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BASES BIOQUÍMICAS DEL ESTRÉS OXIDATIVO
TEORÍA MITOCONDRIAL Y ESTRÉS OXIDATIVO
ESTRÉS OXIDATIVO Y GLICACIÓN
CURSO DE POSTGRADOMEDICINA DEL ENVEJECIMIENTO FISIOLOGICO
Barcelona, 23 Noviembre 2012
Consuelo Borrás BlascoUniversidad de Valencia
¿Qué es el envejecimiento?
El envejecimiento es la acumulación
progresiva de cambios con el tiempo
que son responsables del aumento
de probabilidad de enfermedad y
muerte de los individuos de una
determinada especie
S. Dalí
Harman, D (1992)
In Free radicals and aging p.47
UNIVERSAL
INTRINSIC
PROGRESIVE
DELETERIOUS
AGEING
Características del envejecimiento
Vina et al (2007) IUBMB Life, according to Strehler, B. L. (1977)
The decay of aging
The contributions of the aging processto aging changes are small early in lifebut rapidly increase with age due to theexponential nature of the process(Harman 1991)
Aging causes a decay at thesubcellular, cellular, tissue and organiclevels
Decaying of physiologicalfunctions with age
10090807060504030200
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
GLYCEMIASPEED OF NERVE CONDUCTIONVITAL CAPACITYCREATININE CLEARANCE
AGE : YEARS
% O
F PE
RFO
RM
AN
CE
AT 1
5 YE
AR
S
Cancer risk increases with age
Survival curves in two populations:
10050000
20
40
60
80
100
Years
%SURVIVAL
A Good living conditions
B Bad living conditions
Thiol containing antioxidants increaseaverage life span in Drosophila
Viña et al (1992) EXS
GeneticMutation
CellularWaste
Accumulation
Wear andTear
ANTAGONISTIC PLEIOTROPY THEORY
WASTE ACCUMULATION THEORY
FREE RADICAL THEORY
INSULIN RESISTANCE
ADVANCED GLYCATION
TELOMERES AND HAYFLICK
THE ERROR CATASTROPHE THEORY
AUTOIMMUNITY
CIRCADIAN REGULATION
EVOLUTIONARY THEORY
Theories of aging. Classification
Vina et al (2007) IUBMB Life
Theories of aging
Denham Harman
The free radical theory of ageing
Construct long-lived and short-lived animals and then assay their antioxidant defense levels.
Construct animals with genetically altered levels of antioxidant defense enzymes and then test for lifespan.
Testing the oxidative damage theory
Overexpression of SOD / CAT increase life span of Drosophila melanogaster
But that of each one does not
Orr and Sohal (1994) Science
Testing the oxidative damage theory
Age (days)
ControlControlTransgenic Transgenic Cat/SODCat/SOD
Females behave as double transgenicsoverexpression MnSOD and glutathione peroxidase
Testing the oxidative damage theory
Borrás et al (2003) Free Rad Biol Med
BASES BIOQUÍMICAS DEL ESTRÉS OXIDATIVO
ESTRÉS OXIDATIVOESTRÉS OXIDATIVO
RADICALES LIBRESRADICALES LIBRESANTIOXIDANTESANTIOXIDANTES
SiesSies, H. 1986, H. 1986
Daño Oxidativo a BiomoléculasDaño Oxidativo a Biomoléculas
LÍPIDOSLÍPIDOS
GLÚCIDOSGLÚCIDOS
PROTEÍNASPROTEÍNAS
DNADNA
Situaciones patológicas asociadas a estrés oxidativo
Situaciones patológicas asociadas a estrés oxidativo
Distrés Respiratorio del Adulto
Enfermedad de ParkinsonEnfermedad de AlzheimerEsclerosis lateral amiotróficaDiabetesCáncer
Sobrecarga de hierroInfarto de miocardioAlcoholismoRadioterapiaTabaquismoTraumaAterosclerosisSIDA
Procesos fisiológicos asociados a estrés oxidativo
Procesos fisiológicos asociados a estrés oxidativo
ApoptosisTransducción de señalesDefensa Inmunitaria
EnvejecimientoEjercicio Físico
ConceptoConcepto Moléculas que tienen uno o más electrones desapareados en su capa más externa
FormaciFormacióónn
X-Y X· + Y·11
22
33
X X+·+ e-
X + e-
Radicales Libres Concepto y Formación
X-·
Rotura homolítica de un enlace covalente
Pérdida de un electrón por parte de una molécula
Transferencia de un electrón a una molécula
Radicales Libres Estabilidad de algunos radicales libres
RadicalRadical SustratoSustrato Vida media(a 37ºC)
Vida media(a 37ºC)
HO· LH 10-9 segundos
RO· LH 10-6 segundos
ROO· LH 7 segundos
L· O2 10-8 segundos
1O2 H2O 10-6 segundos
Q·- Días
Radicales Libres Concentraciones de ROS en
mitocondrias hepáticas y citosolRadicalRadicalRadical Concentración en estado estacionarioConcentraciConcentracióón en estado estacionarion en estado estacionario
Mitocondrias hepáticas
Mitocondrias Mitocondrias hephepááticasticas HígadoHHíígadogado
Superóxido (O2-•) 0.1 nM 0.02
Peróxido de hidrógeno (H2O2) 0.05 μM 0.1 μM
Radical hidroxilo (HO•) 0.06 aM 0.06 aM
Radical alquilo (R•) 6 aM 6 aM
Radical peroxilo (ROO•) 2 nM 2 nM
Oxígeno s inglete (1O2) 0.1 fM 0.1 fM
Principales especies reactivas
No radicalesRadicales
ROS
RNS
Superóxido (O2-•)
Hidroxilo (HO•)Peroxilo (ROO•)Alcoxilo (RO•)Hidroperoxilo (HO2•)
Peróxido de hidrógeno (H2O2.)Acido hipocloroso (HOCl)Ozono (O3)Oxígeno singlete (1O2)
Oxido nítrico (NO•).Dióxido de nitrógeno (NO2•)
Peroxinitrito (ONOO-)Acido nitroso (HNO2)Trióxido de dinitrógeno (N2O3)Tetróxido de dinitrógeno (N2O4)
Generación de los radicales libres derivados del oxígeno (ROS)
Daño celular
H2O2H2O2
HH22O + OO + O22
R ·R ·
RHRH
2GSH2GSHGPxGPx
GSSGGSSG
HH22OO
R. R. FentonFenton
FeFe+2+2SODSOD
CATCAT
O2-·O2-· OH·OH·
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical superóxido (O2-·)
No es una especie especialmente dañina per se (en medio acuoso).
In vitro altera la síntesis de ATP al atacar al complejo NADH deshidrogenasa de la cadena de transporte electrónico mitocondrial.
Es importante porque:
se transforma en H2O2 y puede dar lugar a OH•puede promover la reducción de metales de transición
puede reaccionar con el NO• y formar ONOO-
puede protonarse y formar el radical perhidroxilo (HO2•)Se ha estimado que un adulto de 70 kg de peso produce
diariamente 0,147 moles de superóxido.
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical superóxido (O2-•). Lugares de formación.
Detoxificación.
Lugares de formación Detoxificación
Dismutación químicaO2
-·+ O2-· H2O2
ONOO-
Dismutación enzimática (SOD)
O2-·+ NO·
Reacción con NO•
1,0x105 M-1s-1
O2-·+ O2
-· H2O2
2,1x109 M-1s-1
6,9x109 M-1s-1
Cadena de transporte electrónico mitocondrial
Sistemas de transporte electrónico del retículo endoplásmico (cit P450)
Acción de la xantina oxidasa
Fagocitos activados
Oxidación de moléculas por el oxígeno
Especies activadas de oxígeno (ROS)Peróxido de Hidrógeno (H2O2)
No es un radical libre, pero es un agente oxidante porque en presencia de O2•- y/o metales de transición da lugar al radical OH•
Es la forma menos reactiva de las ROS. Es estable en ausencia de moléculas que catalicen su descomposición
Atraviesa con facilidad las membranas y puede propagar el daño oxidativo.
A concentraciones superiores a 50 mM puede atacar ciertas dianas celulares:
In vitro oxida los grupos -SH de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
Especies activadas de oxígeno (ROS)Peróxido de hidrógeno (H2O2).
Producción. Detoxificación.
