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i PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PROTOCOLO DE TRABAJO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE: INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA TÍTULO DEL TRABAJO: ESTUDIO DEL CONSUMO DE OXÍGENO EN PROTOZOARIOS BAJO LA PRESENCIA DE ANÁLOGOS DE NICARDIPINA MAYO DE 2006 Asesor Externo: M. en C. Juana Martha Noyola Díaz Asesor interno: Q.B.P. Miriam Juárez Juárez. Evaluador. Bióloga Lourdes Sánchez. PRESENTA: Méndez Cárcamo Silvia
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i
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
PROTOCOLO DE TRABAJO DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA MODALIDAD DE:
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGÍA
TÍTULO DEL TRABAJO:
ESTUDIO DEL CONSUMO DE OXÍGENO EN PROTOZOARIOS BAJO LA PRESENCIA DE
ANÁLOGOS DE NICARDIPINA
Leishmania mexicana mexicana
MAYO DE 2006
Asesor Externo: M. en C. Juana Martha Noyola Díaz
Asesor interno: Q.B.P. Miriam Juárez Juárez. Evaluador. Bióloga Lourdes Sánchez.
PRESENTA:
Méndez Cárcamo Silvia
ii
CONTENIDO
Pág.
Contenido ii
Índice de figuras v
Índice de tablas vi
Índice de gráfica vii Resumen viii
1 Marco Teórico 1
1.1 Distribución 1
1.2Morfología 1
1.3Clasificación de los protozoarios 3
1.4Importancia 3
1.5 Protozoarios que provocan enfermedades importantes en el ser humano
4
1.5.1Tripanosoma cruzi 5
1.5.1.1La enfermedad de Chagas 5
1.5.1.2Formas de transmisión 7
1.5.1.3 Formas clínicas de la enfermedad 7
1.5.1.4Tratamiento 7
1.5.2 Leishamnia mex. mex. 9
1.5.2.1Leishmaniasis 10
1.5.2.2Formas de transmisión 10
1.5.2.3Síntomas 11
1.5.2.4 Tratamiento 11
1.6Metabolismo de cinetoplastida 12
1.7Compuestos del tipo 1,4 dihidropiridina. 15
1.7.1Análogos de Nicardipina 16
2 Justificación del Proyecto 18
3 Objetivos 19
3.1 Objetivos generales 19
3.2 Objetivos particulares 19
iii
Pág.
4 Materiales y métodos 20
4.1Materiales 20 4.1.1Material biológicos 20
4.2 Medios de cultivos 20
4.2.1 Medio RPM 20
4.2.1 Medio BHI 20
4.2.3 Medio de cultivo para consumo de Oxígeno. 20
4.3 Soluciones 20
4.3.1 Solución de Lock 20
4.3.2 Reactivos para determinación de proteínas (método de Bradford
21
4.3.2.1 Reactivo de Bradfor 21
4.3.2.2 Solución de albúmina 21
4.3.3 Solución de Nicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y DHP-3)
21
4.4Métodos 21
4.4.1Crecimiento de protozoarios para el consumo de oxígeno 21
4.41.1 Crecimiento de Tripanosoma cruzi cepa Brener 21
4.41.2 Crecimiento de microorganismo Leishmania mex. mex
21
4.4.2Estandarización del método de consumo de oxígeno. 22
4.4.2.1rocesamiento de datos 25
4.2.3 Medición del consumo de O2 en presencia de Nicardipina,
sus dos análogos (DHP-1 y DHP3) y vehículo
25
4.2.3.1 Procesamiento de los datos 27
4.2.3.1.1 Determinación del porcentaje de inhibición
de consumo de oxígeno para la cepa CL Brener de
Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. mex.
27
iv
Pág.
4.2.3.1.2 Determinación de la concentración inhibitoria al 50% (CI 50)
27
4.4.4urva estándar de proteínas 28
4.2.4.2 Determinación de proteínas de Leishmania mex. mex. y Tripanosoma cruzi
29
PARTE 5 Resultados y Discusión 30
PARTE 6 Conclusiones 47
PARTE 7 Recomendaciones para trabajos futuros 48
PARTE 8 Bibliografía 49
Apéndice 51
v
ÍNDICE DE FIGURAS
Título de figura Pág.
Figura 1. Algunas estructura de organelos a) Flagelos b) cilios que son organelos de locomoción c) Mitocondria de T. cruzi
2
Figura 2.- Esquema de diferentes protozoarios. A) Estructura de un flagelado Tripanosoma cruzi b) Estructura protista ameboide. Ameba proteus c) Estructura de un ciliado. Paramecium caudatum d) Figura de un esporozoíto apicomplexa
3
Figura 3. Estructura química de los fármacos utilizados para el tratamiento de Chagas
9
Figura 4. Comportamiento metabólico de algunas especies de
cinetoplastidas
12
Figura 5 Posible vía de las pentosas fosfato in Tripanosomatidas. Enzimas: 1Hexosinasa; 2 glucosa 6-fopsfato deshidrogenasa; 3 6-fosfogluconato lactonasa; 4 6-fosfogluconato deshidrogenasa; 7 transaldolasa; 8 transcetolasa ; 9 glucosa 6-fosfato isomerasa; 10 fosfofructiquinasa; 11 triosafosfato isomerasa.
14
Figura.6 Estructura básica de las dihidropiridinas 16
Figura 7. Estructura química de la nicardipina 16
Figura 8. Esquema de la preparación de la suspensión concentrada de parásitos
22
Figura 9. Esquema del método de cuenta viable para la suspensión concentrada de parásitos
23
Figura 10 Esquema del método para la determinación del consumo de oxígeno para la estandarización del método de Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. mex.
24
Figura 11 Esquema del método para la determinación del consumo de oxígeno en presencia del fármaco para Tripanosoma cruzi y Leismania mex. mex.
26
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Título de tabla Pág.
Tabla1. Morfología de T. Cruzi 4
Tabla 2. Características de las formas Clínicas de la enfermedad de Chagas
8
Tabla 3. Morfología de Leishmania mex. mex. 10
Tabla 4. Síntomas de las diversas formas de leismaniasis 11
Tabla 5.Compuestos utilizados para el presente trabajo 17
Tabla 6. Volúmenes requeridos de reactivos para realizar la curva tipo de proteínas por el método de Bradford.
28
Tabla 7. Efecto inhibitorio de Nicardipina sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi
25
Tabla 8. Efecto inhibitorio de DHP-1 sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi
37
Tabla 9. Efecto inhibitorio de DHP-3 sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi
39
Tabla 10. Comparación de la CI50 de los compuestos probados en Tripanosoma cruzi cepa CL Brener en el consumo de oxígeno
41
Tabla 11. Efecto inhibitorio de DHP-3 sobre el consumo de O2 de la cepa Leishmania mex. mex.
43
Tabla 12 Efecto de Nicardipina y sus análogos Comparación de la CI50 de DHP-3 obtenida deTripanosoma cruzi cepa CL Brener y Leishmania mex. mex. en el consumo de oxígeno
45
vii
ÍNDICE DE GRÁFICAS
Título de tabla Pág.
Gráfica 1 Cinética de consumo de Oxígeno de Leishmania mex. mex.
30
Gráfica 2 Cinética de consumo de Oxígeno de la cepa Bener de Tripanosoma cruzi.
31
Gráfica 3 Curva estándar de proteínas 32
Gráfica 4 Velocidad de consumo de O2 de Leishmania mex .mex. (usando 4*108 células) en ausencia y presencia del vehículo.
33
Gráfica 5 Velocidad de consumo de O2 de la Cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi. (usando 1*108 células) en ausencia y presencia del vehículo
34
Gráfica 6 Efecto de Nicardipina sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T. cruzi a Diferentes concentraciones
36
Gráfica 7 Efecto inhibitorio del fármaco Nicardipina en el consumo de O2 de la cepa Brener de Tripanosoma cruzi .
36
Gráfica 8 Efecto de Nicardipina sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T. cruzi a Diferentes concentraciones
38
Gráfica 9 Efecto inhibitorio de DHP-1 en el consumo de O2 de la cepa Brener de Tripanosoma cruzi
38
Gráfica 10 Efecto de DHP-3 sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T. cruzi a Diferentes concentraciones.
40
Gráfica 11 Efecto inhibitorio de DHP-1 en el consumo de O2
de la cepa Brener de Tripanosoma cruzi 40
Gráfica 12 Efecto de DHP-3 sobre el Consumo de O2 de la cepa de Leishmania mex. mex. a Diferentes concentraciones.
