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Instituto Politcnico NacionalUnidad Profesional Interdisciplinaria de BiotecnologaBiotecnologa de la Respuesta Inmune 5BV1 Profesor:Cesar Agustn Jimnez Sierra

Espinosa Pacheco CamiloMorales Martnez Francisco JavierPrez Mora Wendy Aracely.Velo Silvestre Jazmn Elizabeth

Pruebas Inmunolgicas

ENZIMOINMUNOANLISIS (ELISA de Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Pruebas Inmunolgicas

La serologa es la rama de la inmunologa que estudia las interacciones antgeno-anticuerpo para su aplicacin en el diagnostico clnico.

Hay seis tipos fundamentales de pruebas serolgicas:

Reaccin de precipitacin

Aglutinacin

Fijacin del complemento

Inmunofluorescencia

Radioinmunoensayo

Enzimoinmunoanlisis (ELISA).

ENZIMOINMUNOANLISIS (Prueba De ELISA)

Fue descrito en 1971 por los investigadores suecos Eva Engvall y Peter Perlman, y en la actualidad se designan con este nombre a todos los inmunoensayos enzimticos en fase heterognea.

Este ensayo se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica pudiendo ser revelada mediante la adicin de un substrato especfico que, en contacto con la enzima, producir un color observable a simple vista y cuantificable por un lector de densidad ptica.

Componentes de una prueba ELISA

Muestra

Fase slida o soporte: Posos o placas en donde se realizan las pruebas estos pueden ser de diferentes materiales; nitrocelulosa, polivinilo, poliestireno, ltex, nylon, celulosa y sefarosa.

Antgeno o Anticuerpo (policlonales o monoclonales)

-Anticuerpos policlonales: heterogneosReconocen eptopos diferentes del AgProducidos por numerosos clones de Linfocitos B

-Anticuerpos Monoclonales:HomogneosEspecificidad nicaProducidos por un nico clon de Linfocitos B

Conjugado-Enzima: Algunas de las caractersticas de deben reunir son: Actividad especifica Pureza Estabilidad Solubilidad Fcil medicin y deteccin No se reduce la actividad por la conjugacin Bajo costo Estables en amplio intervalo de condiciones del ensayo. Con grupos funcionales adecuados para su unin a Anticuerpos o Antgenos.

Algunas de las enzimas que se utilizan son:PeroxidasaFosfatasa alcalina-galactosidasaPenicilinasaUreasaGlucosa oxidasa

Bloqueo: Protena ajena al sistema que se esta manejando el cual recubre los espacios huecos que no llena el Antgeno; Estos se utilizan para que los Anticuerpos no se unan de forma inespecfica a la fase solida.CasenaCasena/Tween20Tween 20GelatinaBSA

Sustrato:Solubles en aguaFcil de manipularNo txicosNo mutgenicosBajo costo

La tcnica de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad, rapidez y economa. Brinda la posibilidad de analizar un gran nmero de muestras de manera sencilla , rpida y econmica, sin mayor infraestructura.

Existen diferentes modalidades de ELISA y el mtodo competitivo, que permiten la determinacin de antgenos o anticuerpos en fluidos biolgicos.

Directo. Inmunohistoqumica

Indirecto

Sndwich

Competitivo

Inhibicin

Directo

Se utiliza especficamente para detectar un antgeno, porque busca a una sustancia extraa.

En una prueba de ELISA directa la cual es considerada la ms simple, el antgeno se adsorbe en una placa de plstico, a continuacin un exceso de otra protena (generalmente albmina de suero bovino) se aade para bloquear todos los otros sitios de unin. Mientras que una enzima est ligada a un anticuerpo en una reaccin separada, el complejo enzima-anticuerpo se aplica para adsorber al antgeno.Posteriormente el exceso de complejo enzima-anticuerpo se lava, quedando enzima anticuerpo unido a antgeno. Mediante la adicin del sustrato de la enzima se detecta la enzima que ilustra la seal del antgeno.

100 l

Antgeno*

ConjugadoAb-E

Sustrato enzimtico

Bloqueador

Sistemas de Elisa

E.l.i.s.a

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.

Mtodo Directo de ELISA

* Principalmente se busca Ag problema

+ Color + [Ab-Ag]

Indirectos

Es utilizado para detectar los anticuerpos que el paciente ha creado contra el antgeno

Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.

Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.

Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

100 l

Antgeno

ConjugadoAb-E

Sustrato enzimtico

Bloqueador

E.l.i.s.a

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.

Mtodo Indirecto de ELISA

* Principalmente cuando se busca Ab problema

Anticuerpo*

+ Color + [Ab-Ag]

Sistemas de Elisa

Sndwich

Es una variable menos comn, pero es altamente eficiente en la deteccin de antgeno.

ELISA sndwich cuantifica antgenos entre dos capas de anticuerpos (anticuerpo de captura y de deteccin). El antgeno a medir debe contener al menos dos eptopos antignicos capaces de unirse al anticuerpo.

