INSTITUTO TECNOLGICO DE TUXTEPEC

LABORATORIO BSICO DE BIOQUMICA

BIOQUMICA I

PRESENTAN: ALTO ROJAS NUBIA ISELA GONZLEZ SOSA ELIZETH HIGAREDA ARANO HILDA VICTORIA HINOJOSA GIJN MAYRA PEA MOJICA EDUARDO SNCHEZ CATARINO JOS LUIS

NIVEL: 4 A N de Equipo: 2MC. ROSALBA FERNNDEZ VELASCO

FECHA DE REALIZACION DE LA PRCTICA12/MARZO/2014

NDICE

I. Introduccin II. Marco terico III. Desarrollo de la prctica IV. Observaciones V. Resultados obtenidos VI. BibliografaVII. Anexos

I.- IntroduccinEstas enzimas pertenecen al grupo denominado xido reductasas presentes en la mayora de las plantas y de los microorganismos aunque resulta difcil diferenciar la actividad de ambas enzimas puesto que usan sustratos similares, se diferencian en su velocidad ya que la peroxidasa es ms activa que la polifenoloxidasa.Se ha observado que las funciones principales en el cuerpo humano depende de las reacciones de oxidacin, que a su vez producen especies reactivas de oxgeno (ERO) como producto intermedio del metabolismo (Nickavar et al. 2008). En las que incluyen al anin radical superxido, perxido de hidrgeno y el in hidroxilo (Rodrguez et al. 2009).Las especies reactivas de oxigeno no solo estn fuertemente asociados con la peroxidacin de lpidos y el consecuente deterioro de alimentos, sino que tambin estn involucradas en el desarrollo de enfermedades cancergenas (Rodrguez et al. 2010), por lo que el consumo de alimento con alto contenido de antioxidantes es importante en la prevencin de estas (Vargas et al. 2005, Erdemoglu et al. 2006), debido a que son compuestos que pueden retrasar o inhibir la oxidacin de lpidos y otras molculas mediante la inhibicin de la propagacin de ERO (Velioglu et al. 1998).

II.- Marco TericoDefinicionesCatalasa: Es una enzima (hemoprotena) que descompone el perxido de hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno.Peroxidasa: Es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno en presencia de un compuesto oxidable al que transfiere un tomo de oxgeno. Fenoloxidasa: Enzima de la clase de las oxidorreductasas, que cataliza la reaccin entre L-tirosina, L-dopa y oxgeno, para dar lugar a L-dopa, dopaquinona y agua. Es una protena de cobre que acta en los catecoles, catalizando algunas de las mismas reacciones que la CATECOL OXIDASA.xido reductasas: es una enzima que cataliza la transferencia de electrones desde una molcula donante (el agente reductor) a otra aceptora (el agente oxidante).Polifenoloxidasa: La enzima cataliza la O-hidroxilacin de Monofenoles (fenoles en los cuales el anillo bencnico contiene un nico sustituyente hidroxilo) para convertirlos en O-difenoles (fenoles con dos sustituyentes hidroxilo).Inhibidor: son molculas que se unen a enzimas y disminuyen su actividad. Puesto que el bloqueo de una enzima puede matar a un organismo patgeno o corregir un desequilibrio metablico.Enzimas: Una sola clase de monosacrido.

Los microcuerpos comprenden un grupo de orgnulos del tamao de los lisosomas. Son estructuras de membrana sencilla y de unos de dimetro. En las micrografas electrnicas la matriz del microcuerpo tiene a menudo un centro denso debido a hieleras cristalinas de enzimas contenidos en los orgnulos. Estas enzimas catalizan reacciones en la que participa el perxido de hidrogeno (H202), por ejemplo, urato oxidasa y catalasa. Por esta razn los microcuerpos han sido rebautizados peroxisomas. La dotacin enzimtica de los peroxisomas vara en los diferentes tipos de clulas. La catalasa es quizs la nica enzima que se encuentra en todos los peroxisomas. Las funciones fisiolgicas de la serie de peroxisomas conocidos no estn todava claras. Sin embargo, la actividad catalasa es esencial para la eliminacin del perxido de hidrogeno (que es toxico) generado por las enzimas de los peroxisomas y por otros compuestos metablicos. Se cree que los peroxisomas juegan un papel en el metabolismo energtico y oxidativo y en otras rutas metablicas especficas. CatalasaLa catalasa es una enzima perteneciente a la categora de las oxidorreductasas que cataliza la descomposicin del perxido de hidrgeno (H202) en oxgeno y agua. Esta enzima utiliza como cofactor al grupo hemo y al manganeso.