42
Gráfica 13 Efecto de DHP-3 sobre el Consumo de O2 de la cepa Leishmania mex. mex. a Diferentes concentraciones.
44
Gráfica 14 Efecto inhibitorio de DHP-3 en el consumo de O2 de la cepa Leishmania mex. mex
44
viii
ESTUDIO DEL CONSUMO DE OXÍGENO EN PROTOZOARIOS BAJO LA PRESENCIA DE ANÁLOGOS DE NICARDIPINA Silvia Méndez Carcamo, M. en C Juana Martha Noyola Díaz* , Dr. José Luis Martínez *Datos del director de proyecto teléfono 50 61 38 00 ext. 5440
Palabra clave: Consumo de oxígeno, Tripanosoma ,Leishmania, análogos de Nicardipina
Introducción. Los protozoarios adquieren una gran importancia en la naturaleza debido a que son causantes de algunas enfermedades importantes en los seres humanos. Algunas de enfermedades que causan estos son la tripanosomiasis americana(Producidad por T.cruzi) y diferentes tipos de leismaniasis (Producidas por especies de Leishmania).Ambas representan un grave problema para México ya que no se cuentan con datos actuales de la cantidad de personas infectadas por estas, debido a la asintomatología de las mismas. Para el tratamiento de tripanosomiasis americana, se han aceptado solo 2 fármacos los cuales son Nifurtimox y Bencidazol, que a largo plazo producen efectos colaterales. (2)Los fármacos utilizados para el tratamiento de leishmaniasis son antimoniales pentavalentes(Pentostam), la anfotericina B y pentamidina; este tipo de tratamientos son muy costosos y poseen una alta toxicidad (1) Estudios realizados demostraron que una serie de derivados de 1,4-dihidropiridinas tuvieron un efecto inhibitorio sobre el crecimiento y el consumo de oxígeno de T. cruzi siendo la nicardipina a más potente(3). Metodología. Se utilizaron para el experimento dos cepas: Cepa Brener de Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. mex. Se utilizaron medios de cultivo BHI y RPMI respectivamente para su crecimiento. Se realizó una concentración celular, y se realizó el conteo de estas en la cámara de Newbawer . Se midió el consumo de oxígeno para estandarizar el método, con disolvente (DMSO) y con los análogos de Nicardipina con un electrodo de Clark del la marsa YSI. Para cada compuesto se calculó la CI50 en ambas cepas. Y se determino la cantidad de proteína correspondiente al número celular por medio del método de Bradford Resultados y Discusión. Para la estandarización del método se encontró que para Tripanosoma cruzi se deben de utilizar 1*108 células equivalente en promedio a 5.2mg de proteína y para Leishmania mex. mex 4*108 células equivalente en promedio a 5.88mg de proteína. Se probó el consumo de oxígeno con DMSO a 2% para T. cruzi y 0.4% para Leishmania mex. mex. y no observó efecto sobre la velocidad de consumo de oxígeno en ambas cepas. El compuesto que presentó un mayor efecto inhibitorio de la velocidad de consumo de oxígeno para T. Cruzi fue la DHP-3, teniendo la CI50 más baja de los
tres compuestos probados .Los datos de CI50 para DHP-1, DHP-3 y Nicardipina se muestran en el Cuadro 1. Para Leishmania mex. mex., el efecto sobre la velocidad de consumo de oxígeno fue probada solamente en presencia de DHP-3 y Nicardipina. Para esta última no se pudo calcular la CI50 ya que las concentraciones probadas (30•g/mL y 40•g/mL) proporcionaron hasta un 7.12% de inhibición de consumo de oxígeno. Para la DHP-3 se obtuvo una CI50 de 20.38•g/mL(Ver Cuadro 1). Cuadro 1. CI 50 de de consumo ed O2 de T. cruzi y Leishmania mex. mex. en presencia de análogos de Nicardipina
CI50 (•g /mL) Compuesto Leishmania mex. mex Tripanosoma cruzi
DHP-1 --- 39.02 DHP-3 20.38 4.63 Nicardipina --- 81.83 Al hacer una comparación de las CI50 de la DHP-3 para ambas cepas, se observa que T. cruzi es mucho más sensible a ese compuesto que Leishmania mex. mex. El comportamiento observado de los tres compuestos probados en T. cruzi nos muestra que esta es mucho más sensible a DHP-3 que a DHP-1 y a Nicardipina. Para Leishmania mex. mex. presenta el mismo patron, ya que es más sensible a DHP-3 que a Nicardipina. Conclusiones y perspectivas. Con los resultados obtenidos podemos concluir que los análogos y la Nicardipina producen un efecto inhibitorio sobre el consumo de oxígeno en T. cruzi cepa CL Brener y Leishmania mex. mex. Como perspectiva de este trabajo es determinar el mecanismo de acción de estos compuestos, ya que con el efecto encontrado(efecto inhibitorio del consumo de oxígeno) se puede particularizar la región en donde el compuesto actúa, la cual se piensa que es en la mitocondria y en particular en el complejo iV que es donde esta el oxígeno como aceptor final de electrones. Agradecimientos. Agradezco a la M. en C Juana Martha Noyola Díaz, al Dr. Jose Luis Martínz y al Biólogo Mario Gil Referencias
1. Melby PC. (2002) Vaccination against cutaneous leishmaniasis: current status. Am J Clin Dermatol;3 (8): 557-70.
2. Moya, P.R. Paolasso R.d. Blanco, S. Lapasset m., Sanmartino, cC.y Baso B. 1985. Tratamiento de la enfermedad deChagascon nifurtimox durantelos primeros mese de vida. Medicina 45 PP: 553-558
3. Nuñez-Vergara, L.J, Squella J.A. RepettoY., Aldunate, J., Leitier, M.E., 1997,. Nitro aryl1,4 dihidropiridines derivates: effects on Tripanosome cruzi Comp. Biochem. Physiol. 118 C(1), 105-111
x
Compuesto X DHP-1 H DHP-3 Cl
Nicardipona NO2 Figura 1. Compuestos utilizados en el experimento de consumo
de oxígeno.
2
1. MARCO TEORICO
Los protozoarios [del Griego protos: primero y zoon: animal] son seres
unicelulares, eucariotas, heterótrofos y generalmente microscópicos, que
poseen estructura celular típica y aunque son organismos unicelulares deben
reconocerse como “organismos completos” ya que en sus estructuras llevan a
cabo todas las funciones propias de animales multicelulares, a estas
estructuras se les da el nombre de “orgánulos” y son especializadas para
realizar las funciones que sean necesarias para que el protozoario pueda
sobrevivir. Son habitualmente móviles y pueden tener vida libre o parásita
(Prescott, 1999).
1.1 Distribución
Los protozoarios se desarrollan en un ambiente húmedo: lagunas, charcos,
agua de ríos, suelo húmedo. Ya que estos son muy propensos a la desecación.
Y por lo tanto, pueden vivir en cualquier de tipo de ambiente húmedo como
agua dulce o salada. También hay protozoos terrestres que viven en materia
orgánica en descomposición, en tierra e incluso en la arena de playas y en la
sangre (Protozoos parásitos) y en el líquido tisular en plantas(Prescott, 1999).
1.2 Morfología
Como los protozoarios son eucariotes, en muchos aspectos su morfología y
fisiología son iguales a las de los animales multicelulares. Pero como todas las
funciones deben de realizarse en el protozoario individual, algunas
características morfológicas y fisiológicas son peculiares de estos
microorganismos. Algunas estructuras que poseen los protozoarios se
mencionan a continuación:
2
Película: Protección contra sustancias químicas, daño mecánico y pérdida de agua
Citoplasma: Confiere al cuerpo celular cierta rigidez . Mayor parte de los orgánulos.
Mitocondrias: Ciclo de los ácidos tricarboxílicos y la generación de ATP
mediante el sistema de transporte de electrones y fosforilación oxídativa. Puede
haber 1 o hasta 1000 en un célula. En células como tripanosomas contiene una
estructura especial llamada Cinetoplasto, el cual contiene el ADN que modifica
el RNA y las proteínas mitocondriales. (Fig. 1 c)
Aparato de Golgi: Regula la comunicaciones con el ambiente. Participa en la
formación de membranas: plasmática, del retículo, nuclear, etc,
Vacuolas: Las vacuolas contráctiles funcionan como orgánulos
osmorreguladores. Vacuolas fagocíticas producen la digestión. Las vacuolas
secretoras contienen enzimas específicas.
