critica global que en condiciones adversas fue ejemplo e incentivación. A Leyla Abchi por su asfdua y paciente colaboración mecanográfica. Al personal técnico del Laboratorio "J.W. Torrealba" en especial a Rosa, Rafael y Armando por su constante asistencia. A los pacientes de esta área endémica, por su constante preguntar en 1 a Consulta de Lei shmani as i s: ¿cómo enfermamos?, ¿cómo se me metió ese parásito?.

Para el desarrollo de este trabajo hemos elaborado una secuencia intelectual yy metodológica diffcil de abordar por escrito, en una pieza única. Esta dificultad nos viene de la lectura del capftulo III sobre "Casualidad" de W.J.B. Beveridge en "El arte de la Investigación Científica", traducción del Dr. Oswaldo Grillo, de la Facultad de Farmacia de la U.C.V.

Hemos preferido desglosar esta prosa cientffica en seis trabajos; cada uno con sus objetivos, metodologfa, resultados y conclusiones parciales y todos ellos, en conjunto, presentados en una secuencia lógica para responder a la pregunta fundamental: ¿Cómo se transmiten las leishmanias?... Sabemos que a través de los flebótomos, pero .•. ¿Cómo?.

Finalmente, la realización de este estudio se llevó a cabo por el apoyo económico prestado por el Consejo de Desarrollo Cientffico, Humanfstico y Tecnológico de la Universidad de Los Andes, mediante el Programa para la Formación de Investigadores del cual fue becaria la Lic. Elina Rojas M y por el Proyecto NURR-C.-60-88 ambos bajo la tutorfa del Dr. J.V. Scorza B.

RESUMEN

La regurgitación de parásitos por Phlebotominae infectados ha Sido propuesta como hipótesis para explicar la transmisión natural de las leishmaniasis. Sin embargo, se ha desca~tado la contaminación del probosci de como mecanismo de transmisión. La autora ha estudiado como modelo, el desarrollo de una cepa de Leishmania mexicana s.l. aislado de caso de leishmaniasis difusa de Venezuela, en Lutzomyia youngi, transmisor

de leishmaniasis tegumentaria en la región de Los Andes de Venezuela.

Hembras de Lu. youngi, silvestres o de colonia fueron infectadas sobre lesiones tarsales en hámsteres inoculados subcutáneamente seis

semanas antes con 2 x 104 amastigotos. Se mantuvieron a 23QC y más de 80%

de humedad relativa, con solución de azúcar de caña 11 Sin refinar" al 50%

(v:v) en lugar de azúcar refinada o "sucrose 11 Sigma. Distinguimos en

ellas tres fases en el desarrollo de los parásitos: (1) fase de

diferenciación de los amastigotos y de crecimiento exponencial de

promastigotos, que culmina entre 60 y 108 horas después de la ingesta infectante, con la eliminación masiva fecal de promastigotos grandes; (2) fase estacionaria de adhesión flagelar a la cutícula estomodeal y de

síntesis de una glea para formar un tapón, entre las 60 y 120 horas; (3) fase de diferenciaci_ón de metacícl icos que invanden el conducto de la hi pofari nge en un 7% de 1 os insectos infectados, fenómeno que ocurre a partir del 5Q día y más frecuentemente entre el 6Q y 8º días. Los

metacfclicos con 4,21um de longitud somática y 8.81

um de longitud

flagelar, con anchura máxima de l.071um, nadan libremente por centenares, en el fluido del conducto de la hipofaringe que mide 6

1um de diámetro,

yendo desde el ápice hasta la unión del conducto hipofaringeo. Este fenómeno explicaría el mecanismo de transmisión del parásito.

ABSTRACT

Although it has been postulated that the natural transmission of leishmaniasis occurs by regurgitation of the parasites from contaminated probaseis of phlebotomine vector recent experimental results seems to oppose this thesis •.

Wild-caught and laboratory-reared females of Lutzomyia youngi, vector of Leishmania mexicana in the Venezuelan Andes, were infected on tarsal lesion of hamsters, inoculated 6 weeks previously s.c. with 2 x 104 amastigotes of L. mexicana s.l., isolated from a Venezuelan case of diffuse leishmaniasis. The insects were kept at 23QC and 80% R •.• , on a 50% (v:v} solution of 11 unrefined 11 cane sugar. The parasites developed through 3 stages: i) differentation of the amastigotes and exponential growth in the number of promastigotes, ending between 60 and 108 hrs, with a massive fecal elimination of large promastigotes; ii) a stationary phase in growth with flagellar adhesion to the cuticle of the stomodeum and synthesis of a ge 1 that formed a p 1 ug between 60 and 120 hrs; i i i) di fferent i at ion of metacyclics, which invade the hypopharyngeal duct in 7% of the insects, from the 5th day post-jnfection, and most frequently between the 6th and 9.th day. The metacyclics measured 4.21um in body length, l.07

1um in

maximum width and the flagellum was 8.81um lo~g. The parasites swam freely in the saliva of the hypopharyngeal duct (lumen 61um in diameter}, from the apex to union with the salivary duct, without invading the latter.

The mode of the transmission of L. mexicana i discussed in relation to the presence of the metacyclic promastigotes in the hypopharyngeal duct of its natural vector.

•• 1

1 N T R O O U e e 1 O N

La teoría de la transmisión de las leishmaniasis por la picadura de insectos fue planteada originalmente en 1904 por Presaat, según refiere ARAGAO {1927), dando origen a una larga y compleja historia

sobre flebótomos transmisores y especies de leishmanias.

Se ha demostrado que los transmisores de las leishmaniasis son fl ebótomos y aún cuando han aparecí do numerosos trabajos recientes sobre transmisión tanto de parásitos del Viejo como del Nuevo Mundo, destacamos como pioneros, precisos e importantes, 1 os experimentos de

SHORTT y BARRAUD (1924) quienes describieron el ciclo de vida y los cambios morfológicos de Leishmania donovani en Phlebotomus argentipes, desde el momento inicial de la ingesta infectante hasta los 20 días

siguientes. Los citados autores diferenciaron los cambios morfblógicos delos parásitos durante una primera ingesta infectante y los que se dan

durante una segunda ingesta no infectante ofrecida al cuarto o al

quinto día después de aquella. Describieron en estos dos período~ las alteraciones morfológicas de los parásitos y su ubicación dentro del tubo digestivo, diferenciando 15 formas o tipos distintos de flagelados, entre el quinto y el octavo día postinfección,

distinguiendo formas libres en el lúmen y formas adheridas a las

paredes del tubo digestivo.

Es impor~ante destacar dentro de la variedad de formas descritas,

la presencia de un estadio final que consideraron infectante ("the presumption is that they are the end products of division and may either be themselves the infective stage or develop into it without further subdivision") poniendo en este estadio mayor énfasis: "the

stage just descri bed i s that arri ved at by the seventh or ei ght day after the initial infective feed and the second, third or fourth, after

the second feed". Con: respecto a la forma de los mismos, señalaron que eran cortos, con flagelo largo y movimiento rápido y hallándoselos

•• 2

solamente en la unión de la faringe con la cavidad bucal.

Años más tarde y en 1 a misma búsqueda, ADLER et 21.· ( 1931) ensayaron con otros modelos -Leishmania infantum en Phlebotomus perniciosus y Leishmania major en P. papatasi- observando las transformaciones morfológicas que se suceden en los parásitos a medida que transcurre el proceso digestivo, desde la ingesta infectante inicial, distinguiendo cuatro grupos de flagelados en el tubo digestivo a partir de caracteres morfométricos y coincidiendo con SHORTT y BARRAUD (ya citados) en distinguir un estadio terminal infectivo, cuya forma típica lo ubicaría en un IV grupo, con cuerpo corto de 4.7 hasta 10/m, con aparición tan temprana como el cuarto día post-ingesta y cuyo habitat estaría en las proximidades de la válvula esofágica, por encima del cardias. Tales formas solo se diferenciarían en la región anterior del tubo digestivo y mas específicamente en la cavidad bucal y en el hexaqueto. Es importante señalar, además de estas observaciones, experiencias de regurgitación de promastigotos de L. infantum por P. patatasi haciéndolos succionar- · en tubos capilares. Supusieron que así serían inyectados en la piel dejando en claro sin emhat~, que: 11 The mechanism by which the flatellate leave the probaseis is not yet clear 11

•

Hemos puesto énfasis en referir y detallar estas observaciones porque éllas han sido motivo de seguimiento por otros investigadores, en distintas especies de leishmania y en una gran variedad de especies de flebotominos natural o experimentalmente infectados.

Recientemente y con respecto a los promastigotos que se encuentran en las piezas bucales de flebótomos, MOLYNEUX (1977) replantea que las formas infectantes deben ser un estadio infectivo terminal transmisible por picadura y preparado para i ni ciar 1 a infección en un hospedador vertebrado susceptible.

•• 3

La existencia de un promastigoto "metaciclico" en el proboscide de flebótomos, como prerequisito para la transmisión por picadura, ha sido también planteada por KILLICK-KENDRICK (1979) basándose en diferencias entre los parásitos en división en el intestino medio y los hallados en las piezas bucales.

A partir de. esos trabajos comienza la formulación de una teoría sobre metaciclogénesis y un estadio metacíclico en Leishmania spp. que, según SACKS (1989), no se expresaría por algún atributo morfológico obvio, sino que se evidenciaría como un estadio con particulares propiedades bioquímicas y fisiológicas mas que con una forma par ti cul ar. Estas presunciones ti en en fundamento en estudios hechos con parásitos en cultivos axénicos. SACKS y PERKINS (1984), trabajando con promasti gotas de L. major cosechados en 1 a fase 1 ogaritmi ca de crecimiento en medio de cultivo, observan que son avirulentos para ratones BALb/c, en tanto que los cosechados en la fase estacionaria, sí son infectantes. Los mismos autores (1.985) han hecho otro estudio similar, trabajando ahora con promastigotos de L. major y L. mexicana desarrollados en el tubo digestivo de Phlebotomus papatasi y de Lutzomyia longipalpis respectivamente. Los parásitos de tres días de desarrollo resultaron a vi rulen tos para ratones BALb/c, en tanto que fueron progresivamente mas virulentos, los obtenidos de flebótomos con cuatro hasta siete días de desarrollo postingestivo.

La sobrevida del metacíclico en un nuevo hospedador mamífero no infectado, dependerá de cómo aquel evade las reacciones inmediatas de defensa que le opone la barrera dérmica, donde se incluya una eventual 1 i si s mediada por comp 1 emento y 1 a actividad lit i ca de 1 suero fresco normal (FRANKE et 2J..., 1985). Esta resistencia ha sido explicada por la presencia en los promastigotos de la fase estacionaria del cultivo,

de receptores C3b para el CRl del complemento humano, que a su vez los opsonizarían para un eficiente reconocimiento e internalización por los macrófagos (HOWARD,et 2J..., 1987; PUENTE, i!,2l_., 1988).

Como un desarrollo de transmisores,

•• 4

añadido a este resumen sobre evidencias sobre el un estadio infectante particular en los flebótomos

presentaremos también una breve revisión sobre la migración de tales parásitos hacia las piezas bucales del vector, conditio sine~ non para la transmisión natural.

El proceso de la migración de promastigotos de Leishmania, desde el intestino medio hasta la región anterior y específicamente hasta las piezas bucales, se cree que está condicionado por la ingestión de néctares o azúcares.

La importancia de una i ngesta azucarada por fl ebótomos para 1 a transmisión de Leishmania danavani por Phlebatomus argentipes, fue

demostrada por SMITH et ~· (1941) y por SHORTT (1945). SCHLEIN et ~· (1987) han comparado, por otra parte, cambios de forma de L. majar que tienen lugar cuando se los expone a soluciones hipertónicas de sacarosa

(0,25 M) y de mezclas de ésta con solución salina, comparándolos con los cambios que, según se refiere, ocurren en el vector, sugiriendo que el disacárido contribuye a la morfogénesis final del parásito. Por otro lado, YOUNG et ~· (1980) han demostrado la presencia de fructosa en P. ariasi silvestres y han especula~o el posible papel de este azúcar en la transmisión de las leishmanias, en tanto que KILLICK-KENDRICK y KILLICK-KENDRICK (1987) sugieren que P. ariasi ingiere azúcar a partir de secreciones de áfidos, mientras que SCHELEIN (1986) demuestra que P. papatasi puede picar órganos de plantas (Capparis spinosa) y por ese mecanismo ingerir azúcares.

Mezclas de sacarosa con albúmina, suministradas a P. papatasi infectados artificialmente con cultivos de Leishmania majar, promueven la presencia de flagelados libres en la porción anteroesofágica de este vector (WARBURG & SCHLEIN, 1986).

Observaciones jn vivo, utilizando P. papatasi y P. langeroni infectados sobre hamsteres con L. majar, sugieren que la nutrición con

• • 5

sacarosa antes ó después de la i ngesta i nfectante, se acompaña de

migrac10n de parásitos~cia la región cefálica, siendo mayor en P.

langeroni que en P. papatasi (SHEHATA et !1·• 1988).

El curso del desarrollo de L. mexicana en Lutzomyia youngi o de

L. braziliensis en este mismo flebótomo, puede ser modificado por la

especie de azúcar ing~rida experimentalmente por el insecto antes o

después de la ingesta infectante (AÑEZ et !l·, 1989; ROJAS-CASTILLO, 1989). Los trabajos antes citados, señalan sugieren migración de promastigotos hacia la región anterior terminal del tubo digestivo del vector, pero no explican el cómo o el por qué ocurre esa migración, quedando este aspecto como especulación generalizada que

se hace mas dudosa con las observaciones de STEPHENSON & WARD (1986)

acerca de la no necesaria presencia de formas del parásito en el

proboscide del insecto, para que la transmisión de L. chagasi por

Lutzomyia longipalpis tenga lugar.

Aunque la secreción salival ha sido con.siderada fundamental para

la transmisión de otros y distintos parásitos que utilizan la vía

salival como mecanismo de contaminación como sucede con Plasmodium y Trypanosoma (RIBEIRO, 1989), apenas muy recientemente se la ha tomado

en cuenta para estudios sobre infectividad de Leishmania spp. (TITUS

& RIBEIRO, 1988), considerándola con acción adyuvante o reforzadora para la infectivi·dad de promastigotos de L. major, una vez mezclados éstos con homogeneizados de glándulas salivales de L. longipalpis e inoculados subcutáneamente en ratones.

Finalmente, el fenómeno de la transmisión en leishmaniasis no es tan dramático como en otras infecciones epidémicas producidas por protozoos, lo que hace pensar que su circunstancia en esta

parasitosis, estaría regulada por factores limitantes del vector, del parásito o de ambos.

•• 6

En cuanto a la importancia de la estructura y morfología del aparat bucal de flebótomos para la transmisión de leishmaniasis, tenemos que añadir que la inoculación de sus metacíclicos tiene que estar relacionada con la hematofagia de flebótomos infectados. Según LEWIS (1977) la penetración del estilete hasta la dermis ocurre por la actividad cortadora, en tijeras, de las mandíbulas y maxilas, dirigidas en su penetración por la epi-e hipofaringe. Esta acción traumática conduce a la ruptura de capilares en la dermis, fenó~eno

demostrado por CARNEVALI & SCORZA (1982) quienes relacionaron la profundidad de la lesión dérmica, con la longitud de la porción dentada de las mandíbulas. Después de la penetración del hexaqueto hasta la dermis, ocurre la succión de sangre extravasada; en este proceso participaría activamente la secreción salival (TITUS & RIBEIRO, 1988; RIBEIRO, 1989).

Parece evidente que si los promastigotos metacíclicos se hallan libres entre las piezas bucales del hexaqueto, como ha sido mencionado por diversos autores (SHORTT & BARRAUD, 1926; ADLER &

THEODOR, 1931; MOLYNEUX, 1975; KILLICK-KENDRICK, 1978; SACKS & PERKINS, 1985; LAINSON & SHAW, 1988), su penetración hasta la dermis estaría dificultada por la actividad cortadora de las mandíbulas y

maxilas. Suponemos qué tras la pentración qe estas piezas, ocurra la inoculación de metacíclicos por algún otro mecanismo que podría estar relacionado con la secreción salival que precede al acto e succión sanguínea. Se ha especulado que la aparición de múltiples lesiones de leishmaniasis en algunos pacientes, sea producto de repetidas pruebas (probe) por flebótomos sin succión sanguínea; en este caso es más difícil suponer que los parásitos responsables de las lesiones sean formas contaminantes del hexaqueto.

Los fenómenos que conducen a la inoculación de metacíclicos de Leishmania spp. no han sido detalladamente estudiados por los investigaciones, motivo por el cual nosotros no~ haros propuesto en este

•• 7

trabajo, estudiar particularmente el desarrollo, migración y ubicación de Leishmania 11l'EXicana en el hexaqueto de Lutzomyia youngi.

Disponemos de ejemplares de flebótomos de una cría experimental de Lutzomyia youngi Feliciangeli & Morillo, 1987 obtenidos según la técnica de (A~EZ y OVIEDO, 198o) y también los de una colonia natural abierta de esta misma 'especie ubicada en las cercanías de nuestro sitio de trabajo. Poseemos una cepa de Leishmania mexicana mantenida en hamsteres que infecta, en un alto porcentaje, a Lutzomyia youngi cuando se los alimenta sobre hamsteres con histiocitomas tarsales parasitados.

Al estudiar sistemáticamente el desarrollo de L. n:WciCé11a. en LtJ.

youngi haremos énfasis en la búsqueda de parásitos en el aparato bucal y en la eventual caracterización metacíclica de tos mismos así:

1.- Desarrollo inicial del parásito, durante la fase exponencial, en el estómago del vector hasta su excreción por vía rectal y su migración hacia la región estomodeal, donde eventualmente ocurra la metaciclogénesis.

2.- Estudio de la metaciclogénesis, a partir de las 72 horas de desarrollo, para intentar la demostración de un promastigoto infectante.

3.- Estudio de la acción de azúcares naturales (sacarosa), sobre la migración de promastigotos hacia el proboscide.

4.- Estudio comparativo de la resistencia de promastigotos de infecciones tempranas y tardías en flebótomos, a la acción de complemento humano y de cobayo.

5.- Infectividad para el hamster de promastigotos sensibilizados por acción de complemento.

.. 8

6.- Efecto de la adición de homogeneizados de glándulas salivales en

la inoculación de amastigotos de Leishmania sp. sensibilizados o

nó por acción del complemento, y estudio del desarrollo de las lesiones por ellos producidas.

•• 9

MATERIALES Y METODOS GENERALES

1.- PARASITOS.-

Cepa de Leishmania mexicana M HOM/VE/86/MH aislada de una paciente femenina 11 MW, c,on ocho lesiones típicas de leishmaniasis difusa, con abundantes parásitos y ocho meses de evolución. Leishmanina negativa. Lesiones que cedieron tras un tratamiento con 9,5 unidades factor de transferencia y tres series de 33 mg/kg de Sbv diarios por 15, 15 y 9 días, con 15 días de reposo intercalado entre series (DELGADO, comunicación personal, 1989). Esta cepa, aislada antes del tratamiento, ha sido mantenida en hamsteres machos por inoculación en tarsos, produce metástasis y exhibe un patrón de desarrollo suprapilórico en Lutzomyia youngi, infectando entre 30 y 50% de los flebótomos.

2.- INSECTOS.-

Lutzomyia youngi Feliciangeli & Morillo, 1987 silvestres fueron capturados en una localidad no endémica para leishmaniasis, próxima a la ciudad de Trujillo, Venezuela. Las hembras capturadas con trampa de S han non cebada con 1 uz fluorescente, fueron confinados en envases de vidrio revestidos internamente con corcho (MARQUEZ & SCORZA, 1982), no más de 80 ejemp 1 ares por frasco y se mantuvieron en ayunas por no más de 24 horas, hasta su uso experimental. Las hembras de L. youngi nacidas en el laboratorio, fueron obtenidas de cultivos según el procedimiento ,.-de AÑEZ y OVIEDO (1985} y se conservaron como las hembras silvestres.

3.- MANTENIMIENTO EXPERIMENTAL DE LA CEPA "MH" E INFECCION DE l.:t,¡.

youngi.-

Con amastigotos obtenidos asépticamente de lesiones tarsales de un

•• 1 o

hamster donador, se inocularon subcutáneamente en el dorso de uno de los tarsos, nuevos hamsteres destinados a servir de fuente alimenticia infectiva para los flebótomos. Estos hamsteres fueron siempre machos, de 3 hasta 4 semanas de edad. Una vez que el granuloma se hubo desarrollado y siguiendo el protocolo experimental, el animal seleccionado se anestesió con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal {20 mgr/k.) y después de cubrir la región plantal de los tarsos infectados, para reducir el número de los flebótomos no infectados, se introdujo la pata dentro de un envase de vidrio que contenía 1 os fl ebótomos, para alimentarlos preferentemente sobre la piel del dorso tarsal (YARBU-

1 & SCORZA, 1982), dejándolos picar durante diez minutos en

ambiente oscurecido. Los insectos así ingurgitados fueron trasladados a envases de mantenimiento, dentro de cavas de poliestireno a temperatura ambiental {24QC) y con alta humedad relativa ( 70%), suplementando su dieta sanguínea con una solución de sacarosa comercial al 50%, impregnada en una esponja sintética colocada sobre el recipiente con los flebótomos.

4.- PATRON DE DESARROLLO DE L. mexicana EN Lu.youngi.-

Los flebótomos experimentalmente infectados con L. mexicana sobre

lesiones tarsales de hamsteres, fueron anestesiados por exposición a vapores de éter y luego disecados, previa inmersión en solución salina al 0,6% con 11 NP40 11 como detergente al 1/100, para despojarlos de escamas y hacerles un lavado posterior en solución salina. Cada lote de insectos fue d~secado en períodos definidos según el experimento. Fue registrada la condición ovígera resultante de la ingesta sanguínea experimental como evidencia de haber ingerido sangre y seguidamente se les extrajo el tubo digestivo previa cuidadosa tracción para separar la cabeza con un corto segmento de esófago. Se examinó cuidadosamente con ayuda de un microscopio estereoscópico, todo el tracto digestivo anterior, las piezas bucales incluidas, se determinó la presencia o ausencia de promastigotos y su ubicación para los objetivos experimentales.

•• 11

5.- EXCRECION DE FLAGELADOS POR Lu. youngi.-Flebótomos infctados para recoger y estudiar sus excretas, fueron confinados en recipientes especiales provistos de láminas porta-objetos en su parte inferior. Los detalles metológicos se presentarán en la sección NQ 2 de esta tesis.

6.- SOBREALIMENTACION AZUCARADA.-

Antes o después de la ingesta infectante, se ofreció a los flebótomos soluciones de azúcares naturales, simples o mezcladas con otros azúcares, con derivados de azúcares o con aminoácidos obtenidos de SIGMA Chem. Co., POLSCIENCE, Inc. y HOPKINS &

WILLIAMS.

7.- OBTENCION DE SUEROS SANGUINEO HUMANO Y DE COBAYO.-

Los sueros para la incubación de promastigotos obtenidos de fl ebótomos infectados experimenta 1 mente, se obtuvieron frescos por ve ni punctura de donadores humanos sanos y en ayuna o por cardi opunctura, de cobayos a 1 imentados con pasto fresco. Las muestras de sangre se dejaron coagular durante 30 minutos a temperatura ambiente y se mantuvieron en nevera (5QC) hasta la retracción del coágulo; después de centrifugadas a 1500 rpm durante 15 minutos, los sueros no hemolizados fueron separados, fraccionados en alícuotas y congelados a -70ºC hasta su uso, cuando fueron diluidos con solución salina tamponada adicionada con cloruro de magnesio (SST-Mg). Para la inactivación de comp 1 emento a 1 í cuotas de 1 os sueros desconge 1 a dos fueron incubadas inmediatamente a 56QC durante 30 minutos y

seguidamente se conservaron en refrigeración para usarlos antes de un tiempo máximo de dos horas.

o • 12

8.- HOMOGENEIZADOS DE GLANDULAS SALIVALES.-

Hembras silvestres de Lutzomyia youngi fueron capturadas la víspera del día de trabajo, sé sacrificaron y lavaron con solución detergente en condiciones de máxima asepsia y fueron decapitadas sobre láminas previamente flameadas, haciendo suave y firme tracción de la cabeza, de manera tal que las glándulas salivales quedaran expuestas, para ser seccionadas con agujas 000, aspiradas con micropipetas estériles y trasladadas hasta un pequeño mortero de porcelana, tambien esterilizado donde fueron trituradas en lotes de lO glándulas, con adición de 0,2 ml. de solución salina o,85% estéril. El triturado así obtenido se aspiró con jeringa de 1,0 ml y aguja NQ 27 para mezclarlo con la suspensión de parásitos y ser usado inmediatamente.