Producción Detoxificación
H2O2
2 H2O + O22 H2O2
Sistemas de transporte electrónico del retículo endoplásmico (cit P450)
Acción de la xantina oxidasa
Dismutación del O2•-
Acción de algunos enzimas
Reducción directa bivalente de una molécula de O2
2O2 + 2e- + 2H+
Se lleva a cabo por las catalasas. Enzimas que se encuentran presentes en los peroxisomas.
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical hidroxilo (HO•)
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical hidroxilo (HO•)
Es la especie activada de oxígeno más reactiva.
Tiene una vida media muy corta.
Reacciona con cualquier tipo de biomolécula que se encuentra muy cerca de su lugar de formación.
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical hidroxilo (HO•).
Producción. Defensa.
Especies activadas de oxígeno (ROS)Radical hidroxilo (HO•).
Producción. Defensa.Producción Detoxificación
HO• + H•H2O + hυ
2 HO•H2O2 + hυ
HO• + OH- + O2O2-• + H2O2
No existe ningún sistema de protección eficaz.
Las únicas defensas posibles son:
prevención de la formación
sistemas reparadores del daño ocasionado
Para que un molécula actuara como scavengereficaz se estima que debería estar en concentraciones muy elevadas en el organismo
Lisis del agua o del H2O2 por radiaciones ionizantes
Reducción del H2O2 por metales de tansición
Reacción de O2•- con H2O2 o HOCl
Descomposición del ONOO-
Producción de especies activadas de oxígeno en el organismo
Producción de especies activadas de oxígeno en el organismo
Fuentes Fuentes exexóógenasgenas Fuentes endFuentes endóógenasgenas
Radiaciones ionizantes
Xenobióticos
Hiperoxia
Cadena de transporte electrónico mitocondrial
Reacción de Fenton-Haber-Weiss
Sistema hipoxantina-xantina oxidasa
Sistemas de transporte electrónico del retículo endoplásmico
Fagocitos activados
Microsomas y/o peroxisomas
Determinadas actividades enzimáticas
Oxidación de moléculas por el oxígeno
I
III
II
IV
O2. O2
-
O2. O2
-
Producción de especies activadas de oxígeno
Cadena de transporte electrónico mitocondrial
Producción de especies activadas de oxígeno
Cadena de transporte electrónico mitocondrial (II)
Producción de especies activadas de oxígeno
Cadena de transporte electrónico mitocondrial (II)
Las formas reducidas de los complejos redox de la cadena de transporte electrónico mitocondrial pueden transferir directamente electrones al O2.
Sólo el citocromo a3 del complejo IV puede retener las formas parcialmente reducidas del O2, es decir, los complejos I y III son productores de radicales libres (O2
-•)
El complejo IV no forma O2-•, y, además, exhibe cierta
actividad SOD.
La producción mitocondrial de especies activadas de oxígeno aumenta en el estado 4 (elevado ATP/ADP), ya que aumenta la presión parcial de O2 y el grado de reducción de los complejos I, II y III.
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (I)
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (I)
El O2-• reduce monoeléctricamente al Fe+3, y el
Fe+2 producido reduce al H2O2 generando HO•
El hierro tiene un papel como catalizador.
El O2-• necesita que exista H2O2 para producir
HO•, mientras que el H2O2 no.
O2-• + Fe+3 O2 + Fe+2
H2O2 + Fe+2 HO- + HO• + Fe+3
H2O2 + O2-• HO- + HO• + O2
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (II)
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (II)
El Fe+3 puede ser reducido a Fe+2 por distintas moléculas, formándose un ciclo de regeneración de Fe+2 y por lo tanto generándose más HO•
La cantidad de hierro libre en el plasma humano es muy pequeña, casi todo él se encuentra unido a proteínas que lo transportan o lo almacenan, por lo que difícilmente puede participar en esta reacción.
Se ha postulado la existencia de un pool de hierro de bajo peso molecular (hierro unido a ADP, ATP, citrato...) que puede participar en las reacciones de Fenton y Haber-Weiss.
Fe+3 Fe+2
O2-• O2
AscH- Asc·-
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (III)
Producción de especies activadas de oxígeno
Reacción de Fenton y Haber-Weiss (III)
M+n Fe (II)Cu (I)Ti (III)Co (II)Ni (II)
M+n+1
M+n H2O2
HO•
HO-e-
Los efectos dañinos provocados por niveles elevados de oxígeno asícomo de sus productos activados y de otras sustancias prooxidantes varían considerablemente según el organismo sobre el que actúen, la edad, el estado fisiológico y la dieta. Diferentes tejidos pueden afectarse de distinto modo.
B. Halliwell
Efectos de los radicales libres sobre el organismo
Efectos de los radicales libres sobre el organismo
Efectos de los radicales libres sobre el organismo
Efectos de los radicales libres sobre el organismo
¿ Cuándo puede afirmarse que los radicales libres juegan un papel central en el desarrollo de una
patología?
Los ROS/RNS se forman en el lugar donde existe lesión.
Las aparición de estas especies reactivas encaja en el tiempo con la patología.
La eliminación o prevención de su formación conlleva efectos beneficiosos.
La aplicación directa de los ROS/RNS a las concentraciones encontradas in vivo reproduce la patología.
AntioxidantesMecanismo de actuación de un antioxidante
no enzimático
AntioxidantesMecanismo de actuación de un antioxidante
no enzimático
AH + R·RH + A·
FormaciFormacióón de un radical derivado del antioxidante n de un radical derivado del antioxidante capaz de estabilizar (deslocalizar) el electrcapaz de estabilizar (deslocalizar) el electróón n
desapareadodesapareado
Antioxidantes celularesAntioxidantes celulares
Enzimas antioxidantes :Enzimas antioxidantes :• Catalasa• Superóxido dismutasa• Glutatión peroxidasa
Sistemas no enzimáticos :Sistemas no enzimáticos :• Glutatión• Vitamina C (ácido ascórbico)• Vitamina E (α-tocoferol)• Acido úrico• Bilirrubina• Albúmina
Antioxidantes FisiológicosGlutatión.
Antioxidantes FisiológicosGlutatión.
l El glutation (γ-glutamil-cisteinil-glicina) es el tiol no proteico más abundante en las células.
l Entre otras muchas funciones biológicas puede actuar como antioxidante.
l La actividad antioxidante la debe a su grupo tiol de la cisteína.
l Puede actuar como scavengero participar en el llamado ciclo redox del glutatión.
O
N
N
O
NH3
O
H
SHO
H
OO
+
-
-
Glutatión. Estructura químicaGlutatión. Estructura química
γ-glutamil-cisteinil-glicina
γγ--glutamilglutamil--cisteinilcisteinil--glicina glicina
GSHGSHGSH
NSHSHSHOH
OO-
OO
NH3
O
+
NH–
–Grupo tiolGrupo Grupo tioltiol Responsable de la
actividad como antioxidante
celular
Responsable de la Responsable de la actividad como actividad como
antioxidante antioxidante celularcelular
Antioxidantes FisiológicosGlutation. Reacciones redox no enzimáticas.
Antioxidantes FisiológicosGlutation. Reacciones redox no enzimáticas.
Puede intervenir en tres tipos de reacciones Puede intervenir en tres tipos de reacciones redoxredox
Reacciones monoelectrónicasGSH + X· RH + GS·
RSSG + GS-RS-
+ GSSG
Intercambio tiol-disulfuro
Oxidaciones dielectrónicas
2 GS· GSSG
RSSG + I-RS-
+ GSI
Glutatión. Ciclo redoxGlutatión. Ciclo redox
GSH
GSSGROH
ROOH NADP+
NADPH
Glucosa-6-fosfato
6-fosfogluconato
Mantenimiento de los niveles de GSH:
• Glutatión reductasa
• Síntesis de novo
GlutationPeroxidasa
GlutationReductasa
Glucosa-6-fosfatodeshidrogenasa
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosSuperóxido dismutasa.
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosSuperóxido dismutasa.
Cataboliza la reacción de dismutación del superóxido
2 O2·- + 2 H + H2O2 + O2
Formas:
• SOD Cu y SOD Zn (formas isoméricas)Localización:
Intracelular en citosol (hígado, cerebro y testículos)
Extracelular en matriz extracelular• Superóxido dismutasa Mn
Localización en la matriz mitocondrial.