Figura 1. Algunas estructuras de organelos a) flagelos b) cilios que son organelos de locomoción. C)mitocondria de t. Cruzi (Prescott, 1999)
c)
3
Núcleo: Actividades tróficas y procesos de regeneración. Reproducción
Orgánulos locomotores: Estos pueden ser de tres tipos Pseudópodos,
Flagelos (Figura 1 a) y Cilios (Figura 1 b).
1.3 Clasificación de los Protozoarios
La clasificación de los protozoos es muy diversa, debido a que es un grupo muy
heterogéneo, antiguamente existía una clasificación de los protozoarios en la
cual se agrupaban por el tipo de organelo locomotor que estos
poseían(Prescott, 1999), los esporozoos tenen organelo locomotor(Figura 2d),
pero formaba esporas muy resistentes, amebas si formaba seudópodos(Figura
2b), ciliados si posen cilios(Figura 2 c) y flagelados si contaban con
flagelos(Figura 2a).
1.4 Importancia
Los protozoos desempeñan papeles muy importantes en la naturaleza (Prescott,
1999), por ejemplo:
1. Forma parte de cadenas tróficas
2. Forma parte de redes tróficas
3. Son utilizados en estudios bioquímicos y de biología molecular
4. Son causantes de algunas de las enfermedades más importantes en los
seres humanos y animales.
4
a)
b)
c)
d)
Figura 2.- Esquema de diferentes protozoarios. A) estructura de un flagelado tripanosoma cruzi b) estructura protista ameboide. Ameba proteus c) estructura de un ciliado. Paramecium caudatum d) figura de un esporozoíto apicomplexa (Prescott, 1999)
1.5 Protozoos que provocan enfermedades importantes en el ser humano.
Las enfermedades parasitarias son una importante fuente de padecimientos en
países de menor desarrollo. Los tripanosomas y las leishmanias son
protozoarios parásitos estrechamente relacionados entre sí, pues pertenecen al
orden kinetoplastida, suborden Trypano-somatida.
5
Estos parásitos son causantes de graves enfermedades del hombre, entre las
cuales se encuentran la tripanomiasisi americana o la enfermedad de Chagas
producida por T. cruzi y la leishmaniasis cutánea mucocutánea y visceral,
debidas a diversas especies de Leishmania las cuales tienen una gran
importancia en Latinoamérica.
De acuerdo con lo anterior, para el presente trabajo se desprende el estudio de
dos parásitos que provocan dos de las enfermedades más graves en latino
América. Estos dos protozoarios, son Tripanosoma cruzi y Leishmania mex.
mex., se encuentran clasificados en el mismo phylm y subphylum,
convirtiéndolas en dos especies de protozoos emparentados.
1.5.1 Tripanosoma cruzi
Tripanosoma cruzi presenta 4 fases morfológicamente diferentes, con base a la
forma general de la célula y a la emergencia del flagelo (Hoare, 1966). Estas
morfologías se encuentran en la Tabla 1.
1.5.1.1 La Enfermedad del Chagas
El nombre de esta se deriva del brasileño el Dr. Carlos Chagas quien la
descubrió y la describió por primera vez en 1909, demostrando que el agente
etiológico era el Tripanosoma cruzi .
Esta enfermedad ocupa el quinto lugar de las diez enfermedades provocadas
por parásitos en el mundo. Se calcula que aproximadamente 20 millones de
personas están infectadas y otros 90 millones están en riesgo de infectarse
(OMS, 1994). La enfermedad de Chagas, según el Banco Mundial, es
económicamente hablando más importante que todas las enfermedades
parasitarias juntas, incluyendo el paludismo, leishmaniasis y oncocercosis.
6
Tabla1. Morfología de T. cruzi Forma
morfológica Características Figura
Amastigote
Es redondeado u ovalado, mide entre 2 y 7 µm y en
esta fase se multiplica intracelularmente en las
células del mamífero huésped.
Esferomastigote
Es fusiforme, mide entre 15 y 20 µm y este es la fase
multiplicativa que se encuentra en el tubo
digestivo de los triatominos.
Epimastigote
Formas redondeadas caracterizadas por un flagelo
que empieza a formarse, localizado en el estómago del insecto Vector . Tienen poca importancia en el ciclo de la
vida.
Tripomastigote
Es la fase infecciosa no multiplicativa. Tiene forma de C, U o S. Tienen un tamaño
total que varía entre 15 y 20µm. Estos pueden infectar
otras células, no son capaces de multiplicarse en
sangre.
7
En México existen zonas endémica para este padecimiento como son: Oaxaca,
Nayarit y Chiapas (Velasco, 1991). Esta enfermedad es un problema de salud
pública no reconocido por las autoridades mexicanas, y en términos humanos y
económicos no es posible definir alcances, puesto que no se cuenta con un
seguimiento de un programa epidemiológico.
Se estima una incidencia de 44 000 nuevos casos con una prevalencia de 1
610 000 personas infectadas(OPS, 1996). Sin embargo, no se ha diagnosticado
la magnitud del problema con mayor certeza y por lo tanto no se puede planear
estrategias para evitar en la transmisión. (Castrejon, 1992).
1.5.1.2 Formas de Transmisión
La enfermedad del Chagas es transmitida a los humanos por la picadura de un
insecto hematófago de la familia Triptanominae (chinche), la cual representa
más de la 80% de la incidencia total. Existen otras formas de transmisión de la
enfermedad (López, 1997) como son la transfusión sanguínea, transmisión
congénita, lactancia, etc.
1.5.1.3 Formas clínicas de la enfermedad
En la infección con Tripanosoma cruzi presenta tres formas clínicas(Fase
aguda, fase latente o indeterminada y fase crónica) las cuales se detallan en la
Tabla 2 (Brener, 1973).
1.5.1.4 Tratamiento
Para el tratamiento de esta enfermedad, solo han sido aceptados, registrados y
comercializados por autoridades nacionales de la salud en países de América
8
Latina solo dos fármacos, los cuales son Nifurtimox (Fig.3 a) y Benzidazol (Fig.3
b).
El mecanismo de acción del Nifurtimox, (3-metil-N-[(5-nitro-2-
furanil)metilen]4tiomorfolin-4-amina 1,1 dióxido) actualmente ha sido retirado del
mercado) es generar productos de reducción de oxígeno como el peróxido de
hidrógeno (H2O2), radicales libres como (• OH) y (O2 •).
Esto ocurre a diferentes niveles de la célula como en fracciones mitocondriales
y microsomales del T. cruzi . Los productos de reducción parcial del oxígeno
son tóxicos tanto para el parásito como para el humano. Entre los efectos
colaterales del Nifurtimox (Souza, 1991)son anorexia, intolerancia digestiva,
insomnio, pérdida de peso,etc.
Tabla 2. Características de las formas Clínicas de la enfermedad del Chagas
Nombre de la fase Características
Fase aguda
Puede presentarse sin síntomas o con síntomas muy
leves. Inflamación del parpado y de los ganglios
linfáticos, fiebre, mal estar, etc. La mortalidad en esta
fase es entre el 10% y 15% en ciertas regiones.
Fase latente o
indeterminada
Esta fase progresa durante periodos largos e incluso
durante toda la vida del enfermo. Se presenta la
disminución de neuronas del plexo parasitario
Fase crónica
Se presenta entre un 30 y 40 % de los casos y después
de 10 o 20 años de la infección. Los síntomas se hacen
presentes, aparecen como enfermedad cardiaca y
trastornos digestivos. Pacientes que presenten infección
parasitaria del colon pueden experimentar dolor
abdominal y estreñimiento. La enfermedad cardiaca es,
por lo general, la causa de la muerte del paciente.
9
Este fármaco es mejor tolerado por niños de corta edad que por personas
adolescentes y adultas.
El mecanismo de acción de Benznidazol (N-(benzil-2-nitroimidazol-1-il)
acetamida) no se conoce a la perfección, pero muy probablemente los
metabolitos reducidos de este compuesto estén actuando por unión covalente
con las macromoléculas del parásito (Moya, 1985)De esta forma puede inhibir la
síntesis de proteínas y de RNA del parásito (Clesen, 1988). Entre los efectos
colaterales de la administración de este fármaco son (Moya, 1985) anorexia,
artralgias, cefalea, neuropatías
Ambos fármacos provocan mutagenicidad cuando se utiliza por un tiempo
prolongado. Esto tiene como consecuencia que los pacientes(40% a 70%)
abandonen el tratamiento, limitando la dosis y el tiempo del tratamiento.
1.5.2 Leishmania mex. mex.
Leishmania mex. mex. es un protozoario que presenta 2 fases
morfológicamente diferentes (Freeman, 1989). Sus características se muestran
en la Tabla 3
a.- Nifurtimox
b.- Benznidazol
Figura 3. Estructura química de los fármacos utilizados contra el tratamiento del chagas
10
Tabla 3. Morfología de Leishmania mex. mex.