El perxido de hidrgeno es un residuo del metabolismo celular de muchos organismos vivos y tiene entre otras una funcin protectora contra microorganismos patgenos, principalmente anaerobios, pero dada su toxicidad debe transformarse rpidamente en compuestos menos peligrosos. Esta funcin la efecta esta enzima que cataliza su descomposicin en agua y oxgeno. Adems la catalasa se usa en la industria textil para la eliminacin del perxido de hidrgeno, as como en menor medida se emplea en la limpieza de lentes de contacto que se han esterilizado en una solucin de perxido de hidrgeno. La ausencia congnita de catalasa es causante de una acatalasemia (o acatalasia), la enfermedad de Takahara que se manifiesta por la ausencia de actividad de la catalasa en los glbulos rojos y con severas infecciones gangrenosas de la boca, pudiendo producir la prdida de los dientes y graves destrucciones de los maxilares y regiones blandas que los cubre. Enfermedad congnita del Japn (2 de 100.00 habitantes sufren de este trastorno).El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, an as la reaccin qumica se produce en dos etapas:H2O2 + Fe (III)-E H2O + O=Fe (IV)-EH2O2 + O=Fe (IV)-E H2O + Fe (III)-E + O2Donde Fe-E representa el ncleo de hierro del grupo hemo unido a la enzima que actan como cofactores.La enzima se presenta en forma de homotetrmero y se localiza en los peroxisomas.Esta enzima puede actuar como una peroxidasa para mucha sustancias orgnicas, especialmente para el etanol que acta como donante de hidrgeno. Las enzimas de muchos microorganismos, como el Pencillium simplicissimum, que exhiben actividad de catalasa y peroxidasa, son frecuentemente llamadas catalasas-peroxidasas.

Estructura cuaternaria de la catalasa.

Peroxidasa Es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno. Donante + H2O2Donante oxidado + H2OEsta enzima utiliza comocofactorel grupohemo.

Pertenecen a la categora de las oxidorreductasas. Es utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los ensayos para la determinacin y cuantificacin de metabolitos como glucosa, cido rico, colesterol o triglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza en inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el herpes virus. La peroxidasa tambin se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos de inters biotecnolgico e industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y protectores de radiacin magntica, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. En vegetales, es de destacar a la peroxidasa del rbano, que tiene grandes aplicaciones en tcnicas inmunoqumicas y de diagnstico clnico debido a su gran estabilidad, facilidad de conjugacin con las inmunoglobulinas y sencillez para detectarla por mtodos colorimtricos utilizando un gran nmero de reactivos. En animales, existen peroxidasas con una funcin predominantemente defensiva en la saliva, la leche o los leucocitos, donde se aprovecha el carcter oxidante con fines germicidas y bactericidas del perxido que se genera de forma endgena mediante otras reacciones (glucosa oxidasa, amino cido oxidasa etc.). No todas las peroxidasas son defensivas, y por ejemplo una peroxidasa (yoduro peroxidasa) es tambin la responsable de la sntesis de las hormonas tiroideas, oxidando en este caso el yoduro a yodo para que ste se adicione a algunos de los anillos fenlicos de los residuos de tirosina de la tiroglobulina. Otras peroxidasas, como la glutationa peroxidasa, estn ampliamente distribuidas en diversos tejidos con fines diferentes, pero relacionados con una funcin antioxidante.Prcticamente todas las peroxidasas son hemoprotena (excepcin notable es la glutationa peroxidasa, que es una selenoprotena) y tienen como sustrato comn el perxido de hidrgeno. La gran afinidad por este sustrato hace que se pueda unir al hierro del grupo hemo por los dos planos del centro activo, el superior y el inferior, dando lugar a una inhibicin por exceso de sustrato ya que cuando ambas posiciones estn ocupadas por el perxido de hidrgeno no es posible la unin del otro sustrato.Enzima peroxidasa verstilLa enzimaperoxidasa verstil (VP)Donante + H2O2Donante oxidado + H2OEs producida por elhongoligninolticoPleurotus eryngiiy tiene la misma especificad que las otras dos enzimas peroxidasas lignolticas, lamanganeso peroxidasay lalignina peroxidasa. Para esta enzima son necesarios como cofactores 1 grupo hemo B (hierro-protoporfirina IX) y 2 iones calcio por subunidad.Existen tres tipos de esta protena: Peroxidasa verstil de fase lquida 1 (VPL1). Peroxidasa verstil de fase lquida 2 (VPL2). Peroxidasa verstil de fase slida 1 (VPS1).