9.- ESTUDIO DEL APARATO BUCAL DE LU. youngi .-

Bajo microscopio estereoscópico, con aumento 20X, se di secó 1 a cabeza de hembras seccionando pa 1 pos y antenas para separar 1 as piezas del hexaqueto. Las porciones cefálicas fueron clarificadas con líquido de Nesbitt por 24 horas y montadas luego en Berlesse para su estudio morfométrico y fotográfico.

10.- MORFOMETRIA DE PROMASTIGOTOS.-

Las muestras de parásitos excretadas, los extendidos, improntas o dilacerados de tejidos u órganos con parásitos de L. mexicana fueron secados al aire y fijados con metanol durante 10 minutos. Las preparaciones fueron co 1 oreadas con Gi emsa Merck a 1 5% en ta~"ón de fosfato M/200 a pH 7.2 durante un período que varió desde 30íminutos hasta una hora y luego lavados con agua corriente.

C A P 1 T U L O 1

•• 13

DESARROLLO DE LESIONES TARSALES EN HAMSTERES POR Leishmania mexicana Y LA INFECCION DE Lutzomyia youngi ALIMENTADAS SOBRE ELLAS.

Para hacer un estudio detallado sobre el desarrollo de leishmania, en este caso Leishmania mexicana, en un flebótomo antropofílico y

transmisor co~o Lutzomyia youngi, lo fundamental es disponer de suficientes insectos infectados experimentalmente mediante su exposición a un mamífero de laboratorio altamente susceptible a la

infección por estos flagelados.

El hamster dorado, para las cepas de Leishmania spp. de nuestro país es hospedador experimental por excelencia y sobre él, Lu youngi se alimenta sin dificultad alguna. (SCORZA y DELGADO, 1982).

La primera evidencia de la susceptibilidad del hamster (Cricetus griseus) a la infección por Leishmania fue producida por SMYLY & YOUNG (1924) y por YOUNG et al. (1924) mediante la inoculación intrapenitoneal de una suspensión de amastigotos de L. donovani, del bazo de un caso mortal intensamente infectado, originario de la China. En el segundo escrito se confirma la infección de un 91% entre 89 hamsteres inoculados. Desde entonces, este roedor se ha convertido en hospedador de laboratorio para variados trabajos. En nuestro continente, FULLER & GEIMAN (1942) lo introdujeron como sujeto experimental para el aislamiento de cepas de pacientes; STRANGWAYS-DIXON & LAINSON (1966) lo utilizaron para estudiar el

desarrollo de L. mexicana en Lu. pessoana; LAINSON et ~· (1977) para demostrar la transmisión de L. chagasi por Lu. longipalpis y HERRER et

~· {1973) y HERRER (1982) para utilizarlo como centinela y estudiar la actividad enzoótica de las leishmaniasis en condiciones naturales. Nuestra experiencia lbcal sobre infección de flebótomos picando hamsteres inoculados, incluye los trabajos de CARNEVALI & SCORZA (1976), V'AKBUH & SCORZA (1982), AÑEZ et ~· (1985) y ROJAS & SCORZA (1989) donde se registran variados, pero siempre altos porcentajes de infecciones experimentales en esta especie de flebótomo ..

•• 14

Esta primera sección de nuestra tesis se dedica a fijar condiciones óptimas para la infección experimental de lu. youngi, a partir de amastigotos tisulares de l. mexicana ingeridos al picar

lesiones tarsales de hamsteres.

En esencia indujimos lesiones por histiocitomas leishmánicos tarsales en hamsteres, midiendo el desarrollo de los mismos producidos por distintos inóculos, en diferentes tiempos de desarrollo, y para estimar, por disección el porcentaje de insectos que se infectan, relacionando ~ posteriori estos porcentajes con el volumen de las lesiones tarsales sobre la cual se alimentaron y también con el número de amastigotos presentes en dichas lesiones para el momento de la

picadura. La inoculación de los hamsteres se hace subcutáneamente en la cara dorsal del tarso izquierdo y el histiocitomas que se forma involucra toda la pata. Siendo los lugares a picar por lo flebótomos

absolutamente aleatorio, hemos necesitado investigar, además, cómo es la distribución de los amastigotos en la dermis tanto de la cara dorsal como en la cara plantar del tarso, para precisar, aún más, las áreas donde más se contaminan los insectos que pican.

•• 15

MATERIALES Y TECNICAS PARA CADA UNO DE LOS TRES EXPERIMENTOS

Experimento Nº 1.- Inoculación de hamsteres con L. mexicana para medir el desarrollo de las lesiones tarsales.-

Hamsteres machos, pr~ferentemente de colO'i blanco, con 3 semanas de edad, se confinan en grupos de 5 animales por jaula de 50 x 50 x 20 cm. Los roedores se identifican por marcado mediante tinción de la piel con ácido pícrico, según una convención de nuestro laboratorio donde en sentido de las agujas del reloj, con el animal en posición de pie, se

numeran las patas desde 1 hasta 4 incluyendo una quinta marca en el cogote. Los animales se alimentan con concentrado para ratas y agua~ libitum, manteniéndolos sobre lechos de cáscara de arroz.

Para la producción de histiocitomas tarsales y el seguimiento de su desarrollo, utilizamos 60 hamsteres para inocularlos, en lotes de 20, con cada uno de tres diferentes inóculos de la cepa M.H-86 de L.

mexicana. Preparamos una suspensión de amastigotos a partir de tejido granulomatoso de un hamster donante, sacrificado para ese fin.

Muerto e 1 roedor por sobreanestes i a con éter, se 1 a va pro 1 i j amente 1 a pata infectada con agua jabonosa y luego con alcohol de 70Q,

seccionándola con tijeras, en un solo corte, por la articulación

tibioperoneal-tarsal. La pata una vez separada, se coloca sobre gasa esterilizada contenida en un placa de Petri también estéril y con instrumentos desinfectados por inmersión en alcohol, se diseca la piel

del dorso para extraer con pinzas trocitos de tejido granulomatoso. Los fragmentos se trituran en un mortero en cerca de lOX su volumen, en solución salina esterilizada, hasta obtener una suspensión honogénea.

Inmediatamente y sin pérdida de tiempo, se toman 5 mJ de la suspensión para distribuirlos uniformemente en un área de 1 e~ premarcada sobre un porta-objetos. Se seca el extendido con aire caliente, se fija con metanol durante 60" y se tiñe con Giemsa al 30% durante 5• en tampón de 'fosfato M/200 a pH 7.2. Concluida la tinción y secada la preparación,

•• 16

se cuentan los amastigotos por campo con lente de inmersión de apertura

numérica 1,25 (lOOX). Contamos ent'e 10 y 20 campos según la uniformidad del recuento para estimar así una media de parásitos por campo. Esta media se multiplica x 3200 (Nº de campos con inmersión en el área de ·

2 1 cm )

3y se divide el total entre 5 para estimar el número de parásitos

por mm de suspensión. Seguidamente se "diluye" el concentrado por un factor suficiente para preparar suspensiones de 1 x 1&, 2 x 104 y 4 x 104

amastigotos en O.o5 ml., tomado como volumen para el inóculo. Se inoculan los hamsteres a estudiar, 20 para cada inóculo, con el cuidado de rotar la aguja de inyección (Nº 27) dentro de la dermis, para que la dosis quede contenida totalmente dentro de la misma. Entre el sacrificio del hamster_ donador y la inoculación del último hamster experimental, no debí eran transcurrí r más de 45'. Después de 2 horas ~ vitro, según nuestra experiencia, se ha disparado la transformación de los amastigotos en jóvenes promastigotos elípticos, menos infectantes. Para calcular el volumen de la hipertrofias tarsales producidas por la inoculación de los parásitos, semanalmente con un V e r n i e r e a 1 i b r a do p a r a O , 1 mm se e a 1 e u 1 aro n 1 os í n d i e es t a r s a 1 e s a partir e la medida de la longitud del eje medioplantar, la altura dorso-plantar y la anchura transversal de cada pata inoculada en los 20 animales de cada grupo. Con esas mediciones se calculó el volumen de la hipertrofia como si fuera un cilindro y con ellos se estima la}(~~ de las hipertrofias a los 30 y 45 días postinoculación, expresándola en

3 mm •

Experimento Nº 2.- Recuento de amastigotos en la dermis de las regiones dorsal y plantar de los tarsos infectados con L. mexicana cepa MH-86.

Desconociendo por una parte, la distribución de los amastigotos de L.

mexicana en la piel del tarso inoculado por la cara dorsal y observando, que la hipertrofia de la lesión involucraba a toda la pata, exceptuando 1 os dedos, y que por otra parte, a sabiendas de que 1 os flebótomos podrían picar en cualquier lugar expuesto de la pata,

•• 17

debíamos estudiar la distribución de los amastigotos en la piel dorsal y plantar del tarso en los 20 hamsteres de cada lote inoculado, sacrificando 10 animales a los 30 días y otros 10 a los 45 días.

Para ello intentamos un mapa de cada hipertrofia a partir del estudio de improntas de piel hechas con 8 trocitos extraídos con un punch de STIEFEL LABORATORIES (UK) LTD,de 2 mm 0, según el siguiente diseño: cinco biopsias en la región dorsal, una en el centro y 4 equidistantes de éste en los bordes laterales; otras 3 de la región plantar, extraídas a lo largo del eje longitudinal medio. Fijadas y coloreadas con Giemsa, se estimó en cada impronta la presencia o ausencia de parásitos por 100 células blancas para cada una. Se calculó un x ~~ para cada región con los valores del parasitismo a los 30 y 45 días en los granulomas, por inóculo.

Experimento Nº 3.- Xenoiagnósticos con Lu. youngi en lesiones tarsales

por L. mexicana con 30 y 45 días de desarrollo.-

Lotes de 15 hasta 20 hembras de Lu. youngi, capturados 1 a noche anterior a 1 trabajo y confinadas en envases recubiertos internamente con corcho, fueron a 1 imentadas sobre cada uno de 1 os hamsteres con lesiones tarsales de 30 días de desarrollo. Para ello se siguió el siguiente procedimiento: cada hamster se anestesió con pentobarbital sódico en solución salina inyectado intraperitonealmente a la dosis de 20 mg/kg en un volumen de 0,5 ml.. Una vez, inconsciente, para un primer xenodiagnóstico, se cubrió el área plantar de la pata infectada con un trozo de tela adhesiva para permitir que los flebótomos picasen solamente en la piel dorsal, una vez que la pata se introducía en el orificio del envase con los insectos. En un segundo xenodiagnóstico, se cubría el área dorsal dejando expuesta la plantar y se repetía la experiencia. La pata, en cada caso, se expuso en condiciones de penumbre durante 15' tiempo suficiente para que todos o casi todos los

.flebótomos se ingurgitasen.

•• 18

Este procedimiento se repitió para los hamsteres con 45 días de

infectados y para todos los animales (10) infectados con cada inóculo 4 4 4

(lxlO ; 2x10 y 4xl0 amastigotos).

Concluidos los dos xenodiagnósticos por cada animal, se lo sobreanestesió con éter, para sacrificarlo y, de cada área dorsal o plantar donde hubiesen más de cinco lesiones por picadura, se extrajo una tira de piel cortada muy superficialmente para hacer dos improntas en láminas. Las dos improntas, por cada animal, se fijaron y

colorearon para contar en ellas el número de amastigotos en 100 células blancas.

Los insectos ingurgitados, correspondientes a los 120 xenodiagnósticos, se mantuvieron durante cinco días bajo condiciones de oscuridad y alta

humedad re 1 at i va, proporci onándo 1 es sacarosa concentrada a 1 50% en un trocito de espuma plástica. Al quinto día, se anestesió a los fl ebótomos de cada tarro con vapores de éter y se 1 os sumergí ó en solución salina al 0.6% con NP-40 al l%o, agitándolos para separarles las escamas. Seguidamente y después de un enjuague con solución salina al 0.6%, se disecó cada hembra ovígera para separar la cabeza con un trozo de esófago y constatar si estaba o nó infectada con promas ti gotos. Se contaron en cada xenodi agnóstico, 1 os fl ebótomos infectados para estimar su porcentaje con respecto a todos los ovígeros.

•• 19

R E S U L T A O O S

Todos los hamsteres inoculados en la cara dorsal de uno de los 4 4

tarsos, con lxlO hasta 4xl0 amastigotos de L. mexicana, desarrollaron lesiones inflamatorias o hipertrofias perceptibles a partir de 15 dí as con progresivo incremento de su tamaño y casi siempre confinada a la pata inoculada. En algunos animales inoculados

4 con 4xl0 parásitos, a los 45 días, se observaron metástasis en el borde de las orejas, el hocico y en el ápice de la cola.

En el Cuadro 1 puede apreciarse un aumento de volumen de la pata

inoculada, de 47 mm3

para los inoculados con 1x104

parásitos 30 días 3

previos y de 70 mm en los infectados con un inóculo cuatro veces mayor, para hipertrofias número de

el mismo tiempo de desarrollo. El tamaño de las entre los 30 y 45 días aumentó considerablemente. El amastigotos por célula blanca también aumentó

proporcionalmente con respecto al número de parásitos inoculados y se registró una notable diferencia, en números, a los 45 días de inoculados con respecto a los que tenían 30 días de infectados.

En cuanto a la distribución de los parásitos en las improntas de biopsias de las superficies dorsal y plantar de los tarsos, se registró una casi completa ausencia de parásitos en las 90 muestras plantares examinadas. Solamente se vieron parásitos en 3 muestras, un parásito endos y cuatro amastigotos en otra, siendo todas estas de hamsteres que recibieron 4xl0

4 parásitos y con 45 días de evolución.

En la piel dorsal del tarso, la distribución de los parásitos es alta y sus cantidades se presenta en el Cuadro 1. Presumimos que los flebótomos que se ingurgitan sobre la piel plantar del tarso no se infectan. Ello se aprecia en el Cuadro II donde los valores porcentua 1 es obtenidos en 1 os xenodi agnóst i e os hechos sobre 1 a pi e 1 plantar dieron un valor máximo de 8, en tanto que en 29 xenodiagnósticos no se detectó infección alguna.

•• 20

Todos lo xenodiagnósticos hechos sobre la piel dorsal de lesiones de 30 días, presentaron flebótomos infectados desde 6 hasta 38%, para un mínimo de 10 y un máximo de 16 insectos por xeno-ensayo. Fue mayor el porcentaje de insectos infectados sobre lesiones de 30 días,

producidas por 1 x104

y 2x1o4

amasti4otos, que el de los infectados sobre lesiones producidas por 4xlO parásitos. Algo similar ocurrió con los xenodiagnósticos hechos sobre lesiones de 45 días de evolución, aunque fue dos veces mayor el porcentaje de los infectados sobre

lesio~es de 2x10 4• Sin embargo, las hipertrofias tarsales producidas 4 1 04 . . d d por •~ amast1gotos, aunque s1empre e mayor tamano, ieron en ambos

casos, a los 30 y 45 días de evolución, el más bajo porcentaje de insectos infectados, 14 y 7 respectivamente.

Los xenodiagnósticos realizados sobre los tarsos de los tres grupos de animales experimentales dan un porcentaje irregular de

infectividad para los grupos inoculados con 1-4 x 104 amastigotos y con 30-45 e(fas de desarrollo del granuloma, mientras que el grupo inoculado

con 2 x 104

parásitos mantiene un porcentaje promedio de 30-34 para lo xenodiagnósticos con un. mínimo de 23 y un máximo de 50 por ciento de flebótomos infectados cuando fueron alimentados sobre la región dorsal del tarso. Estos resultados nos conducen a utilizar, en nuestros próximos experimentos, hamsteres machos jóvenes, inoculados con 2 x 10 4

amastigotos de L. mexicana y con un tiempo de desarrollo lesional comprendido entre 30 y 45 días, como las condiciones mejores para alimentar a hembras de Lutzomyia youngi silvestres y cultivadas.

Como conclusión, la inyección subcutánea de 2xlo4 amastigotos de una cepa de L. mexicana en el dorso tarsal de hamsteres machos jóvenes, produce hipertrofias entre 30 y 45 días postinoculación. La alimentación de hembras silvestres de Lu. youngi reciencapturadas, sobre la piel dorsal de tales lesiones, infecta estos dípteros en porcentajes cercanos al 30% donde, por lo menos, uno de cadacinco insectos contiene promastigotos a los cinco días de su exposición. El porcentaje de insectos infectados sobre lesiones de 45 días es ligeramente superior al de los alimentados sobre lesiones de 30 días.

CUADRO I

Volúmenes de las hipertrofias tarsales y abundancia de amastigotos en las lesiones de hómsteres por b. Mexicano

N2 de hÓmste - N2 de amostigotos Volúmenes de los lesiones Amastigotos por céruros

res en er inóculo tarsafes o blancos en lesiones tarsafes

30 45 dÍas 30 45 días

X + (]" mm3 X + q- mm3

20 1 X 104 47+3 91 ± 5. 19+21 36+22

N : 10 N: ~o N:lO N:IO

'

20 2 X 104 53 +3 93 +5 43"!:49 70±2p 1

N:lo N: 10 N :10 N: 1b l

• "'"'

20 4x 104 70 +4 11!5 +4 122+62 ** N: lO N: ~o N: 10 N :10

* * = incontable por excesivo número de parásitos

,

CUADRO II

Xeno~i~gnósticos diferenciales con L. youngi en tarsos de

hámsteres ínfectados con L. mexic.a~.

30 OlAS .45 OlAS

DORSO DORSO PLANTA INOCULOS HAMSTER

PLANTA

NI +(*) +¡ o¡o +¡ o¡o +¡T o¡o Ir o¡o T T

1 3/15 20 0/15 o 2/13 15 1/12 8

2 5/14 36 0/13 o 2/11 18 0/13 o

1 X 104 3 5/13 38 0/13 o 0/10 o 0/9 o 4 3/12 25 O/r2 o 3/11 27 0/10 o 5 2/16 13 0/12 o 4/13 31 0/4 o

T: 18/70 26 °/o T : 1 1/98 19 °/o

1 5/14 36 0/12 o 4/13 31 0/10 o

2xl04 2 4115 27 0/13 o 5/10 50 0/9 o 3 5/15 33 0/14 o 3/11 27 0/10 o 4 4/14 29 0/13 o 4/11 36 0/10 o 5 3/13 23 0/12 o 4/14 29 0/12 o

T: 21/71 30 °/o T: 20/59 3 4 °/o

1 2/13 15 0/11 o 1/16 6 0/11 o 2 3/15 20 0/10 o 3/16 19 0/10 o

4xl04 3 1/16 6 0/13 o 0/13 o 0/4 o 4 3/10 30 0/12 o 1/14 7 0/11 o 5 I/ 15 7 0113 o 0/15 o 0/12 o

T: 10/69 14•/o T:S/74 7°/o

* Número de flebÓtomos infectados sobre el número de flebóto mos disecados.

•• 21

D 1 S C U S 1 O N

leishmania mexicana es especie que en algunos pacientes anérgicos

produce lesiones cutáneas no ulcerantes y diseminadas, con extraordinaria abundancia de parásitos. Esta propiedad se expresa

también en hamsteres inoculados con estos aislados y es tan característica para los mismos, que PIFANO (1960) ha propuesto la

creación de un "complejo pifanoi" para parásitos similares, en contraposición a otros aislados obtenidos de lesiones cutáneas ulcerativas de pacientes no anérgicos que exhiben lento desarrollo en

hamsteres y escasos parásitos que pertenecerían al complejo "braziliensis". Esta capacidad invasiva tisular, aunada a otras

características en cultivos ~ vitro, indujo a LAINSON & SHAW (1972) a considerarlas como "fast-growing" y reconocer esas propiedades para los

aislados pertenecientes al complejo "mexicana". Todas estas consideraciones han privado en este trabajo, para la inducción de lesiones asépticas, no ulceradas y ricas en amastigotos, sobre los cuales infectar Lu. youngi silvestres o de colonia.

El curso de la infección de un aislado de L. mexicana de Venezuela, en modelo experimental, ha sido investigado por PEREZ (l9dd) en ratones de la cepa C57BL/6, estudiando la relación entre la dosis o cantidades de amastigotos inoculados subcutáneamente en la cara dorsal

de los tarsos y los tamaños de las lesiones por ellos producidas. En este trabajo, 1 a autora describe e 1 incremento semana 1 de 1 a hipertrofia tarsal, siendo ésta mayor y más rápida cuando los inóculos

son de 10 2 hasta 103 parásitos. Inóculos de 106produjeron lesiones

similares pero con metástasis en diferentes partes del cuerpo.

Nuestros resultados con hamsteres son similares a aquellos y en tanto que en ratones, algunas lesiones producidas por 1& amastigotos cicatrizaron espontáneamente, en nuestro modelo con hamsteres ello no

ocurre; por el contrario, el crecimiento de la hipertrofia tarsal

alcanza un desarrollo tal que conduce en algunos casos a mutilaciones o

•. 22

a la aparición de grandes úlceras necrotizadas. No conocemos trabajos sobre la genética de la respuesta del hamster a la infección con parásitos del tipo "mexicana". En cambio PEREZ ~~· (1979) han investigado las variaciones de las respuestas de cinco razas endógamas de ratones frente a L. mexicana, demostrando que la resistencia o la capacidad para controlar la infección se hereda como un carácter dominante.

En la introducción de este trabajo hemos señalado autores nacionales que han utilizado a Lu. youngi para infecciones experimentales con Leishmania spp. en hamsteres. Los porcentajes de infecciones pueden ser de desde 7.1% hasta 14.3 para ensayos con L. mexicana amazonensis y L.m. mexicana respectivamente hasta 50% para un aislado GR de L. garnhami (YARBUH & SCORZA, 1982). Es importante sealar que los histiocitomas producidos por las dos cepas de L.

mexicana fueron siempre grandes, en tanto que 1 os producidos por 3 cepas de L. garnhami produjeron siempre lesiones de tamaño medio y y con las cuales el procentaje de flebótomos infectados varió desde 14.8 hasta 50%. Los grandes histiocitomas producidos por L. mexicana parecen convertirse en tumores asépticos; los amastigotos que contienen pierden su normal forma de huso y se vuelven esféricos, con mayor tamaño y citoplasma vacuolado. Estos parásitos no serían viables y ello explicaría el paradójico bajo porcentaje de flebótomos positivos cuando se alimentan sobre tales lesiones.

Llamamos la atención sobre este particular fenómeno porque, como lo hemos demostrado, el éxito de la infección de los flebótomos cuando pican sobre la piel de hamsteres infectados, depende extrínsecamente del tamaño de la hipertrofia, que es crítico.

JOHNSON & HERTIG (1970), en ensayos sobre el comportamiento de varios aislados de Leishmania spp. en lesiones de hamsteres y el estudio de su patrón de desarrollo en Lu. sanguinaria y Lu. gomezi de Panamá, registraron tasas de infecciones experimentales de flebótomos,

•• 23

mediante picadura, que fueron desde 22,2 hasta 66,3%. No se pudo precisar, con certeza, la identidad de los parásitos utilizados por estos autores, aunque un a i s 1 a do de Be 1 i ze, que fue considerado L.

mexicana, dió el porcentaje más bajo en un ensayo con apenas 9 insectos.

Porcentajes más altos de infecciones, con dos cepas de L. mexicana mexicana y Lutzomyia anthophora de colonia, fueron obtenidos por ENDRIS et ~· (1987) quienes alimentaron 252 flebótomos sobre lesiones metastásicas de las orejas, el hocico y las patas de hamsteres, obteniendo en un ensayo 68.3% de positividad.

Rec i en temen te, con propósito estratégicamente s imi 1 ar a 1 nuestro LAWYER et al. (1987) estudiaron el desarrollo de una cepa de L. --mexicana proveniente de un caso autóctono de Texas (Estado Unidos) y mantenida en hámsteres, en infecciones experimentales con Lu. diabólica y Lu. shannoni de colonia, vectores natural y no natural respectivamente, señalando tras un exhaustivo examen de los flebótomos infectados sobre hámsteres, en observaciones día a día y durante catorce días, que el desarrollo del parásito en una y otra especie de flebótomos es virtualmente idéntico, con presencia de parásitos en las piezas bucales entre el 6º y 9º días después de la ingesta infectante.

