Pruebas de viabilidad a cinco cepas bacterianas...

PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS

Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES

COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENTICO DEL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE

Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS

DE CALDAS

ANDRES VICENTE CASTAEDA RANGEL

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA

BOGOT D.C.

2015

PRUEBAS DE VIABILIDAD A CINCO CEPAS BACTERIANAS CRIOPRESERVADAS

Y ESTUDIO PARA LA LIOFILIZACIN DE LAS MISMAS, EVALUANDO TRES

COMPUESTOS PROTECTORES, PERTENECIENTES AL BANCO GENTICO DEL

LABORATORIO DE MICROBIOLOGA DE LA FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE

Y RECURSOS NATURALES DE LA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS

DE CALDAS

ANDRES VICENTE CASTAEDA RANGEL

Proyecto de Trabajo de Grado para optar al ttulo de Licenciado en Biologa

Director

MSc. MIGUEL . PIRAGAUTA

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOS DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIN

PROYECTO CURRICULAR DE LICENCIATURA EN BIOLOGA

BOGOT D.C.

2015

DEDICATORIA

Hay hombres que luchan un da y son buenos. Hay otros que luchan un ao y son mejores. Hay

quienes luchan muchos aos, y son muy buenos. Pero hay los que luchan toda la vida, esos son

los imprescindibles.

Bertolt Brech

Este trabajo va dedicado a todas aquellas personas cercanas a m que fueron un apoyo constante

durante estos aos en la universidad. De igual forma esta dedicatoria concierne a aquellas personas

que hicieron difcil mi camino, porque demostrarles que si poda cumplir mis objetivos pese a las

adversidades, result ser una motivacin an ms fuerte para m.

Una dedicatoria especial a mi familia y a mi prometida Adriana Caldern, una investigadora cuyas

enseanzas y apoyo afectivo estn muy relacionadas con la finalizacin exitosa de este proyecto.

AGRADECIMIENTOS

La realizacin de este trabajo fue posible gracias a mltiples personas que de forma directa o

indirecta intervinieron en su realizacin:

La Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, por haberme dado una formacin integral como

Licenciado en Biologa a travs de sus docentes y sus espacios.

A mi director, el docente Miguel . Piragauta MSc. por confiar en m y en mi trabajo, por abrirme

las puertas del laboratorio de Microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos

Naturales, por su asesora y direccin.

A los laboratoristas Oscar Romero y Aleyda Ariza, por su gua, sus consejos durante el desarrollo

del trabajo y su apoyo frente a la realizacin del mismo.

A los estudiantes Cesar Romero y Diego Castaeda, quienes aportaron valiosa informacin y

experiencia durante mi estada en el laboratorio a travs de su proyecto.

A la docente Gloria Stella Acosta Pealoza MSc., quien amablemente dio su apoyo como revisora

y evaluadora de este proyecto y me guio en las encrucijadas con las cuales los cientficos solemos

enfrascarnos.

A Gineth Adriana Caldern, por su colaboracin en distintas etapas de este trabajo.

He mencionado a grosso modo solo a algunas personas, pido por ello disculpas a aquellos que no

mencion, pues sus aportes tambin fueron importantes para el xito de este proyecto.

CONTENIDO

RESUMEN .................................................................................................................................... 10

ABSTRACT ................................................................................................................................... 10

1. INTRODUCCIN ..................................................................................................................... 11

2. MARCO REFERENCIAL ........................................................................................................ 13

2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES

MICROBIOLGICAS. ........................................................................................................... 13

2.2. CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS. .......................................................... 14

2.2.1. Conservacin a corto plazo. .......................................................................................... 14

2.2.2. Conservacin a mediano plazo. Criopreservacin. ....................................................... 14

2.2.3. Conservacin a largo plazo. .......................................................................................... 15

2.2.3.1. Liofilizacin. .......................................................................................................... 15

2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado. ....................................................... 20

2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar. .................................................................................. 21

3. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 22

3.1. OBJETIVO GENERAL .................................................................................................... 22

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS ........................................................................................... 22

4. METODOLOGA ...................................................................................................................... 23

4.1. FASE INICIAL. ................................................................................................................. 23

