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Junio 2017

REPORTE DE PROYECTO

Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV): Implementación y puesta en marcha

CONADESUCAComite Nacional para el DesarrolloSustentable de la Caña de Azúcar

ContenidoINTRODUCCIÓN

OBJETIVO

PROBLEMÁTICA

DESCRIPCIÓN

ORGANIZACIÓN DEL LABORATORIO

EQUIPO PARA EL LABORATORIO

EQUIPO DEL INVERNADERO

RESULTADOS

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

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Av. Insurgentes Sur 489 Piso 12, Col. Hipódromo Condesa, Del. Cuauhtémoc, Ciudad de México, C.P. 06170, Tel.: (55) 38 71 83 00 ext. 20031

REPORTE DE PROYECTO

El cultivo de tejidos vegetales, es un conjunto de técnicas que consiste, esencialmente, en aislar una porción de planta, otorgándole arti�cialmente las condiciones físicas y químicas apropiadas para que las células expresen su máximo potencial. Durante este proceso, es necesario adoptar un estricto procedimiento de sanidad (asepsia) para mantener los cultivos libres de contaminación microbiana.

Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales (CTV) es un área en donde se respeta la organización y procesos determinados para la generación de material vegetativo; además, debe brindar las condiciones que garanticen el desarrollo de células, tejidos y órganos vegetales para la producción de plantas bajo condiciones in vitro; por ello, la infraestructura, debe tener áreas determinadas para la instalación de equipos, materiales y reactivos, en las que se llevan a cabo actividades y procedimientos especí�cos; su correcta ubicación y distribución son necesarios para desarrollar las funciones que permitan aislar y cultivar de manera exitosa células y tejidos vegetales in vitro.

Debido a la escasez de este tipo de infraestructura en el país, fue necesaria la planeación y proyección para la puesta en marcha de un laboratorio de CTV, por lo que al �nal de los trabajos realizados en coordinación con el Comité Nacional para el Desarrollo Sustentable de la Caña de Azúcar (CONADESUCA) y el Centro de Investigación y Desarrollo de la Caña de Azúcar A. C. (CIDCA), se alcanzó la puesta en marcha del laboratorio de CTV del CIDCA; el cual, es el segundo en el país que cuenta con la certi�cación del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria (SENASICA). Esta unidad, además de producir material genético, puede conservar germoplasma, realizar programas de mejoramiento genético biotecnológico e intercambiar variedades in vitro con otros países.

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INTR

ODUC

CIÓN

Debido a la escasez de este tipo de infraestructura en el país, fue necesaria la planeación y proyección para la puesta en marcha de un laboratorio de CTV

INTRODUCCIÓNCONADESUCAComite Nacional para el DesarrolloSustentable de la Caña de Azúcar

México cuenta con un gran potencial productivo para la propagación masiva de vitroplantas

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Presentar los resultados obtenidos del convenio de concertación CONADESUCA-CIDCA, acerca de establecer una planta piloto para la producción de plantas de caña de azúcar utilizando técnicas de Cultivo de Tejidos Vegetales (CTV), en el municipio de Tuxtla Chico, Chiapas, México, la distribución de las áreas del laboratorio y la especi�cidad de cada una de ellas, así como el material que pudo obtenerse para el equipamiento del laboratorio.

Las variedades comerciales de caña de azúcar en México, se han propagado por métodos convencionales mediante la siembra de yemas; sin embargo, esta técnica no garantiza el saneamiento y rejuvenecimiento de las variedades seleccionadas en campo. Una de las alternativas más utilizada para el saneamiento y rejuvenecimiento varietal, es mediante el uso de las técnicas de CTV. Esta herramienta biotecnológica resulta de gran utilidad para la conservación y micropropagación del material vegetal en espacios pequeños bajo condiciones asépticas y controladas. Mediante estas técnicas de cultivo se puede tener un suministro de material de manera constante y homogénea; lo cual, no sucede en la propagación vegetativa por yemas, que es de naturaleza estacional.

Actualmente, la industria biotecnológica agrícola en México cuenta con un gran potencial productivo para la propagación masiva de vitroplantas; sin embargo, el empleo de la micropropagación a escala comercial se ha limitado, debido principalmente a los altos costos de operación ocasionados por la mano de obra, la baja e�ciencia biológica y a la falta de automatización durante los procesos de micropropagación. Con los sistemas de inmersión temporal, se ha podido resolver estas limitaciones, convirtiéndose en una alternativa novedosa y oportuna para lograr la semiautomatización y aumento en el coe�ciente de multiplicación de los cultivos in vitro.