Forma morfológica Características
Amastigote
El amastigote tiene cuerpo ovoide que mide entre 2µm
a 5µm de longitud y no presenta un flagelo. Este
es localizado dentro de la célula ( intracelular)
Promastigote
El promastigote tienen una longitud de su cuerpo es de
20µm y posee un flagelo que tiene la misma longitud del
cuerpo. Este, a diferencia del amastigote, es localizado
fuera de la célula, siendo la forma morfológica utilizada
en cultivo in vitro.
1.5.2.1 Leishmaniasis
Es un conmjunto de enfermedades causadas por diferentes parásitos del
género Leishmania, la cual en América es transmitida por insectos dípteros del
genero Lutzomyia, y sus reservorios son algunos animales mamíferos
domésticos y silvestres. Afecta a 12 millones de personas en todo el mundo,
cada año se reporta 600.000 mil casos nuevos y otras 350 millones de personas
están en riesgo de infección (OMS 2004).
1.5.2.2 Formas de transmisión o ciclo de vida
La leishmaniasis es trasmitida por un insecto, el flebótomo. La hembra de éste
pica al animal o persona contaminada con leishmania, ingiriéndola con la sangre
que absorbe. Una vez en el interior del parásito, la leishmania continúa su ciclo
de vida para que este vuelva a picar a otra persona, y así contaminarla e iniciar
el proceso infeccioso.
11
1.5.2.3 Síntomas.
Los síntomas (Tabla 5) que pueden aparecerse son muy diversos y
dependiendo de la cepa que haya afectado al animal, de la respuesta de sus
defensas, del estado anímico del animal, etc.
1.5.2.4 Tratamiento.
En la actualidad, la quimioterapia utilizada para tratar esta enfermedad es
mediante el uso de antimoniales pentavalentes (glucantime), que actúa
interviniendo en el metabolismo enzimático de las Leishmania especialmente
inhibiendo el metabolismo de la glucosa, pentostam, que actúa inhibiendo los
procesos bioenergéticos del parásito (glucolisis y oxidación de ácidos grasos ),
(Hundam, 2001), la anfotericina B y pentamidina, de la cual se desconoce con
exactitud la forma en como actúa este fármaco, pero se cree que interacciona
con el ADN o con nucleótidos. Este tipo de tratamientos son muy costosos y
poseen una alta toxicidad. (Melby, 2002).
Tabla 4. Síntomas de las diversas formas de leishmaniasis
Forma de la enfermedad Características
Cutánea
Forma seca: en el dorso y lomos de los
perros hay nódulos rojizos. Forma
húmeda: nódulos rojizos ulcerados.
Monocutánea
Hay nódulos en vías olfativas, esto
deriva en hemorragias nasales como
consecuencia de un estornudo.
Forma visceral:
Dermatitis alopécica, inicialmente en
torno a los ojos y más tarde, en dorso
y lomos.
Crecimiento anormal de las uñas.
12
1.6 Metabolismo de Cinetoplastida
Los microorganismos que se encuentran en este orden, son caracterizados por
la presencia de varias rutas metabólicas peculiares, se ha encontrado que
Tripanosoma cruzi no lleva acabo la síntesis y almacenamiento de
polisacaridos, por lo que continuamente deben de ser incorporados para su uso.
Las proteínas son incorporadas por medio de pinocitosis. (Cazzulo, 1984).
Figura 4. Comportamiento metabólico de algunas especies de cinetoplastidas
13
También se sabe que las 7 primeras enzimas de Glicólisis (Hexocinasa, glucosa
6-fosfato isomerasa, fosfofructocinasa, aldolasa, triosafosfato isomerasa,
gliceraldihido-3-fosfatodeshidrogenasa y fosfoglicertato cinasa) se encuentran
contenidas en un organelo especial llamado Glicosoma (Figura 4), este es un
organelo formado por una sola membrana y tiene como característica que es
permeable a dihidroxiacetona y glicerol-3-fosfato(Sommer & Wnag 1994) y las
demás enzimas (enolasa y piruvato cinasa) del ciclo se encuentran en el
citoplasma.
La glucosa es la fuente de energía más importante en el parásito, ya que esta
tiene un rol muy importante en el aporte energético para este( Opperdoes,1987)
y a pesar de que posee todas las enzimas del ciclo de Krebs este es utilizado
parcialmente y en sentido inverso. (Duschak & Cazzulo, 1991). La glucosa solo
es catabolizada parcialmente a CO2 .
La generación de lactato ocurre a través de la actividad de la deshidrogenasa
láctica mediada por una enzima propia de Tripanosoma cruzi , la α-hidroxiácido
deshidrogenasa (Montamat, 1982), involucrando la reoxidación de NADH en
condiciones aerobias, y con las mismas condiciones esta reoxidación ocurre en
la cadena respiratoria y producción de succinato. Se sabe que la α-hidroxiácido
deshidrogenasa utiliza como sustrato α-cetoácidos y se sugiere que esta
enzima está involucrada en el metabolismo energético del Tripanosoma cruzi
(Blanco 1980).
Acerca de Leishmania, se tiene poco conocimiento de su metabolismo
energético tanto de la fase amastigote como de la fase de promastigote. Lo
que si es seguro que se tiene mayor conocimiento de esta última fase en
algunas especies de Leishmania. Lo que es irrefutable es la presencia de la
Glicólisis en el parásito, sin embargo se ha encontrado que para otra cepa de
Leishmania (Leishmania donovani) en su fase promastigote la L-prolina
(Krassner,1972) puede ser un mejor sustrato para la generación de energía ya
que la glicólisis resulta ser de menor importancia.
14
La relativa importancia de aminoácidos y los carbohidratos como sustratos para
la generación de energía, cuando ambos están disponibles, no está claro, ya
que puede variar con la fase de crecimiento del cultivo y con la especie de
Leishmania estudiada. Las reservas de energía no han sido detectada en
alguna especie de Leishmania u otra clase de Tripanosomatida.
El sistema de transporte para el consumo de hexosas (Schaefer, 1977) y varios
aminoácidos han sido analizados y parcialmente caracterízado . Las enzimas de
la glicólisis y las de al ruta de las pentosas fosfato (Figura 5) han sido
reportadas en varias especies de leishmania.
Figura 5 Posible vía de las pentosas fosfato in Tripanosomatidas. Enzimas: 1Hexosinasa; 2 glucosa 6-fopsfato
deshidrogenasa; 3 6-fosfogluconato lactonasa; 4 6-fosfogluconato deshidrogenasa; 7 transaldolasa; 8
transcetolasa ; 9 glucosa 6-fosfato isomerasa; 10 fosfofructiquinasa; 11 triosafosfato isomerasa.
15
También se sabe que las 7 primeras enzimas de Glicólisis (Hexocinasa, glucosa
6-fosfato isomerasa, fosfofructocinasa, aldolasa, triosafosfato isomerasa,
gliceraldihido-3-fosfatodeshidrogenasa y fosfoglicertato cinasa) se encuentran
contenidas en un organelo especial llamado Glicosoma (Figura 4), este es un
organelo formado por una sola membrana y tiene como característica que es
permeable a dihidroxiacetona y glicerol-3-fosfato(Sommer & Wnag 1994) y las
demás enzimas (enolasa y piruvato cinasa) del ciclo se encuentran en el
citoplasma.
1.7Compuestos del tipo 1,4-Dihidropiridinas
Los compuestos del tipo 1,4-dihidropiridinas (DHP) (Figura 6) son conocidas
desde 1882 cuando Hantsch las utilizó como intermediarios de la síntesis de
piridinas.
A pesar de su accesibilidad química, (y de al participación de compuestos del
tipo1,3-dihidropiridinas como coenzimas de gran cantidad de deshidrogenasas)
fueron de poco interés hasta los años 60’s cuando se descubrió propiedad
vasodilatadora de alguna de ellas. Y desde entonces, se han sintetizado un gran
número de derivados de las 1,4-dihidropiridinas y al mismo tiempo su
mecanismo de acción.
Las DHP han sido objeto de estudios como agentes farmacológicos potenciales
para otro tipo de padecimientos, y son utilizados como antimigrañosos (Clesen,
1988), antiepilépticos (De Sarro, 1988), protección de daño celular producido
por radicales libres (Jacinto, 1992), antidepresivos (Landon, 1988), agentes
anticonceptivos (Czyrak, 1997), entre otros. Su mecanismo de acción es el
bloqueo de los canales de Ca2+ en músculo liso. En la actualidad se están
probando como posibles fármacos tripanocidas.