4.1.1. Acervo Microbiano. ...................................................................................................... 23

4.1.2. Eleccin de los protectores. .......................................................................................... 23

4.1.2.1. Crioprotectores. ...................................................................................................... 23

4.1.2.2. Lioprotectores. ........................................................................................................ 23

4.2. FASE INTERMEDIA 1..................................................................................................... 24

4.2.1. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin. ................................................ 24

4.2.1.1. Viabilidad. .............................................................................................................. 24

4.2.1.2. Estabilidad Morfolgica. ........................................................................................ 25

4.2.1.3. Pureza. .................................................................................................................... 25

4.2.2. Recuperacin de los microorganismos. ........................................................................ 25

4.2.3. Criopreservacin. .......................................................................................................... 26

4.2.3.1. Precriopreservacin. ............................................................................................... 26

4.2.3.2. Preparacin del inculo bacteriano y ejecucin de la criopreservacin. ................ 26

4.2.4. Liofilizacin. Etapa 1. ................................................................................................... 26

4.2.4.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano. ........................................... 26

4.2.4.2. Ejecucin de la liofilizacin. .................................................................................. 26

4.2.4.3. Posliofilizacin (Rotulado y almacenaje). ............................................................. 27

4.2.5. Rehidratacin o Reconstitucin. Etapa 2. ..................................................................... 29

4.3. FASE INTERMEDIA 2..................................................................................................... 29

4.3.1. Liofilizacin definitiva. ................................................................................................. 29

4.3.1.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano. ........................................... 29

4.3.1.2. Ejecucin de la liofilizacin. .................................................................................. 30

4.3.1.3. Posliofilizacin. ...................................................................................................... 30

4.3.1.4. Rehidratacin. ........................................................................................................ 30

4.3.2. Control de calidad de la liofilizacin y ajustes tcnicos. .............................................. 30

4.3.2.1. Propiedades fsicas generales. ................................................................................ 30

4.3.2.2. Contaminacin. ...................................................................................................... 30

4.3.2.3. Tiempo de redisolucin o reconstitucin. .............................................................. 31

4.3.3. Pruebas adicionales. ...................................................................................................... 31

4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad msica. ........................................................................ 31

4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada. ............................................................................. 31

4.3.4. Control de esterilidad. ................................................................................................... 32

4.3.4.1. Medios. ................................................................................................................... 32

4.3.4.2. Ambiente. ............................................................................................................... 32

4.3.4.3. Tcnicas de siembra y manipulacin de elementos. .............................................. 32

4.4. FASE FINAL...................................................................................................................... 32

4.4.1. Base de datos. ................................................................................................................ 32

4.4.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 33

4.4.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer. ............................. 33

4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 33

4.4.5. Manual de procedimientos. ........................................................................................... 33

5. RESULTADOS .......................................................................................................................... 34

5.1. RECUPERACIN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIN DE LA

CRIOPRESERVACIN. ......................................................................................................... 34

5.2. CARACTERSTICAS MACRO Y MICROSCOPICAS DE LAS CEPAS DE

ESTUDIO. ................................................................................................................................. 35

5.3. EVALUACIN DE LA LIOFILIZACIN. PRUEBA DE ESTABILIDAD

NATURAL. ............................................................................................................................... 38

5.3.1. Viabilidad y seleccin del lioprotector general. ........................................................... 38

5.3.2. Aspecto fsico del liofilizado. ....................................................................................... 41

5.4. LIOFILIZACIN DEFINITIVA. .................................................................................... 41

5.5. CONTROL DE CALIDAD DE LA LIOFILIZACIN. ................................................ 42

5.5.1. Propiedades fsicas generales. ....................................................................................... 42

5.5.2. Contaminacin. ............................................................................................................. 45

5.5.3. Tiempo de redisolucin. ................................................................................................ 45

5.6. PRUEBAS ADICIONALES. ............................................................................................ 46

5.6.1. Prueba de higroscopicidad msica. ............................................................................... 46

5.6.2. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................... 47

5.7. PROCESO DE DATADO Y DOCUMENTACIN. ...................................................... 47

5.7.1. Base de datos. ................................................................................................................ 47