Los resultados de este, nuestro estudio introductorio, confirman nuestra presunción de que es posible, en condiciones experimentales, completar el desarrollo de L. mexicana en una especie de flebótomo antropofílico capaz de inducir reproducibles porcentajes de infecciones, cuando se alimenta sobre lesiones de hámsteres que puedan ser estandardizadas por el tamaño de los inóculos que las inducen y por el tiempo para su desarrollo óptimo.

CAPl '"ULO 11

LA EXCRECION DE PROMASTIGOTOS E Leishmania mexicana POR Lutzomyia youngi Y LA CONCLUSION DE LA FASE EXPONENCIAL DEL

DESARROLLO DE LOS PARASITOS EN EL VECTOR. 1

•• 24

Los sobresalientes trabajos originales sobre el desarrollo de Leishmania donovani en Phlebotomus argentipes (SHORTT & BARRAUD, 1926) y de L. infantum en P. perniciosus (ADLER & THEODOR, 1931) en la India y Catania r'espectivamente, fueron elaborados con fuerte sesgo para buscar fundamentalmente el desarrollo de parásitos en la porción anterior del tubo digestivo y particularmente en el aparato bucal, sin prestar otra atención al desarrollo y destino de los mi~mos flagelados en la porción posterior del tubo digestivo. Unos y

otros autores, utilizando al hamster como hospedador experimental, infectaron flebótomos y señalaron que lo ciclos vitales de ambos parásitos en los insectos eran continuamente progresivos por lo menos hasta el noveno día de la infección, observando activa multiplicación de promastigotos entre el tercero y quinto días, con un masivo desarrollo de rosetas en el estómago. Describieron la migración de parásitos hacia el cardias y la faringe y la ausencia de los mismos en la porción posterior del estómago con escasos flebótomos presentando pequeñas rocetas en el intestino (SHORTT & BARRAUD, 1926) o enjambres de largos flagelados en el intestino posterior y el recto, cuando las infecciones fueron intensas (ADLER & THEODOR, 1931).

La excreción rectal de flagelados de L. mexicana mexicana, por Lu. youngi (entonces confundida como Lu. townsendi), fue descrita por YARBUH & SCORZA {1982) después de 60 horas postinfección y hasta 132 horas, siendo mas frecuente entre 80 y 108 horas para L.b. panamensis y L. garnhami y un poco más tardía para 1 as subespeci es de L. mexicana, L. mexicana amazonensis.

En el trabajo de MOLYNEUX et !l· (1986) dedicado al estudio de la interfase entre Leishmania y flebótomos, a despecho de detalladas

•• 25

descripciones de las relaciones de los parásitos con el lúmen del

tubo digestivo, con la membrana peritrófica y con las

microvellosidades y las cutículas· de la válvula estomodeal y del píloro, no se mencio.na la excreción de flagelados. Omisión similar

se dá también en el trabajo de WARBURG et .21· (1986) donde a pesar del lujo de información sobre microscopía de rastreado, .apenas se

señala la presencia de· promastigotos nectomonados de L. major en el

estómago de P. papatasi.

La importancia del estudio de una posible secuencia del

desarrollo de estadios de Leishmania sp. en Phlebotominae tiene que

ver con el fenómeno de transmisión. Si ciertamente, como lo

plantearon SHORTT & BARRAUD (1926), el desarrollo de los flagelados

en los vectores es continuamente progresivo, cada etapa del proceso

debe poseer propio significado e incidir sobre el proceso

subsiguiente. El estudio de esta secuencia, en parásitos con escasa

diferencia morfológica o baja sincronización, es complejo y lleno de

contradicciones atribuidas mas a las diferencias específicas entre

parásitos o a 1 as especies de f 1 ebótomos donde e 1 proceso ti ene

lugar.

Pensamos, como los propusieron los pioneros de estos tipos de

trabajos, que el ciclo de Leishmania en los flebótomos es uno y

continuamente progresivo, limitado esencialmente por el agotamiento

de nutrientes en el lúmen de los insectos, lo cual conduciría al

necesario desarrollo de una fase terminal de diferenciación

infectiva.

En esta sección de este trabajo, sin reinsistir en detalles

morfológicos y pleomórficos sobradamente conocidos, describimos las

alteraciones substanciales que ocurren en L. mexicana en su

desarrollo en Lu. youngi, a partir de las primeras dos horas y hasta

las 120 horas de evolución, considerando esta fase comp la de

crecimiento exponencial de la población de parásitos en el vector.

•• 26

MATERIALES Y EXPERIMENTOS

Desarrollamos tres tipos de experimentos.

I. En hembras silvestres de Lu. youngi alimentadas sobre lesiones tarsales de hamsteres producidas por L. ·rnexican~,estudiamos los cambios de forma y reproducción de amastigotos tisulares en el estómago de los lnsectos, entre las dos y cuarenta y ocho horas de la ingesta infectante, disecando especímenes ingurgitados con s~ y dislacerando el contenido de cada est9mago, por ruptura de la membrana peritrófica, sobre una gota de solución de albúmina bovino al 10% en solución salina al 0.6%. Una vez seca la preparación, se hemolizó a los eritrocitos con Giemsa al 5% con tampón de fosfato M/200 a pH 7.2 durante una hora; se enjuagó la preparación evitando su desprendimiento de la lámina y se estudió una vez seca, bajo aumento de lOOOX con inmersión. 01 Los insectos ingurgitados fueron mantenidos a 242C y bajo humedad no menor de 80%. Se disecaron ejemplares a las 2, 4, 8, 17, 22 y 48 horas de la ingurgitación. Se examinaron más de 90 formas evolutivas de los parásitos.

II. Tres lotes de 40, 60 y 70 hembras silvestres de Lu. youngi fueron alimentadas sobre lesiones tarsales de hamsteres producidas por L. ~exicana. Cada lote fue confinado en cilindros de vidrio acorchados de 50 mm de diámetro, similares a los usados por YARBUH & S CORZA ( 1982). Las excretas de 1 os insectos posados sobre el revestimiento de corcho fueron recogidas a las 24 y 48 horas y luego cada 12 horas postinfección, sobre láminas rectangulares de vidrio de 50 x 50 mm que se cambia ron cada vez. Los insectos fueron

$,Ptsr~ce\i@AA1fllcUl~ f CJ.t!lz ~,0%\ft} ~tcff!iel ~01JWI~ i~teV.lr9~hq se reconocieron, tres tipos de gotitas e.xcr:)e1tadas: {~~(' blJn?a~fJ

de soluciones de uratos, (2) negras, producto de la digestió~ ~e hemoglobina y (3) translúcidas, secreciones de azúcar. Se

•• 27

distinguieron y contaron las gotitas y luego se fijaron las

láminas con metanol absoluto para teñir los materiales de excreción con Giemsa, como se ha señalado.

III. Con la finalidad de estudiar las tasas y calidades de excretas de hembras Lu. youngi individuales, ~tilizamos nacidas en colonia y silvestres que fueron alimentadas, respectivamente sobre hamsteres infectados con L. mexicana. Los insectos ingurgitados con sangre fueron marytenidos, individualmente, dentro de cilindros de corcho de 15 mm de diámetro provistos de porta-objetos a modo de fondo y cubiertos por tela fina en el extremos superior. Los porta-objetos fueron sustituidos cada 12 horas para contar, en ellos, los números de deyecciones blancas, oscuras y transparentes. Separamos así 20 hembras de colonia y 20 hembras silvestres que fueron estudiadas desde las 24 hasta las 120 horas, cuando se retiró la octava lámina de estudio, para disecar cada hembra sobreviviente y precisar su condición por infección. La presencia de flagelados fue constatada por examen en fresco con 45X. El estudio morfométrico de los mismos se hizo en las mismas láminas fijadas con metanol y teñidas con Giemsa al 5%.

RESULTADOS

l.- DIFERENCIACION Y PLEOMORFISMO, HASTA 48 HORAS DEL DESARROLLO DE L. ·mexicana EN Lu. youngi.

En el Cuadro III presentamos, junto con dibujos esquemáticos de los estadios de diferenciación de amas ti gotas de L. mexicana hallados en los frotes de contenido estomacal de Lu. youngi infectados, los valores porcentuales de los mismos, junto con el número de formas estudiadas. Detectamos una secuencia o pleomorfismo con predominio de amastigotos y su transformación en promastigotos cortos, indivisos, entre 2 y 4 horas aunque los

•• 28

últimos fueron observados a las 17 horas (37%) (véase el Cuadro III). Formas de división de amastigotos o de promastigotos flagelados, se vieron en bajo porcentaje (18%) entre las 2 y 4 horas pero los últimos fueron mas frecuentes a partir de las 8 horas. Entre lesl7 y 48 horas se incrementa la frecuencia y el número de los promastigotos en división, llegando éstos a formar frecuentes rosetqs.

2.- EXCRECION DE PROMASTIGOTOS DE L. mexicana POR lu. youngi EN LOTES.

Utilizamos 3 1 ates de 40, 60 y 70 hembras sil ves tres de l. youngi cuyas cantidades de gotitas excretadas entre las 24 y 120 horas después de la ingesta infectante, con señalamiento de las excretas blancas por orina, negras por heces y transparentes por excreción de azúcar se presentan en e 1 Cuadro V, con señalamiento de las gotitas contaminadas con promastigotos.

El mas alto porcentaje de excretas de cualquier naturaleza ocurrió, en los tres lotes, entre las 60 y 72 horas y fue siempre mayor del 50% (~Cuadro IV). El número promedio de gotitas excretadas por flebótomo,ffie~de 24.5, 12.3 y 8.1 respectivamente para 1 os grupos I, I 1 y I li con 40, 60 y 70 fl ebótomos por ensayo. Las cantidades de gotitas de excretas contaminadas por promastigotos de l. mexicana se presentan en las columnas, de la derecha del cuadro, observándose que el mas alto porcentaje de excretas positivas se elimina también entre las 60 y 72 horas, siendo respectivamente de 42.3, 57.4 y 82.6 (**Cuadro IV). Aunque tanto las excreciones no contaminadas como las que aparecieron con promastigotos se hacen mas frecuentes a partir de las 60 horas después de la ingesta infectante y s~ 90ntinúan excretando hasta las 120 horas, la data informa que tanto el número de gotitas excretadas por flebótomo, como las contaminadas por promastigotos, es inversamente proporcional al número de hembras ~ lu. youngi confinadas por envase; siendo de

.• 29

6.9, 3.2 y 1.9 respectivamente el número de gotitas de excretas contaminadas para los envases con 40, 60 y 70 hembras de Lu. youngi. Es especulable que el stress de actividad circadial en los envases se incremente con el hacinamiento y se traduzca por un número proporcional e inversamente menor de gotitas excretadas y de gotitas contaminadas por ppomastigotos, con respecto al número de flebótomos confinados por envases. Finalmente, en cuanto a datos sobre infectividad y mortalidad, que no aparecen en el Cuadro IV, las infectividades por lotes fueron respectivamente de 91, 56 y 49% para los grupos de 40, 60 y 70 hembras. Las mortalidades fueron de lO% para el lote ck:!40 hembras y de 31 y 34% para los de 60 y 70 hembras.

3.- EXCRECION DE FLAGELADOS DE L. mexican~ POR HEMBRAS DE lu. youngi SEPARADAS.

Con la finalidad de verificar la hipótesis del hacinamiento y

descartar a la vez el posible efecto de la edad cronológica de las hembras silvestres como se señala en el Cuadro IV, sobre la velocidad y tasa de excreción de flagelados, realizamos un tercer experimento con 20 y 20 hembras de Lu. youngi, unas capturadas la noche anterior a la infección en sus lugares naturales de cría y las otras obtenidas de una colonia o cultivo hecho en condiciones de laboratorio. En este último caso, ut il izamos hembras con edades comprendidas entre 2 y 6 dí as. Después de haberse expuesto a hamsteres infectados con L. mexicana, 1 as 20 hembras ingurgitadas con sangre se separaron individualmente como queda explicado en la sección de materiales y métodos.

Los resultados de este experimento, llevado hasta las, 120 horas, se presentan en el Cuadro V. Del análisis de esta detallada información podemos resumir sus hallazgos mas relevantes del modo siguiente:

•• 30

a. Las mortalidades espontáneas así como los porcentajes de

infección son similares para uno y otro grupo.

b. Hay discrepancias entre los dos grupos, en los porcentajes de infección por Leishmania estimados por disección de las sobrevivientes al final del experimento y el número de hembras que ~xcretó flagelados a lo largo del período de observación. En las hembras silvestres, de las 17 sobrevivientes hasta 108 horas, 10 fueron positivas por excreción en tanto que 9 solamente mostraron flagelados reconocibles por disección, lo cual indica que una eliminó la infección. En las hembras de cultivo hasta las 120 horas, aunque 13 fueron positivas por disección y 2 eliminaron flagelados fecalmente en tanto que 5 resultaron negativas a disección, lo cual sugiere que dos hembras infectadas, eliminaron aparentemente todos sus flagelados por excreción.

c. Comparando el número total de excretas en cada grupo, contadas desde las primeras 24 hasta las 120 horas, las hembras silvestres hicieron 24.7 excretas por flebótomo, en tanto que de cultivo eliminaron 21.8 gotitas por hembra.

d. Comparando el número de gotitas excretadas y contaminadas con promastigotos en uno con otro grupo, las silvestres eliminaron 6.2 gotas positivas por hembra, en tanto que las de colonia excretaron 6.0 gotitas por individuo, tomándose en cuenta solamente los insectos ~excretaron.

e. Con relación a los períodos e mayor intensa actividad excretora, en la Fig. ilustramos las frecuencias de excreciones tomadas porcentualmente de 370 gotitas contadas en las hembras silvestres y 445 en las de cultivo. En las primeras, el 70% de las deyecciones se expulsaron entre las 60 y 108 horas, mientras que las de colonia excretaron un 64% entre 72 y 96 horas ( Fi g. 2a y 2b). Estas diferencias de

•• 31

frecuencias de excreciones ''positivas" pueden observarse también en el Cuadro V; las cifras encerradas dentro de círculos son deyecciones, algunas de las cuales contenían flagelados.

Comparando esta información obtenida de hembras de Lu. youngi

aisladas, con las de las estudia'das en grupo, puede observarse que el experimento hecho con 40 hembras (Lote I) arroja datos similares de excretas por flebótomos y de excretas positivas por insecto, ·a la data obtenida con hembras mantenidas aisladamente. Fue mas regularmente distribuida la actividad de excreción en las hembras incubadas aisladamente que en las hembras confinadas en lotes.

f. Con excepción de los parásitos de los tapones faríngeos, no se hallaron otros flagelados en el tubo digestivo, excepto muy escasas formas inmóviles en ampolla rectal.

4.- MORFOMETRIA DE LOS PROMASTIGOTOS DE L.mexicana EXCRETADOS POR

Lu. youngi.

Aunque es sumamente difícil contar el número de flagelados eliminados espontáneamente en las gotitas de excretas de los Lu.

youngi silvestres o de colonia, experimentalmente infectados con L. mexicana, su cantidad varía desde decenas hasta centenares superpuestos en una masa. Los flagelados se hallaron solamente en deyecciones negras y transparentes, nunca en las excreciones de uratos. En 1 as deyecciones oscuras, 1 os promast i gotas se observaron rodeados o cubiertos por material micelar opaco y generalmente mezclado con fragmentos hialinos de' restos de membrana peri trófi ca. En 1 as deyecciones transparentes, contituidas por gotitas de azúcar -a juzgar por su consistencia, so 1 ubil i dad y reacción con Antrona, no descrita en 1 a

•• 32

metodología, y por la tendencia a contaminarse con micelios- los promastigotos exhiben mejor integridad morfológica. La frecuencia de la presencia de parásitos en las deyecciones azucaradas es similar a la de los que se observa en las deyecciones oscuras.

Un examen somero sobre la frecuencia de formas en división dentro de 1 a aparente homogeneidad morfa 1 ógi ca de 1 os promasti gatos excretados, nos condujo a examinar bajo lente de inmersión a los parásitos de gotitas excretadas entre las 72 y 108 horas por hembras silvestres y cultivadas mantenidas aisladamente. Examinamos cada vez, mas de 500 parásitos visibles claramente en el borde de las gotas, estimando el porcentaje de formas en algún signo morfológico de división {dos núcleos, dos cinetoplastos o dos flagelos) en 15 diferentes gotitas. En la Fig. 3 ilustramos las medias y varianzas calculadas a partir de las 15 cifras porcentuales, cada vez, entre 72 y 108 horas; no incluimos información de menor o mayor tiempo, por la relativa escasez de gotitas positivas cuyo estudio incompleto permitiera hacer alguna comparación válida. Entre 72 y 108 horas disminuye cuasi exponencialmente el número de parásitos en división; puede afirmarse que a partir de las 96 horas, en los promastigotos excretados no se detectan fácilmente parásitas en división. Por ende, corresponden a pob 1 ac iones estacionarias. En cuanto a sus formas y tamaños, son promastigotos monomórficos, grandes, anchos, con núcleos esféricos u ovalados y cinetoplastos voluminosos (Fig. 4a y b). Las medidas de 28 hasta 35 parásitos por gotas bien preservadas, arrojan 23.6 ~ 7.6

1um de longitud total para el soma y 22.0 ~

5.3 um para los flagelos. Las figuras ilustrativas corresponden 1 '

a parásitos excretados a las 72 horas.

•• 33

En las gotitas de más de 108 horas, es frecuente observar fantasmas de promast i gotos, sin núcleos o ci netop 1 as tos aunque con flagelos bien preservados. Solamente persisten los parásitos secuestrados en el tapón de la válvula estomodeal, los otros parásitos desaparecen del lúmen del tubo digestivo tras su eliminación fecal. Excepcionalmente se hallan rosetas o promastigotos libres en el líquido de la ampolla rectal. La circunstancia de que aún en algunas de las gotitas de excretas colectadas a las 120 horas se encuentren flagelados, señala que a los cinco días aún se estén eliminano flagela9os.

' .·

CUADRd m

Pleomorfismo y diferencioció.n de L. mexicaóq en

Lu. youngl entre las dos y cuarenta y ocho horas

de postinfecc Ión.

Horas des- ~ 7J (/ ¡ ~8 fd! pues de lo

ingurgita - @ftl~ .. ~ e ron

VVl 2 55 10 - 22 13

4 11 44 - 18 22

B· - - - 29 71

17 - - 37 16 47

22 - 1 -,.

20 78

48 - - - - lOO

Numero

·de

f.ormos

. l 1 1

15'2

180

92

176

312

108

CUADRO N

Excretas blancos., negros y. transparentes eliminadas por b.M.- youngi entre 24 y 120 horas con indicación de los contaminadas con promostíqotos de .L...

NÚmero del experimento Periodos de

y de los hembras de L.Y: vounoi excrecion entre

por envase. horas

I 24 48

N: 40 6~[60 72

Ex ere tos/Fiebótomo: 24,5 84

Excretas/ FlebÓtomo: 6,9 96 108

Positivos 120

rr 24

'* 48

N= 60 53,5 [60 72

Excretas/FiebÓtomo: 12,3 84 Excretas/ Fle bÓ tomo: 13 2 96 ,

108 Positivos 120

,.m • 24

50,3 [ 48 N: 70 60

72 Excretas/ FlebÓfomo: 8,1 84 Excretas/ Flebótomo: 1,9 96 Positivos ' ·- J·oe-

120

• Porcentaje del total de excretas entre 60 y 7 2 horas

mexicana ----

Excretas por JÓmino

Blancas Negras Transp. Totales

27 6 - 33 30 18 l 49 66 234 60 360 46 137 60 243 49 20 88 157

8 1 81 90 1 - 18 19 +

- - 30 30981

22 9 - 31 28 1 - 29 65 f02 32 219 23 95 58 176 40 78 45 163 - 10 67 77

3 16 19+ -- - 24 24738 39 7 -- 46 22 4 - 26 , 16 42 48 106 16 115 48 179

6 20 43 69 3 - 38 41 1 - 51 52+ - 3 45 48567

i-Gran Total

Excretas contamino dos por

IÓmino

Blancas Negros Transp. Totales

- - - -- - - -- 30 60 90 - 1 20 21]** - 7 86 95 42~ - - 67 67 - - - - + - - 1 1 ZT4

- - - -- - - -- 9 11 20 •• - 26 26 2 8]57.4 - 61 20 81 • - 10 36 46 - - 12 12 + - - 3 3 19()

- - - -- - - -- - 12 12] .. - 59 38 91 82.6 - 7 ~ 12 - - 10 lO - - l 1 + - - - - 132

• • Porcentaje del total de excretas con porositos entre 60 y

72 horas

1

~EMBRA

NS

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 1

12

13

14

15

16

17

18

¡g

20

CUADRO Y

Deyecciones eliminados por Lu. youngi individuales entre 24 y 120 horas posti11gestiÓn senoiÓndose

los gotitas contaminados (en c:Írculos) con L. me xic:ono.

HEMBRAS SILVESTRES PERIODOS DE EXC:RECiÓN . . POSÍTÍVAS HEMBRA

ENTRE HORAS TOTAL POSITI- . PO~, r:--T'"':" 1 -:-tl.,.--.1.,.----,rr----r-r-~----i VAS DISECCION N!. 24 48~J 60¡ 72 84_) 96jl08jl20

- MUERTA

- - - MUERTA

l'

--6(@)3 -------------s 2 3 G) 3 6

- 9@@0 0) 6 10

5 2 6- -0@ MUERTA

3 4 12 ·g 3 10-

2 3 3 0@ MUERTA

- 3- i- --

-2- = : 0 : 4>R ~· - 2 @@@(})~ 6

---45313

--22@953

-1---253

19

20

60

26

44

23 4

20

31

66

16

30

1 1

3

1

18

10

10

6

2

7

17

6

NEGAT.

NEGAT.

PO SI T.

NEGAT.

NEGAT.

POSÍT.

NEGAT.

PO SÍ T.

Po.siT.

POSÍT.

NEGAT.

PO SÍ T.

PO SÍ T.

PO SÍ T.

NE~AT. 1

POSIT.

NEGAT.

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1 1

12

13.

14

15

16

17

18

19

20

HEMBRAS CULTIVADAS PERÍODOS DE EXCRECÍÓN POSÍTÍVAS

ENTRE HORAS TOTAL POSÍTi- . POR .• t--2 4-..jr-4-8,.1l_6_0-r-j7 2-lr-8-4,J_9_6jr-I-0-,8Ir-12-0-i VAS DISE<XION

_ •• 3 @wG)-- - 7 15 @ 17 @(!) 1 G) G)G) - 3 - -

2 ,.4. - 6 5

3 ) 1 6 2.

-1 --7 @@G) -- MUERT~

-- 1 3l3JG) 1-- MUERTA

- - 1 3 0) G)G) 3

1 1 6 •a@@ 3@

2 4'@6@s@3

2 4 5 @@ 6 3-

- - - 4 20 11 (!) 2

27

16

35

1 1

71

10

18 14

27

10

32

49

41

44

40

7

6

4

S

21

7

2

9

6

13

8

2

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POSIT, POSÍT.

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POSÍT.

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Po sir.

POSIT.

PO SÍ T.

NEGAT.

POSiT.

30

20

10

FIGURA

Frecuencias porcentuales de excreción de

got;tas por .L...Y.:... youngl

24 48 60 72 84 96 108 120

HORAS

. N: 370 o--o SILVESTRES

. N: 445 0---e CULTIVADAS

60

45

30

15

70

60

45

30

15

FIGURA 2

Porcentajes de excretas positivos con respecto o excretas totales de h.!:!.· youngi por lapso

de tiempo.

O - Hembras silvestres. b _ Hembras .cultivadas.

24 48 60 72 84 96 108 120

HORAS

24 48 60 72 84 96 108 120

HORAS

X y 'f de

los valores porcen- 20

tuoles.

10

o

FIGURA 3

• • o 1 ' )'

PorcentaJes de formas en dtv1s1on en

promastigotos de L. mexicano excre-

tados por Lu. youngi entre 72 y 108

horas postingesto infectonte.

19,9 ±t5,5

7,5 ± 6,5

1,5+1,1

0,4 ± 0,7

72 84 96 108

' • 1 Penodos de excrecton en horas.