16
Estudios realizados por Núñez Vergara , demostraron que una serie de
derivados de 1,4-dihidropiridinas tuvieron un efecto inhibitorio sobre el
crecimiento y el consumo de oxígeno de T. cruzi siendo la nicardipina (Fig.7) la
más potente.
Figura 7. Estructura química de la nicardipina
1.7.1 Análogos de Nicardipina
A partir del descubrimiento de la nicardipina como un agente tripanocida, se han
sintetizado una serie de análogos, de los cuales se ha probado su capacidad
tripanocida. Para el presente trabajo, se usan dos análogos estructurales que
fueron sintetizados en el laboratorio 36 de la sección externa de farmacología
del CINVESTAV para realizar los experimentos. Los cuales se muestran en la
Tabla 5.
Figura.6 Estructura básica de las dihidropiridinas
17
Tabla 5.Compuestos utilizados para el presente trabajo
x
Compuesto X Nombre químico
1
H 2-(N-bencil-N-metilamino) etil metil 2,6-dimetil-4(fenil)-
1,4dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
2
Cl 2-(N-bencil-N-metilamino) etil metil 2,6-dimetil-4(m
clorofenil)-1,4dihidropiridina-3,5-dicarboxilato.
18
2. JUSTIFICACIÓN DEL PROYECTO
La parasitosis en México por Tripanosoma cruzi y Leishmania
mex. mex. es un problema de salud que aún no ha sido
resuelto.
El tratamiento médico de estas enfermedades es actualmente
deficiente porque no hay fármacos que tengan efectos
satisfactorios, debido a que los fármacos empleados traen
serios efectos secundarios.
Además el conocer el mecanismo de acción de estos fármaco
permitirá explicar a nivel bioquímico la actividad parasiticida.
19
3 .OBJETIVOS
3.1 GENERALES
Evaluar el efecto de algunas dihidropiridinas sobre el consumo de
oxígeno de algunos protozoarios.
3.2 PARTICULARES
Estandarizar el método para medir el consumo de oxígeno de
Tripanosoma cruzi (Cepa Brener) y en Leishmania mex. mex.
Determinar el efecto de algúnos análogos de nicardipina sobre el
consumo de Oxígeno en Tripanosoma cruzi (Cepa Brener) y en Leishmania
mex. mex.
20
4. MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Materiales
4.1.1 Material biológico
- Cepa CL Brener Tripanosoma cruzi (Donada por el laboratorio de
biomedicina molecular del Cinvestav)
- Leishmania mx. mex. (Donada por el Dr. Benjamín Nogueda de la ENCB)
4.2 Medios de cultivos
4.2.1 Medio RPMI
Vaciar un sobre de medio RPMI en un litro de agua desionizada, adicional 10
mL de un regulador de pH (Hepes) y ajustar el pH a 7.2, esterilizar en auto
clave, dejar enfriar y guardar en frascos de vidrio estériles.
4.2.2 Medio BHI
Pesar 32 g. de medio de infusión cerebro y corazón en 1 L de agua desionizada
y esterilizar en autoclave, dejar enfriar y guardar en frascos de vidrio estériles
4.2.3 Medio de cultivo para consumo de Oxígeno.
Tomó 7 mL de medio de cultivo RPMI (Leishmania mex. mex.)o BHI
(Tripanosoma cruzi), 0.5 de suero fetal bovino y 2.5 mL de solución de Lock.
4.3 Soluciones
4.3.1 Solución de Lock
Pesar 2 g de glucosa y se disuelver en 50 mL de agua bidestilada. Pesar 0.4 g
de Cloruro de potasio (KCl), 4 g de Cloruro de sodio (NaCl) y 5 g de Na2HPO4 y
disolver en 50 mL de agua bidestilada. Esteriliza en autoclave, se dejar enfriar
las dos soluciones y adicionar , de manera estéril, la solución de glucosa a la
solución de sales .
21
4.3.2 Reactivos para determinación de proteínas (método de Bradford)
4.3.2.1 Reactivo de Bradfor
Pesar 200mg de azul de Coomasie G-250 y mezclar con 100mL de alcohol
etílico en un matraz aforado a 2L. Agregar 200ml de ácido fosfórico al 85% y
llevar al aforo.
4.3.2.2 Solución de albúmina
Preparar 5 ml de solución de albúmina con una concentración de 1mg /mL
4.3.3 Solución de Nicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y DHP-3)
Preparar soluciones stock de concentraciones 10mg /mL y 5mg /mL de los
compuestos, utilizando DMSO como vehículo(disolvente) .
4.4 Métodos
4.4.1 Crecimiento de protozoarios para el consumo de oxígeno
4.4.1.1 Crecimiento de Tripanosoma cruzi cepa Brener
¬ Colocar en una botella de cultivo 9 mL de medio BHI, 1 mL de
suero fetal bovino y 4µL emina
¬ Agregar 100 µL de un cultivo previo de Tripanosoma cruzi
(cepa Brener)
¬ Dejar incubar por 8 días
4.4.1.2 Crecimiento de microorganismo Leishmania mex. mex.
¬ Colocar en una botella de cultivo 9mL de medio RPMI y 1mL de
suero fetal bovino
¬ Agregar 100 µL de una cultivo previo de Leishmania mex. mex.
¬ Dejar incubar por 5 días
22
4.4.2 Estandarización del método de consumo de oxígeno.
Para preparar una suspensión concentrada de parásitos de las cepas de
Leishmania mex. mex. y T. Cruzi) se realizó como se muestra en la Figura 8.
Cultivo celular Cultivo celular De 5 Días De 8 días (Leishmania mex. mex.) (T. cruzi cepa Brener)
Vaciar a tubos de centrífuga
De 15 mL
Centrifugar los tubos a 2600 RPM por
10 minutos (Hart. 1981)
Se juntan las suspensiones Decantar el sobrenadante concentradas en un solo tubo a un volumen final de 1.5 mL con medio para consumo de O2
Resuspender cada sedimento con 500 µL de medio para consumo de O2
Figura 8. Esquema de la preparación de la suspensión concentrada de parásitos
23
Se tienen los cultivo de cualquiera de las dos cepas y realizar una
concentración de parásitos por medio de centrifugación y decantar el
sobrenadante y los botones se resuspenden en medio de cultivo para obtener
un volumen final de aproximadamente de 1.5 mL.
Posteriormente se procedió a hacer un conteo de parásitos en la dilución por
medio cuenta viable y haciendo diluciones de la suspensión de parásitos
obtenida anteriormente como se muestra en la figura 10.
Tomar 10 µL de la suspensión de parásitos Y agregar 990 µL de Solución de Lock
Tomar 10 µL de esta suspensión y agregar 99 µL de solución de Lock
Tomar 25 µL y colocar la en la cámara
de Newbawer Se tiene una dilución final de1: 1000 (Factor de dilución 103)
Se contó el número de parásitos en 2 cuadrantes opuestos Se obtuvo el promedio de la cuenta
de los 2 cuadrantes y se multiplicó por el factor de dilución y el factor de dilución y de la cámara (104) para dar el no. De parásitos / mL
Figura 9. Esquema del método de cuenta viable para la suspensión concentrada de parásitos.
24
Calcular el volumen necesario para obtener una serie de número de parásitos
(Hart. D.T. 1981) para Leishmania mex. mex. 2, 3, 4 y 8*10 8parásitos y
Tripanosoma cruzi 5*10 7 , 5*10 7 y 1 *10 8 parásitos.
Ya teniendo el volumen necesario, realizar la determinación de consumo de
oxígeno para Leishmania mex. mex. y Tripanosoma cruzi cepa C.L. Brener por
medio de un electrodo de Clark de la marca Yellow Spring Instrumens, con el fin
de encontrar un 30% de consumo de oxígeno, esto se realizó como se muestra
en la Figura 10.
Calibración y ajuste a 100% de O2 el oxímetro con agua bidestilada y con medio de cultivo fresco Agua Medio de cultivo fresco Colocar el volumen de la suspensión de parásitos correspondiente al número
calculado.
Tomar las lecturas de la cantidad de O2 en celda registrada
en el oxímetro cada minuto (25 minuto)
Figura 10 esquema del método para la determinación del consumo de oxígeno para la estandarización del método de Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. Mex.
25
4.4.2.1 Procesamiento de datos
Los datos de consumo de oxígeno que se obtienen, se grafican en el programa
Microsoft Exel 2000 (% de oxígeno contra tiempo) y se selecciona un número de
parásitos para Tripanosoma cruzi cepa C.L Brener y Leishmania mex. mex. que
llegue a un 30 % de consumo de oxígeno en menos de 30 minutos.
