Celaya Guanajuato, 02 de Diciembre del 2011

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE CELAYA

Estudio de degradación de cafeína por acción de Pleurotus,

Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus. Ingeniería Ambiental

Daniel Zamora Avella

Taller de investigación

Prof.: Rosario Granados Uribe

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Tabla de contenido RESUMEN .................................................................................................................................................... 3

PROBLEMÁTICA ......................................................................................................................................... 5

JUSTIFICACIÓN .......................................................................................................................................... 5

MARCO TEÓRICO ....................................................................................................................................... 5

HIPOTESIS .................................................................................................................................................. 7

VARIABLES ................................................................................................................................................ 7

OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................................. 7

OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................................................ 7

Materiales y métodos .................................................................................................................................... 8

Medios de cultivo ..................................................................................................................................... 8

Medios sólidos .......................................................................................................................................... 8

Placa ..................................................................................................................................................... 8

Tubos .................................................................................................................................................... 8

Agar con extracto de pulpa de café ........................................................................................................... 9

Agar con dextrosa y papa .......................................................................................................................... 9

Cepas ...................................................................................................................................................... 10

Aislamiento por medio de tejido ............................................................................................................. 10

Aislamiento por medio de esporas .......................................................................................................... 10

Inoculo .................................................................................................................................................... 11

La elaboración de inoculo se realiza en dos etapas: ............................................................................. 11

Procedimiento..................................................................................................................................... 12

Tratamiento de los substratos ................................................................................................................. 12

Pasteurización con vapor. .................................................................................................................... 13

Pasteurización por inmersión en agua caliente. ................................................................................... 13

DETERMINACIÓN DE CAFEÍNA POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CON DETECCIÓN UV-VIS ........................ 14

Aparatos y material ............................................................................................................................. 14

Reactivos ................................................................................................................................................ 14

Calibrado............................................................................................................................................. 15

Determinación de cafeína en una muestra .......................................................................................... 15

Resultados .......................................................................................................................................... 15

Procedimiento ............................................................................................................................................ 15

Medios de cultivo .................................................................................................................................... 15

Inoculo .................................................................................................................................................... 15

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Sustrato .................................................................................................................................................. 16

Elección de cepas .................................................................................................................................... 16

Medición de la concentración de cafeína ................................................................................................ 16

Resultados .................................................................................................................................................. 16

Bibliografía ................................................................................................................................................. 17

Índice de tablas

Tabla 1……………………………..……………………………………………………………………………………………………16

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RESUMEN

La cafeína es un alcaloide, con propiedades cardiotónicas. Este alcaloide se identificó

por primera vez en el café; su primer uso del café y el descubrimiento de sus efectos

para reducir la fatiga y aumentar el estado de alerta, se atribuyeron al parecer

erróneamente a un monje etíope, quien después de oír la versión de un pastor sobre el

efecto que producían las bayas del árbol del café en sus cabras, decidió preparar una

bebida con las mismas, para poder pasar la noche despierto y en oración. En este

proyecto se intenta utilizar la cafeína como nutrimento primario para el crecimiento y

desarrollo de los hongos Pleurotus, Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus a fin de

verificar su eficacia del potencial de degradación. Al ir degradando la cafeína, se da el

fenómeno químico de fermentación aerobia, cabe mencionar que los procesos

fermentativos se pueden realizar a tres niveles, dependiendo de la escala del proceso

y/o la institución, entidad o empresa que lo realiza. El primero es a nivel laboratorio,

en el cual generalmente se trabaja con un volumen de substrato de 0.5 a 25 litros. Le

sigue el nivel piloto, en el cual se utilizan de 25 L hasta 300 L, para luego pasar a nivel

industrial, en donde se manejan volúmenes que podrían llegar hasta los 100,000 L de

substrato para fermentar. (S).