•• 34

COMENTARIOS

ADLER & THEODOR ( 1931) seña 1 a ron que fl age 1 a dos 1 argos de L. infantum en P. perniciosus, midiendo 22 hasta 30.5 u de longitud, con flagelos relativamente mas cortos que la long/tud del soma, eran las formas más numerdsas en el digestivo medio de insectos a los 2 hasta 6 días después de la ingesta infectante. SHORTT & BARRAUD, 192ó habían ya señalado que a las 72 horas, en P. argentipes infectados con L. donovani, en fase particular del desarrollo de los parásitos tenía lugar por la presencia de flagelados alargados activamente móviles cuya población es evidente por la formación de rosetas que asumen grandes proporciones. A partir del 3er día, que parece marcar una fase definitiva, se detecta la mayoría de los diferentes estadios por e 11 os reconocidos, aunque en comparativamente pequeño número. Los autores no explican la súbita disminución en la población de parásitos largos y móviles. En una reciente contribución con microscopía de rastreado, WARBURG et ~· (1986), ilustran para infecciones de tres días por L. major en P. papatasi, la presencia de enjambres de 200.000 hasta 800.000 promastigotos de 15 a 2o

1um de

largo en el estómago medio. Al mismo tiempo, se detectan verdaderas alfombras de parásitos más cortos, con 5 a 71um de longitud, adheridos a la válvula estomodeal y al esófago. Acá el polimorfismo de los promastigotos contrasta con el monomorfismo de los estadios largos y libres. Aunque los autores discuten la importancia del polimorfismo, sus relaciones cori los opistomastigotos y paramastigotos y también con formas pequeñas con largos flagelos cuya importancia consideran crucial para la transmisión por picadura, ninguna información se produce con respecto a los largos promastigotos de cortos flagelos existentes en el estó"!ago medio, cuando ya la válvula estomodeal está saturada por otras formas.

LAWYER et ~· (1987) coinciden con los autores anteriores en estimar, hacia las 72 horas, hasta en medio millón, los promastigotos

•• 35

largos y altamente móviles de l. mexicana en lu. diabólica; señalan sin embargo, masas de flagelados unidos por una matriz gelatinosa en la válvula estomodeal y plantean que la asociación de las nectomonas grandes con las microvellosidades, puede impedir su excreción con la ingesta degerida; es la única referencia habida con respecto a estas formas y la sería más para sugerir su retención, que para explicar su expulsión. WALTERS ~t il· (1989) refiriéndose ahora a un parásito que necesariamente se adhiere a las creastas pilóricas -L.

braziliensis panamensis- en Lutzomyia gomezi, distinguen dos tipos de promastigotos nectomonados, unos cortos y espatulados con 5-s

1um de

longitud somática y otros más largos, con 13 hasta 191

um, que "aparentemente representan productos finales de la multiplicación" (p. 23) y añaden que ninguna de esas formas se interdigita con las microvellosidades, ni parecen ocupar el nicho del digestivo medio por mas tiempo, después de la ruptura de la membrana peritrófica.

La enorme masa de nectomonas largas y activamente móviles, cuyo destino es controvertido, puede ser retenida por las microvellosidades del tubo digestivo mediu aunque no se interdigiten con ellas; pueden desplazarse hacia el píloro como producto final del ciclo vital de los parásitos, sin ocupar espacio físico o nidal alguno. LAINSON & SHAW (1988), al estudiar el desarrollo de L.

chagasi en Lutzomyia longipalpis, señalan la presencia de muy numerosos promastigotos alargados e indivisos, a los cua~es

identifican como las formas a 2p cuyo destino o función ignoran. Retomando las ideas fundamentales de los pioneros en este tipo de estudios, consideramos que el ciclo vital de Leishmania sp. en su vector, es cont ínuamente progresivo y que es comp 1 etamente natura 1 que un excedente de parásitos que ya no puede competir con otros que han sufrido diferenciación por contacto con receptor,es? tanto estomodeales como proctodeales, sean necesariamente eliminados. Confirmamos ahora, mas detalladamente, observaciones ya publicadas por YARBU~ & SCORZA (1982) ssbre el fenómeno ~e la excreción de flagelados no funcionales por Lutzomyia youngi. En conclusión,

•• 36

siendo este fenómeno mucho más importante para el estudio de las fases secuencia 1 es de 1 de sarro 11 o de estos parásitos en fl ebótomos, consideramos que con la excreción de estos parásitos monomórficos e indivisos, culmina la fase exponencial de los mismos, coincidiendo ello con el inicio de una fase estacionaria que a su vez concluiría con la producción de parásitos infectantes por picadura natural.

C A P 1 T U l O 111

ESTADIO TERMINAL DE Leishmania mexicana EN LA HIPOFARINGE DE Lutzomyia youngi EXPERIMENTALMENTE INFECTADOS

•• 37

YOUNG & LAWYER (1987} han compendiado información sobre transmisores, sospechosos o comprobados, de leishmaniasis en el Nuevo Mundo, en tanto que RYAN et .!!_. (1987) han elaborado un listado de transmisores experimentales de Leishmania ¡pp. por picadura de flebótomos. L. mexicana, en condiciones experimentales, puede desarrollarse y ser transmitida por diferentes especies de Lutzomyia que no son sus vectores naturales, como s~ señala repetidas veces en 1 a 1 iteratura.

En la sección anterior de este trabajo hemos demostrado experimentalmente que Lutzomyia youngi puede infectarse con L. mexicana y producir, en la fase exponencial de crecimiento, una gran cantidad de promastigotos cuya masa principal es excretada a partir de 1 as 60 horas y hasta 1 os primeros cuatro dí as después de 1 a infección. En esta fase, regulada por el peristaltismo el tubo digestivo del insecto, tiene lugar también una migración anterior de parásitos aparentemente estacionarios, que caracterizan al tipo de desarrollo suprapilórico y que eventualmente concluiría con la producción de estadios infectantes (KILLICK-KENDRICK, 1987; LAWYER et .!!_., 1987} relacionados con el proboscide o fascículo y con la actividad funcional de éste durante la picadura (LEWIS, 1977).

CARNEVALI & SCORZA (1982) han demostrado que el proboscide de Lu. youngi (referido entonces como Lu. townsendi) puede penetrar la piel de hamsteres hasta 130 um de profundidad, para succionar sangre de pozos hechos en la dermi,.

En esta sección exponemos los resultados de nuestras observaciones sobre la migración y morfología de L. mexicana, hacia el proboscide de Lu. youngi, a partir de las 72 horas de desarrollo

•• 38

en el insecto y después que ha tenido lugar la excreción de parásitos producidos durante la fase exponencial de multiplicación.

MATERIALES Y METODOS

Flebótomos.- Hembras de Lu. youngi capturadas 1 a vfspera, fueron

confinadas en envases usuales y mantenidas con sacarosa comercial, no refinada a 1 50% ( v :v). A 1 gunos especfmenes fueron sacrificados por sobreanestesia con éter y se lavaron en agua destilada con Triton XlOO al %o para decapitarlos bajo el microscopio estereoscópico a 20X. Las cabezas fueron fijadas y clarificadas en medio de Nesbit, suprimí éndo 1 es 1 as antenas y pa 1 pos y entreabrí en do 1 as pi e zas de 1 hexaqueto. Se sustituyó al medio de Nesbit por Berlesse para montarlas, dejándolo fraguar 48 horas a temperatura ambiente.

Otras hembras se ingurgitaron sobre la piel dorsal de tarsos de hámsteres infectados 4 semanas antes con L. mexicana, que fueron anestesiados con pentobarbital sódico (20 mg/kg). Los insectos ingurgitados se mantuvieron con sacarosa y se disecaron cada 24 horas, a partir del primer día, sobre solución salina 0.6%. Se extrajó el tubo digestivo completo por el extremo posterior del abdomen, previa sección del estómago anterior y se cubrió, junto con los tubos de Malpighio con una laminilla de 11 x 11 mm. El estudio de los parásitos, en los especímenes infectados, se hizo tempranamente dilacerando al estómago para romper la membrana peritrófica y extender su contenido. El magma ingerido se secó con corriente de aire caliente y la preparación se cubrió con solución de Giemsa al 10% en ·tampón de fosfato M/200 a pH 7.2 como si' se tratara de una ~ota gruesa, durante 45 minutos, 1 avandose 1 o cuidados amente con agua destilada para evitar la pérdida de material. El secado se hizo a 402C en una estufa.

•• 39

En insectos con 48 o mas horas de desarrollo infectivo, después de precisar la distribución de los parásitos a lo largo del tubo digestivo, se procedió a su estudio en modo similar pero fijando la preparación con metanol antes de colorearla con Giemsa.

A partir de 1 as 120 horas i nc 1 us i ve, examinamos en fresco 1 a cabeza de los flebótomos prestando especial atención a parásitos presentes en el proboscide. Hicimos un esfuerzo especial para disecar sus pie~as, fijarlas con metanol y teñirlas con Giemsa.

Cabezas monta~as en Berlesse y parásitos hallados en la faringe o en 1 as pi e zas bu ca 1 es fueron fotografiadas con un microscopio compuesto binocular Zeiss, con aumentos de 50 hasta 1.000 x, usando película blanco y negro o de color lenta (lOO ASA). Hicimos transparencias pa~a diapósitivas y copias en papel.

La morfometría de las piezas bucales se hizo en las fotografías o en 1 as preparaciones mismas usando, en este caso, un mi crometro ocular calibrado. Una foto del micrometro de platina, en cada aumento microscópico usado, fue utilizada como escala para las medidas.

•• 40

RESULTADOS

Las longitudes del labio y de las piezas del fascículo de la cabeza de las hembras de Lu. youngi montadas en medio de Berlesse, miden entre 0,30 y 0,40 mm (N:lO) (Fig. 5a). De las seis piezas del fascículo o hex·aqueto (Fig. 5b) las mandíbulas sobrepasan a las demás en longitud por mas de 4~um, siendo las maxilas las de menor longitud; unas y otras, estas cuatro piezas, actúan activamente durante la penetración del estilete a través de la dermis, teniendo como guía al labwo (LEWIS, 1977).

La longitud· total de la hipofaringe, pieza del hexaqueto que penetra hasta la dermis, es de 390

1um y remata en su extremo aguzado

por una doble fila de 16 dientes (Fig. 5c). Un conducto salival, recto, cursa a lo largo de la hipofaringe (Fi~. 5c y d), mide 6

1um de

diámetro interno en su tercio medio y 2.51

um en su extremo distal.

La descripCión de las fases tempranas de la diferenciación de amastigotos de L. mexicana ingeridos por lps flebótomos al picar lesiones tarsales de hámsteres, se hizo en capítulo II. Durante las primeras 48 horas los amastigoto se diferencian hasta promastigotos y se multiplican por dentro de la membrana .Peritrófica de Lu. youngi. Hasta 1 as primeras 24 horas se observa en 1 a i ngesta, amas ti gotas alargados en división, con muy cortos flagelos; y entre las 24 y 48 horas, promas ti gotas 1 argos, a i s 1 ados o en rosetas. A partir de 48 horas ocurre la ruptura de la membrana peritrófica y los parásitos se detectan entonces, en tránsito posterior hacia el píloro y el intestino o comienzan a agregarse, en el antro de la válvula estomodeal, la mayoría inmóviles y en el seno de una glea transparente. Se observan también parásitos activos y móyiles en el esófago por delante de este tapón gléico o por detrás de éste, en el estómago anterior. Concluida la excreción de flagelados, la cual ocurre entre 1 as 60 y 96 horas, no se observan parásitas en e 1

·estómago, como tampoco en el digestivo posterior postpilórico. En

•• 41

preparaciones hechas a partir de tapones disecados y separados, los promastigotos tienden a evolucionar hacia paramastigotos (KILLICK-KENDRICK et .21., 1977), con núcleos ovoides, cinetoplastos pequei'ios no antenucleares sino colocados lateralmente en posición critidioide y con flagelos un poco mas largos que la longitud de la célula, midiend? s.o

1um para la longitud del cuerpo y 10

1um para el

flagelo 1,2/m de anchura (N:lO) (Figs. 6a y 6b). En los tapones mismos, los promastigotos se adhieren en hileras complejas, por fijación de los extremos de los flagelos de unos al trayecto flagelar de otros.

Sorprendente ha sido el inequívoco y no raro hallazgo de parásitos libre5y activos r~tr0 el conducto de la hipofaringe. A lo largo de este conducto, y sin invadir el conducto salivar propiamente dicho, decenas hasta centenares de promastigotos se desplazan incesantemente en la luz del conducto, en ambas direcciones, desde el ápice de la hipofaringe hasta su base. No nos ha sido posible fotografiar .i!J. vivo este fenómeno por carecer del equipo adecuado; i nút i1, por otra parte, fue hacer fotografías de preparaciones .i!l. vitro que colorearon sin definición. Hemos· coloreado parásitos de:

hipofaringe examinados tras la disección y .separación de ésta, con la finalidad de asegurar el estudio cte los estadios comprometidos con este fenómeno. Son parásitos finos, delgados, aguzados, con núcleo estrecho y alargado, cinetoplasto siempre prenuc 1 ear o típicamente 1 eptomonoi de y fl age 1 o cerca de dos veces tan largo como el cuerpo (Fig. 6c). En algunos casos los parásitos son simplemente aciculares (Fig. 6d). La longitud de1.cuerpe alcanza 4.2! 1.1

1um y la del flagelo 8.8! 1.3

1um, con una anchura

máxima de l.o7! O.l91

um.

Al lado de estos parásitos intrahipofaríngeo, suelen observase, entre las piezas mismas del probóscide, otras formas a las cuales no hemos prestado especial atención por su escasez y polimorfismo. El

•• 42

hallazgo de promastigotos hipofaríngeos lo ha sido en flebótomos después de los cinco días de infectados, en insectos sobrealimentados principalmente con sacarosa comercial no refinada y mantenidos a la temperatura de 1 laboratorio ( 24QC) en ambiente húmedo siempre mayor de 80%.

Para estudiar la secuencia del desarrollo y migración de promastigotos hipofaríngeos, hemos disecado flebótomos alimentados sobre hamsteres infectados con L. mexicana y mantenidos con sacarosa desde 3 hasta 9 días. Los resultados de las disecciones de 16 ensayos donde estudiamos 610 insectos, se presentan en el Cuadro VI. Los flebótomos infectados mostraron siempre un tapón de parásitos en la válvula estomodeal y ninguno o muy escasos parásitos libres en el resto del tracto digestivo. Todo hace pen~ar que a partir de las 72 horas postinfección, estamos en presencia de la fase estacionaria del parasitismo. Entre 144 Lu. youngi infectados con 3 hasta 5 días de desarrollo, hallamos un 9% con promastigotos libres en proboscide y uno solo con la hipofaringe infectada (0.7%). Las invasiones a la hipofaringe fueron mas frecuentes a partir el mismo sexto día de la infección. Entre 186 insectos infectados, con duración de desarrollo entre 6 y 9 días, detectamos 24 con parásitos en proboscide (13%) con 13 de ellos (54%) presentando parásitos en el conducto hipofaringeo para un 7% de pos it i vi dad en este conducto e 1 tota 1 de 1 os 186 infectados. Esto es, que en términos po~centuales, la frecuencia de promastigotos en la hipofaringe es diez veces mayor en Lu. youngi infectados con 6 o más días de evolución. Es importante destacar, para la elaboración de conceptos, que la invasión de la hipofaringe acontece como una tercera fase del desarrollo de la infección. La primera fase sería la exponencial, con transformación de amastigotos tisulares en promastigotos entomoentéricos y con activa r~producción hasta la conclusión de la ingesta sanguínea, terminando esta fase con la excreción masiva de flagel~dos. la segunda fase, que describimos en esta otra sección de nuestro trabajo, sería la fase estacionaria,

•• 43

de gelificación o de tapón gléico estomodeal, con su formación entre 60 y 120 horas postinfección.

La tercera fase, que anticipadamente vamos a denominar de metaciclogénesis, ocurriría a partir del 52 día y mas seguramente del 62. En el Cuadro VI se observa que es siempre mayor y cuasi simultánea, la presenCia de flagelados libres entre las piezas del proboscide y su. hallazgo en la hipofaringe. Más aún, la presencia de flagelados libres entre las piezas del hexaqueto puede ocurrir tempranamente, entre las 72 y 120 horas, siendo su localización hipofaringea, una secuencia con menor frecuencia. La mitad del número de flebótomos con parásitos en el hexaqueto, los presentan también en la hipofaringe. Todo esto sugiere que algunos de los promastigotos qua se detectan en el proboscide estarían en tránsito hacia la hipofaringe. Estos últimos deben ser lo suficientemente delY,ados como para penetrar a traves de un conducto hipofaríngeo terminal que mide 2,~um de diámetro.

COMENTARIO FINAL Y CONCLUSIONES

La mas reciente revisión sobre el ciclo vital de Leishmania en flebótomos, con particular referencia a las formas infectantes para el hospedador vertebrado, ha sido producida por KILLICK-KENDRICK (1990) quien describe hechos bien conocidos y se replantea especulaciones sobre los posibles mecanismos de inoculación de parásitos metacíclicos, señalando que, mientras podría ocurrir realmente cuando los parásitos se hallan en las piezas bucales, la regurgitación de promastigotos infectantes desde un ambiente posterior no es menos importante. Nuestro hallazgo contribuye a aclarar, en modo definitivo, el mecanismo de inoculación de estos parásitos por el vector; mecanismo que no es otro que el usual en todos 1 os protozoos que se transmiten por picadura y durante 1 a

1 •

picadura, por la inoculación de formas presentes en el conducto de la

•• 44

hipofaringe. La regurgitación de parásito durante la ingestión de

sangre por flebótomos infectados, tan discutida desde el punto de vista de la mecánica de fluidos por JEFFERIES et !!· (1986), se hace totalmente innecesaria, como hipótesis, a la luz de nuestro hallazgo.

La sospecha de que la transmisión de Leishmania por flebotominos

vectores pudiera ser similar a los de los tripanosomas salivarios,

había sido especulada por BAKER (1977}. Finalmente, es importante

señalar que 1 a sobrevi da de Lu. youngi infectados con L. mexicana

hasta por nueve días, ha sido posible mediante su sobrealimentación

con sacarosa comercial; esta circunstancia merece un estudio

especial.

b

Fig. 4.- Forma y tamaño de parásitos en excretas de Lutzomyio youngi

o los 72 horas post-infección con Leishmani a mexicana

\.

b

a

d ·------------------·

Fig. 5.- Piezas de fascículo bucal o hexaqueto de Lu. Y.OUngi.

a .. Cabeza mostrando el labro y hexaqueto .

b- Mandíbulas (1), maxifas (2), eplfaringe (3) e hipofaringe (4)

e - Hipofaringe

d- Detalle de lo hipofaringe mostrando e 1 conducto so lival (c .s.)

• • •

t ..... 1 e

.. ....

Fig. 6.- !:..:.... mexicana de la válvula estomodeal y de la hipofaringe de Lu. l 'OUftiL

o y b- Formas critidioides (Final Fase migratoria) e y d- Estadios metacfclicos (Fa•• meta ele lo gen lea)

CUADRO '21 Frecuencia de promostigotos de L. mexico.ná en probo5cide e hipo faringe de .h!:!,. you-;gi infectados.

DÍAS DESPÚÉS DE NI DE FLEBÓTOMOS FLEBÓTOMOS CON LA iNFECCiÓN. DiSECADOS. TAPON ESTOMODEAL..

3 3

4

4 4 5 5

3 hasta 5 dÍas

6 6

7 7

8

8

8

8

9

6 hasta 9 dÍas

Gran total

48 .23

50

21

30

20 79

271

38 21

20 17 21

62 81

20 55

339

610

24 12 36

14

30

7 .21

144

7

13

16

9 1 1

42

56

11

21

186

330

50 52 72

67

lOO

35 27

53

18 52

80

53 52 68

69

55

38

55

54

FLEBÓTOMOS CON PROMASTiGOTOS EN:

PROBOSCIOE 0/ 0 HIPOFAR[NGE

5 2 -

3

5

13

1

4

2 4

3

6

2

2

24

37

43

24

9

8

25 22 36

5

l 1

18

7

13

11

1

2

2 1

3

1

1

2

13

14

5

o;r

8

13

22

9

5

2

9

7

7

4

C A P 1 T U l O IV

•• 45

INFLUENCIA DE SACARIDOS SIMPLES O ASOCIADOS SOBRE LA PRESENCIA DE UN ESTADIO HIPOFARINGEO DE Leishmania mexicana EN Lutzomyia youngi

La ingestión de azúcares por dípteros hematófagos es esencial para sobrevivir al menos hasta la primera ovopostura (DOWNES, 1958; WILSON, 1967). El agua y los fluidos azucarados pasan directamente hacia el buche expandfendo el divertículo esofágico, en tanto que la i ngesta de sangre pasa di rectamente hacia e 1 estómago (OAY, 1954).

La presencia de azúcar en flebótomos silvestres fue verificada por YOUNG et !1· (1980) mediante la aplicación del test de antrona, que reacciona con fructosa o con sacarosa, a Phlebotomus ariasi cap~urados en el sur de Francia; entre 71 y 75% de los insectos

reoocion~ron posi~~vam~nt~ ~~ test.

Lutzomyia young1 capturados en la vecindad de la ciudad de Trujillo, en el oCcidente de Venezuela, fueron también positivos al test de antrona en un 52% (N: 68) ROJA$-CASTILLO, 1989).

El azúcar ingerido provendría de savia o nectarios (SHLEIM, 1986) o de' excreciones de áfidos (KILLICK-KENDRICK y KELLICK-KENDRICK, 1987). En ambos casos, la ingesta directa o indirecta, lo sería seguramente de sacarosa o de fructosa contaminadas con aminoácidos libres y otros componentes nitrogenados presentes, por lo menos, en el sistema floémico de árboles pertenecientes a 11 familias que han sido estudiadas (ZIMMERMANN, 1957). Entre los aminoácidos floémicos mas comunes y abundantes se han identificado la alanina, la glu_tamina asparagina y la leucina (AUCLAIR, 1963).

Se ha especulado la relación entre las concentraciones de .azúcares ingeritlas por flebótomos y la morfogénesis de Leishmania. Altas concentraciones de sacarosa aGtúan sobre la morfogénesis de L.

•• 46

major en medio NNN. Adicionado este desacarido (0.25/M), se inicia un desarrollo ple0mórfico que a partir del 62 día, a 282C, culmina con la producción de un estadio terminal que no se divide o reproduce {SCHLEIN et ~· (1987), semejante a otros observados en P. papatasi infectados por L. majar mediante picadura en hamsteres y mantenidos hasta 7 días con sacarosa al 30% (SHEHATA et ~· (1988}; en ambos casos, estos estadio.s serían similares a los reconocidos por un anticuerpo monoc·lonal (WIC, 79~3) que identifica al ligando que enlaza los parásitos a macrófagos, en presencia de complemento (SCHLEIN et ~., 1987). Estos experimentos parecen confirmar suposiciones pr~vias acerca de la necesidad de una dieta suplementada con sacarosa o con fructosa para que los flebótomos infectados pueden transmitir Leishmania spp. por picadura (SMITH et al., 1940;- SHORTT, 1945; KILLICK-KENDRICK, 1979}.

Compuestos nitrogenados, específicamente aminoácidos se sabe que son ingeridos naturalmente por flebótomos a partir de savia o de rocío me 1 oso ( honey dew) excretado p.or áfi dos. Aminoácidos frecuentes y abundantes en estas secreciones son 1 a asparagi na, 1 a glutamina, la leucina y la alanina (ZIMMERMANN, 1960} presentes tanto en la savia del floema como en el rocío-meloso y el maná. MOLYNEUX et ~· (1990) han analizado el rocío meloso extraído por áfidos Qel floema de diversas plantas de cultivo que producen alcaloides. Considerando al líquido floémico como medio de transporte de pequeñas moléculas, desde sus sitios de síntesis hasta órganos de reserva, es presumible que en el rocío meloso aparte de azúcares y aminoácidos no existan polímeros importantes.