Glutatión peroxidasa Selenio dependienteCataboliza :
1) Reducción de peróxido de hidrógenoH2O2 + 2 GSH 2 H2O + GSSG
2) Reducción de peróxidos orgánicosROOH + 2GSH ROH + H2O + GSSG
Glutatión peroxidasa Selenio no dependienteCataboliza la reducción de peróxidos orgánicos
Ambos enzimas utilizan GSH como dador de equivalentes reductores. Existe mayor actividad en citosol, aunque también aparece en matriz mitocondrial.
Glutatión peroxidasa Selenio dependienteCataboliza :
1) Reducción de peróxido de hidrógenoH2O2 + 2 GSH 2 H2O + GSSG
2) Reducción de peróxidos orgánicosROOH + 2GSH ROH + H2O + GSSG
Glutatión peroxidasa Selenio no dependienteCataboliza la reducción de peróxidos orgánicos
Ambos enzimas utilizan GSH como dador de equivalentes reductores. Existe mayor actividad en citosol, aunque también aparece en matriz mitocondrial.
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosGlutatión Peroxidasa
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosGlutatión Peroxidasa
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosCatalasas.
Sistemas Antioxidantes EnzimáticosCatalasas.
Catabolizan la descomposición del peróxido de hidrógeno:
2 H2O2 H2O + O2
LocalizaciLocalizacióónn:
• Intracelular, sólo en peroxisomas
• Existe gran actividad en hígado y cerebro.
Antioxidantes NaturalesVitamina C (ácido ascórbico)Antioxidantes Naturales
Vitamina C (ácido ascórbico)
OHHO
O OHOH
Antioxidantes NaturalesVitamina C (ácido ascórbico).Antioxidantes Naturales
Vitamina C (ácido ascórbico).
La vitamina C es un antioxidante de naturaleza hidrosoluble.
Acción antioxidante
O
OHOH
OOH
OH
O
OO
OOH
OH
O
OOH
OOH
OH
·ROOHROO··
Puede tener una acción prooxidante si hay en el medio elevados niveles de Fe+3, ya que reduciría a éste a Fe+2 y podrían originarse radicales HO•
Antioxidantes NaturalesVitamina C. Reacción con distintos radicales
Antioxidantes NaturalesVitamina C. Reacción con distintos radicales
R·R· RadicalRadical AH- + R·AH- + R· A·- + RHA·- + RHkobs (M-1s-1)
* Reacción de dismutación
HO·hidroxilo
1,1x1010
RO·alcoxilo
1,6x10 9
ROO·peroxilo
1,0x106
GS· tiílo 6,0x10 8
UH·- uratoílo 1,0x10 6
TO·- tocoferoxílico 2,0x10 5
A·- ascorbilo * 2,0x10 5
CPZ·- clorpromazina 1,4x10 9
O2·- superóxido 1,0x10 5
Antioxidantes NaturalesVitamina C . Regeneración del ascorbato.
Antioxidantes NaturalesVitamina C . Regeneración del ascorbato.
Dismutación no enzimáticaDismutaciDismutacióónn no no enzimenzimááticatica
Deshidrorreductasa o NADH-semideshidrorreductasa(glutarredoxina)DeshidrorreductasaDeshidrorreductasa o NADHo NADH--semideshidrorreductasasemideshidrorreductasa((glutarredoxinaglutarredoxina))
Asc·- + Asc·- AscH2 + AscH-
Asc·- + 2 GSH 2 AH- + GSSG
Antioxidantes NaturalesVitamina C.
Regeneración del ácido ascórbico. Papel de la
glutarredoxina.
Antioxidantes NaturalesVitamina C.
Regeneración del ácido ascórbico. Papel de la
glutarredoxina.
NADP+ NADPH
ROOH
ROOHROOH ROH
ROOROO··
GSHGSH GSSGGSSG
AcAc. asc. ascóórbicorbicoAcAc. . deshidroascdeshidroascóórbicorbico
Degradación
glutarredoxina
glutatiónperoxidasa
glutatión reductasa
Antioxidantes NaturalesVitamina E
Antioxidantes NaturalesVitamina E
l Es un conjunto de ocho sustancias liposolubles de los que α-tocoferol, β-tocoferol y α-tocotrienol son las más activas.
OCH
CHHO
H CRCH3
3
3
3
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α-tocoferol)
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α-tocoferol)
• Actividad antioxidante• Destinos del radical derivado de la acción
antioxidante
3
Propagation oflipid peroxidation
reacciones reacciones redoxredox
oxidacioxidacióónnQuinone
reduccireduccióónn
α-T-OHa
b
c
3O CH
R
CH3
CH3
OHCH3
O CHR
CH3
CH3
OCH3
ROO· ROOH
·
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α -tocoferol)
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α -tocoferol)
O CH3
R
CH3
CH3
OHCH3
O CH3
R
CH3
CH3
OCH3·
A-·AH-
ROO·o
R·
ROOH
oRH
Recuperación por ascorbato
Reacción con RH, ROOHc
AntioxidanteAntioxidante
ProoxidanteProoxidante
a
El radical tocoferoxílicopuede propagar la peroxidación lipídica en las LDLBowry & Stocker, 1993J. Am. Chem. Soc. 115, 6029-6044
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α -tocoferol)
Antioxidantes NaturalesVitamina E (α -tocoferol)
O CH3
R
CH3
CH3
OCH3·
O CH3
R
CH3
CH3
CH3O
OH
b
Oxidación a forma quinona
La forma La forma quinonaquinona no puede ser no puede ser transformada en vitamina E. Grandes transformada en vitamina E. Grandes cantidades de cantidades de ascorbatoascorbato a bajo a bajo pHpH ssíípueden transformar la forma pueden transformar la forma quinonaquinonaen vitamina Een vitamina E
Lieber et al., 1990J. Am. Chem. Soc. 112, 6995-6700
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (I)
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (I)
Los flavonoides son un tipo de productos fitoquímicos, con efectos potencialmente beneficiosos para la salud humana.
Los flavonoides son metabolitos secundarios de origen vegetal, una parte importante de la dieta humana y unos principios activos en algunas plantas medicinales.
Los flavonoides tienen muchas funciones diversas:AntioxidantesMutagénicos y con efectos biocidasAnticarcinogénicosPropiedades antifertilizantesEfectos beneficiosos en sistemas inflamatorios e
inmunomoduladoresInteracción con procesos de transducción de señales
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (II). Estructura básica de los
Flavonoides.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (II). Estructura básica de los
Flavonoides.
O
O
4
5
6
7
81
3
2
3’
4’
5’
6’
2’
A
B
C
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (III). Diversidad estructural de los
Flavonoides.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (III). Diversidad estructural de los
Flavonoides.
O
O
O
OOH
O
OOH
O
OH
·O
OH
O
O
Flavanona
Flavona
Dihidroflavonol Flavonol
Flavan-3-ol
Antocianidina
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (IV). Relación estructura-actividad
antioxidante.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (IV). Relación estructura-actividad
antioxidante.
O
O
OHOH
OH
OH
OH
O
O
OHOH
OH
OH
OH
O
O
OHOH
OH
OH
OH
Presencia de la estructura o-dihidroxi en el anillo B; esto confiere una estabilidad mayor a la forma radical y participa en la deslocalización electrónica.
Una conjugación del 2,3-doble enlace con la función 4-oxo en el anillo C.
Los grupos 3-OH y 5-OH con la función 4-oxo en los anillos A y C para un potencial máximo como scavengers
Bors et al., 1990 Meth. Enzymol. 186, 343
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (V). Mecanismos antioxidantes.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (V). Mecanismos antioxidantes.
Los flavonoides son buenos captadores de radicales libres siguiendo la reacción general
Los flavonoides forman complejos con iones hierro (catalizadores de la reacción de Fenton, que conduce a radicales hidroxilo), por esto son importantes antioxidantes
Fl(OH) + R· Fl(O·) + RHflavonoide flavonoide
radical (aroxilo)
Fl(OH) + Fe Fl(O·) Fe
1
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (VI). Actividad antioxidante y
prooxidante.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (VI). Actividad antioxidante y
prooxidante.