4.4.3 Medición del consumo de O2 en presencia de Nicardipina, sus dos
análogos (DHP-1 y DHP3) y vehículo.
Ya encontrado el número de parásitos, se procede a medir el consumo de
Oxígeno en presencia del fármaco. Los procedimientos de concentración y
conteo se realizan de la misma manera que en el punto 4.4.2 en la
estandarización del método (Figura 8 y figura 9).
Para observar el efecto del consumo de oxígeno de lacepa CL Brener de
Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. mex. en presencia del fármaco, probar el
consumo de oxígeno en presencia del disolvente (DMSO) como un blanco a
concentraciones de 2 % Tripanosoma cruzi para y 0.4 %para Leishmania mex.
mex. del volumen final en la celda del oxímetro.
Para la determinación de consumo de oxígeno de Tripanosoma cruzi las
concentraciones de fármacos utilizadas fueron las siguientes:
♣ DHP-1 : 7.5µg / mL, 20µg / mL, 40µg / mL y 60µg / mL
♣ DHP-3 : 2.5µg / mL, 5µg / mL, 7.5µg / mL y 10µg / mL
♣ Nicardipina: 20µg / mL, 40µg / mL, 60µg / mL, 80µg / mL y 100µg / mL
Y para Leishmania mex. mex. las concentraciones fueron:
♣ DHP-3 : 15µg / mL, 20µg / mL, 30µg / mL y 40µg / mL
♣ Nicardipina: 30µg / mL y 40µg / mL
26
El procedimiento utilizado para hacer el experimento es semejante al utilizado
en la estandarización del método, pero la aplicación del fármaco o del disolvente
se realizó 5 minutos después de haber colocado iniciado las lecturas de
consumo de oxígeno como se muestra en la Figura 11.
Calibración y ajuste a 100% de O2 el oxímetro
Suspensión de parásitos Solución de fármacos (Número de estandarización) o disolvente
A los 5 minutos adicionar volumen de la solución de fármaco o vehículo
Tomar lecturas de % de O2 en la cámara cada minuto (Por 30 min para Tripanosoma cruzi y 20min para Leishmania mex. mex. )
Figura 11 Esquema del método para la determinación del consumo de oxígeno en presencia denicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y DHP-3)para Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. Mex.
27
4.4.3.1 Procesamiento de los datos
4.4.3.1.1 Determinación del porcentaje de inhibición de consumo de oxígeno
para la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi y Leishmania mex. mex.
A los datos de consumo de oxígeno obtenidos de cada experimento se tratan
como en la estandarización del método de consumo de oxígeno. Teniendo las
gráficas correspondientes de cada experimento, aplicar una regresión lineal,
obteniendo, de esta, el valor de la pendiente (Velocidad de consumo de
oxígeno). El porcentaje de consumo de oxígeno se determina comparando la
pendiente que se obtene de cada concentración de fármaco con respecto al
vehículo con la siguiente ecuación:
% CO = mCF *100
mV
Donde : %CO = Porcentaje de consumo de oxígeno
mCF = Pendiente obtenida a la concentración del fármaco
mV = Pendiente obtenida del vehículo
Los porcentajes de inhibición del consumo de oxígeno se obtienen por medio de
la siguiente ecuación:
100%-%CO =%IN
Donde :
%IN = Porcentaje de inhibición del consumo de oxígeno
4.4.3.1.2 Determinación de la concentración inhibitoria al 50% (CI 50) Los valores de % de inhibición se grafican con el programa estadístico Sigma
Plot versión 6.0, ajustando una regresión de tipo sigmoidal de 3 parámetros,
obteniendo la ecuación
f(x) = a .
1+e[-(x-x0)/b]
28
con la que se calcula la CI50 despejando X de la ecuación, obtieniendo
X= X0-b Ln f(x) -1 a
Donde X es la concentración inhibitoria de la velocidad de consumo de oxigeno
al 50%, a, b y X0 son constantes obtenidas de la ecuación(donde a es
adimensional y b y X0 tienen unidades de µg /mL).
4.4.4 Determinación de la cantidad de proteína que se encuentran en
Leishmania mex. mex. y Tripanosoma cruzi en el número de células encontrado
(Método de Bradford)
4.4.4.1 Curva estándar de proteínas
La técnica para realizar la curva tipo de proteínas es la siguiente:
Preparar 9 tubos de ensayo, a los cuales se les colocó los reactivos mostrados
en la Tabla 6.
Tabla 6. Volúmenes requeridos de reactivos para realizar la curva tipo de proteínas por el método de Bradford.
Tubo Solución stock de Proteínas (µL)
Agua bidestilada (µL)
Reactivo de Bradford
(mL)
Cantidad de albúmina en el tubo
(µg) Blanco 0 100 2.4 0
1 10 90 2.4 10 2 15 85 2.4 15 3 20 80 2.4 20 4 25 75 2.4 25 5 30 70 2.4 30 6 35 65 2.4 35 7 40 60 2.4 40 8 50 50 2.4 50
Homogenizar los tubos por medio de agitación con vortex y se leyó la
absorbancia en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm.
Realizar la curva de calibración de proteínas gráficando de cantidad de
absorbancia vs. Cantidadad de proteína.
29
4.4.4.2 Determinación de proteínas de Leishmania mex. mex. y
Tripanosoma cruzi
Después de haber hecho un experimento de consumo de oxígeno con los
parásitos, se procede a hacer una ruptura celular por medio de la técnica de
choque térmico. Se congelaba la muestra con nitrógeno líquido y se
descongelaba en un baño de agua a 37ºC por 5 ocaciones.
Ya teniendo homogenizada la muestra, se toman 20 µL y se adicionan 80 µL de
agua bidestilada y 2.4 mL de reactivo de Bradford.
Agitar con un vortex y se leer la absorbancia de las muestras en un
espectrofotómetro a una longitud de onda de 595nm.
Para determinar la cantidad de proteínas existente, el valor de la absorbancia es
interpolado en la gráfica obtenida de la curva tipo y obtenemos la cantidad de
proteína equivalente al número de parásitos.
30
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 Resultados de la estandarización del método de consumo de Oxígeno
La estandarización del método consistió en determinar el número de células que
se utilizarían para llevar a cabo los experimentos por medio de una cinética de
respiración celular. En la Gráficas 1 se muestra la cinética de respiración de
Leishmania mex. mex. en la cual se observa como va aumentando la velocidad
de consumo de oxígeno al ir aumentando el número de células. Para
Leishmania mex mex. se escogió un número de células de 4*108 células, ya que
es un número de células que alcanza muy bien el 30% de consumo en 20
minutos.
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25
Tiempo(min)
% d
e O
2
Gráfica 1 Cinética de consumo de Oxígeno de Leishmania mex. mex. Con diferente número de célula . 2*108 Células. 3*108 Células. 4*108 Células. 8*108 Células.
31
Para Tripanosoma cruzi cepa C.L Brener, la cinética de respiración se observa
en la Gráfica 2. Se observa que las pendientes no son muy pronunciadas como
ocurre con Leishamania mex. mex. en este experimento el que presenta mayor
pendiente es el número de parásitos igual a 1*108 , ya que esta cantidad de
células permite obtener casi un 30% de Oxígeno consumido en la cámara a los
minutos(aproximadamente), mientras que para un número de células de
2.5*107 y 5*107 el % de oxígeno que se encuentra en la cámara es mayor al 90
%
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25
Tiempo (min)
% d
e O
2
Gráfica 2 Cinética de consumo de Oxígeno de la cepa Bener de Tripanosoma cruzi. Con
diferente número de célula . 2.5*107 célula 5107 células, 1*108 células.
32
5.2 Cuantificación de la cantidad de proteína que se encuentran en Leishmania mex. mex. y Tripanosoma cruzi en el número de células encontrado (Método de Bradford) La curva estándar de proteínas obtenida de Albúmina se muestra en la Gráfica
3. La cual nos sirvió para calcular la cantidad de proteínas que se encuentran en
1*108 celulas de la Cepa C.L. Brener de Tripanosoma cruzi y 4*108 células de
Leishmania mex. mex.
y = 0.0167x + 0.0311R2 = 0.9904
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
0 10 20 30 40 50 60
Proteínas (mg)
Abs
orba
ncia
Gráfica 3 Curva estándar de proteínas
Obteniendo que para 1*108 células de la Cepa C.L. Brener de Tripanosoma
cruzi son equivalentes a 5.2 mg de proteínas y para 4*108 células de
Leishmania mex. mex. son equivalentes a 5.88 mg de proteínas
33
5.3 medición del consumo de O2 en presencia de Nicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y DHP-3) y el vehículo.