La interacción ..:!..!!. situ e in vivo, con azúcares o con sus derivados nitrogenados, puede afectar la morfogénesis Y. hasta la presencia de promastigotos de Leishmania spp. en el tracto digestivo anterior de flebótomos, lo cual ha sido sugerido por MOLYNEUX et ~· (1986), aunque ninguna de las evidencias que aportan tengan que ver específicamente con Leishmania-Phlebotominae y se refieran, por lo

•• 47

contrario, a la asociación Blastocrithidia-Gerris o a promastigoto de

Leishmania en cultivo. Experimentos para asociar actividad lectínica de flebótomos con promastigotos, fueron realizados por WALBMJKS 1 et ~· (1986) con extractos de Phlebotomus papatasi y promastigotos e Leishmania major, L. aethiopica y L. donovani. Estos parásitos cosechados a los 5-6 días en cultivo fueron aglutinados debilmente, con excepción de L. donovani, por extractos de cabezas de P. papatasi. Los autores no mencionan explícitamente el comportamiento de azúcares aminados como inhibidores, aunque sí señalan el efecto inhibidor de la trehalosa azúcar ,..común~ en la hemolinfa, para la aglutinación de eritrocitos humanos de ocho tipos de ABO (N). No obstante, las primeras evidencias de asociación entre leishmanias y

flebótomos mediada por mecanismos semejantes a lectinas, fueron producidas por ROJ~-CASTILLO (1989) trabajando con Lu. youngi prealimentados con sacarosa, sacarosa-manosa y sacarosa-galactosa e infectados luego con dos aislados de L. braziliensis. Observó la aútora que en los flebótomos que ingirieron manosa o galactosa previa a la infección, no se produjo la adhesión de promastigotos al ca~djas, aunque sí al píloro, en tanto que en los controles, alimentados con sacarosa únicamente, hubo adhesión tanto al píloro

\. .

como a la válvula estomodeal.

En otro esf~rzo por investigar si el contacto entre los flagelos de promastigotos de Leishmania y la cara interna del epitelio digestivo de flebótomos está mediado por lectinas WARBURG et ~· (1989) han utilizado fragmentos de flagelos de promastigotos de L. major y L. panamensis separados por gradiente de sacarosa y

secciones del tubo digestivo medio y posterior de P. papatasi cortadas por congelación y fijadas con acetona helada. Los flagelos se adhirieron a. las secciones fijadas y fueron evidenciados mediante reacción con anti cuerpps monocl o na 1 es conjugados .con1 fl uorescei na. En estos experimentos se incluyeron diez sacáridos, un oligosacárido y dos derivados acetil-aminados de galactosa y de glucosa, como

•• 48

candidatos inhibidores de una eventual reacción lectínica. No se registraron resultados positivos que lo sugirieran; por el contrario con nueve azúcares, el número de flagelos adheridos fue mayor en los cortes experimentales que en las secciones controles. La "fijación" de los flagelos de promastigotos de Leishmania spp. a las microvellosidades del epitelio del tubo_digestivo medio de flebótomos por otra parte, se hace por irnsérción y nunca por el tipo hemidesmosomal que tiene lugar en la válvula estomodeal (MOLYNEUX et

~·' 1984).

A despecho de estas inconsistencias y siguiendo los resultados de ROJAS de CASTILLO (1989), persistimos en esta línea de trabajo. Nos ocuparemos, por lo tanto, de investigar el posible papel de una dieta suplementaria azucarada sobre la migración antero-cibarial de L. mexicana en Lu. youngi experimentalmente infectados, prestando especial atencion a la presencia de los parásitos en la porción media y terminal de la hipofaringe, fenómeno descrito en la sección anterior de este estudio y observado en Lu. youngi mantenidos con Sdf=~r~~a a partir del quinto y hasta el séptimo día después de la ingesta infectante. Nuestra planificación experimental comprende ,, sucesivamente la ,:observación del desarrollo de la infección de L.

mexicana en el probóscide de Lu. youngi sobrealimentados con (1)

sacarosa comercial1Jno refinada; (2) sacarosa comercial refinada; (3)

sacarosa 99 +% de Sigma Chem. Co.; (4) sacarosa 99 +% ñdicionada con tres aminoácidos mas comunes en el sistema floémico de -árboles; (5) sacarosa mezclada con N-acetil-galactosamina o N-acetil-D-glucosamina y (6) mezcla de sacarosa-galactosa de Sigma. La inclusión de derivados aminoacetilados de glucosa y de galactos;a obedece a la importancia de estas moléculas en la síntesis de precursores de la quitina por un lado, y de lipofosfoglicanos de importancia estratégica adaptativa para promastigotos de Leishmania, tanto en el vector como en el vertebrado (TURCO, 1990)~

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. Las hembras silvestres de Lu. youngi fueron capturadas en la •

1

"''época de mayor propo~2ii5~1;de nulíparas (Agosto 1987 o'1

Feb~ero l988), : -' $ J ; ) i 1 • ' '

durante la noche, por atracción con trampa de Shannon cebada con luz ,,ijiJ(>,' ,\],) 'l• •\

fluorescente de 15W. Se confinaron en envases acorchados y dentro de cavas de poliestireno (242C y mas de 80% H.R.) en penumbra. Veinticuatro horas después de 1 a captura fueron expuestas a 1 dorso posterior de hamsteres infectados cuatro semanas antes con L. mexicana y se dejaron ingurgitar sobre la piel hasta su separación espontánea.

Se prepararon separadamente soluciones con sacarosa de las tres calidades al 30% (1M), y también soluciones de sacarosa Sigma adicionando separadamente a cada ml con 340 mg. de sacarosa con 50 mg. de los siguientes azúcares o derivados: galactosa, N-acetil glucosamina y N-acetil-galactosamina. En el caso de mezclas de sacarosa Sigma con aminoácidos, se preparó 10 ml. de una solución 2M de $~carosa Sigma y se mezcló con un vol~men igual de DL-alanina 99%, de L-glutamina, 99% de L-asparagina 99% o de DL-l~ucina 99+%, conteniendo 50 mg~ de cada aminoácido disuelto en agua destilada tibia.

1 J

Los sacaripos simples o mezclados con otros derivados, se ofrecieron a los flebótomos infectados, en grupos desde 14 hasta 56 insectos, 96 horas (cuatro días) después de la ingesta infectante, mediante un trocito de espuma plástica prelavada con agua destilada e impregnada con la solución dulce hasta el 72 día, :cambiándose el plástico diariamente para reducir su contaminación por microorganismos. . A los 7 días los insectos se sacrificaron por sobreanestesia con éter y tras enjuagarlos con sol,uc;ión salina al O, 6% conteniendo l%o de detergente, fueron di secados para examen. Separamos la cabeza con un fragmento de esófago para examinarla, bajo

•• 50

cubre-objeto, con 400X. Prestamos especial atención a la presencia

del tapón estomodeal de parásitos y a éstos en el conducto de la

hipofaringe.

RESULTADOS

1.- Experimentos con sacarosa únicamente.

Entre 152 hembras de Lu. youngi alimentadas sobre el hamster

infectado que fueron sobre a 1 imentaas con sacarosa Sigma, hallamos tapones con parásitos en 42 (27,8%) y de éstas 4 con

promastigotos ~n la hipofaringe (2,6%).

Entre 200 hembras que fueron alimentadas con sacarosa comercial refinada, hallamos 65 con parásitos en el tapón estomodeal (32,5%} y entre éstas, 8 que poseían promastigotos hipofaríngeos

( 11 '7%).

De 224 hembras sobrealimentadas con sacarosa no refinada, 101 resultaron positivas (45,0%} y de éstas 16 (16,1%) mostraron parásitos libre en el conducto hipofaríngeo (Cuadro VII). A juzgar por el grado de refinación de la sacarosa, a menor grado de pureza, mayor es el porcentaje de lu. youngi infectados con l. mexicana y mayor también la frecuencia de parásitos libres en el canal hipofaríngeo. Este hecho sugiere algún tipo de relación entre "las impurezas" de la sacarosa y el éxito de la infección por el parásito y su localización hipofaríngea. las diferencias entre estos porcentajes de invasión hipofaríngea es altamente significativa, sugiriendo ello que las impurezas cel azúcar no refinada contribuyen a una mayor migración hipofaríngea (Cuadro VII).

Un análisis químico somero de las tres muestras de sacarosa utilizadas, incluyó determinación de nitrógeno, pH y

•• 51

conductividad en concentración isomolar (O, 1M) Y reveló pequei'ías

diferencias que por su consistencia pudieran estar asociadas con 1 a frecuenc i·a de parásitos en 1 a h i pof ar i nge (Cuadro VII 1 ) • La contaminación nitrogenada aparece en los tres azúcares como trazas, siendo mayor en las que no tienen grado reactivo, en donde también son más altas las conductividades. Con todo hasta ahora, nada de 1 o observa do podría exp 1 i car sufi e i entemente 1 as diferencias entre las frecuencias de invasión de los parásitos a la hipofaringe· y hasta su éxito mismo en el tubo digestivo de los fl ebótomos. Apenas detectamos una e i erta re 1 ación di recta entre contaminación nitrogenada en tres muestras de sacarosa y porcentajes de infección de Lu. youngi por L. mexicana e invasión hipofaríngea.

Parece obvio que, en la naturaleza, la ingestión de sacarosa por los flebótomos viene o está acompañada de otros compuestos de la economía vegetal. Hasta este momento, nuestros experimentos demuestran que la presencia de algún o algunos factores distintos a la naturaleza química de la sacaros.a, favorecen el desarrollo exitoso de L. mexicana en Lu. youngi y están asociados a una mayor frecuencia de promastigotos libres hipofaríngeos; esto es, a una mayor probabilidad de transmisión del parásito por el vector.

•• 52

2.- Experimentos con sacarosa mezclada con otros azúcares y compuestos

nitrogenados.

Disecamos 289 hembras de Lu. youngi de las cuales 81, el 28% se infectó con L. mexicana. Agrupamos los Lu. youngi alimentados sobre hamsteres infectados con L. mexicana en cuatro experimentos: 1) sobre a 1 imentados entre 4 y 7 días con sacarosa más ga 1 actos a (N: 62); 2) sdbrealimentados con sacarosa y N-acetil galactosamina también por el mismo período (N:83) e igualmente 3) sobrealimentados con sacarosa y acetilglucosamina (N: 82) y 4) alimentados con sacarosa y cuatro aminoácidos (N: 62). Los resultados de estos experimentos se presentan en el Cuadro IX. Prestamos especial atención a la presencia de parásitos fijos en la región estomodeal y libres en la hipofaringe. La

heterogeneidad de compuestos suministrados con la sacarosa no parece modificar los porcentajes de infecciones, aunque esta fue relativamente más baja (18, 1%) en los flebótomos que recibieron sacarosa con N-acetilgalactosamina donde tampoco se observaron parásitos en la misma válvula estomodeal. No así con los sobrealimentados con sacarosa y N-acetilglucosamina donde tuvo 1 ugar 1 a formación de tapones faríngeos y se vi eren parásitas libres en el probóscide y en el dueto hipofaríngeo, en forma

similar a los observados en el experimento con sacarosa descrito anteriormente y en particular con los flebótomos que ingirieron sacarosa comercial. La adición de aminoácidos a la dieta sacarosada, así como la inclusión de galactosa, pareció inhibir

igualmente la migración anterior de los parásitos.

Sacaro•a

Sigma

Comercial

refinada

Comercial

CUADRO v.n

Influencia de la calidad • la sacarosa como sobreaiimento -=

en el desarrollo de la infección hipofaringea de L mexicana -.. Lu. younai.

.

• de Lu. lOU!!II! ~ l!!ungi positivos Lu. youngi con para-sito$ en la hipofarin -

exaMinado. ge

Nt OJo Nt o¡.

152 42 27,8 4 2,6

200 65 32,5 8 11, 7

,

22'4 101 4 5.,0 16 16,1

no refinada

S.acarosa 1

1

1

Sigma Ch

Comercial

refinada

Comercial

no refinada

CUADRO VIII

Acid~z, conductividad y N2 en tres mues tras de sacarosa suministradas

a J._ yoyngi que mostraron promastigotos de ..1.u.. mexicana en la -! .

hipofaringe

•'

A cid~ Conductividad N2 J::.._ Y.OUngi 'i 1

-

pH /f.ll/cm •Jo Infectados Hipofaringe

N• N° (0/o)

6,52 ll 0,054 42 4 (2 ,6)

••

6,77 25 0,057 65 8 (11,7)

. ·- -----.

6,42 35 0,059 10·1. 16 US,l)

'

•

CUADRO IX Awcu..a. • invociÓft pro•o•cidea • intr...,ofarfn9eo •· r b' znl9 -.. KÍCCJM - L.utzpanria JIIIDIÍ al•un..... C*1 IICaroiCI IIICI8 clerhldOI ... COii

deos y •lrullcldo• 4unlftfe cinco...,. ...,. 4íaa

OlAS DE NUMERO DE IP DE INSEC-LOCALIZACION DE LOS PARASITOS.

ALIMENTADOS DESARR(). INSECTOS DI- TOS INFECTA- TAPO N LIBRES DI UBRES CON LLO- SECADOS. DOS t%J FARIN- PIIOBOSCIDE IIITitAHIJIO'ARI.eEO

6EOrJQ tJQ

Secero .. -- 5 35 •• l. 1 1

.. lecto .. 5 27 • - - -

Totel•• 82 24(38.7) 1(4.,2) J (4,2) 1 (4,2)

S.C.ro•• ••• 5 18 5 - - -M- oceHf - .. lec- 5 14 5 - - -......... 7 50 7 - - -Tohl,.. - u 15a..J) - - -. Socor080 ... 5 ~9 z 3 3 2

•- •ce•- ··--- 5 23 . 13 3 5 l ....... 5 40 4 l.

Totol•• - ez 1.8 (23,2) 7~ 7C3e.eJ 5 us,eJ ....... -- 5 43 18 ~ 1 ~ CtNttro .., .. ..,_ 5 18 5 - - -.... Tet•le• - - 24(38.7) 1(4.2) 1(4.2) 1(4,2) - .... ~ u~ u~ 8,1~

1

• ,53

COMENTARIOS

Considerando "contaminación.. nitrogenada en la sacarosa a la presencia de N-acetil galactosamina o de la N-acetilglucosamina, registramos efectos diferentes en el desarrollo, migración y presencia de L. mexicana libres en la región estomodeal de Lu. youngi: el derivado galactosado inhibe la formación de tapón faríngeo en tanto que la N-acetil glucosamina no lo interfiere, como tampoco a la aparición de parásitos libres.

La formación del tapón faríngeo, cuya frecuencia parece estar inversamente relacionada con el éxito de la infección (Cuadro IX) y a su vez con la colonización del conducto hipofaríngeo por los parásitos, ti ene que ver de a 1 gún modo con e 1 desarro 11 o de 1 os promastigotos metacíclicos o con el mecanismo de transmisión. Una explicación posible que relaciona estos fenómenos con la actividad lectínica y en este caso con el tracto estomodeal, ha sido producida por HOWARD et ll· (1987) quienes trabajaron con formas estacionariasde cultivo de L. donovani. Han destacado estos autores que los 11 metacíclicos 11 de cultivo son aglutinados particularmente por la lectina de mani.cuya inhibidora especifica es la N-acetilgalactosamina. Los mismos estadios, por el contrario, no son aglutinados por la lectina de trigo cuyo inhibidor es la N-acetilglucosamina. Podría suponerse, análogamente, que la cutícula estomodeal de Lu. youngi posee una actividad lectínica afín a la del maní, saturable por la N-acetil-galactosamina y por ende inactivada para el reconocimiento de los promastigotos estacionarios de L. mexicana. Refuerza este punto de vista. la demostración de SCHOTTELIUS (1982) quien evidenció que un aislaaode L. pifanoi (I.:RC-L90) es aglutinado por la lectina de Ricínus communis-120 y de Arachis hypogea, ambas inhibidas por N-acetil-galactosamina; en cambio, el mismo aislado no es aglutinado por la lectina de Aaptos papillata que tiene por inhibidor a N-acetilglucosamina. Similares espectros

•• 54

de aglutinación e inhibición exhibieron varios aislados de L. donovani.

Es altamente improbable que los contaminantes nitrogenados de las muestras de sacarosa comercia 1 tengan a 1 gún derivado acet il ami nado, como tampoco que la cutícula estomodeal de Lu. youngi contenga lectinas similares a las del .maní o del tártago. Nuestras comparaciones solamente pretenden ofrecer una explicación o hipótesis racional para el fenómeno de la migración de promastigotos hacia la hipofaringe y su presencia en el dueto mismo, fenómeno de considerable importancia para la comprensión del mecanismo de la transmisión leishmánica. La extraordinaria variedad y riqueza de los componentes del fluido del floema no descarta que azúcares o sus derivados -aún no investigados deliberadamente- puedan intervenir en la morfogénesis y migración de parásitos tan específicamente reconocibles por lectinas, también de origen vegetal.

No sería exagerado especular que junto con la sacarosa, los flebótomos puedan ingerir factores que favorezcan la migración de los parásitos hacia la hipofaringe. MOLYNEUX & ELBEIN (1984) han detectado en el rocío meloso la presencia de aTcaloideo~;uno de éstos, la castonospermina, es un potente inhibidor de lalll(- y}3-glucosidasa cuya ingestión pudiera impedir la síntesis de polímeros o glucanos. Mientras no conozcamos a ciencia cierta la naturaleza del material que forma el tapón estomodeal, no podríamos hacer conjeturas importantes; sin embargo, la ingestión de azúcares debe estar relacionada, en alguna manera con un complejo que se forma, precisamente, en la desembocadura del divertículo esofágico.

C A P 1 T U L O V

•• 55

PROMASTIGOTOS METACICLICOS DE Leishmania mexicana EN Lutzomyia youngi Y SU RESISTENCIA A LA ACTIVIDAD LITICA DE COMPLEMENTO

HUMANO Y COBAYO.

Con -1 as raras excepciones de contami nací ón transp 1 acentari a en casos graves de Kala-azar y de algunas infecciones resultantes de accidentes en el laboratorio, la transmisión natural de las leishmaniasis es a través de la picadura de Phlebotominae epidemiológicamente relacionados con las áreas y períodos de endemoepidemicidad.

En el Viejo ~1undo, SHORTT & BARRAUD, 1926 y ADLER & BER (1941) produjeron las primeras evidencias experimentales de transmisión por picadura de Phlebotomus para L. donovani y L. tropica respectivamente. RYAN gt ~· (1987) han publicado un listado actualizado de las transmisiones de Leishmania spp. por picaduras de flebótomos.

Desde entonces y a partir de 1 os ensayos pioneros de ARAGAO (1927) en nuestro Continente, sabemos que estadios flagelados, extraídos de flebótomos -Lu. intermedia- pueden inducir infecciones cuando son inoculados en un animal susceptible. LAINSON et ~· (1987) han confirmado este conocimiento con flagelados de L. mexicana extraídos desde 15 asta ltv horas de Lu. flaviscutellata y desde 38 hasta 221 horas con L. chagasi en Lu. longipalapis inoculados subcutánea o i ntraperi tone a lmente en hamsteres, como sujetos susceptibles. En estos casos no se cuantificó el tamaño de las formas inoculadas.

El problema fundamental no es la demostración del poder infectante de estos flagelados inoculados con jeringas; sino la caracterización de estadios metacíclicos de Leishmania spp., para los cuales. no existe una inequívoca y precisa descripción morfológica (SACKS, 1989).

•• 56

Es obvio que tales estadios deberán ser intrínsecamente infectantes. En esta dirección se han abierto caminos pra el estudio de atributos fisiológicos vinculados a la condición virulenta de los parásitos.

Entre nosotros y como aportaci enes pioneras, DAWIDúlWICZ et ll· (1975) demostraron que promastigotos de Leishmania sp. que han perdido su virulencia tras numerosos pasajes por cultivo in vitro, no son aglutinados por la lectina de Ricinus comunis; esto es, no poseen terminales galactósidos en sus membranas, en tanto que los promastigotos de parásitos infectantes sí los contienen. Por otras técnicas microscópicas con alta resolución, AVESTA et al. (1985) han confirmado estas diferencias, esta vez usan'do concanavalina A, Con-A con ferrit i na y Con-A conjugada con i sot i oci anata de fl uorescei na. Las investigaciones cuantitativas de SACKS & PERKINS (1984) con promastigotos de cultivo de l. tropica y de otras especies del Neotrópico, usando ratones BALB/c, demuestran claras diferencias entre las virulencias de los parásitos de la fase logarítmica de crecimiento y los de la fase estacionaria, siendo mucho más agresivos estos últ irnos. Una aportación muy significativa para diferenciar promastigotos de cultivo virulentos de no virulentos, fue introducida por FRANKE ~ ~· (1985) con la demostración de susceptibilidad letal en parásitos de la fase exponencial a la acción lítica del complemento humano y de resistencia en los de la fase estacionaria, frente a sueros no diluidos. SACKS & PERKINS (1984 utilizaron promastigotos de L. tropica desarrollados en Lutzomyia anthophorá para comparar la virulencia de estos parásitos cosechados a los tres (3) días desarrollo, con los extraídos entre los siete (7) y diez (lO) días. Inexplicablemente, los autores decapitaban eliminando con ello la más importante pieza a flagelados de la faringe y de las piezas bucales.

sus insectos, estudiar: los

Nosotros hemos establecido las siguientes novedades: (1) la demarcación precisa de la conclusión de la fase exponencial del desarrollo y multiplicación de los parásitos en el vector, con la

•• 57

expulsión de una sobrecarga entre 72 y 84 horas, para nuestro modelo (L.mexicana en lu. youngi); (2) la presencia de una carga residual de parásitos en la válvula estomodeal como formas estacionarias y (3) el descubrimiento de promastigotos pequeños, delgados y activos con largos flagelos, en la hipofaringe de un porcentaje reducido de flebótomos con mas de cinco días de infección. En esta penúltima parte de esta tesis hemos comparado la infectividad de promastigotos estomodea 1 es de L. mexicana en hamsteres machos jóvenes, inoculando parásitos de la porción cefálica de Lu. youngi, extraídos a las 72, 96 y mas de 120 horas de desarrollo, pretratándolos con complemento humano y de cobayo, activado e inactivado, para medir sus respectivos éxitos en virulencia, por el porcentaje de los animales infectados después de su inoculación subcutánea tarsal y también por la precocidad en el desarrollo de lesiones a los 15 y 30 días postinoculación, examinadas microscópicamente para confirmar la presencia de amastigotos.

MATERIALES Y METODOS

145 hamsteres machos jóvenes, de 4 semanas, provenientes del Bioterio de la Facultad de Medicina de la Universidad Centrooccidental "Lisandro Alvarado", por bondad del Dr. Rafael Bonfante.

1.- Flebótomos.-

Hembras de 'lu. youngi capturadas en su econo (HEATWOLE, 1989) entre Febrero y Abr i 1 de 1989, cuando 1 a pob 1 a e i ón de hembras estuvo constituida, en mas del 80%, por hembras nulíparas aunque fertilizadas. Antes de transcurrir 48 horas de su captura, las hembras fueron expuestas a lesiones tarsales de hamsteres por L. mexicana y las que se ingurgitaron fueron mantenioas en el laboratorio, en condiciones ya descritas y con sacarosa comercial no refinada, al 50% {p/v), como sobredieta para inducir la presencia de parásitos en la hipofaringe.

•• 58

2.- Ensayos con complemento humano y de cobayos.-

Sueros frescos separados de 1 a sangre de 1 a autora y de sangre extraída por cardiopunctura de cobayos machos adultos de 800 g.,

alimentados con pasto fresco, fueron separados por centrifugación

a los 60 minutos de incubación a 37QC y se conservaron por

congelación en alícuotas de 0,5 ml a -40QC. Para los ensayos de

inactivación de complemento, las alícuotas experimentales fueron

tibiadas, antes de cada experimento, a 56QC durante 30 •. Los

sueros frescos o inactivados fueron diluidos en solución isotónica de NaCl (0,15M).

Los flebótomos para ensayos fueron sacrificados por sobreanestesia con vapores de éter etílico y lavados en solución salina 0,6% con

NONIDET al l%o. Las disecciones se hicieron en tampón de fosfato

Sorensen M/100 a pH 7.2 adicionado con 1,5mM de M9 Cl~l,5 mM de

CaC12

.