5.7.2. Fichas de resumen. ........................................................................................................ 47

5.7.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer. ............................. 47

5.7.4. Formatos de control del banco de liofilizados. ............................................................. 48

5.7.5. Manual de procedimientos de conservacin. ................................................................ 48

6. ANLISIS DE RESULTADOS ................................................................................................ 49

7. CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 54

8. RECOMENDACIONES ........................................................................................................... 55

9. REFERENCIAS ........................................................................................................................ 56

10. BIBLIOGRAFA ..................................................................................................................... 60

11. ANEXOS .................................................................................................................................. 62

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Esquema general de la conservacin de microorganismos mediante el proceso de

liofilizacin. .......................................................................................................................... 16

Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado ................................. 17

Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. ........................................... 18

Figura 4. Descripcin global del proceso de liofilizacin .......................................................... 19

Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. .......................................... 21

Figura 6. Metodologa .................................................................................................................. 23

Figura 7. Rtulos creados para los viales liofilizados. .............................................................. 28

Figura 8. Tasa de supervivencia (BSR) o viabilidad, de las cinco (5) cepas bacterianas de

estudio luego de la descongelacin .................................................................................... 35

Figura 9. Tasa de supervivencia (BSR) de la cepa CM-CR004 en las distintas

concentraciones de los tres lioprotectores evaluados. ...................................................... 38









Figura 14. Comparacin entre las BSR de los liofilizados de Fase intermedia 1 y la

liofilizacin definitiva, por cepa bacteriana. .................................................................... 41

Figura 15. Transicin fsica de liofilizados conforme se realizaron los ajustes. ..................... 45

Figura 16. Contenido de agua absorbida (%) en funcin del tiempo por parte del

lioprotector general en viales y crioviales. ........................................................................ 46

Figura 17. Organigrama de la base de datos. ............................................................................ 47

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas. .................................... 24

Tabla 2. Nmero de repeticiones (y tubos), segn lioprotector y concentracin. .................. 27

Tabla 3. Cdigo de colores propuesto segn la clasificacin de los microorganismos

infecciosos por grupos de riesgo de la OMS. .................................................................... 28

Tabla 4. Rehidratacin de los crioviales. .................................................................................... 29

Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada. ................................................................................. 31

Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados. ...... 33

Tabla 7. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin (criopreservacin). ............. 34

Tabla 8. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR004. .............................................. 36

Tabla 9. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR006. .............................................. 36

Tabla 10. Caractersticas macroscpicas de la cepa CM-CR007. ............................................ 37



Tabla 13. Lioprotectores con mejores resultados por cepa con base en el indicador de

viabilidad. ............................................................................................................................ 41

Tabla 14. Tabla de convenciones. ............................................................................................... 42

Tabla 15. Liofilizados en la fase intermedia 1. .......................................................................... 42

Tabla 16. Liofilizados de la prueba de estabilidad natural, liofilizacin definitiva y de la

prueba de estabilidad acelerada. ....................................................................................... 44

Tabla 17. Tiempo de redisolucin de liofilizados de acuerdo al lioprotector usado. ............. 46

10

RESUMEN

La vida no es posible sin la intervencin de los microrganismos y, dada su importancia, se han

creado colecciones biolgicas para preservarlos y poderlos utilizar en distintos campos de la ciencia

y la tecnologa. Existe variedad de mtodos de preservacin, en este trabajo se determin el estado

de criopreservacin de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de viabilidad, estandarizando e

implementando adems el sistema de liofilizacin, teniendo como punto de partida a los mismos,

evalundolos frente a tres compuestos protectores. Se realiz una evaluacin de los mtodos de

conservacin teniendo como base tres indicadores, viabilidad, estabilidad morfolgica y pureza;

encontrando que el sistema de criopreservacin implementado en el laboratorio es ptimo y el

glicerol al 67%v/v funciona para casi todas las cepas por largos perodos de tiempo; la sacarosa

10%p/v result ser el mejor lioprotector de los tres evaluados, designndolo como lioprotector

general para el laboratorio. Se cre un manual de laboratorio para la conservacin de cepas, que

incluye los protocolos de criopreservacin y liofilizacin y de seguridad de los mismos. Este

trabajo aporta al campo de la microbiologa de la conservacin y constituye un peldao ms para

el registro del Banco Gentico del Laboratorio de Microbiologa de la Facultad del Medio

Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC),

ante las instituciones nacionales e internacionales correspondientes.