Aplicando la información recapitulada y teniendo en cuenta el potencial de

degradación de los microorganismos se aprovechó en la degradación de sustancias

específicas para obtener un beneficio. Se trataron hongos de los géneros Pleurotus,

Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus. Estos no fueron elegidos al azar, ya que tomando

en cuenta la información aportada por el seminario internacional, gestión integral de

residuos sólidos y peligrosos siglo XXI, los géneros anteriormente mencionados tienen

la capacidad de degradar cafeína y a la vez aportan un valor nutricional. Se trabajará

con medios de cultivo solido, se emplearon tres medios de cultivo: agar papa dextrosa,

extracto de pulpa de café con glucosa, extracto de pulpa de café sin glucosa. Como

inoculo se usó trigo previamente esterilizado a 120ºC. Usándose fermentadores

aerobios, se fermentó por un periodo de siete días. Se tomó una lectura de

concentración de cafeína al inicio y otra después de los siete días. Posteriormente se

realizará una curva de degradación versus tiempo.

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PROBLEMÁTICA

La desmedida demanda y consumo de productos que contienen cafeína como

principal o secundario componente activo, ha provocado en los últimos años cambios

importantes en los cuerpos de agua dulce y salada. No solamente esta afección ha

llegado a los seres humanos, sino que ya empieza a haber repercusiones en flora y

fauna acuática. Actualmente no se cuenta con sistemas que remuevan este tipo de

sustancias por qué no se le ha atribuido la debida importancia. El problema no es la

falta de información, ya que si hay registros de los organismos capaces de degradar

cafeína y también son bien conocidos distintos mecanismos para determinar cafeína.

Con lo que no se cuenta es con la adecuada información estadística-experimental para

poder afirmar que cierto organismo tiene una mayor y mejor capacidad para degradar

éste alcaloide. Para así, posteriormente y en un futuro no muy distante puedan usar

ésta información para diseñar un sistema de tratamiento de depuración de aguas

contaminadas con cafeína.

JUSTIFICACIÓN

No es necesario mencionar ni tampoco lo es el objetivo de el presente proyecto, los

diversos contaminantes presentes en las aguas residuales municipales. Lo que sí es

preciso es tener en cuenta que para poder hacer remoción de contaminantes,

primeramente se deben estudiar métodos y condiciones para la optimización de

desarrollo de organismos específicos así como el grado de degradación.

El presente proyecto tiene la intencionalidad de cuantificar, documentar y comparar

los potenciales de degradación de cafeína para aminorar el daño que le causa al medio

ambiente, así como dar pie a nuevas investigaciones para el tratamiento de aguas

residuales con exceso de cafeína (entiéndase por exceso la cantidad límite para ser

perjudicial a los organismos que habitan un nicho ecológico dado) provenientes de

efluentes municipales así como de industrias cafetaleras.

MARCO TEÓRICO

La cafeína es una de las sustancias adictivas más consumidas en todo el mundo, su uso

y abuso ha llegado a convertirse en un hábito culturalmente aceptado en occidente.

Sólo el petróleo excede al café como un producto globalmente comercializado. Las

bebidas gasificadas, actualmente, son las más populares en los Estados Unidos y en el

resto del mundo, y la mayoría contiene cafeína. Su presencia se extiende a más de 60

plantas (hojas de té, café y granos de cacao); comercialmente la encontramos en

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varios alimentos y bebidas, y en muchos medicamentos de venta libre como elemento

estimulante, generalmente en asociación con analgésicos, antigripales y

descongestivos (Enrique, 2008).

Para el aprovechamiento de los residuos sólidos generados durante el proceso de

cultivo y beneficio del fruto, se están utilizando hongos de los géneros Pleurotus,

Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus. Los cuales son muy apreciados por su gran valor

nutritivo y medicinal, la lombricultura, los procesos de ensilaje y la obtención de

pectinas, entre otros, permitiendo obtener productos de un alto valor agregado,

valorizando los subproductos del proceso e impidiendo que se conviertan en fuentes

de contaminación de nuestros recursos naturales (Valencia, 1999).