Tras la separación de la cabeza del insecto y confirmada la

presencia del tapón de parásitos en la región estomodeal de

aquellos con desarrollo de 72 y 96 horas, fue dilacerada en la

solución tam.ponada para separar los parásitos y el homogeneizado

fue as pi rada con un ca pi 1 ar de hematocri to s imp 1 e. L·as muestras

se mantuvieron a 24QC dentro de cámara húmeda construí da con

placas de Petri y papel de filtro humedecido. En los flebótomos

con mas de 5 días de desarrollo infectivo, se prestó especial

atención a los promastigotos libres entre las piezas del hexaqueto

o dentro del conducto hipofaríngeo, para aspirarlos con los

capilares.

Se hicieron cuatro tipos de experimentos con parásitos ~e cada uno

de los tres períodos o fases del desarrollo: (a) final de la fase

exponencial de 72 horas; (b) comienzo de la fase estacionaria de

96 horas y (e) período de la metaciclogésis hipofaríngea, desde

120 o más horas y hasta 170 horas de desarrollo.

•• 59

Experimento 1, que consistió en inocular subcutáneamente tarsos de hamsteres con parásitos extraídos y mezclados con solución tamponada

. . ++ ++ ad1c1onada con Ca y Mg y preincubada a 372 durante 30 minutos.

Experimento 2, preincubando suspensiones de parásitos con suero humano fresco en proporción de 1:2, durante 30 minutos a 372C, asegurando la mezcla de los mismos con el suero, por basculación repetida de los capil,res. Estos parásitos fueron también inoculados subcutáneamente en la piel dorsal del tarso izquierdo de hamsteres.

Experimento 3, con suero humano inactivado mezclado con la suspensión de parásitos en proporción l :2 y su incubación en capilares, previa agitación, a 372C durante treinta minutos, para ser similarmente inoculado subcutáneamente en el tarso izquierdo de hamsteres.

Experimento 4, incubando suero de cobayo fresco también en proporción 1:2 con la suspensión de parásitos, también a 372C durante treinta minutos para infectarlos subcutáneamente en hamsteres. En este experimento no se incluyeron parásitos de 96 horas de desarrollo.

En el Cuadro X presentamos los números de hamsteres usados en cada uno de estos once experimentos.

Los roedores en número no mayor de 10 por jaula de 40 x 40 x 20 cm., fueron identificados por coloración ,de la piel, según nuestra convención, con fucsina fenicada y fueron mantenidos con concentrado para ratas y agua ad libitum. Los animales fueron examinados a los 10 días para asegurar la desaparición del infiltrado inflamatorio inespecífico y luego a los 15 días y a partir de entonces, quincenalmente, hasta constatar la aparición o nó de una lesión hipertrófica en el sitio dorsal del tarso izquierdo inocul~do.

•• 60

RESULTADOS

Se precisó la condición de cada animal a los 15, 30, 45, 69 y 90 días postinoculación. En todos 1 os. casos donde se constató e 1 desarrollo de una lesión a los 15 días, esta persistió sin involución y con mayor desarrollo, hacia los 30 días. Así pués, el número de los animales infectados y contados a los .30 días, incluye a los previamente examinados a los 15 días. En el Cuadro XI presentamos los resultados de las lesiones observadas en los dos periodos, indicando además del número N de· animales en el experimento. En el numerador los observados con lesiones entre los, que al final, fueron confirmados como infectados por e 1 ha 11 azgo de amast i gotas en 1 as respectivas lesiones.

En primer lugar nuestros resultados confirman los de SACKS &

PERKINS (1984) en el sentido de que las poblaciones de promastigotos de flebótomos (lu. youngi) no son homogéneas en cuanto a infectividad se refiere, sino que la incrementan en la medida en que progresa su ciclo de desarrollo desde la fase exponencial que concluye con parásitos no divisibles a las 72 horas hasta el comienzo de la fase estacionaria. Es definitivamente mayor (67%) el número de los hamsteres infectados con parásitos de mas de 5 días de desarrollo que los inoculados con parásitos de 72 horas (47%). Los parásitos de 72 horas de desarrollo, preincubados con suero humano fresco, son totalmente lisados; en 15 ensayos de inoculación, ninguno produjo infección, en tanto que las formas con 120 horas de desarrollo. preincubadas con suero humano fresco, infectaron en su totalidad.

Parásitos con 72 horas de desarrollo e incubados en suero humano inactivado, fueron tan infectantes a los hamsteres como los·controles no incubados. Promas ti gatos de Lu. youngi con mas de 120 horas de desarrollo e in.cubados con suero humano inactivado, fueron también infectantes para hamsteres · como los parásitos controles. Igual fenómeno ocurrí ó con 1 os prei ncubados con suero fresco de cobayo;

•• 61

fueron lisados los de 72 horas de desarrollo, mientras que los de 120 horas fueron infectantes en modo similar a los controles o a los incubados con sueros humano y de cobayo.

En resumen, los parásitos con 72 horas de desarrollo, parcialmente infectantes para hamsteres, no resisten la actividad lítica de los sueros frescos, humano o de cobayo. Los parásitos con 120 horas de evolución incrementan su infectividad cuando son incubados con suero humano fresco y su infectividad es afectada parcialmente por suero fresco de cobayo o por suero humano inactivado.

.. 62

DISCUSION

Parece evidente que la acción lítica sobre los parásitos con desarrollo menor de 72 horas, inducida por el suero humano normal y fresco sea debida a la actividad de complemento. Una vez inactivado el complemento, algunos parásitos infectantes {30%) sobreviven, siendo mayor su frecuencia en 1 as pob 1 ac iones de 96 y 120 horas ( 60%). En estos casos, la acción del complemento lo es por la vía alterna por cuanto no median anticuerpos específicos, necesarios para 1 a activación de la vía clásica, con intervención de Cl hasta C2.

Llama la atención el hecho de que los parásitos de mas de 120 horas de desarrollo, infecten a los hamteres en un 100% {N: 20) después de ser incubados con suero fresco humano, en tanto que 1 os incubados con el mismo suero pero inactivado, solo infectan en un 60%.

Esta paradoja requeriría alguna explicación. La inactivación del suero humano por calentamiento a 56QC durante 30 minutos bloquea Cl y por ende a C2; C3 permanece como proact i vador. FRANKE _tl -ª.1_.

{1985), especulando acerca de los diferentes mecanismos de evasión de los promastigotos para su destino infectante en macrófagos, admiten la hipótesis de la resistencia a la acción lítica del complemento y demuestran que la fracción C3 del complemento se fija a los promastigotos, y puede ser reconocida su reacción ~ situ con un suero antihumano-C3, conjugado con fluoresceina. WOZENCRAFT ~ ~· (1986) a su vez, han demostrado con elegantes experimentos, que en macrófagos pretratados con citocalasina B para reducir su actividad endocitótica, adicionados con parásitos de la fase estacionaria de cultivos incubados con antiC3 humana, para precisar la ausencia de C3 en el sistema, se induce la secreción de C3 por los macrófagos para provocar una opsonización local y la subsiguiente internalizactón de los parásitos; en este caso, la deposición de C3 por los macrófagos sería comparable a su provisión por adición exógena mediante suero. Parece evidente que si la internalización de los promastigotos de la fase estacionaria en macrófagos es mediada por la presencia de C3 endógeno

•• 63

o exógeno, la actividad del suero fresco sea una mayor opción de

opsonización y por ende una mayor probabi1idad de infección, que

cuando se restringe la disponibilidad de C3 por la vía alterna en sueros inactivados, o se impide la activación de C3 necesaria para la vía clásica.

Por cuanto a los resultados con suero fresco de cobayo, es probable que otros factores intervengan en la génesis de una actividaa lítica parcial. Tenemos la experiencia de que los cobayos no son susceptibles a la infección con amastigotos de leishmania mexicana en

tanto que sí lo son con parásitos del complejo "braziliensis". MOSSER ~ il· (1986) han ensayado el poder lítico de sueros normales humanos y de cobayos contra cinco especies de leishmania cosechados de cultivo en la fase estacionaria y han comprobado que L. major, l. donovani, L. mexicana mexicana y L.m. amazonensis así con L.b. guyanensis son

lisadas por estos sueros cuando se los incuba por 30 minutos a 36ºC; los sueros inactivados a 56º por 30' pierden esa actividad lítica.

125 Todas estas especies enlazaron C3 marcado por I con cinética similar, requiriendo todos ellos la presencia decationes divalentes, comportándose en modo idéntico ante sueros humanos y cobayos. Ambas actividades líticas estan relacionadas con aglutininas inespecíficas de variable título en los sueros probados. La presencia de aglutininas probablemente activa el mecanismo de lisis por vía clásica; es probable que esto ocurra con nuestros sueros ~cobayos y nó con e 1 suero humano fresco. No intentamos determinar t ítu 1 os de aglutinación en ningún caso y, por tanto, la posibilidad de una mayor lisis por vía clásica, con sueros de cobayos queda como una

especulación.

En resumen y como conclusión, en esta porc1on de nuestro trabajo,

demostramos diferencias fundamentales entre las infecttvidades de promastigotos de l. mexicana cosechados a las 72 horas de desarrollo

en Lu. youngi y 1 os cosechados a 120 horas , cuando entonces son

•• 64

observables algunos parásitos libres en las piezas bucales de Lu. youngi o en la hipofaringe de este vector. Los sueros frescos, humanos y de cobayos normales, lisan en un 100% a los parásitos de 72 horas; la inactivación del suero humano redujo su actividad lítica y permite que entre 10 ensayos de inoculación, tres (3) de éllas fueran exitosas. Los parásitos de 120 horas de desarrollo en Lu. youngi, por el contrario, son altamente infectantes para hamsteres, inclusive aquellos preincubados con sueros normales y frescos o inactivados. Se confirma, en el caso de la preincubación de estos parásitos con suero fresco humano, la presunción de que, por vía alterna, el enlazamiento de C3 con los promastigotos se convierte en un paso importante y decisivo para el éxito de la infección. Llegamos así a confirmar que los parásitos de la fase estacionaria, entre los cuales se hallan los

metacíclicos que hemos descubierto en la hipofaringe, constituyen estadios altamente infectantes.

Si ciertamente la presencia de metacíclicos en la hipofaringe constituye el elemento fundamental para la transmisión durante el acto de la picadura, estamos en condiciones de sustentar la opinión de STEPHENSON & WARD (1986) de que la presencia ocasional de parásitos {L.d. chagasi) en el proboscide de Lu. longipalpis no es esencial para la transmisión. La condición inhóspita de tal ambiente y el aspecto de deterioro de algunos parásitos (L.m. amazonensis) como los que se

ha observado en secciones finas de la faringe de Psych~d~pygus carrerái (RYAN~e~ al., 1987) hacen pensar que la inoculación de un suficiente número de parásitos para provocar una infección, es practicamente imposible, aún invocando los comentarios de KILLICK-Kenan'Ck et

al.(l988) acerca de la existencia de promastigotos adheridos que 'conspicuamente' obliteran el lúmen de la faringe del flebótomo •••

bloqueo exacerbado por la presencia de un gel que integra la masa de

parásitos. Después de nuestros hallazgos es incomprensible'o carece de significado negar o poner en duda que la presencia de parásitos en ~¡

proboscide, como lo sostuvo el Profesor Saúl Adler, sea una necesidad para la transmisión. Para nosotros y consideramos importante trabajar 1

.• 65

en esa dirección para confirmarlo, la metaciclogénesis es un fenómeno

terminal que ocurre en la porción más anterior del tapón estomodeal y que, en la medida en que los metacíclicos se forman, pasan a la hipofaringe vía espacio intermandibulo-maxilar.

Si ciertamente, la inoculación de promastigotos dependiera del esfuerzo por ingerir sangre en flebótomos taponados por parásitos, las tasas de transmisión de leishmaniasis, aún aquellas que ocurren en situaciones de epidemias, serian elevadas y con muy alta frecuencia.

Nos queda, para concluir esta tesis, la necesaria consideración del papel que pueda jugar en la infección, la saliva del vector que llena al conducto hipofaringeo y en donde se desplazan libremente los promastigotos metaciclicos.

CUADRO X

Numero de hamsteres inoculados con promastigotos de .6.. mexicana

Tiempo de desarrollo Hamsteres y EX PE-'RIMENTOS

de- .L. mexjcona e n J.JI:.. young; (HORAS) Controles Suero humo- Suero huma- Suero cobayo Total

sin suero no fresco no i noctivado fresco N N N N

72 ~5 15 10 10 50

96 10 10 5 - 25

120 25 20 15 10 70

-

(; UA lJ t-< 0 ..JLL

Infecciones en hamsteres inoculados con metacícficos de J...- me xicang

pre incubados _con sueros humano y de cobayo

TRATAMIENTOS TIEMPO DE DESARROLLO DE LOS PARASITOS EN h xouncü --- ,, ----

72 HORAS

deN=15 1 7 positivos ContrQJes * 2/15 ~5 dÍa$

* 7/15. ~Q d(as

47°/o positivos

Preincu ba dos con de N=15

suero humano Negativos todos a

fresco . los 90 d{as ..---.... -

deN=lO 1 3 positivos

Preintubados con * l/10 30 dÍas

suero humano *2/10 45 dfos

inactiva do. *3/10 60 días

30°/o positivos

Prefncubados con deN=lO

suero de coba yo

fresco.

Negativos todos

hasta 90 dÍas

* Positivos/Inoculados

96 HORAS 120 HORAS

deN=!O 1 5 positivos deN=25 1 19 positivo_s

* 2/10 15 d/as *13/25 15 días \

* 5110 30 días *19/25 30 d(as 50.,. positiv9s 67°.4 positivos

deN= 20 1 20 positivos

deN=lO · 1 6 positivos *18120 15 días

*616 15 días *20/20 30 dÍas

so•;. positivos lOOtyo positivos

. --:·

deN=5 , 3 positivos de N= 15 1 9 positivos

*2/5 15 dios *5/15 15 dt'as

•315 30 días *9/15 30dlas

60°/o positivós so•t. positivos

deN=lO 6 positivos .

No se hizo * 6/ 10 15 días

60 °/o positivos

C A P 1 T U L O VI

PAPEL DE LA SALIVA DE Lutzomyia youngi EN LA INFECTIVIDAD

Y TRANSMISION DE LEISHMANIAS

•• 66

El ha 11 azgo de numerosos promast i gotas pequeños, 1 i bres y activamente móviles en el conducto hipofaríngeo de Lu. youngi infectados con L. mex.icaña descrito en este trabajo, constituye no solamente una explicación mas racional para el mecanismo de la transmisión de las leishmaniasis, sino fortalece las especulaciones que KILLICK-KENDRICK (1990) ha transcrito, a partir de los resultados de TITUS & RIBEIRO (1988) confirmados por nosotros, como veremos en el curso del desarrollo experimental de esta última sección de la tesis. Sugiere KILLICK-KENDRICK (1990) que el sorprendente incremento de infectividad de promastigotos de L. major de cultivo, para cuando son mezclados con peql.leñfsimas. cantidades de saliva de flebótomos, podría estar relacionada con la sensibilidad de los parásitos al complemento.

Es evidente la existencia de un complejo saliva-metacíclicos de Leishmania mexicana en la fase terminal del desarrollo de este parásito en Lu. youngi.

Las consecuencias epidemiológicas de tal complejo integrado por el estadio terminal de un parásito de "estación anterior" con el aparato salival, han sido evaluadas por ejemplo, en el caso de Aedes aegypti y Plasmodium gallinaceum por ROSSIGNOL et !1· (1984), al demostrar que la existencia de esporozoitos en las células epiteliales salivales o en el conducto mismo de la glándula salival, interfiere la capacidad del zancudo para localizar vasos sanguíneos en el acto de picar, aumentando de este modo los contactos infectantes de este microdepredador con su presa.

El trabajo de TITUS & RIBEIRO (1988), ya mencionado, demuestra que la mezcla de por lo menos el extracto o lisado de media glándula salival de Lu. longipalpis con promastigotos de cultivo de L. major

•• 67

cosechados en la fase estacionaria e inoculados en ratones BALB/c, incrementa no solamente el número de amastigotos en las lesiones, sino disminuye considerablemente el período prepatente para el desarrollo ~ de las lesiones, fenómeno no observado con lisados de glándulas salivales de A. aegypti, Rhodnius prolixus o Ixodes dammini.

En esta última sección de la tesis hubier-amos deseado investigar si el lisado salival de lu. youngi refuerza la infectividad de los promastigotos de l. mexicana en fase estacionaria aislados del mismo vector, pero ante 1 a incertidumbre de cosechar 1 os sin contaminación con material salival del mismo insecto, decidimos montar otro experimento con amastigotos de l. braziliensis, con material salival de lu. youngi y en hamsteres como animal susceptible.

Los amast i gotas de parásitos peri pi 1 óri cos en escaso número no siempre infectan al hamster (VALERA et ~., 1978). El aislado de L.b. braziliensis proviene de una paciente de la ciudad de Trujillo donde también se han encontrado especímenes de Lu. youngi naturalmente infectados con parásitos con desarrollo peripilórico (SCORZA et !l·, 1984).

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MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

1.~ Parásitos.- Aislado MHOM/VE/82/ZC de Leishmania braziliensis braziliensis identificado por la Dra. Nancy Core Saravia del

CIDEIM, Colombia, en 1985 (Nº 4004), como una variante de

M/HOM/BR/75/M2903). A 1 a Ora. Sara vi a agradecemos esta

identificación.

Fl ebótomos. ~ Hembras nulíparas no infectadas, capturadas en 1 as proximidades de la ciudad de Trujillo y mantenidas con sacarosa al 50% (P/V) durante no mas de 72 horas antes de su uso.

2.- Inoculación de parásitos en los hamsteres controles.- Con tejido granulomatoso de un hamster infectado en los tarsos, se preparó asépticamente una suspensión de amastigotos en solución isotónica, conteniendo 400 promast i gotos por m l. elaborada por

"dilución" a partir de homogeneizados conteniendo 60.000

amastigotos por ml. Esta suspensión debería "diluirse" para

lograr otra que diese un amastigoto por campo de inmersión en una

preparación hecha con 5 mm3 de 1 a misma, dispersa en un área de 10 x 10 mm en un porta objetos.

Con esta preparación de 400 amastigotos por ml. se inocularon subcutáneamente nueve machos,1riyectamos 0,05 ml en la cara dorsal tarsal izquierdo, y como control 0,05 ml de solución isotónica en la cara dorsal tarsal derecha.

3.- Preparación de la mezcla de saliva de flebótomos con leishmanias.- De diez hembras de Lu. youngi separamos glándulas salivales para suspenderlas en 0,5 ml de solución salina para ser

conge 1 a das y desconge 1 a das tres veces y preparar así un 1 i sado. Se mezcló 0,5 ml de la suspensión de amastigotos conteniendo 400

parásitos por ml con 0,05 ml de la solución el lisado de

glándulas para inocular subcutáneamente o, 1 ml en la superficie

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dorsal tarsal izquierda, de nueve hamsteres. En el tarso derecho se inyectó O, 1 ml de solución isotónica como control.

4.- Seguimiento y estudio de los hamsteres inoculados.- Para comparar los efectos de la inoculación de amastigotos solos de L.b. braziliensis, con la inoculación del complejo amastigotos-lisado salival, se mantuvieron los hamsteres durante 45 días hasta que se desarrollaron lesiones visibles en uno y otro grupo. Los animales fueron sacrificados por sobreanestesia con éter, en tres días sucesivos y a cada uno se les separó, mediante corte único con tijera de disección, ambas patas a nivel de la articulación tarso-tibio peroneal, para pesarlas con aproximaciór hasta 0,001 g. y estimar 1 as diferencias de peso entre ellas. Los resultados se expresan en miligramos. Con materia 1 de 1 infiltrado granul ornatos o e vi dente o no evidente en en 1 a cara dorsa 1 de 1 a pata izquierda, se prepararon sendas improntas comprimiendo un trocito de tejido dérmico sobre un porta-objetos. El material fue secado al aire, fijado luego con metanol y te~ido con Giemsa al 5% durante una hora. Con lente de inmersión y según la riqueza celular y parasitaria observada, se estimó la relación amastigoto-célula blanca, fuera ésta una célula gigante, un macrófago, un linfocito o excepcionalmente un polimorfonuclear. En algunos casos se examinaron tan sólo 20 campos, en otros hasta 500 campos, bajo lente de inmersión

. _ ~ooox).

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RESULTA"DOS

Al final del experimento no se registraron diferencias significativas entre los pesos de las patas derechas de los hamsteres de uno y otro grupo, inyectados con solución salina y que fueron considerados como pesos controles de patas normales. En cambio, fueron claramente visibles diferencias entre las medias de los pesos de las patas inoculadas con un bajo número de amastigotos de l.b. braziliensis, solos o mezclados con lisados de glándulas salivales de lu. youngi (Cuadro XII). En este caso la hipertrofia tarsal izquierda de los animales inoculados con el complejo parásito-saliva fue evidente en todos los nueve hamsteres; no así en los hamsteres inoculados solamente con amastigotos de l.b. braziliensis donde solamente tres animales exhibieron hipertrofias perceptibles a simple vista. Puede afirmarse que la adición de lisado de glánula salival al i nócu 1 o de parásitos, induce 1 es iones a todos 1 os hamsteres y éstas alcanzan, para un mismo período de observación, doble tamaño al obtenido con las patas izquierdas de los animales inoculados solamente con cerca de 20 amastigotos. No incluimos en nuestros resultados las observaciones sobre cuatro hamsteres a 1 os cua 1 es inyectamos únicamente lisado de glándulas; en estos animales sin embargo, no detectamos lesión alguna después de cuatro días de la inyección. En cuanto a la abundancia de parásitos en las lesiones aparentes o no aparentes, también detectamos claras diferencias•. Un inóculo con tan escaso número de parásitos no siempre desarrolla infecciones en un período prepatente re 1 at i vamente breve para este tipo de infección. 45 días después de la inoculación y pese al esfuerzo de búsqueda de parásitos en hasta 500 campos con abundantes células blancas de la dermis del sitio de inoculación, no los detectamos en cuptro (4) de los nueve (9) animales inoculados. En otros dos casos hallamos un amastigoto en 95 y 106 campos, revisados respectivamente. La mayor abundancia de parásitos, en el grupo experimental inoculado con

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parásitos y lisado de glándulas salivales, hallamos parásitos en todas las láminas; en dos casos el número fue tan bajo como en el grupo control; fue normal el hallazgo de un parásito por cada cuatro o cinco células blancas. Esto es, cinco a diez parásitos por campo. Aunque no se detectó relación alguna entre la masa del tejido granulomatoso asociado a la infección y la abundancia de parásitos, fué evidente que la hipertrofia tarsal estuvo siempre asociada con párasitos.

En conclusión se demuestra que un muy bajo número de amastigotos de una especie de Leishmania de lento desarrollo y usual baja abundancia de formas, tanto en las lesiones experimentales en animales susceptibles como en lesiones clínicas, induce el desarrollo de evidentes lesiones en hamsteres, con abundantes amastigotos, a condición de que se los inocule con una pequeña cantidad de lisado equivalente a cerca de media glándula salival de Lu. youngi. En otras palabras, la adición de saliva o fracción soluble de glándula salival a un bajo inóculo de amastigotos de L.b. braziliensis incrementa la infectividad de éstos en casi todos los animales inoculados. Estas lesiones, con respecto a las de hamsteres controles inoculados solamente con amastigotos del mismo parásito, aumentan su frecuencia, duplican la masa de infiltrado y cuadruplican la densidad de los parásitos en ellas presentes.

HAMSTER

Nt

1

2

3

4

5

6

7

8

9

X±Q'

.

CUADRO XII

Abundancias de pardsitos en patas de hÓmsteres Inoculadas é:on amastigotos solamente y con amostigotos mezcJodos con li·sado de glándulas soli-

vo les de J.... lt.2Y.!!.9Í

GRUPO CONTROL GRUPO EXPERIMENTAL ( L. b. braziliensis + s.s.) (L!l...br!:u:iliensi~ +lisado de glond_

~O f.)

PATA NORMAL PATA INOCUL. P/C.B. PATA NORMAL PATA INOCUL. PI<:;:_ e_

386 527 o,o8 314 549 o.-..ca.s 400 348 0,01 356 ~ 760 <>.~6

298 332 o,oo 366 616 o~os

328 340 o,o1 321. 514 D~o,.