PALABRAS CLAVE: Criopreservacin, liofilizacin, lioprotectores, conservacin,

microorganismos.

ABSTRACT

Life is not possible without the intervention of microorganisms and, given its importance, have

been created to preserve biological collections and they can be used in different fields of science

and technology. Exists variety of methods of preservation, in this work was determined the state

of cryopreservation five bacterial strains by viability testing, standardizing and further

implementing the system freeze-drying, taking as a starting point to them, evaluating them against

three protective compounds. An evaluation of preservation methods on the basis of three indicators, viability, morphological stability and purity was performed; finding cryopreservation system

implemented in the laboratory is optimal and glycerol 67% v/v works for almost all strains for long

periods of time; sucrose 10% w/v lyoprotectant proved to be the best of the three evaluated,

designating it as a general lyoprotectant for the laboratory. It was created a manual for conservation

laboratory strains, including cryopreservation and freeze-drying protocols and safety of

themselves. This work contributes to the field of microbiology conservation and is a stepping stone

for registration Gene Bank Microbiology Laboratory of the Faculty of Environment and Natural

Resources of the University District Francisco Jose de Caldas (CM-UDFJC) before the relevant

national and international institutions.

KEYWORDS: cryopreservation, freeze-drying, lyoprotectants, conservation, microorganisms.

11

1. INTRODUCCIN

La importancia de los microorganismos en el planeta es indiscutible, pues, como lo menciona

Hurtado (2009), la vida no es posible sin la actividad de estos, ya que estn involucrados en todas

las dinmicas ambientales existentes en el planeta. Sin embargo, su importancia ha ido ms all,

desde que fueron descubiertos hace unos 300 aos por van Leeuwenhoek, potencializndose su

investigacin y utilizacin en distintos campos de la ciencia y la tecnologa en los ltimos 100

aos, iniciando con Louis Pasteur y Robert Koch (Manzi & Mayz, 2003).

Debido a esto, se han creado colecciones biolgicas, como mtodo para preservar la

diversidad microbiana fuera de su nicho. Las colecciones de cultivos microbianos estn

representadas a nivel nacional por el Instituto Alexander von Humboldt, y a nivel internacional por

la Federacin Mundial de Colecciones de Cultivos (WFCC), en donde existen actualmente

2520.200 microorganismos en 711 colecciones de 71 pases registrados en el Centro Mundial de

Datos de Microorganismos (WDCM). Para Colombia solo existen dos colecciones legalmente

registradas ante la WFCC en la WDCM: el CIAT (Rhizobium Collection America) de cdigo

WDCM 536 y la CM-PUJ (Coleccin de Microorganismos de la Pontificia Universidad Javeriana)

de cdigo WDCM 857 (WFCC, 2015).

No obstante, varias universidades del pas, instituciones pblicas o privadas que desarrollan

proyectos relacionados con ciencias biolgicas, poseen colecciones microbiolgicas aun no

registradas en la WFCC pero si ante el Instituto Alexander von Humboldt, como es el caso de la

Universidad de los Andes (representada por el CIMIC) y la Universidad Nacional de Colombia

(IBUN); en otros casos las colecciones estn en proceso de registro o en formacin como en la

Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC), entre otras.

En este tipo de colecciones es imprescindible establecer mtodos de conservacin fiables,

que, entre otras cosas, eviten al mximo el riesgo de prdida o de variabilidad gentica de los

individuos. Existe variedad de mtodos de conservacin, segn sea el tiempo que estarn en la

coleccin o el tiempo en que tardarn en ser usados; dentro de ellos destacan la criopreservacin y

la liofilizacin, mtodos utilizados para la coleccin de la Universidad Distrital Francisco Jos de

Caldas y que fueron evaluados en este trabajo.

Martnez & Mayorga (2013) desarrollaron las bases del Banco Gentico en el Laboratorio

de Microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad

Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC, siglas de la coleccin microbiolgica), utilizando

la refrigeracin como mtodo primario implementando y estandarizando adems el sistema de

criopreservacin.