Fl(OH) + R· Fl(O·) + RH
Fl(OH) + Fe Fl(O·) Fe
Efectos Antioxidantes
Efectos Prooxidantes
Radicalflavonoide
estable
Complejoflavonoide-Fe
inerte
Radical flavonoideRédox lábil
Complejoflavonoide-Fe
Rédox lábil
Los Los flavonoidesflavonoides no sonno son un grupo homogun grupo homogééneo de neo de compuestos y las mismas propiedades esenciales para su compuestos y las mismas propiedades esenciales para su actividad antioxidante pueden participar en reacciones actividad antioxidante pueden participar en reacciones
prooxidantesprooxidantes..
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (VII). Sinergismo entre flavonoides y
vitamina C.
Antioxidantes NaturalesFlavonoides (VII). Sinergismo entre flavonoides y
vitamina C.
Fl(O·) + AscH- Fl(OH) + Asc·-
Recuperación del radical aroxilopor vitamina C
Recuperación delradical de la
vitamina C por flavonoides
El “orden teórico” en una reacción biológica sería:El “orden teórico” en una reacción biológica sería:
R·
RH
Fl(OH)
Fl(O·)
Asc·-
AscH-
Asc·-
Asc
Sin embargo, sólo puede ser aplicado a un número limitado de flavonoides con potencial de reducción adecuado.
AntioxidantesElección de un antioxidante
AntioxidantesElección de un antioxidante
A la hora de evaluar o elegir un antioxidante A la hora de evaluar o elegir un antioxidante deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos:
Tipo de biomolécula que se pretende proteger.
Si el posible antioxidante puede estar en el organismo a una concentración que muestre eficacia.
Mecanismo antioxidante: saber si el posible antioxidante actúa previniendo la formación de especies reactivas, actúa como scavenger o repara los daños ocasionados.
El antioxidante no debe causar efectos desagradables en lugares distintos al que se desea proteger.
TIPOS DE ANTIOXIDANTESTIPOS DE ANTIOXIDANTESTIPOS DE ANTIOXIDANTES
1. INHIBEN QUIMICAMENTE LOS EFECTOS DE LOS OXIDANTES (p.e. Vitamina C)
2. INHIBEN LA FORMACION DE LOS RADICALES LIBRES(p.e. El alopurinol que inhibe la xantina oxidasa)
3. ESTIMULAN LA SINTESIS DE CATALIZADORES (ENZIMAS ANTIOXIDANTES) (p.e. Los estrogenos y fitoestrogenos que inducen la expresion de SOD y peroxidasa)
BIOMARCADORES DE ENVEJECIMIENTO
BIOMARCADORES DE ENVEJECIMIENTO
Cambiar progresivamente con la edad
Referirse a parámetros relevantes a la salud y longevidad
Ser poco invasivos
Ser –relativamente- fáciles de determinar
Ser reproducibles
BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO
BIOMARCADORES DE ESTRÉS OXIDATIVO
Deben tener las Deben tener las siguentessiguentes caracteristicascaracteristicas
Cambiar cuando hay cambios en el estatus redox
Mostrar daño a varios tipos de moleculas(proteínas, lípidos, DNA, péptidos etc)
Ser poco invasivos
Ser –relativamente- fáciles de determinar
Ser reproducibles
Weindruch R (1997) New England Journal of Medicine
TEORÍA MITOCONDRIAL DEL ESTRÉS OXIDATIVO EN EL ENVEJECIMIENTO
Teoría mitocondrialdel envejecimiento
Miquel, J., Economos, A.C., Fleming, J.Johnson Jr., J.E. (1980) Exp. Gerontol. 15, 575-591
ES UN DESARROLLO DE LA TEORÍA DE LOS RADICALES
EN EL ENVEJECIMIENTO, EN LA CUAL, EL DR. MIQUEL DA
UNA IMPORTANCIA ESPECIAL A LA MITOCONDRIA COMO
FUENTE GENERADORA DE RADICALES LIBRES
Mitocondria
Mitochondria andFree radical theory of aging
Mitochondria: structure Mitochondria under the microscope
Damage to mitochondrial genome!Impaired mitochondrial gene
expression.Inability of mitochondria to replicate,
divide, further reducing energy production, etc.Damaged mitochondria replicate
faster than intact mitochondria.
Focus on mitochondria
I
III
II
IV
Cadena de transporte electrónico mitocondrial
O2. O2
-
O2. O2
-
NADH FMN [Fe-S]6 UQ bT bK c1 a3a
FAD
[Fe-S]3
Succinato
c
O2 O2· -
O2
H2O
O2 O2· -
El 2% del OEl 2% del O22 consumido por la mitocondria se transforma enconsumido por la mitocondria se transforma en OO22·· --
La producciLa produccióón de On de O22·· -- aumenta cuando el aporte de sustrato excedeaumenta cuando el aporte de sustrato excedela demanda energla demanda energééticatica
Complejo IIComplejo II
Complejo VIComplejo VI
Complejo IComplejo I Complejo IIIComplejo III
Cadena de transporte electrónico mitocondrial
• Harman, D.,(1956),Aging: a Theory based on
free radical and radiation chemistry,J.
Gerontol., 11,298- 300
• Harman, D.,(1991),The Aging Process -
Major Risk Factor for Disease and
Death,Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of
America,88, 5360- 5363
• Miquel, J.; Economos, A. C.; Fleming, J.; Johnson Jr., J. E. (1980) Mitochondrial role in cell aging.. Exp. Gerontol., 15, 575-591
• Ames, B.N., Shigenaga, M., Hagen, T.M.,(1993),Oxidants, antioxidants and thedegenerative diseases of aging, PNAS,90,7915- 7922
• Beckman, K.B., Ames, B.,(1997), Oxidative decay of DNA,J. Biol. Chem. 272,19633- 19636
• AGE associated accumulation ofMITOCHONDRIAL DEFICITS due toOXIDATIVE DAMAGE (Shigenaga et al, 1994; Sastre et al., 1998).
• OXIDATIVE lesions to MITOCHONDRIAL DNA accumulate with AGE (Hayakawaet al., 1991; Mecocci et al., 1993; Ames et al., 1993; García de la Asunción et al., 1996; Sastre et al., 1998).
0
2
4
6
8
10
12
14
Machos Hembras
nm
ol G
SH /
mg
pro
t
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Machos Hembras
nm
ol G
SH /
mg
pro
t
*
MITOCONDRIAS HEPÁTICASMITOCONDRIAS HEPMITOCONDRIAS HEPÁÁTICASTICAS TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
0123456789
10
MACHOS HEMBRAS
nmol
GSH
/mg
prot
0123456789
10
MACHOS HEMBRAS
nmol
GSH
/mg
prot
Efecto del GEfecto del Géénero en los Niveles de nero en los Niveles de GlutatiGlutatióónn Reducido (GSH)Reducido (GSH)
EXISTE UNA RELACIÓN INVERSA ENTRE EL
DAÑO OXIDATIVO A DNA MITOCONDRIAL Y LA
LONGEVIDAD
Oxidative damage to DNA correlates with MLSP
LA TASA DE PRODUCCIÓN MITOCONDRIAL DE
RADICALES ES INVERSAMENTE
PROPORCIONAL A LA LONGEVIDAD
EL DNA MITOCONDRIAL ACUMULA 10 VECES
MÁS DE DAÑO OXIDATIVO QUE EL
NUCLEAR
Effect of age and treatment with EGb761 on oxidative damage to
mitochondrial DNA
Brain Liver0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Brain Liver
YoungOldOld-treated
**p<0.01
**
**
Sastre et al. FRBM, 1998
Relationship between DNA andglutathione oxidation
• Garcia et al FASEB J 10, 336 (1996)
• ••••••
• • •• •
••• ••
3
2
1
0oxo
8 dG
(pm
ol/ µ
g)
400GSSG / GSH
(r=0.95)
• 18 mo old + antiox.
• 6 mo. old mice
• 18 mo old mice
• 24 mo old mice
Effect of age and treatment with EGb761 on glutathione oxidation in liver
mitochondria.
0
5
10
15
20
25
30
YoungOldOld-treated**
**p<0.01
Sastre et al. FRBM, 1998
Peroxide production in brainmitochondria in state 4 using
succinate as substrate.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
YoungOldOld-treated
Pero
xide
prod
uctio
n (n
mol
/min
.mg
prot
) *
* p<0.05
Estrés oxidativo y glicaciónEstrés oxidativo y glicación
Glicosilación/glicación• Glicosilación es el proceso enzimático
fisiológico por el cual se adiciona un carbohidrato a otra molécula (proteínas, lípidos)
• Glicosilación no-enzimática o glicación La glicación implica una reacción patológica en la cual los azúcares (glucosa en general, pero no exclusivamente) reaccionan no enzimáticamente con las proteínas (y en menor grado lípidos y DNA)
Reacción de glicación
AGEs y patología
AGEs y patología
Receptores AGEs
AGEsEstas sustancias se originan en ambientes hiperglicémicos y con alto estrés oxidativo (siendo a suvez pro-oxidantes)Además pueden ser ingeridosdirectamente a través de la dieta(reacción de Maillard).