No obstante, la composición química de los residuos generados en la zona cafetera y

de otros residuos en el sector agrícola (residuos del cultivo de caña de azúcar, cultivo

de arroz, cultivo de algodón, entre otros.) Permiten que sean utilizados en el cultivo de

hongos tropicales (Rodriguez, Blandon G, 1994).

Entre los subproductos agroindustriales más empleados en el cultivo de Pleurotus está

la pulpa de café, rica en carbohidratos, proteínas y minerales, aunque la presencia de

taninos, cafeína y poli fenoles limita su utilización y aplicación comercial; por lo que se

convierte en un considerable agente contaminante de ríos y zonas aledañas a las

despulpadoras de café (García, Bermúdez, & Augur, 2007).

Pleurotus spp. Es muy utilizado en zonas tropicales por sus facilidades para crecer

sobre una gran diversidad de subproductos agroindustriales, y por la calidad nutritiva y

organoléptica de su cuerpo fructífero. Los hongos de pudrición blanca poseen un

sistema multienzimático complejo, del cual la lacasa forma parte, que les permite

degradar además de la lignina un gran número de compuestos de estructuras disímiles

y complejas. Dentro de estos hongos se encuentra Pleurotus spp., La lacasa óxido

reductasa: es una multicobre azul oxidasa que cataliza la oxidación unielectrónica de

orto y para di fenoles y aminas aromáticas, por remoción de un electrón y un protón

de un grupo hidroxilo para formar un radical libre. La enzima lacasa ha sido empleada

de forma inmovilizada para remover compuestos xenobióticos de residuales acuosos,

en la detoxificación de compuestos fenólicos en vinos, en la obtención de hidrolizados

de ligninocelulosa antes de ser usados para la fermentación alcohólica por S.

cerevisiae, y se ha reportado su participación en la decoloración de melazas,

colorantes y efluentes coloreados como la vinaza de destilería y el extracto líquido de

la cocción de la pulpa de café (García, Bermúdez, & Augur, 2007).

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HIPOTESIS

Al aplicar la información recapitulada del comportamiento de degradación de cafeína

de Pleurotus, Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus; se obtendrán resultados veraces y

confiables.

VARIABLES

Independientes: pH, T, Concentración de microorganismos, concentración de solución,

agitación, tiempo de incubación, humedad, inoculo, tipo de m.o.

Dependientes: tasa de crecimiento de los m.o., tasa de mortandad, capacidad de

degradación, reproducción de m.o., cambios en la concentración de la cafeína con

respecto el tiempo.

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la potencialidad y eficiencia de cepas de hongos de los géneros Lentinula,

Ganoderma e Hypsizygus.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Aislar, cultivar y evaluar hongos de los géneros Pleurotus, Lentinula, Ganoderma e Hypsizygus, capaces de degradar cafeína en diversos ambientes.

2. Determinar los ambientes óptimos para su desarrollo y adecuado metabolismo.

3. Comprobar la efectividad del proceso por medio de diseños experimentales.

4. Verificar la no afección de otros parámetros de calidad del agua durante el proceso de degradación.

5. Comparar los resultados obtenidos por diferentes cepas.

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Materiales y métodos

Medios de cultivo

En líneas generales, todos los medios de cultivo utilizados en micología han de contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo de los hongos (carbono,

nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.). El pH ha de ser ligeramente ácido para facilitar el crecimiento de los hongos e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros

microorganismos.

Se añadirán antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de las bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los más usados son el Cloranfenicol y

la Gentamicina. Se añade también actidiona (Cicloheximida) que inhibe el desarrollo de hongos saprofitos ambientales.

En el momento de la siembra, y aun sabiendo que ninguna combinación de medios de

cultivo va a cubrir totalmente el abanico de posibilidades, han de seleccionarse

adecuadamente los medios a utilizar en función del tipo de muestra y de los

microorganismos fúngicos sospechados. Si la muestra procede de zonas

presuntamente contaminadas, es fundamental incluir, junto a los medios normales,

medios que contengan sustancias inhibitorias de bacterias y hongos saprofitos

(cloranfenicol, gentamicina, cicloheximida) (danival.org).