Se aplican la peroxidasa se emplea para el tratamiento industrial de aguas contaminadas: por ejemplo, losfenolespueden eliminarse mediante su polimerizacin catalizada mediante la peroxidasa deArmoracia rusticana.Fenol oxidasaEnzima de la clase de lasoxidorreductasas, que cataliza la reaccin entre L-tirosina, L-dopa yoxgeno, para dar lugar a L-dopa, dopaquinona yagua. Es una protena decobreque acta en los catecoles, catalizando algunas de las mismas reacciones que la CATECOL OXIDASA.La Polifenoloxidasa recibe muchos nombres debido a la gran diversidad de sustratos que emplea. Tcnicamente es una o-difenol: oxigeno reductasa. Su reaccin se puede describir de la siguiente manera:

Esta enzima puede llevar a cabo la oxidacin directa aerobia de compuestos mono y difenoles (tirosina, fenol, p-cresol, 3, a-dimetil fenol, 4-terbutilfenol). Tambin puede atacar a o-difenoles y a la adrenalina. Es una enzima de peso molecular 120.00, con un centro de cobre.La polifenoloxidasa de la papa ataca a los siguientes compuestos en orden de mayor a menor actividad: cido clorhdrico, Catecol, quercitina, piragalol, cido cafeico, 3,4-dihidroxifenilalanina, p-creso, tirosina entre otros. Las quinonas resultantes de la reaccin de la polifenol oxidasa pueden continuar oxidndose y polimerizndose, para dar compuestos finales que son muy complejos y coloridos.Es difcil distinguir las actividades de las dos enzimas a partir de la misma fuente, ya que pueden atacar a los mismos substratos.III.- Desarrollo de la PrcticaPRCTICA: Obtencin y estimacin de la actividad de la catalasa, peroxidasa y la fenol oxidasa.

Objetivo: Aislar las enzimas mencionadas y poder estimar su actividad cataltica.

MATERIALES REACTIVOS1 Cuchillos AGUA DESTILADA1 Licuadora Catecol al 1%1 Pelador Goma de guayacol al 1.5%1 Bao de hielo Tirosina 0.1%1 Bao Mara NaCN al 5%2 Vaso de precipitado de 150 ml. Tolueno3 Matraz Erlenmeyer de 125 ml. Perxido de hidrgeno12 tubos de ensaye1 gradilla1. Algodn1. Extracto de papa

Procedimiento:Lave, pele y muela 5 papas pequeas. Coloque la papa ya molida en 100 ml. de agua en un bao de hielo, deje reposar por 15 minutos agitando ocasionalmente. Filtre la mezcla a travs de algodn (doblado 4 veces) exprima y colecte el lquido en un vaso de precipitado o en un vidrio de reloj. Decante el lquido del almidn, el cual se encuentra en el fondo y regrselo al bao de hielo. Use esta preparacin como una fuente de ambas enzimas (extracto de papa).

Prepare una serie de tubos como se muestra a continuacin:T U B O SSustancia123456789101112

Catecol al 1%0.50.50.50.5--------------------0.5---

Guayacol 1.5%------------0.50.50.50.5---------0.5

Tirosina 0.1%------------------------22------

H2O2 al 3%---0.5---0.5---0.5---0.5---0.50.50.5

NaCN al 5%------------------1 gota---------------

Extracto de papa5555555555------

= calentar a ebullicin en bao Mara por 10 minutos y enfriar a temperatura ambiente, observar. Solo se realizaron las pruebas de los tubos N 5, 6, 8, 9, 10 y 12, debido a la falta de reactivos (Catecol y NaCN).

Mezclar y dejar reposar los tubos a temperatura ambiente, observar los cambios de color despus de una hora, Dejar los tubos 9 y 10 conteniendo tirosina con unas gotas de Tolueno hasta dos das despus para realizar una observacin final.Anotar los resultados y observaciones.

IV.- ObservacionesNGuayacol 1.5%Tirosina 0.1%H2O2 3%Extracto de papaObservacionesUna hora despus

5

0.5

----------

-------

5Al instante se produjo efervescencia lenta originando un color blanquecino Presento color blanquecino.

6

0.5

----------

0.5

5Al instante se produjo mucha efervescencia originando un color guinda.Presento un color entre morado y rojo oscuro y efervescencia (espuma).

8

0.5

----------

0.5

5Se produjo efervescencia rpida, originando un color caf obscuro.Color morado o rojo sangre con espuma en la superficie.

9

----------

2

-------

5Al instante se produjo efervescencia , dando la presencia de un color ligero blanquecino

Presento el color blanquecino, pero al ponerle tolueno se le hizo un anillo de color cafecito en la superficie.