Se pueden utilizar tanto anticuerpos monoclonales como policlonales. Los antecuerpos monoclonales reconocen un eptopo nico que permite la deteccin y cuantificacin final de las pequeas diferencias en el antgeno, mientras que los policlonales a menudo son utilizados como anticuerpo de captura.

Una de las ventajas de este tipo de prueba ELISA es que la muestra no tiene que ser purificada antes de su anlisis sin afectar la sensibilidad del ensayo (de 2 a 5 veces mas sensible que ELISA directo o indirecto).

Esquema de procedimiento:

Placa recubierta con anticuerpo de captura.

Se aade la muestra y cualquier antgeno presente se une a la captura de anticuerpos.

Se aade anticuerpo de deteccin el cual se une al antgeno.

Se aade el anticuerpo secundario ligado a enzima y se une al anticuerpo de deteccin.

El sustrato es agregado , y es convertido a una forma detectable por la enzima.

E.l.i.s.a

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.

Mtodo del Sndwich de ELISA

+ Color + [Ab-Ag]

100 l

Antgeno*

ConjugadoAb-E

Sustrato enzimtico

Bloqueador

Anticuerpo de sensibilizacin

* Principalmente cuando se busca Ag problema

Sistemas de Elisa

Competitivo

Consta de las siguientes etapas:

1.- Fijacinalsoporteinsolubledeanticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados.

2.- Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio.

3.- Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado.

4.- Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea.

5.- Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados.

Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tiene nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte.

Si hay diferenciaen laslecturasde ambospocillos,el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizarel soporteyla diferencia dedensidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra.

100 l

Antgeno*problema

Sustrato enzimtico

Bloqueador

E.l.i.s.a

Nota: Los esquemas varan con el tamao verdadero de las estructuras mostradas.

Mtodo Competitivo de ELISA

* Principalmente cuando se busca Ag problema

ConjugadoAg-E

Ab estandar

+ Color + [Ag-E] = - [Ag de muestra]

Sistemas de Elisa

Ag estandar

Bloqueador

E.l.i.s.a

Nota: Los esquemas varan en el tamao verdadero de las estructuras mostradas.

Mtodo de Inhibicin de ELISA

Ag problema* de la muestra

MuestraProblema

(+)

(-)

(+)

100 l

Ab estandar

ConjugadoAb-E

(-)

+ Color + [Ab-Ag] = - [Ag de muestra]

Sustrato enzimtico

* Principalmente cuando se busca Ag problema

Sistemas de Elisa

Importancia

Son utilizadas en el diagnostico medico, industria de alimentos y el estudio y control del medio ambiente.

En estudios serolgicos, hematolgicos, endocrinolgicos, oncolgicos, en trasplantes, medicina forense y antropologa.

Con propsitos mdicos se han aplicado en la determinacin de hormonas y protenas plasmticas, antgenos tumorales, drogas, Ag y Ac de microorganismos (parsitos, hongos bacterias, virus).

Los resultados aportan elementos diagnsticos, informacin de una enfermedad y coadyuvan en la planificacin del tratamiento.

Aplicaciones

Prueba de embarazo

Diagnstico de hepatitis vricas

Infecciones por el virus del herpes simplex y virus de rubola

Infecciones por retrovirus

Patologa animal

Enfermedades producidas por parsitos

Babesias y tripanosomas

Toxocara canis

Toxoplasmosis

Triquinosis

Enfermedades producidas por Micoplasmas

Enfermedades producidas por bacterias

Mycobacterium tuberculosis

Brucelas

Enterotoxinas Vibrio cholerae

Estreptococos

Salmonelas

Enfermedades producidas por virus

Enfermedad de Aujeszky

Enfermedad de Newcstle

Fiebre aftosa

Leucemia felina

Peste porcina africana

Peste porcina clsica

Rinotraqueitis infecciosa

Rotavirus

Artritis vrica

Otras aplicaciones

Hormonas

Gonadotropina corinica

Progesterona

Testosterona

Hormonas tiroideas

Cuantificacin de inmunoglobulinas

IgG

IgE

IgA

Inmunopatologa

Anticuerpos anti-DNA

Factor reumatoide

Inmunocomplejos circulantes

Enfermedades producidas por virus

En frutales

PPV

CLSV

TRSV

En ctricos

CTV

En patata

PLRV

PVY

PVX

PVA

TRV

En cereales

En guisante

En lpulo

En soja

En ornamentales

En plantas hortcolas

Enfermedades producidas por bacterias

Enfermedades producidas por Micoplasmas

Enfermedades producidas por hongos

Patologa vegetal

Bibliografa

http://cnia.inta.gov.ar/helminto/pub%20triquinosis/ELISAtrichinella.pdf

http://www.elisa-antibody.com

Tortora et al; Introduccin a la Microbiologa; 9na edicin; Editorial Medica Panamericana; Argentina, 2007, Pp.:544

John L. Ingraham. Introduccin a la Microbiologa; Volumen 2. Editorial Reverte S.A. . Madrid, Espaa. Pp.:448, 449 y 457

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