332 504 0,33 345 7Jl o~o.l. ~

31.0 341. o,oo 41.0 461 0~..1.7" -~

273 305 o,oo 313 620 0~6

328 323 o,oo 346 667 0~3

290 405 0,03 345 711 o.la -323:!:: 42 380±81 -- 346+30 623+100 --- -

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COMENTARIOS

Hemos confirmado que la saliva o un compon~nte de la glán~ula salival de un flebótomo vector de L. braziliensis, de la m1sma localidad endémica del parásito, incrementa la infectividad de un aislado de L.b. braziliensis en un estadio donde suele hacerlo solamente mediante manipulación experimental. Este fenómeno, que parece ser específico de la asociación parásito-vector (TITUS & RIBEIRO, 1988), adquiere para nosotros una mayor importancia cuando se ha hecho evidente que tal posibilidad no es una circunstancia casual sino, por el contrario, puede ser parte fundamental para el mecanismo natural de la transmisión, al menos, de un parásito con desarrollo

estomodeal, como L. mexicana.

Para ingerir amastigotos de L. garnhami desde la piel, Lu. youngi (CARNEVALLI & :.>CORZA',- 1982) utiliza el proboscide para penetrar la epidermis y alcanzar la dermis hasta los lOO y 15~um en profundidad, donde el insecto produce micropozos o puntos hemorrágicos con demostrable presencia de sangre extravasada. Los Ph 1 ebotomi nae son hematófagos en pozos, a diferencia de los Culicidae que canulan vénulas superficiales, después de un proceso de pruebas durante las cuales el estilete alcanza hasta 0,5 mm de tejido en profundidad. Durante esta fase en ambos casos, se eyecta saliva (GRIFFITHS & GORDON, 1952). RIBEIRO (1988) ha revisado este tema y compendiado información sobre aspectos farmacológicos y fagoestimulantes asociados con las pruebas y la secreción salival y con nucleotidos de adenosina, tisulares. La ligadura de los conductos salivales en Aedes aegypti

, prolonga su tiempo y actividad de prueba aunque no afecta a la velocidad de succión de sangre (MELLINK 8i SOflENi\AMP , 1981). Hallazgo importante ha sido la demostración de actividad de apirasa en la saliva de Glossina (MANT & PARKER, 1981) que degrada rápidamente tri-y dinucleótidos hasta mononucleótidos o fosfato libre, limitando

de este modo la actividad agregante plaquetaria del ATP o del ADP.

•• 73

Mas recientemente RIBEIRO et al. (1986) han demostrado intensa actividad antiplaquetaria en la saliva de Lutzomyia longipalpis, por la presencia de apirasa, con actividad ocho veces mayor que la de Rhodnius prolixus, expresada en unidades por mg de proteína, medida a pH 7,5 y utilizando ATP como substrato. En un trabajo mas reciente, RIBEIRO et ~· (1989} estiman la actividad de apirasa en Phlebotomus argentipes, P. perniciosus y P. papatasi detectando respectivamente 134-149, 87-110 y 55-70 unidades por mg, e~ta altima tan baja como la

++ de Lu. longipalpis. Las enzimas Ca -dependiente, son activas dentro de rangos de pH de 7,5 hasta 8.5.

Es presumible que la saliva de Lu. youngi contenga -como en casi todos los artropodos hematófagos en donde se la ha investigadoactividad de apirasa. En este caso, su papel antagónico para la hemotasis del hospedador facilitaría, junto con la inoculación de metacíclicos, en caso de transmisión, el éxito de las pruebas y la rápida ingurgitación de sangre a repleción. CARNEVALI & SCORZA (1982) relacionaron la proporción de Lu. youngi que se infectan, con la abundancia y distribución de amastigotos en la dermis de hamsteres infectados con L. garnhami o con L. mexicana. En estos casos, la inyección de saliva jugaría importante papel en la infección de los flebótomos. Por tanto, la salivación de flebótomos, con o sin metacíclicos, es importante para el mecanismo de transmisión. Quedaría por considerar, en esta breve discusión, la posibilidad de inoculaciones maltiples de metacíclicos de Leishmania durante la actividad de prueba en el acto de la picadura. Hallamos ahora mas convincente la probabilidad de maltiples inoculaciones por cuanto en cada prueba se emitiría saliva con parásitos. Esta posib-ilid'ad era aceptada con reservas cuando entonces se asumía un mecanismo de regurgitación de parasitos desde el cibario, incrementaoo por una supuesta interferencia de la función de sensillas.

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En conclusión, demostramos actividad incrementadora de la infectividad de amastigotos de l.b. braziliensis cuando son mezclados

con lisados de glándula salival de Lu. youngi, relacionando este hecho

con el hallazgo de metacíclicos de L. mexicana en el conducto de la hipofaringe de este flebótomo experimentalmente infectado. Discutimos

la necesaria salivación de estos flebótomos durante las pruebas que

preceden a la ingurgitación y revisamos conocimiento sobre la

actividad farmacológica antiplaquetaria de la apirasa salival,

señalando que la actividad de salivación debe estar relacionada no

solamente con la simple o repetida inoculación de metacíclicos, sino

con una mayor posibilidad de infección de los flebótomos con

amastigotos de 1~ piel de hospedadores infectados.

DESARROLLO UBICACION EN EL TUBO DIGESTIVO EN OlAS

5 4

e 6 7

8

9

14

+++ ++ +

++ + + + ++ +

++ ++ +

++ + ++ +

++ +

I : Exponencial

II : Estacionaria

UI = Migratoria

IV = Metaciclogénica

DESARROLLO TE M PORO· ESPACIAL DE.

Leíshmanía mexicana E N Lutzomylg Y.2YD.9.Í

FASE

+++

u

ur

lV

•• 75

OISCUSION FINAL

El hallazgo de metacíclicos de L. mexicana en el conducto de la hipofaringe de Lu. youngi experimentalmente infectados, no solamente explica el mecanismo de transmisión de este parásito por un vector sino complementa, como pieza epidemiológicamente necesaria, la definición de vector.

KILLICK-KENDRICK & WARD ( 1981) han sistematizado conocimientos fragmentarias sobre e 1 pape 1 de 1 os fl ebótomos como transmisores de leishmaniasis intentando precisar una metodología para incriminar una determinada especie como vectora e Leishmania sp. en un foco o localidad dada donde ocurre la transmisión. Proponen cinco exigencias metodológicas que denominan "grados-vectores" y que se refieren a 1) la comprobación de especies antropofflicas; 2) la abundancia de la misma y en densidad tal que asegure el mantenimiento de la transmisión; 3) el hallazgo de insectos naturalmente infectados con promastigotos de Leishmania sp. y el aislamiento de tal parásito para su debida identificación; 4) evidencias adicionales sobre el ciclo de los parásitos en insectos natural o experimental infectados con , demostración de la migración de los mismos hacia "la faringe y las piezas bucale" y finalmente, 5) la demostración de la transmisión del parásito por picadura de flebótomos infectados.

Nos parece razonab 1 e, a 1 a 1 uz de ,nuestros ha 11 azgos de metacfclicos en la hipofaringe de Lu. youngi experimentalmente infectados, con L. mexicana, que una condición obvia adicional para la segura transmisión, tendría que sr l'a presencia del estadio metacíclico en la hipofaringe del insecto experimentalmente infectado. Lal i circunstancia del relativamente bajo porcentaje d,e insectos infectados con promastigotos libres en el conducto de la hipofaringe, como lo comentaremos mas adelante, no invalida la obligatoriedad de tal ubicación para el éxito de la transmisión. Presumimos que la

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presencia de parásitos libres en la hipofaringe debe ser requisito

para considerar a la asociación entre un parásito y con su insecto vector como una expresión de muy alta especifidad parasitaria, habida cuenta, de la gran susceptibilidad de la mayoría de las especies con L. brazili.ensis ·o con L mexicana. Es probable que la migración hacia la hipofaringe ocurra siempre y a partir de los cinco días de desarrollo y que la persistente tendencia de los insectos a probar -al menos para ingerir azúcares- descargue parásitos con cada prueba. Esto nos explicaría porqué varía tanto el tamaño de la población de parásitos ~n la hipofaringe, desde decenas hasta centenares.

BRAY (1974) ha reconocido que nuestra ignorancia sobre el preciso mecanismo de inoculación de Leishmania, es una de las razones por la cual una fórmula epidemiológica matemática, no ha podido proponerse como modelo para las leishmaniasis.

DYE ( 1986) ha re 1 a e i onado 1 os componentes entorno 1 ógi cos con 1 os parasitólogicos en los modelos predictivos para malaria propuestos por la tradición de Ross-Macdonald-Garki, haciendo énfasis en la necesidad de precisar cuales de las variables, son realmente significativas. En el caso de Anopheles y la transmisión mal~ricap se presumen que cada hembra susceptible infectada puede o debe transmitir~ en este caso incidencia por malaria y tasas de picadura por mosquitos~ son correlativas. En el caso de la transmisión de L. mexicana por Lu.

youngi -tomando en cuenta nuestro hallazgo- la simple prueba o conducto de la hipofaringe infectada con la dermis, una o varias veces, puede inocular parasitos produciendo una o varias 1 e si ones, como es usual en nuestro material clínico.

Colocado el hallazgo de metacíclicos en la hipofaring~ dentro de este contexto, nos dedicaremos al análisis de tres cuestiones fundamentales con él relacionados: (1) la validez del modelo Lu. youngi-L mexicana y la posibilidad de extrapolar sus resultados a otros 11 modelos 11

; (2) el por qué una fase exponencial .de desarrollo d_el

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parásito concluye con la excreción fecal de una parte de su población por el vector y (3) por qué metacíclicos en la hipofaringe.

1.- La validez del modelo.- RYAN et 2.1· (1987) han transcrito un cuadro elaborado por R. KILLICK-KENDRICK que incluye la lista de especies de Leishmania que han sido experimentalmente inoculadas al hombre y algunos animales de laboratorio, por diferentes especies de Phlebotominae, tanto en el Viejo como en el Nuevo Mundo. En esta lista, L. mexicana aparece transmitida por diferentes especies de Lutzomyia: L. furcata, L. anthophora (ENDRIS et 2.1·, 1987), L. cruciata (=sin. L. diabolica) (LAWYER, 1984), especies todas de la subregión mexicana. Faltó en esa lista, el hallazgo pionero de BIAGI et 2.1· (1963) quienes después de los experimentos de COELHO & FALCAO (1962), con especies anisocenóticas {L. renei y L. longipalpis), demostraron

transmisión de L. mexicana al autor por Lu. flaviscutellata i socenót i ca, esto · es, perteneciente a 1 área de di stri buci ón de 1 parásito y de la infección.

L. chagasi ha si do transmití da experimentalmente por Lu. longipalpis (LAINSON et ~., 1977), flebótomo con distribución en 1 oca 1 i dad es semi áridas de centro y sur América en áreas que son endémicas para leishmaniasis visceral. Esta asociación constituiría el segundo modelo natural.

La transmisión de L. mexicana mexicana por Lu. renei y Lu. longipalpis (COELHO & FALCAO, 1962), por Lu. longipalpis (KILLICK-KENDRICK et ~., 1977) y por Psychodopygus carrerai (RYAN et ~., 1987), son ejemplos de modelos anisocenóticos que tienen la importancia de comprobar que una especie de.flebótomo, capaz de picar a un mamífero en condiciones de laboratorio, y de infectarse con una especie de Leishmania del Continente Americano, puede ser potencial y demostradamente vectora.

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Las barreras geográficas o ecológicas que KILLICK-KENDRICK (1985) presume actúan como mecanismos de selección para la chictoncia de especies de Phlebotomus vectoras y no vectoras, frente a determinadas especies de Leishmania del Viejo Mundo, no parecen operar en la Región Neotropica. Nuestra experiencia continental demuestra que diferentes especies de Lutzomyia o de Psychodopygus

mastozoófilos, pueden actuar como vectores, siempre y cuando se hallen en el área de la biocenosis leishmánica.

Con respecto a Lu. youngi, S CORZA & AÑEZ ( 1984) demostraron su condición transmisora para un aislado de L. garnhami del Estado Mérida, Venezuela, donde esta especie es el flebótomo mas abundante, frecuente y con alto grado de antropofilia. FELICIANGELI (1988) señala la presencia de Lu. youngi en tres estados andinos de Venezuela, entre los 760 y 1800 msnm y hace énfasis en la simpatría de esta especie con Lu. townsendi y con L. spinicrassa en el Estado Táchira, donde las hembras de las tres especies podrían ser confundidas cuando se las examina o identifica por criterios morfotaxon6micos convencionales. A esta simpatría de vectores, habría que añadir la de los parásitos. De la población de La Grita, en el Estado Táchira, CAMICO et al. (1991) han identificado L. braziliensis y L. mexicana en tres de cuatro cepas por análisis isoenzimático de siete enzimas; una cuarta presentó caracteres de L. braziliensis y de L. mexicana.

En una localidad de la ciudad de Trujillo en los Andes de Venezuela, se ha hallado Lu. youngi naturalmente infectada con L.

braziliensis (SCORZA et ~·, 1984) y se han aislado también·, de casos clínicos del lugar, parásitos identificados por Nancy Saravia del CIDEIM de Calí, Colombia, como L.b. bra~iliensis y L.b. guyanensis (SCORZA, com. pers.).

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La ausencia de una estricta especificidad parásito-vector en los focos enzoóticos de leishmaniasis tegumentaria en América, la posibilidad. de éxito de transmisione experimentales de Leishmania spp. con flebótomos anisocenóticos y la frecuente simpatría de vectores y parásitos, conducen al convencimiento de que el hallazgo de metacíclicos de L. mexicana en la hipofaringe de Lu. youngi, no es un fenómeno artificial sino parte de un ciclo biológico de necesaria conditio ~~~para la transmisión.

El ha 11 azgo de parásitos en 1 a hi pofari nge no es un fenómeno de observación excepcional. Entre 605 Lu. youngi infectados con L. mexicana, la presencia de metacíclicos en la hipofaringe ha sido detectada 47 veces (8%); en insectos con infecciones de cinco o menos de cinco días de desarrollo, entre 211 infectados, 6 veces (3%) y entre 394 flebótomos infectados, con mas de seis días de desarrollo, 41 veces (10%).

2.- Una fase exponencial de crecimiento de los parásitos que concluye

con la excreción de una parte de la población.

Leishmania es un parásito que en su vector cumple todo el ciclo reproductivo dentro del tubo digestivo; se inicia por la hematofagia del insecto y lo concluye cuando termina la digestión de la sangre ingerida al menos donde es armónico el ciclo gonadotrófico.

Esta coincidencia trófica expone al parásito a la acción de las enzimas proteolíticas del insecto, y a la cuales debe resistir o bloquear. Por otro lado, el parásito en su fase de diferenciación, crecimiento y multiplicación,· requiere metabolitos derivados de la ingesta sanguínea y talvez azúcares ingeridos por el insecto desde fuentes vegetales.

•• 89

En la fase de diferenciación de L. mexicana, desde amastigotos hasta promastigotos, la tasa de respiración de los parásitos aumenta 4 a 5 veces (HART et !l·, 1981}. Durante esta fase de diferenciación y crecimiento los mismos segragan proteínas (HERNANDEZ et ~·, 1980) y consumen aminoácidos, particularmente asparagina, glutamina, ácido glutámico, leucina, lisina, motionina y treonina, aminoácidos todos presentes en los constituyentes protéi cos de 1 a sangre ingerida por 1 os insectos (HART & COOMBS, 1982). La ingestión de algunos aminoácidos es por transporte activo (SIMON & MUKADA, 1977).

Durante esta fase activa de consumo de aminoácidos por los parásitos en multiplicación en el estómago de los flebótomos, se segrega (Phlebotomus papatasi) una membrana peritrófica que comienza a formarse a las cuatro horas y permanece intacta hasta las 48 horas (BLACBURN et ~., 1988). En esta misma especie, la digestión de los constituyentes protéicos de la sangre humana es desigual; las albúminas se degradan rápidamente y hacia las 48 horas su concentración ha disminuido cien veces los niveles originales; no así las globulinas, particularmente las IgG e lgM que pueden detectarse hasta por 4 días, una vez aparentemente concluida la digestión (TESH et ~., 1988).- Ignoramos si existe otra información sobre digestión en flebótomos y presumimos que es similar entre los nematóceros hematófagos, a juzgar por las semejanzas de· esos procesos entre Culicinos y Phlebotominae. Efectivamente, una membrana peritrófica no comienza a formarse en Aedes aegypti antes de las cuatro horas (PERRONE & SPIELMAN, 1988); en Anopheles stephensi (LACKIE & GAVIN, 1989} anticuerpos anti-conejo ingeridos, persisten en el tubo digestivo por 24 horas en tanto que la hemolinfa lo hacen hasta 9 días. Resultados similares se obtienen con A. aegypti donde las proteínas ingeridas desaparecen entre 24 y 48 horas, siendo mas resistentes las inmunoglobulinas G. (IRBY & APPERSON, 1989}. En

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uno y otros casos -fl ebótomos y mosquitos, enzimas similares a

la tripsina y quimiotripsina están presentes en el estómago de P. papatasi y A. aegypti en concentraciones superiores a 65 ng. (BOROVSKY & SCHLEIN, 1988). Es presumible que los aumentos de concentración de aminoácidos en la hemolinfa de Culex pipiens, que se inician a las 4 horas y alcanzan su máximo nivel entre 12 y 14 horas postingestión (UCHIDA et ..tl·, 1990}, ocurran también en Phlebotominae. De ser así, es evidente la competencia por los mismos nutrientes derivados de la digestión de la sangre, entre Leishmania spp. y flebótomos, lo cual conduciría a la conclusión de la fase ·exponencial de crecimiento de los flagelados entre 24 y 48 horas después de la ingesta infectante, con la consecuente expulsión de su exceso poblacional.

La secreción de enzimas similares a la tripsina por Culex nigripalpus, que BOROVSKY (1986) consideró responsable del 80% de 1 a actividad ·proteo lit i ca en e 1 estómago de 1 mosquito a 1 as 35 horas, se segrega en dos etapas; en una primera aparece como enzima de 32-36 kilo-Daltons tan pronto se inicia la ingesta de sangre y en la otra con 30 KD unas diez horas después, concluyendo su síntesis a las 24 horas de la ingesta de sangre (GRAF & BRIEGEL, 1989). Si ello ocurre también en Phlebotominae, se puede especular que la competencia por los nutrientes de la sangre entre los flagelados y el insecto vector, se establece tan pronto ocurre la ingesta; esto es, cuando aun no ha comenzado la fase de crecimiento exponencial de los promastigotos.

3.- ¿Por qué metacíclicos de Leishmania spp. en la hipofaringe?

Las diferencias en exigencias ambientales que plantean habitats vivientes tan distintos como un vertebrado y un invertebrado, se traducen como discrepancias estratégicas adaptativas, extremadamente disímiles para los protozoos parásitos. En el caso de parásitos heteroxénicos, el fenómeno de la transmisión

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ocurre por cambios adaptativos que se traducen por 1 a expresión de un nuevo y distinto ciclo, donde el desarrollo y supervivencia del protozoo bascula entre uno y otr~ ciclo de vida. La forma o estadio que se introduce o induce el cambio que permite se cierre un ciclo e inicie otro, es por definición y en principio, una forma metacíclica. Esta forma existe y tiene una larga historia en el estudio de la transmisión de las fiebres recurrentes en nuestro país (BEAUPERTHUY, 1856). Esta suposición se complementa con la descripción del papel del esporozoíto, como foma metacíclica en los parásitos maláricos (GRASSI, 1900 citado por WENYON, 1926). El esporozoíto constituye la clave morfológica que reune en un todo racional, a los ·heterogéneros Sporozoea en homogéneos Apicomplexa. Son estadios de parásitos absolutamente célula-dependientes que disponen de tres rutas fundamentales para su infectividad a saber: desarrollo anterior por inoculación (Plasmodidae); por contaminación durante la hematofagia (Haemogregarina sp.); desarrollo cavitario para infección por infección (Hepatozoon spp.). Plasmodium mexicanum constituye, en el caso de Phlebotominae como vector, el ejemplo relativamente primitivo de uso del aparato salival para la transmisión de metacíclicos (esporozoítos) por Lutzomyia vexator. HOARE {1966) ha planteado también similares mecanismos de transmisión en Trypanosomatidae. En todos los Kinetoplastida heterox-énicos existe sin excepción, una forma metacíclica hospedador competente, que aprovechó las relaciones tróficas entre transmisor y hospedador vertebrado para penetrar al lecho capilar sanguíneo o linfático. Esta forma metacíclica aparece en tres grupos muy diferentes, donde el fluido salival anticoagulante vertido a través del conducto de la hipofaringe, asegura la inyección de los estadios metacíclícos: Cryptobia y Trypanosoma en peces y anfibios por hirudíneos; Trypanosoma de la sección: Salivaría por Díptera, T. rangeli por Rhodnius spp. y Phytomonas por chinches fitófagos. Una segunda forma de penetración lo

•• 83

sería por contaminación pasiva por vía percutánea como el caso de Trypanosoma cruzi por Triatominae y finalmente la contaminación activa, por. ingestión, como en Hepatozoon sp. transmitido por

· Cul icini.

Los Phlebotominae, al igual que otros artrópodos transmisores actúan como vectores por la vía salival, como en el caso ya mencionado de Plasmodium mexicanum de Scoloporus undulatus por Lutzomyia vexator (KLEIN et !!·, 1987); otro mecanismo o vía de transmisión por estos dípteros, lo es por contaminación activa como en el caso de Schellackia occidentalis y S. golvani de Anolis carolinensis y Sceloporus undulatus transmitidas con la ingestión de Lutzomyia vexator experimentalmente infectadas (KLEIN et !!·, 1988).

En la revisión que BAKER (1976) ha hecho. en forma suscinta para explicar los problemas de entrada o penetración de hemoprotozoos a través de sus transmisores, señala las tres formas de contaminación que hemos mencionado, a~virtiendo que la forma de transmisión mas 11 Sofisticada 11

, mas no de reciente evolución es el tipo de estación anterior con desarrollo o invasión de los parásitos a la glándula salival o a las piezas bucales. Este método es tan primitivo como la asociación de Cryptobia-peces-hirudíneos. Con Phlebotominae la vía salival para la transmisión de parásitos tan primitivos como Sauromoeba (= Plasmodium) mexicanum entre lagartos es altamente eficiente; pueden infectarse nueve de 13 saurios picados, al máximo por tres flebótomos (KLEIN g !!·, 1987). Para Leishmania nos es difícil concebir que los parásitos sean regurgitados desde el cibario, cuando en él se encuentran 1 i bres o por contami nac.i 6n de 1 as piezas de un probóscidae inhóspito. La asociación entre Sauroleishmania y lagartos es del Mesozoíco, anterior a la apari e i 6n de 1 as mismas b i ocenas i s con mamíferos ( EDMAN, 1988).

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Siendo tan amplia la distribución geográfica de estos parásitos y sus vectores, es realmente diffcil comprender su supervivencia como grupo con un mecanismo tan incierto o inseguro para su transmisión.

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CONCLUSIONES

Demostramos la presencia del estadio metacfclico de Leishmania mexicana s.l. en el conducto hipofarfngeo de Lutzomyia youngi experimentalmente ·infectada y se hace énfasis en su importancia para explicar el mecanismo de la transmisión de Leishmania spp. por Phlebotominae, como una ruta determinada y más efectiva que la formulada por la eventual contaminación con muy escasos parásitos observados entre las piezas del probóscide, o por la hipótesis de la regurgitación por bloqueo de la faringe durante la hematofagis.

•• 86

REFERENCIAS

Adler, S. & Ber, M. (1931).- Transmission of Leishmania tropica by the bite of Phlebotomus papatasi, Nature, 148 (3747: 227 •.

---------- & Theodor, O. (1930).- The exit of Leishmania infantum from the probaseis of Phlebotomus pennisiosous. Nature, 126 (3188): 883.

---------- & ---------- (1931).- Investigations on Mediterranean Kala-Azar IV-infection of sandflies with Leishmania infantum. Natural parasites of wild sandflies in Catania. Observations on Trypanosoma phyodactyli Catanilard. Proc. Roy. Soc., 108: 481-493.

Auclair, J.H. (1963).- Aphid feeding and nutrition. Ann. Res. Entomol., 8: 439-491. --. '

Añez, N., Nieves, E. & Cazarla, D. (1989).- The validity of the developmental pattern in the sandfly gut for classification of leishmania. Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg., 83: 634-635.