ProblemáticaObjetivo


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El laboratorio e invernadero en mención, se encuentran ubicados en la carretera Tapachula-Talismán en el kilómetro 17.5, Tuxtla Chico, C.P.

30870, Chiapas, México.

Descripción

El convenio de concertación celebrado entre el CONADESUCA y el CIDCA, tuvo dentro de sus objetivos, el diseño, construcción, equipamiento y puesta en marcha de un laboratorio de cultivo de tejidos in vitro, así como la construcción y equipamiento de un invernadero para la aclimatación de plántulas de caña de azúcar.

Las instalaciones, donde se construyó el laboratorio de CTV, forman parte de la infraestructura de la Estación de Hibridación (E.H.) del CIDCA. En éstas, se realizaron el diseño y las adecuaciones de las instalaciones del Laboratorio de Cultivo de Tejidos ubicado en la E.H. Todos los equipos adquiridos, junto con los materiales y reactivos fueron instalados y calibrados de forma correcta para el buen funcionamiento del laboratorio.

De forma complementaria, se realizó la selección y colecta de plantas de caña de azúcar en campo y se establecieron en el laboratorio las variedades seleccionadas. La selección consistió en la preferencia de aquellas plantas que tuvieran las características agroindustriales deseables para el programa de Mejoramiento Genético del CIDCA (alto rendimiento agroindustrial, resistentes a las principales plagas y enfermedades y con adaptación a diversas condiciones agroecológicas del país), para establecer un total de 368 variedades. Todas las variedades seleccionadas se

multiplicaron y trans�rieron a medio de elongación y enraizamiento.

Para el establecimiento del banco de cruzamientos con plántulas in vitro de la E.H., se llevaron a cabo dos procesos:

• aclimatación en invernadero de las variedades seleccionadas, y

• siembra en campo de las plántulas ya aclimatadas.

En el laboratorio se implementaron adecuaciones respecto a laboratorios estándar, tales como el uso de la luz natural a �n de ahorrar costos, y la mejora del proceso de aclimatación de las vitroplántulas, implementando paneles traslúcidos y paredes con doble cristal, que permiten el mejor aprovechamiento de la luz solar y el ambiente térmico.

El laboratorio e invernadero en mención, se encuentran ubicados en la carretera Tapachula-Talismán en el kilómetro 17.5, Tuxtla Chico, C.P. 30870, Chiapas, México. Coordenadas geográ�cas 14°57’05.87” N, 92°09’14.60” W

Las instalaciones después de las adecuaciones realizadas, cuentan con una super�cie de 224 m2, destinadas a la producción de plantas de caña de azúcar utilizando técnicas de CTV.


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Área de trasferencia: En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de disección, inoculación y trasferencia de los explantes (tejido vegetal).

Organización del laboratorio

Área de preparación: Se utiliza principalmente para preparar los medios de cultivo, además de proveer también un espacio para almacenar los materiales de vidrio, plástico y los reactivos químicos. Cuenta con mesas de trabajo para la preparación de los medios y para colocar las balanzas, el medidor de pH, preparador automático de medios de cultivo y otros elementos; también incluye vitrinas, estanterías y espacio para el equipo de refrigeración.

Área de lavado y esterilización: El área de lavado incluye un lavadero grande con agua caliente y fría, una fuente de agua de alto grado de pureza, así como basureros adecuados para el material vegetal, inorgánico y de vidrio que se desecha. El área de esterilización contiene un espacio para la autoclave.

Área de trasferencia: En esta área del laboratorio se realiza el trabajo de disección, inoculación y trasferencia de los explantes (tejido vegetal). Dado que este trabajo demanda el más alto nivel de limpieza ambiental, se cuenta con la instalación de campanas o cámaras de �ujo horizontal con aire �ltrado bajo presión.

Área de incubación: Los cultivos se incuban en gabinetes o cámaras de crecimiento. El área de incubación o crecimiento in vitro proporciona un buen control de la temperatura (24 ±1°C), fotoperiodo de 16/8 hora luz/obscuridad, y de irradiancia entre 50-60 µmol.m-2.s-1. En el cuarto de incubación se encuentran las estanterías para colocar los cultivos. Esta área incluye un espacio para Birreactores de Inmersión Temporal.

Invernadero/Área de aclimatación: Las plantas obtenidas en laboratorio, también llamadas vitroplantas, se acondicionan o aclimatan en un invernadero automatizado de 541.8 m2. Esta infraestructura es un modelo tipo capilla, con dobles ventanas y cortinas cenitales, protegida con malla antiá�dos y techo de plástico.