10----------20.55Efervescencia rpida, dando como producto final un color meln.color meln tenue con espuma y en el fondo se form un precipitado

120.5----------0.5----------No hubo reaccin (transparente)Sigui transparente

V.- Resultados

TubosGuayacol 1.5%Tirosina 0.1%H2O2 3%

5Polifenoloxidasa no actu libremente----------------------

6La peroxidasa actu libremente sobre el guayacol-----------

8La peroxidasa actu libremente sobre el guayacol-----------La peroxidasa actu libremente sobre el guayacol

9-----------Polifenoloxidasa actu libremente sobre la tirosina-----------

10-----------La peroxidasa actu libremente sobre la tirosina

12No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxgeno atmosfrico

-----------No hay enzima, los compuestos se oxidan por el oxgeno atmosfrico

ConclusinSe demostr las dos actividades enzimticas de la peroxidasa y polifenoloxidasa partir de la misma fuente, el extracto de la papa. En base a los resultados la peroxidasa es mucho ms rpida en actuar que la Polifenoloxidasa.Cuestionario:1.- Cmo acta la peroxidasa, difiere de la catalasa?La catalasa se detecta con facilidad por su accin sobre el perxido de hidrogeno. Cuando se agrega una gota de perxido de hidrogeno a la papa que producen catalasa, se liberan burbujas de oxgeno. Cualquiera que haya colocado perxido de hidrogeno sobre una herida reconocer que las clulas de los tejidos humanos tambin contienen catalasa. La otra enzima que degrada el perxido de hidrogeno es la peroxidasa, que difiere de la catalasa en que su reaccin no produce oxigeno:

2.- Hay alguna evidencia de la actividad de la catalasa en la papa en este experimento?, explique.Si, por que hubo desprendimiento de oxgeno en los tubos 5, 6, 8, y 10

3.- Qu pasara si se adicionara un exceso de peroxidasa en la reaccin de la polifenoloxidasa?Provoca que la reaccin de polifenoloxidasa se lleve a cabo rpidamente oxidando a los compuestos polifenoles

4.- Cmo se podra distinguir la peroxidasa de la polifenoloxidasa usando este mismo extracto crudo?Se puede distinguir mediante el tipo de substrato que se le aadir. Como se sabe que la polifenoloxidasa cataliza la oxidacin de difenoles en presencia de oxigeno molcular. Tales fenoles son catequinas (3-hidroxiflavanes), steres de cido cinmico, cido clorgenico (3- O-cafeoyl-D-cido quinico) el cual, es el sustrato ms encontrado en la naturaleza, el 3,4-dihidroxipenilalanina (L-DOPA) que es el producto de la hidroxilacin de tirosina; y la Tirosina la cual siendo un fenol y al mismo tiempo un aminocido constituyente de protenas, se encuentra en cada tejido de las plantas.En cambio en la peroxidasa es similar a la polifenoloxidasa, ya que pertenecen al grupo de oxidoreductasas. Las cuales descomponen perxido de hidrgeno en presencia de un donador de hidrgeno.Una gran variedad de compuestos pueden actuar como donadores de hidrogeno, incluyendo fenoles (p-cresol, guayacol, resorcinol) aminas aromticas (anililina, bencidina, o-fenildiamina, o-dianisedina) nicotinamida-adenina dinucleotida reducida y nicotinamida-adenina dinucleotida fosfato reducida

5.- Acta el cianuro como un inhibidor de ambas enzimas? Explique.El cianuro acta un inhibidor de tipo no competitivo, la catalasa es un hidroxiperoxidasa; y como tal, contiene hierro en su ncleo porfirnico, este hierro puede ser afectado por el cianuro.No se observ si el cianuro acta como inhibidor para la peroxidasa y polifenoloxidasa ya que esta prueba no se realiz (falta de reactivos).

6.- Cul es el propsito de los tubos 11 y 12?Observa la presencia de peroxidasa (tubo 12) ya que esta cataliza, una deshidrogenacin directa en presencia de perxidos; en este caso el guayacol es oxidado dando una quinona coloreada. El cual no se presenci en el tubo N 12

VI.- BibliografaPDF (2013). Actividad enzimtica y capacidad antioxidante. Fecha de consulta: abril 03, 2014 desde http://www.mag.go.cr/rev_meso/v24n01_057.pdfAllen, Janda. Koneman, Woods (2008). Diagnostico microbiolgico. Pg. consultada 1383. Editorial Mdica panamericana S.A. 6 edicin Gutirrez, Jos Mira (1973). El diagnostico bioqumico de las micobacterias. Pg. consultada 39. Editorial Universidad de Sevilla. Serie medicina, No 16. Polifenol oxidasa. (2014, 8 de marzo).Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de consulta: 14:00, abril 4, 2014 desdehttp://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Polifenol_oxidasa&oldid=73056805Oxidoreductasas. (2013, 21 de diciembre). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de consulta: 13:00, abril 5, 2014 desde http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Oxidorreductasa&oldid=71504146.Catalasa. (2013, 22 de diciembre). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de consulta: 18:36, abril 5, 2014 desde http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Catalasa&oldid=71520787.Peroxidasa. (2014, 10 de marzo). Wikipedia, La enciclopedia libre. Fecha de consulta: 18:58, abril 5, 2014 desde http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Peroxidasa&oldid=73100364.VII.- Anexos

Despus de una hora

Tres das transcurridos