Medios sólidos

Placa

Los medios en placa tienen la ventaja de ofrecer una gran superficie para el

aislamiento pero, para soportar la deshidratación durante el largo período de

incubación a que van a ser sometidos (un mes o más), has de contener una gruesa

capa de medio (25 a 40 ml). Son más peligrosos a la hora de su manipulación y fáciles

de contaminar que los medios en tubo. (danival.org).

Tubos

Los medios en tubo tienen una superficie de trabajo mucho más pequeña, pero

ofrecen máxima seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación

y a la contaminación. (danival.org).

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A continuación, se mencionan algunos métodos sencillos de preparación de los más

frecuentes medios de cultivo utilizados en preservación de cepas de Pleurotus. Se

recomienda tener lo siguiente:

Báscula granataria Papel aluminio

Agua destilada o purificada Olla de presión o autoclave

Matraz Erlen Meyer Cajas de Petri

Mecheros

Agar con extracto de pulpa de café

Ingredientes:

Extracto de pulpa de café 10 g

Agar-Agar 15 g

Glucosa 20g

Procedimiento:

Se pesan los ingredientes y se mezclan en el matraz con 1000 ml de agua destilada. La

suspensión se calienta y agita hasta que queden totalmente disueltos los ingredientes.

Agar con dextrosa y papa

Ingredientes:

Papa 200 g

Agar-Agar 15 g

Dextrosa o Glucosa 20 g Levadura 2 g

Procedimiento:

Pelar y poner a hervir la papa en 500 ml de agua destilada o purificada durante 10-15

min. El extracto se filtra y se adiciona más agua hasta ajustar 1000 ml para reponer lo

que se evaporó. Se agrega los otros ingredientes y se calienta a fuego lento moviendo

constantemente durante 1-2 min hasta que queden totalmente disueltos.

Una vez que cualquiera de los medios anteriores es diluido, el matraz se tapa con

papel aluminio y se esteriliza a 15 lb de presión por 15 min en ollas de presión o

autoclaves. En condiciones de asepsia (en cámara de flujo laminar o con ayuda de

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mecheros), el medio de cultivo tibio se vierte a cajas de Petri estériles de vidrio o

desechables y se deja solidificar. (danival.org).

Cepas

Su aislamiento se puede realizar por medio de tejido (fragmento del hongo) o por

medio de esporas, requiriendo lo siguiente:

Bisturí o navaja

Papel filtro o papel bond estéril

Pinzas de disección

Cámara de flujo laminar o mecheros

Agujas de disección Alcohol o benzal como desinfectantes

Pipetas

Cajas de Petri con medio de cultivo

Vasos de precipitado

Aislamiento por medio de tejido

El hongo se corta longitudinalmente con una navaja; con la ayuda de unas pinzas

estériles y frías, se toman fragmentos del micelio o carne del hongo y se colocan en

cajas de Petri con medio de cultivo. Las cajas con los aislamientos se incuban entre 25-

28°C, de preferencia en la obscuridad o penumbra; 2 ó 3 días después, se observará

crecimiento micelial en forma algodonosa sobre la superficie del medio. El color será

blanco o blanco amarillento, lo que indicará que el aislamiento se realizó

correctamente. Se deben seleccionar los cultivos con mejor apariencia y transferirse a

nuevas cajas con medio de cultivo (Hernández, 2006).

Aislamiento por medio de esporas

Para llevar a cabo este aislamiento, se deberá contar con una esporada del hongo. La

esporada se obtiene colocando el sombrero del hongo con las láminas hacia abajo

sobre papel estéril por un tiempo de 6 a 8 hrs. Para evitar contaminación y favorecer

un ambiente húmedo para que la descarga de esporas se realice adecuadamente, el

hongo y el papel se tapan con un recipiente limpio y también estéril. Transcurrido el

tiempo, se retira el hongo del papel, quedando éste impreso con las esporas en forma

de una huella radial, de preferencia se seca en una incubadora durante 24 hrs. a 28-

30°C. Una vez obtenida la esporada sobre el papel, con una navaja o tijeras estériles se

corta un pequeño fragmento de aproximadamente 1 cm, que se sumerge en 100 ml de

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agua destilada estéril fría, agitándose para que las esporas se disuelvan en el líquido.