Este proceso de adaptación al medio externo debe ser gradual; por lo que las vitroplántulas obtenidas se

someten a una reducción lenta de la humedad relativa (de 90% a 50%), así como a incrementos paulatinos de la intensidad luminosa (de 40-50 µmol·m-2·s-1 a 120 µmol·m-2·s-1). La infraestructura de invernadero garantiza el control tanto de la humedad relativa como de la entrada de luz.

1.- Incubación2.- Transferencia3.- Área de Preparación4.- Área de esterilización

5.- Sanitarios6.- Transfer7.- Vestíbulo8.- O�cina.


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El área de incubación en este laboratrio es un cuarto con temperatura, fotoperiodo, iluminación y humedad relativa controladas.

Equipo para el laboratorio

El equipo con el que cuenta el laboratorio de cultivo de tejidos vegetales es:

En el área de preparación: refrigerador, balanzas (una macrobalanza y una de precisión), potenciómetro, plancha eléctrica con agitador magnético, frascos (125, 250 y 500 ml), botellas y material de vidrio o plástico.

En el área de lavado y esterilización: Autoclave automático, destilador de vidrio, gradillas para secado, bandejas de aluminio y de plástico de varios tamaños, recipientes de plástico grandes, estufas para esterilización y secado.

En el área de transferencia: gabinete de �ujo laminar, microscopio de disección con luz, incidente e instrumentos de disección: cuchillas, mangos para cuchillas, aguja de disección, pinzas, tijeras, navaja de afeitar, frascos con alcohol, mechero de alcohol, máscaras, guantes, marcadores a prueba de agua, bandejas, y recipientes para basuras.

En el área de incubación: un cuarto con temperatura, fotoperiodo, iluminación y humedad relativa controladas; estanterías con iluminación para los cultivos, bandejas, termómetros de máxima y mínima y gradillas para tubos de varios tamaños.

En el área de crecimiento en vivo: suelo, estantes, bandejas, cámaras de alta humedad.


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Detalle del equipo y reactivosDescripción del TrabajoConstrucción de Invernadero automatizadoEstructura de mesas con tensores de aceroAnaqueles de aluminio

Unidad de Medida541.8 m2

pza.pza.

Cantidad128

Descripción del EquipoPreparadora de Medio de 9 l con dispensadorBaño maría con display digital, pantalla táctil, microcomputarizado para ofrecer una alta exactitud, sensor deplatino pt-100, protector contra sobre temperatura,cámara de acero inoxidable de 495x295x150 mm,capacidad de 20 litrosHorno de Microondas IndustrialBiorreactores semiautomatizados Campana de Flujo Laminar individualParrilla de agitación de cerámica tamaño grandeEsterilizador Germinador 500Etiquetadora digital con cartuchos

Unidad de Medidapza.pza.

pza.pza.pza.pza.pza.pza.

Cantidad11

1301212

Descripción del ReactivoMyo inositol de 100 g Ácido cítrico de 100 g Ácido Ascórbico de 100 g Alcohol etílico al 96 % de 20 lPhytagel 5 kgAzúcarReactivos varios

Descripción de MaterialesVaso de precipitado de vidrio 50 mlVaso de precipitado de vidrio 100 mlVaso de precipitado de vidrio 250 mlVaso de precipitado de vidrio 600 mlTubos pirex de 25 X 150 mmFrasco tarro 1000 mlFrasco tarro de 500 mlTimer DIGITAL 3 CANALESGradilla para tubos de 25X150 de plástico resistente al autoclaveadoEspátula doble: extremo plano y redondo 12 pulg. daiggerBarra magnética de 60X12"Gorro para cirujano c/100 piezasMango para bisturí no. 4Mango para bisturí no. 3Pinza de disección recta dentada de 20 cmPinza de disección recta dentada de 30 cmLámpara de alcohol Cubre bocas desechable c/150 piezasHojas no. 22 c/100 pzas. para bisturí no. 4Hojas no. 11 c/100 pzas. para bisturí no. 3Termómetro de vidrio -10 A 120°cRollo de papel aluminio grueso larga duración

Descripción de MaterialesRollo de Película plástica adherible 30X600 mAlgodón rollo de 500 grCarrito de metal para transportar material (PLÁSTICO RESISTENTE)Escobillones para matrazEscobillones para tubos de ensayeTapas para tubos de ensayo de 25 X 150 mm (HULE)Piceta 500 mlVaso c/asa de pp de 2 lVaso c/asa de pp de 5 lTapa de presión esterilizable para frasco tarro de 500 mlTapa de presión esterilizable para frasco tarro de 1000 mlBata blanca talla medianaBata blanca talla grandeEscalerillas de 3 escalonesToallas interdobladas por cajas de 3,000 piezasDespachador toalleroJabón Líquido antibacterial para manos Jabón líquido axion tricloroBolsas para basura transparentePapel estrazaBolsas de Polipapel de 5 kgTela de manta Botes de basuraElectrodo para potenciómetro cuerpo de plástico Mod.HI 1332BPotenciómetro de mano portátilMarcadores Sharpie para rotulaciónTenis blancos para ingreso al laboratorioLámparas de luz blanca


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Todos los requisitos, y recomendaciones emitidas por el evaluador fueron atendidos satisfactoriamente.