Los AGEs se acumulan con la edady en enfermedades asociadas al envejecimiento.
Causan inflamación, pérdida de flexibilidad, y dañan la funcióncelular.
AGEs
Enfermedades asociadas a glicación
• Diabetes mellitus• Hiperglucemia• Activación de protein kinasa C• Disfunción renal• Disfunción del colágeno• Arteriosclerosis
Glicación y piel
• Disminuye la tasa de proliferaciónepidérmica.
• Aumenta el número de receptores AGE.• Aumentan el riesgo de daño al DNA. • Microcirculación alterada.
Marcadores de AGEs• El más utilizado es la pentosidina. Es una
sustancia fluorescente que está presenteen la mayoría de los tejidos y aumentaproporcinalmente con la edad.
Alimentación y AGEs
• Los alimentos ricos en grasas y proteínas (queso, carne) proporcionanmás AGEs.
• En general, la cocción de los alimentosa elevada temperatura (más de 60ºC) aumenta los niveles de AGEs.
• Cocinar al vapor o cocer lentamente losalimentos genera menos AGEs quefreir, asar o hervir.
Oxidative stress in aging: intervention
Antioxidant vitamins
Phytoestrogens
Exercise training
Caloric restriction
Genetic modifications
Supplementation with antioxidantvitamins: The debate
LINUS PAULING ADVOCATED FOR THE USE OF MEGADOSE
OF VITAMIN C FOR “LIVING LONGER BETTER”
BUT…THERE IS A DEBATE.
SOME AGAINST, AND SOME IN FAVOR!
Evidence against the use ofantioxidant vitamins
Thiol containing antioxidants increaseaverage life span in Drosophila
Viña et al (1992) EXS
Navarro A et al (2005) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol
Administration of vitamin E increases life span in mice
Oxidative stress in aging: intervention
Antioxidant vitamins
Phytoestrogens
Exercise training
Caloric restriction
Genetic modifications
Regular exercise (which is anantioxidant) increases life span in mice
Navarro A et al (2004) Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol
Oxidative stress in aging: intervention
Antioxidant vitamins
Phytoestrogens
Exercise training
Caloric restriction
Genetic modifications
Caloric restriction increases lifespan in mice
Weindruch and Sohal (1997) N Engl J Med
Oxidative stress in aging: intervention
Antioxidant vitamins
Phytoestrogens
Exercise training
Caloric restriction
Genetic modifications
Age (days)
Transgenic Cat/SOD
Antioxidant enzyme over-expressionIncreases life span in mice
Orr and Sohal (1994) Science
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/SuperWTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 400 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
Delayed aging in s-Arf/p53 mice
WTSuper/Super
surv
ival
(%)
time (months)
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
survival curvewithout tumors
Logrank test= 0.02 (*)
WTSuper/SuperWTSuper/Super
surv
ival
(%)
time (months)
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25 30 35 400 5 10 15 20 25 30 35 40
survival curvewithout tumors
Logrank test= 0.02 (*)
Cancer and aging: convergent and divergent mechanisms
Mechanisms whichprotect cells fromdamage provideprotection againstcancer and aging
Mechanisms thatlimit indefiniteproliferation providecancer protectionbut favour aging
p53p53
p53 is expressed ubiquitouslyin all cell types as an inactive, latent, transcription factor thatbecomes active only when thecells are subjected to a varietyof cellular insults.
p53 transcription factor
p53 transcription factor
The function of p53 is to prevent cellularproliferation in the face of cellular damage
p53 function
Nature Genetics 39, 11 - 12 (2007)
Animal models overexpressing p53
Animal models overexpressing p53
Animal models overexpressing p53
Role of p53 in cancer and longevity
Science. 2006 Aug 18;313(5789):971-5
Cancer and aging: convergent and divergent mechanisms
Mechanisms whichprotect cells fromdamage provideprotection againstcancer and aging
Mechanisms thatlimit indefiniteproliferation providecancer protectionbut favour aging
ArfArf
INK4a/ArfModified from Molecular Cancer 2003
INK4a/Arf
p16INK4a p19Arf/p14Arf
Cyclin D1/CDK 4
RB
Mdm2/HDM2
p53
Ink4a/Arf
Arf/p53 pathway
Arffunction isto stabilize
p53
Su/Su Su/SuWTWT
3 2 3 4
females males
The super-super Arf/p53 mice
Arf and p53 cooperate in conferringcancer resistance
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/SuperWTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 400 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
Delayed aging in s-Arf/p53 mice
Improved physiologicalperformance in s-Arf/p53 mice
Su/Su Su/SuWTWT
3 2 3 4
females males
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
surv
ival
(%)
time (months)
WTSuper/SuperWTSuper/Super
0 5 10 15 20 25 30 35 400 5 10 15 20 25 30 35 40
spontaneoussurvival curve
Logrank test= 0.01 (*)
Delayed aging in s-Arf/p53 mice
WTSuper/Super
surv
ival
(%)
time (months)
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25 30 35 40
survival curvewithout tumors
Logrank test= 0.02 (*)
WTSuper/SuperWTSuper/Super
surv
ival
(%)
time (months)
0
25
50
75
100
0
25
50
75
100
0 5 10 15 20 25 30 35 400 5 10 15 20 25 30 35 40
survival curvewithout tumors
Logrank test= 0.02 (*)
Possible mechanisms involved
Cancer and aging: convergent and divergent mechanisms
Mechanisms whichprotect cells fromdamage provideprotection againstcancer and aging
Mechanisms thatlimit indefiniteproliferation providecancer protectionbut favour aging
ROSROS
Oxidative damage theoryProposed by Denham Harman, 1956.Harman D (1956) J. Gerontology
The free radical theory of aging
Denham Harman
Antioxidant role of p53
Lower radiation-induced DNA damage in s-Arf/p53 mice
Lower radiation-induced DNA damage in s-Arf/p53 mice
Lower peroxide levels in olds-Arf/p53 mice
Lower lipid peroxidation in olds-Arf/p53 mice
Lower oxidized protein levels in old s-Arf/p53 mice
Increased antioxidant enzymeexpression in s-Arf/p53 mice
Higher glutathione levels in s-Arf/p53 mice
s-Arf/p53 mice are resistant tooxidative stress-induced death
s-Arf/p53: CONCLUSSIONS
A combined increase in Arf and p53 (normally regulated) results in anti-aging effectThis effect is even more pronouncedwhen removing cancer mortalityThe spectra of genes activated by p53 under normal physiological conditionshave a global antioxidant effect, thusdecreasing aging-associated oxidativestress
Cell
COLABORACIÓN
Dr. Manuel SerranoSupresión Tumoral
Dra. María A. BlascoTelómeros y Telomerasa
¿POR QUÉ LAS MUJERES VIVEN MÁS QUE LOS HOMBRES?
Dra. Consuelo Borrás BlascoDr. Jose Viña Ribes
Universidad de Valencia
DIPLOMATURA DE POSTGRADOMEDICINA DEL ENVEJECIMIENTO
7ª Edición – Noviembre 2007 a Junio 2008
Esperanza de Vida en España en el período entre 1900-2020
Esperanza de VidaEsperanza de Vida en Espaen Españña a en el peren el perííodo entre 1900odo entre 1900--20202020
FernFernáández Ballesteros et al. , ndez Ballesteros et al. , AgingAging in in EuropeEurope, 1999 , 1999
AÑO HOMBRES MUJERES %
1900 33.8 35.1 3.8
1960 67.4 72.2 7.1
1980 72.5 78.6 8.4
1992 73.7 81.0 9.9
2020 77.7 83.8 7.9
AAÑÑOO HOMBRESHOMBRES MUJERESMUJERES %%
19001900 33.833.8 35.135.1 3.83.8
19601960 67.467.4 72.272.2 7.17.1
19801980 72.572.5 78.678.6 8.48.4
19921992 73.773.7 81.081.0 9.99.9
20202020 77.777.7 83.883.8 7.97.9
Curva de Supervivencia Curva de Supervivencia de Ratas de Ratas WistarWistarMachos y HembrasMachos y Hembras
00
2020
4040
6060
8080
100100
120120
11 33 55 77 99 1111 1313 1515 1717 1919 2121 2323 2525 2727 2929 3131 3333 3535 3737
Edad (Meses)Edad (Meses)
% S
up
ervi
ven
cia
% S
up
ervi
ven
cia
% de machos% de machos
% de hembras% de hembras
Estudios in vivoEstudios Estudios in vivoin vivo
MachosMachos HembrasHembras
Estado de las Estado de las mtmt ((CitometrCitometrííaa de flujo, Oximetrde flujo, Oximetríía)a)
ProducciProduccióón de Hn de H22OO22 ((FluorimetrFluorimetrííaa, , BarjaBarja y y colscols.).)