Para poder descartar que el vehículo (DMSO) no afecta al proceso de
respiración de la cepa C L Brener de Tripanosoma cruzi y Leishmania mex.
mex., se realizaron pruebas de consumo de oxígeno en presencia de este a
concentraciones de 2% y 0.4% respectivamente, concentraciones máximas
permitidas de DMSO que no afecta al crecimiento celular de estas dos
cepas(estas concentraciones de DMSO fueron probadas en experimentos de
viabilidad realizados en el laboratorio 36 de la sección externa de farmacología
del CINVESTAV).
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25
Tiempo(min)
% d
e O
2
Gráfica 4 Velocidad de consumo de O2 de Leishmania mex .mex. (usando 4*108 células)
en ausencia y presencia del vehículo. sin DMSO con DMSO
34
En la Gráfica 3 y 4 no se observó algún efecto del vehículo (DMSO) sobre el
consumo de oxígeno de Leishmania mex. mex. y la cepa Brener de
Tripanosoma cruzi (respectivamente) y, por lo tanto, se utilizaron estos
experimentos de medición de consumo de oxígeno como blancos de los
posteriores experimentos utilizando Nicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y
DHP-3).
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25Tiempo(min)
% D
e O
2
Gráfica 5 Velocidad de consumo de O2 de la Cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi.
(usando 1*108 células) en ausencia y presencia del vehículo . sin DMSO con DMSO
35
El efecto de la Nicardipina y sus dos análogos (DHP-1 y DHP-3) sobre el
consumo de oxígeno de cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi se muestra en
las Gráficas 5, 7 y 9. Se observa, en la Gráfica 5, que Nicardipina presenta un
efecto inhibitorio de la velocidad de consumo de oxígeno en esta cepa. La
concentración que presenta un mayor efecto inhibitorio es a 80µg/ mL
comparado con 60µg/ mL, 40µg/ mL y 20µg/ mL, pues estas últimas no tienen
un efecto muy grande sobre el consumo de oxígeno (Ver Tabla 7), debido a la
similitud que estas presentan con respecto al control(DMSO a 2%).
Se observa de manera más clara el efecto inhibitorio de Nicardipina sobre la
cepa Brener de Tripanosoma cruzi en la Gráfica 6, donde se observa que las
concentraciones de 20µg/ mL y 40 µg/ mL de Nicardipina presentan un
porcentaje de inhibición muy bajo y que la concentración de 80µg/ mL de no
alcanza un 50% de inhibición de la velocidad de consumo de oxígeno
La CI50 se calculó con la ecuación de la línea de tendencia obtenida para hacer
una predicción de esta concentración inhibitoria 50, la cual tuvo un valor de
81.83µg/ mL.
Tabla 7. Efecto inhibitorio de Nicardipina sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma
cruzi
Concentración
(µg /mL) % de inhibición de consumo de O2
80 44,153 ( +3,421)
60 9,568 ( + 0,624)
40 1,296 ( + 2,212)
20 4,805 ( + 7,661)
0 0
36
Gráfica 6 Efecto de Nicardipina sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T.
cruzi a Diferentes concentraciones. DMSO 2%; 20µg/ mL de Nicardipina; 40 µg/ mL de Nicardipina 60µg/ mL de Nicardipina; 80µg/ mL de Nicardipina.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Concentración de Nicardipina(µµg /mL)
% d
e in
hibi
ción
de
la v
eloc
idad
de
cons
umo
de O
2
Gráfica 7 Efecto inhibitorio del fármaco Nicardipina en el consumo de O2 de la cepa Brener de Tripanosoma cruzi .
f(x) = 418,7201 . 1+e[-(x-106.9602)/12,5753]
R2 = 0.985
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25
Tiempo(min)
% d
e O
2
37
El efecto que presenta el análogo de Nicardipina (DHP-1) se muestra en la
Gráfica 7. Se observa un efecto inhibitorio, también de este compuesto, sobre
la velocidad de consumo de oxígeno. Para este caso las concentraciones más
bajas, no presenta un gran efecto inhibitorio sobre la velocidad de consumo de
oxígeno (7.5 µg/ mL y 20 µg/ mL) con respecto al control (DMSO a 2%). Se
comienza a observar un efecto inhibitorio a concentraciones de 40 µg/ mL y
60µg/ mL(Ver tabla 8).
El efecto inhibitorio de consumo de oxígeno en presencia de DHP-1 se muestra
en la Gráfica 8, en la cual observamos que a mayor concentración del
compuesto el efecto inhibitorio de la velocidad de consumo de oxígeno se
incrementa. La CI50 de DHP-1 es de 39.02 µg/ mL .
Tabla 8. Efecto inhibitorio de DHP-1 sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi
Concentración (µg /mL)
% de inhibición de consumo de O2
60 74,970 ( + 2,378)
40 52,878 ( + 0,928)
20 7,666 ( + 3,876)
7,5 9,809 ( + 4,911)
0 0
38
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25Tiempo(min)
% D
e O
2
Gráfica 8 Efecto de Nicardipina sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T.
cruzi a Diferentes concentraciones.: DMSO 2%; 7.5 µg/ mL de DHP-1; 20 µg/
mL de DHP-1; 40 µg/ mL de DHP-1; 60 µg/ mL de DHP-1.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentración de DHP-1(µµg /mL)
% in
hibi
ción
de
la v
eloc
idad
dec
onsu
mo
de
O2
Gráfica 9 Efecto inhibitorio de DHP-1 en el consumo de O2 de lcepa Brener de Tripanosoma cruzi
f(x) = 78.173 . 1+e[-(x-34.5127)/7.8555]
R2 = 0.985
39
El análogo de Nicardipina (DHP-3) también presenta un efecto inhibitorio sobre
la velocidad de consumo de oxígeno. Este efecto se muestra en la Gráfica 9.
Donde podemos observar que las concentraciones bajas de este compuesto ya
presentan un efecto inhibitorio (Ver tabla 9)sobre el consumo de oxígeno
comparado con el control(DMSO a 2%)y las concentraciones de 7.5µg/ mL y
10µg/ mL presentan una inhibición casi total de la velocidad de consumo de
oxígeno.
En la Gráfica 10 se muestra como a mayor concentración el análogo de DHP-3,
el efecto inhibitorio de este se incrementa. Teniendo un CI50 de 4.63µg/mL.
Tabla 9. Efecto inhibitorio de DHP-3 sobre el consumo de O2 de la cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi
Concentración (µg /mL) % de inhibición de consumo de O2
10 83,422 (+ 9,314)
7.5 95,009 (+ 3,653)
5 48,411 (+ 9,973)
2,5 23,556 (+ 2,719)
0 0
40
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20 25
Tiempo(min)
% d
e O
2
Gráfica 10 Efecto de DHP-3 sobre el Consumo de O2 de la cepa CL Brener de T. cruzi a Diferentes concentraciones. DMSO 2%; 2.5µg/ mL de DHP-3; 5µg/ mL de DHP-
3; 7.5µg/ mL de DHP-3; 10µg/ mL de DHP-3.
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10 12
Concentración de DHP-3(µµg/ mL)
% d
e in
hibi
ción
de
la
velo
cida
d de
con
sum
o de
O2
Gráfica 11 Efecto inhibitorio de DHP-1 en el consumo de O2 de la cepa Brener de Tripanosoma cruzi
f(x) = 92.013 . 1+e[-(x-4.4418) /1.3285]
R2 = 0.955
41
Al comparar el valor de CI50 de cada uno de los compuestos probados, se
observa que la CI50 más baja fue la de el compuesto de DHP-3 (Ver Tabla
10)seguido de la DHP-1 y finalmente la Nicardipina. (CI50 de DHP-3 < CI50 de
DHP-1< CI50 de Nicardipina). Lo cual nos indica que para la cepa CL Brener de
Tripanosoma cruzi es mucho más sensible al compuesto DHP-3 que la misma
Nicardipina.
Tabla 10. Comparación de la CI50 de los compuestos probados en Tripanosoma cruzi cepa CL Brener en el consumo de
oxígeno
Compuesto CI50 µg/ mL
DHP-1 39.02
DHP-3 4.63
Nicardipina 81.83
42
El efecto de la Nicardipina y su análogo (DHP-3) sobre el consumo de oxígeno
de cepa de Leishmania mex. mex. se muestra en las Gráficas 11 y 12. El
efecto que tiene Nicardipina sobre Leishmania mex. mex. es un efecto
inhibitorio, este se muestra en la Gráfica 11. Para este compuesto, las
concentración que fueron probadas son de 30µg/ mL y 40µg/ mL, estas
concentraciones de compuesto tuvieron un efecto inhibitorio de 1.18% y 7.12%
respectivamente.