Resultados

Como resultados de la implementación del proyecto CONADESUCA-CIDCA, se enlistan los siguientes:

1. Adecuación de la infraestructura adecuada y el equipamiento del laboratorio;

2. Establecimiento de un manual de procedimientos y protocolos de micropropagación de plantas en sistemas de biorreactores.

3. Certi�cación del laboratorio de CTV por el SENASICA de conformidad con la Ley Federal de Sanidad Vegetal y a la Norma O�cial Mexicana NOM-016-FITO-1995, por la que se establece la cuarentena exterior para prevenir la introducción de plagas de caña de azúcar.

4. Puesta en marcha de la producción de vitroplantas de caña de azúcar.

Para que el laboratorio contara con una certi�cación de las instalaciones, este trámite se solicitó ante el SENASICA, organismo que emitió una serie de requisitos que se debían cumplir para este proceso. Una vez realizadas dichas observaciones se presentó, por parte del CIDCA, la evidencia documental y presencial de los requisitos.

El SENASICA, envió un evaluador (Jefe del Departamento de Cuarentena y Saneamiento) del Centro Nacional de Referencia Fitosanitaria (CNRF) al sitio, para veri�car los criterios de evaluación requeridos en la certi�cación, mismo que veri�có las instalaciones del laboratorio y sus procedimientos; además, realizó la toma de muestras de material vegetal para el diagnóstico �tosanitario de las plagas y enfermedades cuarentenarias reglamentadas en la NOM-016-FITO-1995. Finalmente, el evaluador emitió una lista de sugerencias y recomendaciones para obtener la certi�cación del laboratorio.

Todos los requisitos, y recomendaciones emitidas por el evaluador fueron atendidos satisfactoriamente. Los diagnósticos realizados por el CNRF fueron negativos para todas las enfermedades, por lo que se obtuvo la certi�cación para la producción de vitroplántulas de caña de azúcar para el laboratorio.

A la fecha, el laboratorio de CTV del CIDCA, cuenta con un protocolo de micropropagación de plantas en sistemas de biorreactores y con la certi�cación de los métodos empleados en cultivo in vitro de plantas de caña de azúcar en México, con la certi�cación 02/2016/CIDCA. Una vez obtenida la certi�cación, se dio inicio a la producción masiva de vitroplantas mediante Biorreactores de Inmersión Temporal semiautomatizados.


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El banco de cruzamientos será utilizado para continuar con el programa de obtención de variedades de caña de azúcar a cargo del CIDCA.

Conclusiones

Este proyecto inició en 2014, los objetivos primordiales de creación del laboratorio y construcción del invernadero para maduración de las vitroplantas fue cumplido en su totalidad para 2015; a partir de esa fecha, el proyecto ha sido un éxito y actualmente se encuentra en operación y ha producido para el proyecto, la cantidad de 220 mil vitroplantas.

Posterior al desarrollo de esta primera etapa, se consiguió el establecimiento del banco de cruzamientos, en el que fueron utilizadas vitroplantas, con las siguientes características:

• Sanidad vegetal: libres de plagas y enfermedades.

• Alta pureza varietal: no más de una variedad dentro del semillero.

• Homogeneidad genética: sin presencia de variantes somaclonales (mutaciones).

El banco de cruzamientos será utilizado para continuar con el programa de obtención de variedades de caña de azúcar a cargo del CIDCA.


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• Bello-Bello J. J., Flores-Revilla C., Certificación �tosanitaria de vitroplantas de Saccharum spp., para establecer semilleros básicos; Agroproductividad; México, 2016.

• CONADESUCA, Convenio de concertación CONADESUCA-CIDCA 2014-2016, México, 2016.

• Cuenya, M. I., et al, Distribución de variedades comerciales de caña de azúcar en el área de cultivo de la provincia de Tucumán: campaña 2004 – 2005. Gacetilla Agroindustrial, Argentina, 2005.

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• Flores, S. C., Planeación estratégica para la agroindustria de la caña de azúcar. México, 2006.

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Bibliografía


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