DaDañño o oxidativooxidativo al DNA al DNA mtmt (HPLC, (HPLC, ShigenagaShigenaga y y colscols.).)
Niveles de GSHNiveles de GSH (Espectrofotometr(Espectrofotometríía, a, BrigeliusBrigelius y y colscols.).)
Enzimas antioxidantesEnzimas antioxidantes ((GpxGpx, , MnMn--SOD)SOD)
Niveles de HNiveles de H22OO22((FluorimetrFluorimetrííaa, , BarjaBarja y y colscols.).)
ConcentraciConcentracióónnEstradiolEstradiol
ReceptoresReceptoresEstradiolEstradiol
TamoxifenoTamoxifenoGenisteGenisteíínana
Cultivo de cCultivo de céélulas MCFlulas MCF--77
Actividad Actividad enzimenzimááticatica(Espectrofotometr(Espectrofotometríía, a, FloheFlohe y y colscols.).)
ExpresiExpresióón 16S n 16S rRNArRNA
Ratas Ratas WistarWistar de 4de 4--6 meses6 meses
ExpresiExpresióón gn géénicanica(RT(RT--PCR PCR semisemi y y
cuantitativa.)cuantitativa.)
Estudios Estudios in in vitrovitro
TiempoTiempoEstradiolEstradiol
Actividad Actividad telomerasatelomerasa (PCR(PCR--ELISA)ELISA)
WesternWesternEstradiolEstradiol
Efecto del GEfecto del Géénero en la Produccinero en la Produccióón n MitocondrialMitocondrial de de PerPeróóxido de Hidrxido de Hidróógenogeno (I). (I).
MITOCONDRIAS HEPÁTICASMITOCONDRIAS HEPMITOCONDRIAS HEPÁÁTICASTICAS
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Machos Hembras
nmol
H2O
2/m
g pr
ot.m
in
*
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Machos Hembras
nmol
H2O
2/m
g pr
ot.m
in
*
PiruvatoPiruvato--MalatoMalato
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Machos Hembras
nm
ol H
2O2/
mg
pro
t.m
in **
0.00
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
Machos Hembras
nm
ol H
2O2/
mg
pro
t.m
in **
SuccinatoSuccinato
Efecto del GEfecto del Géénero en la Produccinero en la Produccióón n MitocondrialMitocondrial de de PerPeróóxido de Hidrxido de Hidróógenogeno (II). (II).
MITOCONDRIAS CEREBRALESMITOCONDRIAS CEREBRALESMITOCONDRIAS CEREBRALES
0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
Sinápticas No Sinápticas
nm
olH
2O2/
mg
pro
t.m
in Machos
Hembras*
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Machos Hembras
nm
ol G
SH /
mg
pro
t
*
0
2
4
6
8
10
12
14
Machos Hembras
nm
ol G
SH /
mg
pro
t
*
Efecto del GEfecto del Géénero en los Niveles de nero en los Niveles de GluGlutatitatióónn ReducidoReducido (GSH)(GSH)
MITOCONDRIAS HEPÁTICASMITOCONDRIAS HEPMITOCONDRIAS HEPÁÁTICASTICAS TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
0123456789
10
MACHOS HEMBRAS
nmol
GSH
/mg
prot
0123456789
10
MACHOS HEMBRAS
nmol
GSH
/mg
prot
0
20
40
60
80
Machos Hembras
**
8-ox
odeo
xygu
anos
ina/
105dG
Efecto del GEfecto del Géénero en el nero en el DaDañño o OxidativoOxidativo alal DNA DNA MitocondrialMitocondrial
TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
26 S rRNA (ref ) (252 bp )
GPx (395 bp )
Macho Hembra
26 S rRNA (ref ) (252 bp )
GPx (395 bp )
Macho Hembra
Efecto del GEfecto del Géénero en la nero en la ExpresiExpresióónn yy ActividadActividadde la Enzima de la Enzima GlutatiGlutatióónn PeroxidasaPeroxidasa
TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
0
0.2
0.4
0.6
0.8
UI/
mg
prot
Macho
Hembra
**
0
0.2
0.4
0.6
0.8
UI/
mg
prot
Macho
Hembra
**
ActividadActividad
0
2
4
6
8
Macho Hembra
Inte
nsi
dad
Rel
ativ
a
**
DensitometrDensitometrííaa
Efecto del GEfecto del Géénero en la nero en la ExpresiExpresióón n yy Actividad Actividad de la Enzima de la Enzima MnMn--SuperSuperóóxidoxido DismutasaDismutasa
TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
26 S rRNA (ref) (252 bp)
Mn-SOD (378 bp)
MachoHembra
02468
10
Macho
*
Hembra
Inte
nsi
dad
Rel
ativ
a DensitometrDensitometrííaa Macho
Hembra
0
20
40
60
80
100
UI/
mg
prot
**
ActividadActividad
Efecto del GEfecto del Géénero en la nero en la ExpresiExpresióónn deldel16S 16S rRNArRNA MitocondrialMitocondrial
TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
DensitometrDensitometríía a
0
2
4
6
8
Macho
**
Hembra
Inte
nsi
dad
Rel
ativ
a
Macho Hembra
16S rRNA (380bp)
26S rRNA ref(252bp)
Efecto del GEfecto del Géénero en la nero en la ActividadActividad EnzimEnzimááticatica de la de la TelomerasaTelomerasa
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
MACHOS HEMBRAS
RTA
*
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
MACHOS HEMBRAS
RTA
*
TEJIDO HEPÁTICOTEJIDO HEPTEJIDO HEPÁÁTICOTICO
Poseen una menor tasa de producción de
H2O2
Contienen niveles superiores de GSH
Su DNAmt sufre un menor daño oxidativo
La expresión y la actividad enzimática de las
enzimas antioxidantes Mn-SOD y GPx es
superior
La expresión del marcador de envejecimiento
16S rRNA es superior
La actividad telomerasa es mayor
Poseen una menorPoseen una menor tasa de produccitasa de produccióón de n de
HH22OO22
Contienen niveles superiores deContienen niveles superiores de GSHGSH
SuSu DNAmtDNAmt sufre un menor dasufre un menor dañño o oxidativooxidativo
La expresiLa expresióón y la actividad n y la actividad enzimenzimááticatica de las de las
enzimas antioxidantesenzimas antioxidantes MnMn--SOD SOD yy GPxGPx es es
superiorsuperior
La expresiLa expresióón del marcador de envejecimiento n del marcador de envejecimiento
16S 16S rRNArRNA es superiores superior
La actividad La actividad telomerasatelomerasa es mayor es mayor
Las
Mitocondrias
de las Ratas
Hembra
Las Las
Mitocondrias Mitocondrias
de las Ratasde las Ratas
HembraHembra++
En ComparaciEn Comparacióón Con n Con
las Mitocondrias de las Mitocondrias de
Ratas Ratas MachoMacho
EL ESTRÉS OXIDATIVO ESTÁ IMPLICADO EN LAS
DIFERENCIAS DE LONGEVIDAD ENTRE GÉNEROS
EL ESTREL ESTRÉÉS OXIDATIVO ESTS OXIDATIVO ESTÁÁ IMPLICADO EN LAS IMPLICADO EN LAS
DIFERENCIAS DE LONGEVIDAD ENTRE GDIFERENCIAS DE LONGEVIDAD ENTRE GÉÉNEROSNEROS
Free Rad Biol Med, 2003
Las ratas ovariectomizadas poseen un estrés oxidativo comparable
al de los machos
La reposición con estrógenos en ratas ovariectomizadas devuelve
la protección contra el estrés oxidativo observado en las
hembras control
CELL MEMBRANECELL MEMBRANE
ESTRADIOLESTRADIOL
ESTROGEN ESTROGEN RECEPTORRECEPTOR
NUCLEUSNUCLEUS
PP MEKMEK
PP ERKERK
UO126UO126
PP IKIKββ
PDTCPDTC
NFKNFKββpp50 50 pp6565
GPxGPxMnSODMnSOD
MITOCHONDRIAMITOCHONDRIA
LOWER OXIDATIVE STRESS
GPxGPxMnSODMnSOD
PP
Borrás C, et al Aging Cell, 2005 ; Viña J, et al FEBS Letters 2005
PERO ….. SON LOS ESTRÓGENOS BENEFICIOSOS EN CUALQUIER SITUACIÓN???