De esta dilución, con ayuda de una pipeta, se toman 0.5 ml y se colocan en cajas de

Petri con medio de cultivo. La caja se mueve ligeramente para distribuir

homogéneamente el agua con las esporas en todo el medio. Las cajas se incuban en las

mismas condiciones mencionadas para el aislamiento por tejido y 5 u 8 días después,

se observará el desarrollo del micelio algodonoso. Todo este proceso se debe realizar

en condiciones de esterilidad absoluta.

Inoculo

Material:

Semillas de gramíneas

Bolsas de poli papel 18x25 cm

Mecheros o cámara de flujo laminar

Alcohol al 70 por ciento

Agujas de disección Bisturí o navaja

Olla de presión o autoclave

La elaboración de inoculo se realiza en dos etapas:

Inoculo primario.- es la propagación del micelio en semillas a partir de una cepa

crecida en medio de cultivo.

Inoculo secundario.- es la propagación del micelio en semillas a partir del

inoculo primario, es decir, es la multiplicación del micelio para disponer de una

mayor cantidad para su siembra en el substrato elegido para la producción de

hongos.

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Procedimiento

La elección de los granos o semillas para la producción de inoculo dependerá de su

disponibilidad, bajo costo y calidad. Se pueden emplear semillas de sorgo, trigo,

centeno, cebada, avena, mijo y arroz, entre otros. La semilla previamente se limpia,

lava e hidrata por inmersión en agua de 8-12 hrs. Transcurrido el tiempo de

hidratación, los granos se enjuagan y se escurre el exceso de agua con la ayuda de un

cernidor, pasando un lienzo seco sobre la semilla hasta que al momento de tomar una

porción con la mano ésta no quede húmeda. La cantidad de agua que absorbe la

semilla es de aproximadamente 25-30 por ciento. Una vez controlado el contenido de

humedad en el grano, se coloca 300 g en bolsas de poli papel, después se esterilizan en

olla de presión o autoclave, a 15 lb durante 50-60 min. Las bolsas esterilizadas se

enfrían en un área aislada y limpia, de preferencia en una superficie desinfectada. Las

muestras así preparadas, servirán para hacer el inoculo primario y el secundario. El

inoculo primario como se mencionó anteriormente, se elabora a partir del micelio

desarrollado en medio de cultivo, éste se corta con una navaja o bisturí flameado o

desinfectado con alcohol, en fragmentos de aproximadamente 1 cm y con una aguja

de disección se toma uno de éstos y se coloca sobre la semilla, se le deja un poco de

aire a la bolsa y se le hace un pequeño nudo en la parte superior. Se incuba de 25-28°C

en obscuridad hasta que el micelio cubra totalmente la semilla; 15 ó 20 días después,

el inoculo primario estará listo y podrá ser utilizado para elaborar el inoculo

secundario. El inoculo secundario se realiza vaciando un poco de inoculo primario a

nuevas bolsas con semilla estéril, se agita homogéneamente y se incuban en las

mismas condiciones mencionadas para el inoculo primario. El inoculo secundario es el

que se usa para la siembra y fructificación de las setas. Si el inoculo no se emplea

inmediatamente puede ser almacenado de preferencia en obscuridad y refrigeración a

5°C hasta por tres meses, aunque lo recomendable es utilizarlo a la semana de estar en

refrigeración.

Los hongos del género Pleurotus, toman los nutrientes necesarios para su alimentación

de los materiales sobre los que crecen. Tienen la capacidad de degradar celulosa y

lignina presentes en diversos esquilmos agrícolas (pajas, rastrojos), desechos

agroindustriales (bagazos de caña de azúcar, maguey tequilero, henequén, pulpa de

café), y/o forestales (aserrín y viruta de diversas maderas).