----------, ---------- & Scorza, J.V. (1985).- Infectividad para el hamster de prQmastigotos de Leishmania garnhami. Rev. Cub. Med. Trap., 37: 72-81.

---------- & Oviedo, M. (1985).- Two new larval diets .for rearing sandflies in the laboratory. Trans. Rey. Soc. Trap. Med. & Hyg., 12.: 739-740.

Aragro, H.B. (1927).- Leishmaniose tegumentar e sua transmissao pelos phlebotomos. ~1em. Inst. Oswaldo Cruz, 20: ·177-186.

,., Ayesta, C., Arguello, C. & Hernández, A. (1985).- Leishmania

braziliensis: cell surface differences in promastigotos of pathogenic and no pathogenic strains. Exp. Parasito1., 59: 185-191

•• 27

Baker, J.R. (1977).- Factory affecting transmission of vector-borne b1ood parasites. Acta Trop., 34: 7-19.

Barra1-Netto, M., Roters, Silene B., Sherlock, 1 & Reed, S.G. (1987).- Destruction of Leishmania mexicana amazonensis promastigotes by normal human serum. Am. J. Trop. Med. Hyg., l[: 53-56.

Beauperth~y, L.D. (1956).- Recherches sur la cause du chó1era Asiatique, sur celle du Typhus Icterode et des Fievres de Maracages. Comp. Rend. Seanc. Acad. Sci. Parfs, Ji: 692-693.

Biagi, F., De Biagi, A.M. de B. & Beltran, H. (1965).- Phlebotomus flaviscutellatus, transmisor natural de Leishmania mexicana. Prensa Med. Mex., 30 (9-12): 267-272.

Borousky, D. (1986).- Proteolutie enzymes and blood digestion in the mosquito, Culex nigripalpus. Arch. Insect. Biochem. & Physiol., 1: 147-160.

---------- & Schleim, Y. (1988).- Quantitative determination of trypsin-like and chymotrypsin-like enzymes in insects. Arch. Insect Biochem. Physiol., ~: 249-260.

Blackburn, K., Wallbanks, K.R., Molyneux, D.H., Lavin, O.R. &

Winstanley, S.L. (1988).- The peritrophic membrane of the female sandfly Phlebotomus papatasi. Ann. Trop. Med. Parasitol., 82: 613-619.

Bray, R.S. (1974).- Zoonoses in Leishmaniasis. zoonoses: clinical and experimental studies. (Ed.). London: Academic Press.

In: Parasitic Sou1sby, E.J.

Camico, C., Gaitan, M., González, E., Almera, R. & Petralanda, 1 (1990).- Biological characterization of Leishmania isolates from La Grita, Edo. Táchira, Venezuela. Second CEC Meeting on Leishmania, November 1990 -Macuto, Venezuela, 85 pp.

•• 88

Carnevali, M. & Scorza, J.V. (1976).- Infección experimental de Lutzomyi a townsendi ( Ort i z, 1959) con una cepa venez o 1 a na de Leishmania braziliensis. Bol. Dir. Malariol. y Saneam. Amb., ji:

333-343.

---------- & ---------- (1982).- Factores dérmicos que condicionan la i nf ecc i ón de Lutzomyi a townsendi ( Ort·i z, 1959) por Lei shmani a spp. de Venezuela. Mem. Inst. O. Cruz, ll: 353-365.

Coelho, M.V., Falca'o, A.R. & Falca'o, A.L. (1967).- Desenvolvimentos de especies do género Leishmania em espécies brasileiras de flebótomos do género Lutzomyia Franca, 1924. III Ciclo vital de L. mexicana em L. longipalpis e L. renei. Rev. Inst. Med. Trap. Sao Paulo, i: 29S-303.

Dawidowicz, K., Hernández, A.G. & Infante, R.B. (1975}.- The surface membrane of Leishmania. I. The effects of lectins on different stages of Leishmania braziliensis. J. Parasitol., §1: 950-953.

Day, M.F. & Irzykeiwsky, .N. (1954}.- On the mechanism of transmission of non-persistent phytogenic virous by aphis. Austral. J. Biol. Sci., L: 251-273.

Delgado, O., Romano, E.L., Belfort, E., Pifano, F., Scorza, J.V. &

Rojas, z. (1981).- Dialyzable leukocyte extract therapy in immunodepressed patients with cutaneous leishmaniasis. Clin. immunol. & immunopathol., ]I:(l83): 251-359.

Oye, C. (1986).- Vectorial capacity: must we measure all its components? Parasitology Today I: 203-209.

---------- (1990).- Epidemiological models of the Leishmaniasis. Second CEC Meeting on Leishmaniasis. November 1990: Macuto, Venezuela. 85 pp.

•• 89

Downes, J.A. (1958).- The feeding habits of biting flies and their significance in classification. Ann. Rev. Entomol., 1: 249-260.

Edman, J.D. {1988).- Disease control through manipulation of vector-host ·interaction: sorne historical and evolutionay

th perspectives. Proc. Symp. Ent. Soc. Amer. Dec. 10 , 1985, 43-50 pp.

Endris, R.G., Young, D. & Perkins, P. (1987).- Experimental transmission of leishmania mexicana mexicana by a North american sandfly, lutzomyia anthophora (Diptera: Psychodidae) J. Med. Entomol., 24: 243-247.

Feliciangeli de Piñero, D. (1988).- La fauna flebot6mica (Díptera: Psychodidae) en Venezuela: I. Taxonomfa y distribución geográfica. Bol. Dir. Malar. & Saneam.'Amb., 28: 99-113.

Fuller, H.S. & Geiman, Q.M. (1942).- South American cutaneous leishmaniasis in experimental animals. J. Parasitol., 28: 429-431 •.

Franke, E.D., ~-1cGreevy, P.B., Katz, S. & Sacks, D. (1985).- Growth cycle dependent generation of complement-resistant leishmania promastigotes. J. I~mnumol., 134: 2713-2718.

Griffiths, R.B. & Gordon, R.M. (1952).- An apparatus which enables the process of feeding by mosquitoes to be observed in tissues of a live rodent, together with an acconmt of the ejection of saliva and its significance in malaria. Ann. Trop. Med., 46: 311-319.

Graf, R. & Briegel, H. {1989).- ·The synthetic path way of trypsin in the mosquito Aedes aegypti (Díptera: Culicidae) an.in vitro stimulation in isolated miguts. Insect Biochem., ji: 120-137.

•• 90

Harts, D.T., Vickerman, K & Coombs, , G.H. (1981).- Respiration of Leishmania mexicana amastigotes and promastigotes. Mol. & Biochem., i= 39-51.

---------- & Coombs, G.H. (1983).- Leishmania mexicana: energy metabol ism of amastigotes and promastigotes. Exp. Parasitol., 54: 397-409.

Heatwole, H. (1989).- The concept of the econe, a fundmental ecological unit. Trap. Ecol., 30: 13-19.

Hernández, A.G., Rodríguez, N., Dagger, F. & Greenblatt, C.L. (1980).- Production and secretion of Leishmania braziliensis protein. Mol. & Bioch. Parassitol., l= 143-149.

Herrer, A., Christensen, H.A. & Beumer, R. (1973).- Detection of 1eishmanial activity in nature by means of sentined animal. Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg., 67: 870-879.

Herrer, A. (1982).- Empleo del hamster dorado como animal centinela en 1 as 1 oc' a 1 i dades donde es endémica 1 a Uta. ( Lei shmani as i s tegumentaria). Rev. Inv. Med. Trap. Sao Paulo. 24: 162-167.

Howard, M.K., Sayers, G. & Miles, M.A. (1987).- Leishmania donovani metacyclic promastigote: Transformation in vitro lectin agg1utination, complement resistance and infectivity. Exp. Parasitol., 64: 147-156.

Irby, W. & Aperson, C. (1989).- Immunoblot analysis of digestion of human and rodent blood by Aedes aegypti (Díptera: Culicidae). J. Med. Entomol., 26: 284-293.

Jefferies, D., Livesey, J.L. & Molyneux, D.H. (1986~.- Fluid mechanics of blood meal uptake by Leishmania infected sandf1ies. Acta Trap., 43: 43-53.

•• 91

Johnson, P.T. & Herting, ~1. (1970).- Behavior of Leishmania in Panamian Phlebotominae sandflies fed on infected animals. Exper. Parasitol., fl: 281-300.

Kil1ick-Kendrich, R. {1990).- The 1ife cycle with special reference to the form infective to the vertebrate host. Ann. Parasitol., Hum. Comp.,.§.§..: 37-42.

---------- & Killick-Kendrick, ~1. (1987).- Honeydew of aphids as a source of sugar for Phlebotomus ariasi. Med. & Veter. Ent., l= 297-302.

---------- & Ward, R.O. (1981).- Eco1ogy of Leishmania. Parasito1ogy 82: 143-152.

---------- {1985).- Sorne epidemio1ogica1 consequences on the evo1utionary fit between Leishmaniae and their ph1ebotomine vectors. Bu11. Soc. Path. Ex., 78: 747-755.

---------- (1979).- The bio1ogy of Leishmania in phlebotomine sandf1ies. In: Bio1ogy of Kinetop1astida, Vol. II {Eds. W.H.R. Lumsden & O .A. Evans). Acdemi e Press, London/New York. 395-449 pp.

---------- (1978).- Recent advances and outstanding prob1ems in the biology of ph1ebotomine sandf1ies. Acta Trap., 1l: 297-313.

----------, Leaney, A.J., Ready, P.D. & Molyneux, O.H. (1977).Leishmania in phlebotomid sandf1ies, IV. The transmission of L~ishmania · mexicana amazonensis to hamster by the bite of

experimentally infected Lutzomyia longipalpis. Proc. R. Soc. B., 196: 105-115.

Klein, T.A., Young, D.G., Telford, S. & Kim, J. {1987).- Experimental transmission of Plasmodium mexicanum by bites of infected Lutzomyia vexator (Oipt: Psychodidae). J. Amer. Mosq. Contr. Assoc., 1: 154-164.

•• 92

----------, ----------, Greiner, E., Telford, S. & Butler, J. (1988).- Development and experimental transmission of Schellackia golvani and Schellackia occidentalis by ingestion of infected blood-feeding arthropods. Intern. J. Parasitol., ~: 259-267.

Lackie, A. & Gavin, S. (1989).- Uptake and persistance of ingested antibody in the mosqui~o Anopheles stephensi. Med. Vet. Entomol., l: 225-230.

Lainson, R. & Shaw, J.J. (1972) .- Leishmaniasis of the New World: taxonomic problems. Br. Med. Bull., 28: 44-48.

---------- & ---------- (1988).- Observations on the development of leishmania (l.) chagasi Cunha and Chagas in the midgut of the sandfly vector Lutzomyia longipalpis luts and Neiva. Ann. Parasitol. Hum. Comp., 63: 134-145.

----------, · Ryan, L. & Shaw, J.J. (1987).- Infective stages of leishmania in the sandfly vector and sorne observations on the mecanism of transmission. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 82: 421-424.

: ----------, Ward, R.O. & Shaw, J.J. (1977).- Experimental transmissio~ of leishmania chagasi causative agent of neotropica1 visceral 1eishmaniasis, by the sandf1y lutzomyia longipalpis. Nature, 266: 628-630.

Lawyer, P., Young, D., But1er, J. & Akin, D. (1987).- Development of leishmania mexicana in Lutzomyia diabolica and Lutzomyia shannoni (Díptera: Psychodidae) J. Med. Entomol., 24: 347-355.

Lewis, O.J. (1975).- Functiona1 morphology of the mouth par~s in New Wor1d ph1ebotomine sandf1ies (Díptera: Psychodidae). Trans. R. Ent. Soc. London, 126: 497-532.

. 1

.1

1

•• 93

---------- (1977}.- Phlebotomine sandfly research. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., lf: 94-99 .

Mant, M.J. & Parker, K.R. (1981).- Two platelet aggregation inhibit~rs in tsetse (Glossina) saliva with studies on the role of thrombin and citrate in in vitro platelet aggregation. Br. J. Haematol., 48: 601-608.

Márquez, M. & Scorza, J.V. (1982).- Criterio de nuliparidad y de paridad en Lutzomyi a townsendi, Ort i z, 1959 de 1 occidente de Venezuela. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, ]]_: 22.9-246.

Mellink, J.J. & Bodenkamp, V.D. (1981).- Functional aspects of mosquito salivation in blood feeding in Aedes aegypti. Mosq. News, 1!: 115-119.

Molyneux, D.H., Ryan, L., Lainson, R. & Shaw, J.J. (1984) .- The Leishmania-sandfly interface. Leishmania. Taxonomie et phylogenese. Applications eco-epidemiologiques. (Coll. int. CNRS/INSERM). IMEEE, Montpellier, 1986, 311-324.

----------, ----------, ----------, & ( 1986) • - The leishmania-sandfly interface. Leishmania. Taxonomie et phologenese. CRRS, INSERM, 1984. Montpellier, 311-324.

Molyneux, R.J., Campbell, B.C. & Dreyer, D.I. (1990).- Honeydew analysis for detecting phloem transport of plant natural products. J. Of Chem. Ecol., ~: 1899-1909.

Mosser, D., Burke, E., Coutavas, J., Wedwood, J. & Ede1son, P. (1986).- Leishmania species: mechanisms of complement activation by- five strains of promastigotes. Exper. Parasitol.,- 62: 394-390.

Pérez, H. (1988).- La infección experimental del ratón con leishmania mexicana: efecto del número de parásitos inoculados sobre el curso de la infección. Acta Cient. Venez., ll: 174-179.

1

1

'1

.94

----------, Labrador, F. & Torrealba, J.W. (1979).- Variations in the· response of five strains of mice to Leishmania mexicana. intern. J. Parasit., ~: 27-32.

Perrone, J.B. & Spielman, A. (1988).- Time and site of assembly of the peritrophic membrane of the mosquito Aedes aegypti. Cell Tiss. Res., 252: 473-478.

Pifano, F.C. (1960).- Aspectos epidemiológicos en la leishmaniasis tegumentaria en la región neotrópica, con especial referencia a Venezuela. Arch. Ven. Med. Trop. & Parasit. Med., 1= 31-61.

Puente, S.M., Sacks, D.L., Dasilva, Rosangela, P. & Keith, A.J. (1988).- Complement binding by two development stages of Leishmania major promastigotes varying in expression of a surface lipophosphoglycan. J. Exp. Med., 167: 887-902.

Ribeiro, J.M.C., Rosignol, P. & Spielman, A. (1986).- Blood-finding stretegy of a capillary-feeding sandfly. Lutzomyia longipalpis. Comp. Biochem. & Physiol., 83A: 683-686.

--------- (1988).- How mosquitos find blood. Proceeding of a symposium: the role of vector-host interactions in disease

' transmission. Editors Thomas W. Scott & Judith Grumstrup-Scott. Publ. Ent. Soc. Amer., 18-24 pp.

---------- (1989).- Vector saliva and its role in parasite transmission. Exper. Parasitol., 69: 104-106.

Rojas-Castillo, Leonor (1989).- Mecanismo de adhesión de Leishmania braziliensis en Lutzomyia youngi. Trabajo de Ascenso. Universidad de Los Andes, Trujillo, Venezuela. Mimeog., 26 pp.

Rojas, E. & Scorza, J.V. (1989).- Xenodiagnóstico con LutzQmyia youngi en casos venezolanos de Leishmaniasis cutánea por leishmania braziliensis. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 84 (1): 2S-34.

:1

•• 95

Rossigno1, P., Ribeiro, J. & Spie1man, A. (1984}.- Increased intradermal probing time in sporozoite infected mosquitos. Amer. J. Trop. Med. & Hyg., ~: 17-20.

Ryan, L., Lainson, R.S., Shaw, J.J. & Wallbanks, K.R. (1987}.- The transmission of suprapy1arian Leishmania by the bit of experimenta lly i nfected sandf1 i es (Di ptera: Psychodi dae). Mem. Inst. Oswa1do Cruz, 82: 425-430.

Sacks, D.L., Perkins, P.V. (1984).- Identification of an infective stage of Leishmania promastigotes. Science, 223: 1417.

---------- & ---------- (1985).- Development of infective stage Leishmania promastigotes within phlebotomine sandflies. Am. J. Trop. Med. Hyg., 34: 456-459.

---------- (1989}.- Metacyclogenesis in Leishmania promastigote. Exper. Parasitol., 69: 100-103.

----------, Hieny, S. & Sher, A. (1985).- Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between non infective an infective deve1opment stages of Leishmania major promastigotes. J. Immuno1., 135: 564-569.

Schottelius, J. ( 1982).- Lecting binding strain-specific carbohydrates on the ce11 surfaces of Leishmania strains from the 01d Wor1d, 66: 237-247.

Sch1ein, Y., Boru~, S. & Greenb1att, C.L. (1987).- Development of sandf1y forms of Leishmania major in sucrose solutions. J. Parasit., 11: 797-805.

---------- (1986).- Sandf1y diet and Leishmania. Parasitoldgy Today. 2: 175-177.

Shehata, M.G., Wahba, M., Morsi, T.A., El Said, S. & El Sawafm B.M. ( 1988}.- De ve 1 opment of Lei shmani a major:- in the ph l ebotomi ne

:1

•• 96

sandflies, Phlebotomus papatasi (SCOPOLI) and Phlebotomus langeroni (Nitzulescu). Ann. Parasitol. Hum. Comp., 63: 146-151.

Shortt, H.E., Barraud, P.J. & Craighead, A.V. (1926).- The life-history and morphology of Herpetomonas donovani in the sandfly Phlebotomus argentipes. Ind. J. Med. Res., ]l: 947-959.

---------- (1945).- Recent research on Kala-azar in India. Trans. R. Se. Trap. Me. Hyg., 39 (1): 13-41.

Scorza, J.V. & Añez, N. (1984.- Transmisión experimental de leishmania garnhami al hamster por la picadura de lutzomyia townsendi. Rev. Cub. Med. Trap., 36: 139-145.

---------- & Delgado, O. (1982).- Morfometría amastig6tica y desarrollo de cuatro aislados de leishmania mexicana pifanoi de Venezuela en Lutzomyia townsendi. t~em. Inst. O. Cruz, ll: 217-277.

----------, Márquez, M. & Márquez, J.C. (1984).- Hallazgos de Lutzomyia townsendi (Ortiz, 1959) naturalmente infectada con Leishmania braziliensis en el área suburbana de Trujillo. Bol. Dir. Malar. y Saneam. Amb., 24: 21-28.

---------- & Rojas, E. (1988).- Caficu.ltura y leishmaniasis tegumentaria en Venezuela. Bol. Dir. Malar. y Saneam. Amb., 28: 114-12,7.

Simon, M.W. & Mukkada, A.J. (1977).- Leishmania tropica: regulation and specificity of the methinine transport system in promastigotes. Exp. Parasitol., 42: 97-105.

Smith, R.O.A., Halder, K.C. & Almed, I. (1940).-. Further investigations on the transmission of Kala-azar. Part. III: The phenomenon · of the 11 blocke 11 sandfly. Ind. J. Med. Res., 28: 581-584.

1

1

•• 97

----------, ---------- & ---------- (1941).- Further investigation on the transmission of Kala-azar Part •. VI A second series of transmission of L. donovani by P. argentipes. Ind. J. Med. Res., 29: 799-802.

Smy1y, H.J. & Young, Ch.W. (1924).- The experimental transmission of 1eishmaniasis to anima1s. Proc. Soc. Exper. Bio1.· & Med., ll= 354-356.

Stephenson, G. & Ward,, R.O. (1986).- A study of the transmission of Leishmania donovani chagasi by Lutzomyia longipalpis, using an artificial microfeeder. Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg., 80: 343.

Strangways-Dixon, J. & Lainson, R. {1966).- The epidemio1ogy of derma1 1eishmaniasis in British Honduras III. The transmission of Le.ishmania mexicana to man by Phlebotomus pessóanus, with observations on the deve1opment species of Phlebotomus. Trans. R. Soc. Trap. Med. Hyg., 60: 192-207.

Tesh, R., Ru-Chen, W. & Catuccion, D. (1988).- Surviva1 of a1bumin IgG, IgM, and complement (C3) in human blood after digested by Aedes aegypti and Phlebotomus papatasi. Am. J. Trap. Med. Hyg., 39: 127-130.

Turco, S.J. (1990).- The 1eishmania1 1ipophosphog1ycan: a multifunctional melécu1a. Exper. Parasito1., 70: 241-245.

Titus, R. & Ribeiro, J.M.C. {1988).- Sa1ivary g1and 1ysates from the sandf1y Lutzomyia longipalpis enhance Leishmania infectivity. Science, 239: 1306-1308.

Uchida, K., Omori, D., Yamakura, F. & Suzuki, K. (1990).- ~hanges in free aminoacid concentration in the hemo1ymph of the fema1e Culex pipiens pallens (Diptera: Culicidae) after a b1ood mea1. J. Med. Entomol., gr: 302-308.

•• 98

Young, C.W., Smyly, H.J. & Brown, C. (1924).- Experimental Kala-aza~

in a hamster. Proc. Soc. Exp. Biol. r~ed., fl: 357.

Valera, M., Moreno, E. & Scorza, J.V. (1978).- Cincuenta y seis casos de leishmaniasis tegumentaria en cuenca de los rfos Chama-Mocoties (Estado Mérida, Venezuela). Bol. Oir. Malar. &

Saneam. A~b., 18: 238-247.

Wallbanks, K.R., Ingram, G.A. & Molyneux, O.H. (1986).- The agglutination of erythrocytes an Leishmania parasites by sandfly gut extracts: evidence for lectin activity. Trop. Med. Parasit., 37: 409-413.

Walters, L.L., Chaplin, G.L., Madi, G.B. & Tesh, R. (1989).Ultrastructural biology of Leishmania (Viannia ) Panamensis (=

Leishmania braziliensis panamensis) in Lutzomyia gomezi (Oiptera: Psychodidae): a natural host-parasite association. Am. J. Trap. Med. Hyg., 40: 19-39.

~~arburg, A. & S eh 1 ei n, J. ( 1986).- The effect of post-b 1 ood mea 1 nutrition of Phlebotomus papatasi on the transmission of Leishmania major. Am. J. Trap. Med. Hyg., 33: 926-930.

Warburg, G.S.H., Schlein, J. & Shire, O. (1986).- Scanning electron microscopy of Leishmania major in Phlebotomus papatasi. Z. Parasitenk., ZI: 423-431.

Warburg, A., Tesh, R.B. & McMahon-Pratt, O. (1989).- Studies on the attachment of leishmania flagella to sandfly midgut epithelium. J. Protozool., 36: 613-617.

Wenyon, C.M. (1926).- Protozoology Vol. I, Bailliere, Tyndall & Cox. London 76S pp.

Wozencraft, A.O., Sayers, G. & Blackwell, J.~1. (1986).- Macrophage type 3 complement receptors mediate serum-independent binding of

1

•• 99

Leishmania donovani: Detectian af macraphage derived camplement an the parasit surface by inmma-electran micrascapy. J. Exper. Med., 164: 1332-1337.

Wu, W. & Tesh, R.B. (1990).- Selectian af Phlebotomus papatasi (Díptera: Psychadidae) lines susceptible and refractary ta Leishmania major infectian. Am. J. Trap. Med. Hyg., 42: 320-328.

---------- (1990).- Genetic factars cantralling susceptibility ta Leishmania major in the sandfly Phlebotomus papatasi (Díptera: Psychadidae). Am. J. Trap. Med. Hyg., 42: 329-334.

Yarbuh, A.L. & Scorza, J.V. (1982).- Ensayos metodológicos para la investigación de reservorios de Leishmania spp. en Los Andes venezolanos. Mem. Inst. O. Cruz, ZL: 367-384.

Yaung, C., Turner, O.P., Killick-Kendrick, R., Rioux, J.A. & Leaney, J.A. (1980).- Fructase in Phlebotomus ariasi and the possible relevance af sugars taken by sandflies to the transmission of leishmania~is. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. & Hyg., 74: 363-366.

Young, D.G. & Lawyler, P.G. (1987).- New Warld vectors of the leishmaniases. Current Topics in vector research., i= 29-71.

Zimmerman, M.H. (1957).- Trans1ocation of arganic substances in trees. I. The nature of sugars in the sieve tube exudate of trees. Plant ·Physiol., 32: 288-291.

---------- (1960).- Absorptian and trans1ocation: transport in the phleam. Ann. Rev. Plant Physiol., Jl: 167-190.

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