NO!!!TUMORES FEMINIZANTES
Son los fitoestrógenos de la sojacapaces de reproducir el efecto
antioxidante del estradiol?
FitoestrógenoFitoestrógeno
OHOHOH
OHOHOH OOO
OOOOHOHOH
17ß17ß --estradiolestradiolOHOHOH
OHOHOH
Estudios in vitroEstudios in vitro
Niveles HNiveles H22OO22
ReceptoresGenisteínaTamoxifeno
Concentración
MAPK y NFKBseñalización
Cultivo cCultivo céélulas MCFlulas MCF--7 7
Dieta CON sojaDieta CON sojaDieta SIN sojaDieta SIN soja
Peroxidación lipídica (MDA)
Niveles antioxidantes
Presiónarterial
Relajación vascular
Ratas Ratas WistarWistar (12 y 16 meses)(12 y 16 meses)
Estudios in vivoEstudios Estudios in vivoin vivo
++
Estudios in vivoEstudios Estudios in vivoin vivoBorrás et al FASEB J, 2005
Niveles de MDA en Niveles de MDA en mitocondrias hepmitocondrias hepááticasticas
0
1
2
3
4
SOJA SIN SOJA
nmol
MDA
/ mg
prot
*Ratas Ratas WistarWistar de 12 mesesde 12 meses
Niveles de GSH en Niveles de GSH en mitocondrias hepmitocondrias hepááticasticas
Ratas Ratas WistarWistar de 12 mesesde 12 meses
02468
101214
SOJA SIN SOJA
nmol
GSH
/ mg
prot
*
02468
101214
SOJA SIN SOJA
nmol
GSH
/ mg
prot
*
Niveles de GSH en Niveles de GSH en mitocondrias hepmitocondrias hepááticasticas
Ratas Ratas WistarWistar de 16 mesesde 16 meses
ExpresiExpresióón de la n de la MnMn--SOD SOD en hen híígado gado
Ratas Ratas WistarWistar de 16 de 16 mesesmeses
0
5
10
15
SOJA SIN SOJA
Inte
nsid
ad re
lativ
a
*
DensitometrDensitometrííaa
26S 26S rRNArRNA(ref.)(ref.)
MnMn--SODSODSojaSoja
Sin Soja
Sin Soja
26S 26S rRNArRNA(ref.)(ref.)
CytCyt c c OxidOxidSojaSoja
Sin so
ja
Sin so
ja
DensitometrDensitometrííaa
0
5
10
15
SOJA SIN SOJA
Rel
ativ
eIn
tens
ity *
ExpresiExpresióón de la n de la citocromocitocromo c c oxidasaoxidasa en hen híígado gado
Ratas Ratas WistarWistar de 16 de 16 mesesmeses
ExpresiExpresióón en hn en híígadogado
0
1
2
3
4
5
Mn-SOD GCSc Cit c ox eNOS
Fold
Cha
nge
Sin SOJASOJA 6 meses
SOJA
p<0.002
p<0.0012p<0.0011
p<0.011p<0.013
p<0.015
ExpresiExpresióón en aortan en aorta
0
1
2
3
4
Mn-SOD GCSc Cit c ox eNOS
Fold
Cha
nge
Sin SOJASOJA 2 meses
SOJA
p<0.002p<0.0012
p<0.0011
Arteria aorta Arterias intrapulmonares
Reactividad vascularReactividad vascular
SIN SOJA
SOJA
SOJA 6 MESES
SIN SOJA
SOJA
SOJA 6 MESES
L-NAME
SIN SOJA
SOJA
SOJA 6 MESES
SIN SOJA
SOJA
SOJA 6 MESES
L-NAME
PresiPresióón arterialn arterial
SOJA
SOJA 6 MESES
SIN SOJA
PresiPresióón arterialn arterial
SOJA
SOJA 6 MESES
SIN SOJA
Estudios in vitroBorrás et al FASEB J, 2006
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Control gen 0.5nM
gen 5 nM gen 50nM
gen 0.5uM
gen 5 uM gen 15uM
nmol
H2O
2/m
gpr
ot
**
**
*
Efecto de la Efecto de la genistegenisteíínana en los en los Niveles de Niveles de PerPeróóxido de Hidrxido de Hidróógenogeno en en
CCéélulas MCFlulas MCF--7 Incubadas Durante 7 Incubadas Durante 48 Horas48 Horas
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
0
nmol
H 2O
2/m
g pr
ot.m
in
##
**
Control
Tamoxif
en
Genist
ein
Gen +
Tam
El efecto de la El efecto de la genistegenisteíínana sobre los niveles sobre los niveles de perde peróóxidos estxidos estáá mediado por receptores mediado por receptores
330034003500360037003800390040004100
CONTROL GENISTEIN GEN + UO126 UO126
Arb
itrar
yU
nits
*
** **
α-tubulin
P-ERK1/2
CONT
ROL
GENIS
TEIN
GEN +
UO12
6UO
126
La La genistegenisteíínana activa la activa la fosforilacifosforilacióón de MAPKn de MAPK
250
270
290
310
330
350
Control Genistein Gen + UO126 UO126
*
**
Arb
itrar
yU
nits
La La genistegenisteíínana activa la activa la translocacitranslocacióónn de de NFNFκκBB al nal núúcleocleo
0
1
2
3
4
5
Control Genistein Genistein + UO126 UO126
Fold
Cha
nge
p<0.01
La La genistegenisteíínana induce la induce la expresiexpresióón de n de MnMn--SODSOD
0.0
0.7
1.4
2.1
2.8
Control Genistein Genistein + UO126 UO126
*
nmol
H2O
2/m
gpr
ot
El El efectoefecto antioxidanteantioxidante de la de la genistegenisteíínana estestáámediadomediado porpor MAPKMAPK
MAPK
MEKP
PIκB
PP
NFκBP50 P65
MnSOD
Genistein
Estrogenreceptor
Nucleus
Mitochondria
Lower oxidativestress
MnSOD
STOP PDTC
STOP UO126
Borrás et al FASEB J, 2006 (en prensa)
0 200 400 600 800
RussiaLithuaniaHungary
Czech RepIreland
RomaniaUKU.S
DenmarkSwedenAustria
GermanyAustralia
CanadaNetherlandsLuxembour
GreeceItaly
SpainFranceJapan
Death RatesPer 100,000Men Aged 34-74 by SelectedCountries,1996
Reino Unido y Estados Unidos
0 200 400 600 800
RussiaLithuaniaHungary
Czech RepIreland
RomaniaUKU.S
DenmarkSwedenAustria
GermanyAustralia
CanadaNetherlandsLuxembour
GreeceItaly
SpainFranceJapan
Death RatesPer 100,000Men Aged 34-74 by SelectedCountries,1996
Reino Unido y Estados Unidos
JapónFranciaEspaña
ItaliaGrecia
LuxemburgoPaíses Bajos
CanadáAustraliaAlemania
AustriaSuiza
DinamarcaEstados Unidos
Reino UnidoRumania
IrlandaRepública Checa
HungríaLituania
Rusia
Media de muertes por 100,000 hombres entre 34-74 años por países seleccionados, 1996
Tasas de mortalidad por enfermedad coronaria en el mundo
Tasas de mortalidad por enfermedad coronaria en el mundo
Rie
sgo
rela
tivo
de m
orta
lidad
Copas por semana5 10 15 20 25
3
2.5
2
1.5
1
El consumo moderado de vino reduce el riesgo de mortalidadEl consumo moderado de vino reduce el riesgo de mortalidad
O
O
4
5
6
7
81
3
2
3’
4’
5’
6’
2’
A
B
C
O
O
4
5
6
7
81
3
2
3’
4’
5’
6’
2’
A
B
C
0102030405060708090
100110
0 10 20 30 40 50 60 70 80días
% s
uper
vive
ncia
19%
-control
-vino
-Vino sin alcoholp<0,00001
p=0,012
p vscontrol
0102030405060708090
100110
0 10 20 30 40 50 60 70 80días
% s
uper
vive
ncia
19%
-control
-vino
-Vino sin alcoholp<0,00001
p=0,012
p vscontrol
0102030405060708090
100110
0 10 20 30 40 50 60 70 80días
% s
uper
vive
ncia
19%
- Control
- Vino tinto
- Vino tinto sin alcohol
p<0,00001
p=0,012
p vs control
El vino tinto alarga la vidaa moscas Drosophila melanogaster
El vino tinto alarga la vidaa moscas Drosophila melanogaster
INTRODUCCIÓN
Gambini J, Borrás C, * Francés E, * Garcia M, López‐Grueso R, Mohamed‐Abdelaziz K, El Alami M, Bonet‐Costa V, Viña J
DPT FISIOLOGÍA, FAC. MEDICINA UNIV. DE VALENCIA, *ESCUELA DE ENFERMERIA, UNIV. CATÓLICA DE VALENCIA, SPAIN
Qué el vino tinto es beneficioso, se sabe. Los estudios de moléculas procedentes del vino tintomuestran capacidades beneficiosas sobre la salud, por ejemplo sobre el sistema cardiovascular, elcáncer o sistema inmune.