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
% d
e O
2
Gráfica 12 Efecto de Nicardipina sobre el Consumo de O2 de la cepa de Leishmania
mex. mex. a Diferentes concentraciones: DMSO 0.4%; 30µg/ mL de DHP-3; 40µg/ mL de DHP-3
43
Pero el factor limitante para seguir probando concentraciones más altas fue la
concentración final de DMSO. Debido a que al incrementar la concentración de
Nicardipina se incrementaba el la concentración final de DMSO.
Por cual no se logró realizar una gráfica de % de inhibición de la velocidad de
consumo de oxígeno contra concentración del Nicardipina.
Para el análogo de Nicardipina (DHP-3), también presenta un efecto inhibitorio
sobre la velocidad de consumo de oxígeno. Este efecto se muestra en la Gráfica
11, donde se observa que las concentraciones de 30µg/ mL y 40µg/ mL
presentan una inhibición del 100% de la velocidad de consumo de oxígeno con
respecto al control (DMSO al 2%) y las demás concentraciones presentan un
menor efecto inhibitorio (Ver Tabla 10).
En la Gráfica 13 se observa que se incrementa el efecto inhibitorio del consumo
de oxígeno conforme aumenta la concentración de DHP-3. Y para este
compuesto, en esta cepa, se obtuvo una CI50 de 20.38µg/mL.
Tabla 11 Efecto inhibitorio de DHP-3 sobre el consumo de
O2 de la cepa Leishmania mex. mex.
Concentración (µg /mL)
% de inhibición de consumo de O2
40 99.765 ( +1.693)
30 102.527 ( +1.303)
20 45.209 ( +14.11)
15 8.546 ( + 12.086)
0 0
44
50
60
70
80
90
100
0 5 10 15 20
Tiempo (min)
% d
e O
2
Gráfica 13 Efecto de DHP-3 sobre el Consumo de O2 de la cepa Leishmania mex. mex. a
Diferentes concentraciones. DMSO 0.4%; 15µg/ mL de DHP-3; 20µg/ mL de DHP-3; 30µg/ mL de DHP-3; 40µg/ mL de DHP-3
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50
Concentración de DHP-3 (µµg/mL)
% d
e in
hibi
ción
de
la v
eloc
idad
de
cons
umo
de O
2
Gráfica 14 Efecto inhibitorio de DHP-3 en el consumo de O2 de la cepa Leishmania mex. mex.
f(x) = 101.75 . 1+e[-(x-20.4634) /2.1965]
R2 = 0.999
45
A pesar de que no se logró calcular una CI50 para Nicardipina, se puede decir
que para la cepa de Leishmania mex. mex. resultó ser más sensible al
compuesto DHP-3 que a Nicardipina.
Al comparar las CI50 de Nicardipina y sus dos análogos obtenidas para
Leishmania mex. mex y la cepa Brener de Tripanosoma cruzi (Ver Tabla 11), se
observa que para el análogo de Nicardipina DHP-3 presenta una mayor
actividad inhibitoria sobre el consumo de oxígeno en la cepa Brener de
Tripanosoma cruzi que en Leishmania mex. mex (4.4 veces más activo). Para
Nicardipina, cual no se puede asegurar cual cepa es más sensible a este
compuesto. Ya que a concentraciones de 40µg/mL de Nicardipina, y la cepa
Brener de Tripanosoma cruzi presenta un 1.296% de inhibición y Leishmania
mex. mex presenta un 7.12% de inhibición. Pero para la cepa Brener de
Tripanosoma cruzi si se calculó la CI50 y para Leishmania mex. mex no se
logró calcular, por lo que no se puede dar un resultado certero. Para DHP-1 no
se realizaron experimentos en Leishamania mex. mex. Por lo que no se puede
realizar una comparación entre ambas cepas.
Tabla 12 Efecto de Nicardipina y sus análogos Comparación de la CI50
de DHP-3 obtenida deTripanosoma cruzi cepa CL Brener y
Leishmania mex. mex. en el consumo de oxígeno
CI50
Tripanosoma cruzi cepa Brener
Leishmania mex. mex. Compuesto
µg/ mL µM µg/ mL µM
DHP-1 39.02 113.10 DHP-3 4.63 9.86 20.38 43.40
Nicardipina 81.83 170.47 40* 83.33 *Nota: Concentración máxima probada en Leishmania mex. mex. que tubo el % de inhibición más alto. (7.12%)
Se puede pensar que el compuesto está actuando sobre una parte importante
de la cadena respiratoria en la mitocondria, específicamente en el transporte de
46
electrones(pues se sabe que la cadena respiratoria es encontrada en el orden
Cinetoplastida), en especial en el complejo IV donde se encuentra la citocromo
oxidasa, ya que se sabe que esta juega un papel importante en la respiración
celular junto con su capacidad de transferencia de electrones para formar agua,
pues el efecto que se tiene de los experimentos es un efecto inhibitorio en el
consumo de oxígeno, lo que impediría la formación del gradiente de protones y,
por consiguiente, no produce ATP.
Otra explicación es que el compuesto esté actuando en un proceso anterior a la
cadena respiratoria, recordando que para Tripanosoma cruzi la glucosa es la
fuente de energía predominante para el parásito, se podría pensar que el
compuesto estuviese actuando en alguna parte de la vía de la glicólisis. Para
Leishmania mex. mex. se sabe que también posee el ciclo de la glicólisis, pero
se sabe que en algunas especies de Leishmania en la fase promastigote la L-
Prolina es mejor sustrato que la glucosa y si pensamos que Leishmania mex.
mex. es una de esas especies, este podría estar actuando en esa parte del
proceso.
47
6. CONCLUSIONES En este trabajo podemos concluir que:
El método de estandarización utilizado sirvió para poder realizar las
pruebas de consumo de oxígeno de la Cepa CL Brener de Tripanosoma
cruzi () y en Leishmania mex. mex.
La Nicardipina y sus dos análogos (DHP-3 y DHP-3) mostraron un efecto
inhibitorio sobre la velocidad de consumo de oxígeno en la cepa CL
Brener de Tripanosoma cruzi .
Nicardipina y uno de sus análogos (DHP-3) mostraron un efecto inhibitorio
sobre la velocidad de consumo de oxígeno en Leishmania mex. mex.
El análogo de Nicardipina (DHP-3) resultó ser el compuesto más activo
con respecto al análogo de Nicardipina (DHP-1) y a Nicardipina en la cepa
CL Brener de Tripanosoma cruzi .
El análogo de Nicardipina (DHP-3) resultó ser más activo que Nicardipina
en Leishmania mex. mex.
La cepa CL Brener de Tripanosoma cruzi resultó ser más sensible al
análogo de Nicardipina (DHP-3) que Leishmania mex. mex.
48
7. RECOMENDACIONES PARA TRABAJO FUTURO
1.-Al seguir probando el efecto del consumo de oxígeno sobre Tripanosoma
cruzi cepa C.L. Brener y Leishmania mex. mex. se recomienda utilizar un
método turbidimétrico para determinar le número de células.
2.- Para poder tomar los volúmenes necesarios para las concentraciones más
altas en experimentos para Leishmania mex. mex. conseguir pipetas más
precisas que puedan medir menos de 1µL para poder preparar soluciones de
compuestos más concentradas y tomar menos volumen de estas para realizar
los experimentos con una concentración final de DMSO de 0.4%
3.- Para poder determinar el mecanismo de acción parasiticida de estos
compuestos se recomienda seguir los siguientes pasos:
a) Aislar mitocondria de Tripanosoma cruzi cepa C.L. Brener y
Leishmania mex. mex.
b) Probar directamente el consumo de oxígeno sobre el organelo
en presencia de la Nicardipina y sus análogos (DHP-1 y DHP-3)
49
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LA ENFERMEDAD DE CHAGAS. PUBLICACIÓN TÉCNICA NO.8. INSTITUTO
NACIONAL DE DIAGNÓSTICO Y REFERENCIA EPIDEMIOLÓGICA DE LA
SECRETARÍA DE SALUS. MÉXICO.
51
APÉNDICE
1,4-Dihidropiridinas ABREVIATURAS PESO
MOLECULAR
DHP-1 435 g/ mol
Cl DHP-3 469.5 g /mol Ç 480g /mol