Tratamiento de los substratos

Para utilizar los substratos en el cultivo del hongo seta, es necesario someterlos a un

tratamiento previo, que consiste básicamente en aplicarles calor para disminuir la flora

microbiana nociva que está presente en ellos y de esta manera evitar que los

microorganismos compitan por espacio y nutrientes con el micelio de Pleurotus.

Existen algunos substratos a los que es recomendable aplicarles una fermentación

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aerobia, para proporcionarles una micro flora capaz de proteger al micelio del hongo

seta de otros microorganismos competidores; entre estos substratos están la pulpa de

café y los bagazos de maguey tequilero y de caña de azúcar, que deben ser utilizados

preferentemente frescos, evitando aquellos que hayan tenido previamente un proceso

fermentativo por almacenamiento. El tiempo de fermentación depende del substrato,

por ejemplo, para los bagazos se recomiendan de 8-10 días, mientras que la pulpa de

café, de 3-5 días. Para realizar una fermentación homogénea, es necesario colocar el

substrato en forma piramidal, humedeciendo con agua y tapándolo con un plástico

para mantener el calor y la humedad. Dicho substrato debe voltearse cada 3 días para

favorecer la aireación y el proceso de fermentación. Los materiales que no requieren

de fermentación, deberán mantenerse deshidratados y libres de plagas y

enfermedades. La Pasteurización es la técnica común de tratamiento del substrato

para el cultivo de Pleurotus, y su propósito es preparar a dicho substrato para un eficaz

desarrollo del hongo. Este método se puede aplicar de dos formas distintas:

Pasteurización con vapor.

Consiste en colocar el substrato en un área cerrada, ésta puede ser un pequeño

cuarto de concreto o un recipiente metálico, se le aplica vapor generado por una

caldera eléctrica, de diesel o gasolina, por medio de tubos de cobre o mangueras

resistentes al calor. Se recomienda que la temperatura alcance entre de 70-80°C y que

el substrato se mantenga de 2 a 4 hrs. en esa condición.

Pasteurización por inmersión en agua caliente.

El substrato se sumerge en agua caliente (75-80°C) durante 1 hr. Una vez llevada a

cabo una buena pasteurización del substrato, éste estará listo para ser sembrado con

la semilla o inoculo previamente preparado. Si se utilizan pajas o rastrojos, deben ser

cortados en segmentos de 5 a 10 cm por medio de una picadora eléctrica u otro

sistema que cumpla la misma función. Es importante que la temperatura de

pasteurización se mantenga estable, ya que si se eleva demasiado puede ocasionar

cambios en la composición química del substrato provocando la solubilización de

azúcares simples, con lo que predispone al substrato a una mayor invasión de hongos

contaminantes que impiden el buen desarrollo del hongo seta. De manera contraria, al

pasteurizar a temperaturas inferiores de 55 °C se evita destruir organismos

competidores presentes en el substrato. También hay que verificar que los substratos

utilizados para el cultivo del hongo, no hayan sido previamente tratados con

plaguicidas o fungicidas.

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Determinación de cafeína por cromatografía líquida con detección UV-VIS

La cromatografía líquida de alta eficacia se utiliza para la separación y análisis

cuantitativo de una amplia variedad de mezclas, especialmente aquellas en las cuales

sus componentes no son volátiles o son térmicamente inestables para ser separados

por cromatografía de gases. El objetivo de esta práctica es la separación y

determinación cuantitativa de cafeína, que es constituyente usual en algunos

analgésicos, utilizando la calibración con patrones. Para la separación cromatográfica

se va a utilizar un cromatógrafo de líquidos que consta de una bomba de alta presión

de dos pistones, una válvula de inyección con un bucle de 20 μl, una columna C18

y un

detector de ultravioleta visible. Los datos cromatográficos son procesados a través de

una interfase por un ordenador que contiene un programa de integración. (Jeffery,