OBJETIVOSDeterminar si el consumomoderado de vino tinto afecta a la expresión de genes de longevidad
MATERIAL Y METODOSPara llevar a cabo el estudio se contó con 4 mujeres de diferentes edades (35, 37, 60 y 65 años) pertenecientesa una comunidad religiosa de monjas de clausura que no consumen vino tinto de forma regular y que llevanuna vida relativamente parecida. A los 4 sujetos de estudio se les extrajo sangre antes y se aisló las célulasmononucleares sanguíneas para obtener ARN. El cual se usó para determinar la expresión de genes medianteun chip (sequenom®) diseñado con 16 genes relacionados con la longevidad. Las muestras sanguíneas seobtuvieron al inicio del estudio (GRUPO ANTES) y 18 días después (GRUPO DESPUES) del consumo de 2 copas(200 mL aprox.) diarias
El consumo moderado de vino tinto activa la expresión de Catalasa, Sirt1 y p53.
RESULTADOSEl chip mostró un incremento significativo, después del consumo moderado de vino tinto, en la expresión de tres genes relacionados con la longevidad catalasa, sirtuinas y p53.
Sin embargo, es importante tener en cuenta que la biodisponibilidad de algunas moléculasestudiadas es muy baja y que las concentraciones efectivas no se alcanzan con el consumomoderado de vino tinto. Hasta el momento nadie ha estudiado si el consumo moderado es capazde activar genes relacionados con la longevidad
0
5E-14
1E-13
1,5E-13
2E-13
2,5E-13
3E-13
3,5E-13
ANTES DESPUES
[] M
Media ARNm Catalasa *
0
ANTES DESPUES
[]M
Media ARNm Sirt1
0ANTES DESPUES
[]M
Media ARNm p53 *
0
5E-14
1E-13
1,5E-13
2E-13
2,5E-13
3E-13
1 2 3 4
[] M
Niveles de ARNm de Catalasa
ANTESDESPUES
01 2 3 4
Niveles de ARNm de Sirt1
ANTESDESPUES
01 2 3 4
Niveles de ARNm de p53
ANTESDESPUES
*
FEMALES LIVE LONGER THAN MALES
MT ROS PRODUCTION IN FEMALES IS HALF
THAT OF MALESMT ROS PRODUCTION IS INVOLVED IN AGING
OVARIECTOMISED FEMALES HAVE HIGH ROS PRODUCTION.
ERT PREVENTS THIS
ESTROGENS UP-REGULATE THE EXPRESSION OF Mn-SOD AND GPx THROUGH ESTROGEN
RECEPTOR BINDING AND SUBSEQUENTLY ACTIVATING THE MAPK/ NFκB SIGNALLING PATHWAYS
FEMALES BEHAVE AS DOUBLE TRANSGENICS OVER -EXPRESSING LONGEVITY -RELATED GENES
PHYTOESTROGENS MAY MIMIC SOME OF THE FAVOURABLE EFFECTS OF ESTROGENS
FEMALES LIVE LONGER THAN MALES
MT ROS PRODUCTION IN FEMALES IS HALF
THAT OF MALES
MT ROS PRODUCTION IN FEMALES IS HALF
THAT OF MALESMT ROS PRODUCTION IS INVOLVED IN AGINGMT ROS PRODUCTION IS INVOLVED IN AGING
OVARIECTOMISED FEMALES HAVE HIGH ROS PRODUCTION.
ERT PREVENTS THIS
OVARIECTOMISED FEMALES HAVE HIGH ROS PRODUCTION.
ERT PREVENTS THIS
ESTROGENS UP-REGULATE THE EXPRESSION OF Mn-SOD AND GPx THROUGH ESTROGEN
RECEPTOR BINDING AND SUBSEQUENTLY ACTIVATING THE MAPK/ NFκB SIGNALLING PATHWAYS
FEMALES BEHAVE AS DOUBLE TRANSGENICS OVER -EXPRESSING LONGEVITY -RELATED GENES
PHYTOESTROGENS MAY MIMIC SOME OF THE FAVOURABLE EFFECTS OF ESTROGENS
Viña et al, Science (SAGE KE), 2005
Estrogen therapy controversy
Ovariectomy
Ovariectomy
Sacrifice Sacrifice Sacrifice
Sacrifice Sacrifice Sacrifice
Wistar Females Rats(3-4 months) (n= 5-8)
Wistar Females Rats(24 months) (n=5)
Weeks
Weeks
vehicle
vehicle
vehicle
Ova
riect
omy
(OVX
)
Estradiol is only effective when administered immediately after ovariectomy
Estradiol is only effective when administered immediately after ovariectomy
Positron emission tomographyfor small animals
Young Old
Aging decreases in vivobrain glucose uptake
Brain
*
Young Old
*
Young OldUnpublished results
**
###
* **
6 weeks 9 weeksControl 3 weeks
Effect of ovariectomy and estrogenreplacement therapy
Unpublished results
The Spanish centenarian study
Nature Scientific Reports (in press)
Juana Bautista, 127 years old
Which genes are modulated in extreme longevity????
Strategy
miRNAs are critical for theregulation of transcription
The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006
Andrew Z. Fire Craig C. Mello
"for their discovery of RNA interference ‐ gene silencing by double‐stranded RNA"
Photos: Copyright © The Nobel Foundation
http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/2006/
The Spanish centenarian study
YoungOctogenarianCentenarian
miRNAs are similar in young and
centenarians!!!!!
The Spanish centenarian study
The Spanish centenarian study
2.38
*
3.61
*
2.97
*
YoungOctogenarianCentenarian
The Spanish centenarian study
Strategy
YoungOctogenarianCentenarian
mRNAs are differentbetween
octogenarians andcentenarians!!!!
The Spanish centenarian study
C vs Y C vs O
The Spanish centenarian study
Strategy
The Spanish centenarian study
2.38
*
YoungOctogenarianCentenarian
The Spanish centenarian study
El gen clave Bcl‐xL
Mitochondrial protein!!!!!!!!!!
The Spanish centenarian study
FUTURE DIRECTION
COLLABORATIONS
MULTIGENIC ANALYSIS SERVICE OF THEUNIVERSITY OF VALENCIA
Dra. Eva Serna
Jesica Portero
Juan Antonio Avellana ZaragozaFrancisco José Tarazona SantabalbinaÁngel Belenguer VareaJuan Ramón Doménech PascualMaría Isabel Salvador PérezCarmen ValldecabresPaula Sanchis AguilarAlicia Perez de la Calle Miriam Oya BelenguerMª Jesús Martinez DomenechRosa Carrasco Llorens
LABORATORY OF PROF. JOSE VIÑA