1989)

Aparatos y material

Cromatográfo de líquidos de alta eficacia Perkin Elmer con detector uv-visible Columna cromatográfica C

18 de 15 cm de longitud, 4.0 mm de diámetro interno y 5

μm de tamaño de partícula

Filtros para disolventes de 0.40 μm

8 matraces aforados de 10 mL

2 matraces aforados de 100 mL

1 matraz aforado de 500 mL

1 matraz aforado de 1000 mL

Pipeta graduada de 10 mL

Pipeta graduada de 5 mL

Reactivos

Cafeína, sólido.

Ácido acetilsalicílico, sólido.

Metanol.

Ácido fosfórico.

Disolución de 200 mg/L de cafeína. Se prepara pesando una cantidad adecuada de cafeína para preparar 100 mL de disolución y se disuelve en metanol.

Disolución de 500 mg/L de aspirina. Se prepara pesando una cantidad adecuada de aspirina para preparar 100 mL de disolución y se disuelve en metanol.

Fase móvil. Mezcla de metanol/agua/ácido fosfórico formada por 40% de metanol, 59.92% de agua y 0.08% de ácido fosfórico. Filtrar la fase móvil antes de usarla cada día.

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Calibrado

Se prepara una disolucion patrón que contenga entre 10 y 50 μg/mL de cafeína en la

fase móvil, respectivamente. Se fija la longitud de onda de detección en 254 nm y el

caudal en 1.0 mL/min. Se inyectan en el cromatógrafo de líquidos la mezcla preparada

y se registra el área correspondiente. La curva de calibrado se obtiene representando

el área del pico cromatográfico frente a la concentración.

Determinación de cafeína en una muestra

Se inyectan 20 μl de muestra tres veces y se cuantifican los picos correspondientes a

cafeína a partir de la curva de calibrado obtenida en el apartado anterior. El resultado

se expresa como μg de cafeína y aspirina por mL de muestra. Una vez terminado el

análisis es necesario pasar por la columna cromatográfica unos mL de metanol para

asegurar su buen estado de conservación para análisis posteriores. (Jeffery, 1989).

Resultados

1. Representar los calibrados obtenidos y obtener sus ecuaciones.

2. Determinar el contenido de cafeína y ácido acetilsalícilico en la muestra.

3. Calcular el intervalo de confianza y la precisión. (Jeffery, 1989)

Procedimiento

Medios de cultivo

Se emplearon tres medios agarizados: agar papa dextrosa (SIGMA); extracto pulpa de café con glucosa y extracto pulpa café sin glucosa. Todos los medios se esterilizaron a 121 °C durante 15 min.

Inoculo

Granos de trigo (Triticum aestivum L.) (50 % humedad) previamente esterilizados durante 1 h a 121 0C; posteriormente se inocularon con las cepas en estudio y se incubaron a 25 0C durante 10 d.

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Sustrato

Se empleó pulpa de café (Coffea arábica L.) seca, molida y tamizada (entre 0,8 y 2mm).

Elección de cepas

Género Cepa

Pleurotus CCEBI 3024

Lentinula guarapiensis

Ganoderma tessellatus

Hypsizygus tsugae

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Medición de la concentración de cafeína

Se medirá la concentración de cafeína por el método de cromatografía. Las mediciones

se realizarán cada día hasta los 3 días de crecimiento.

Resultados

Se realizarán gráficas de concentración de cafeína versus tiempo, donde será

apreciable la eficacia relativa de degradación de cada cepa. Para así determinar cual

cepa tiene mejor comportamiento con respecto al grado de degradación contra el

tiempo. Este proyecto apenas inicia, hasta ahora ha sido puramente teórico, donde se

plantea el problema y las estrategias para solucionarlo. Si todo sale bien, el siguiente

semestre concluirá con resultados tangibles, confiables, representativos y validados.

1 Tabla de cepas seleccionadas

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Bibliografía

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