En este trabajo, se pretendi determinar el estado de criopreservacin de cinco cepas

bacterianas mediante pruebas de viabilidad, implementando y estandarizando adems el sistema de

liofilizacin, teniendo como punto de partida a los mismos, evalundolos frente a tres compuestos

protectores. Para ello, en primera estancia, se recibi una capacitacin sobre manejo y control de

microrganismos, preparacin de medios y seguridad de equipos en el laboratorio por parte de los

laboratoristas encargados; posteriormente se evalu el estado de criopreservacin de las cinco

cepas seleccionadas, utilizando tcnicas de recuento en placa estndar, y se evalu a tres

lioprotectores para la liofilizacin de cepas microbianas del Banco Gentico; adems, se realizaron

12

los ajustes pertinentes a los protocolos de seguridad de la criopreservacin y, se disearon los

protocolos para la implementacin del sistema de liofilizacin con las cinco cepas y el lioprotector

que present mejores resultados en este estudio.

Para la realizacin de estos fines, el trabajo fue dividido en cuatro fases, comenzando por los

criterios de eleccin de los microrganismos y los lioprotectores, seguido de la evaluacin de los

mtodos de preservacin, utilizando tres indicadores: viabilidad, estabilidad morfolgica y pureza;

posteriormente, una tercera fase de ajustes a la liofilizacin para lograr un producto fiable y

funcional a largo plazo, utilizando como indicadores las propiedades fsicas generales, la

posibilidad de contaminacin en el proceso y el tiempo de redisolucin; finalmente, una cuarta

fase, que corresponde al proceso de documentacin, este incluye la revisin y modificacin de la

base de datos, la elaboracin de nuevas etiquetas y formatos de control para los productos

liofilizados, as como de fichas resumen para cada trabajo presente en la coleccin y finalmente la

elaboracin del manual de procedimientos. Con lo anterior se encontr que el sistema de

criopreservacin desarrollado por Martnez & Mayorga (2013) es eficiente, y permite porcentajes

de recuperacin bastante altos, incluso superiores al 90% luego de dos aos; sin embargo, no todas

las cepas logran sobrevivir durante tanto tiempo a las condiciones en las que estn expuestas por

este mtodo. De otro lado se determin la sacarosa al 10% como el mejor lioprotector para bacterias

en general (aunque el lioprotector siempre obedece a las caractersticas propias de cada organismo)

y se estandariz el sistema de liofilizacin.

Este trabajo se formula como pilar principal en la implementacin de un nuevo mtodo de

conservacin de microorganismos para el Banco Gentico de la Universidad Distrital Francisco

Jos de Caldas, adems aporta al conocimiento prexistente de la liofilizacin en bacterias y ofrece

informacin y/o tips sobre el proceso de liofilizacin en general, que no suele mencionarse en otros

trabajos y que son importantes para la efectividad del proceso. Tambin se constituye como otro

sustento para el proceso de registro del Banco Gentico en la comunidad cientfica, a nivel nacional

e internacional.

Este documento consta, en su orden, de un captulo de introduccin y un marco referencial; de los

objetivos tanto general como especficos alcanzados en este trabajo; una metodologa detallada

paso a paso perfectamente reproducible; los resultados encontrados as como el anlisis de los

mismos y las conclusiones a las que se llegaron luego de todo un proceso de investigacin;

finalmente, un conjunto de recomendaciones para futuros trabajos en este campo, el campo de la

conservacin microbiana, y los captulos correspondientes a las referencias y bibliografa utilizada.

Se incluye tambin un captulo con ocho anexos que enriquecen el entendimiento y el alcance en

la comunidad cientfica del presente trabajo.

13

2. MARCO REFERENCIAL

2.1. IMPORTANCIA DE LOS MICROORGANISMOS Y LAS COLECCIONES

MICROBIOLGICAS.

La vida en la Tierra no sera posible sin la actividad continua de los microorganismos

(Hurtado, 2009), ya que estn involucrados con las dinmicas en los ecosistemas terrestres, areos

y acuticos en todas las regiones y condiciones ambientales que presenta el planeta. Existen

microorganismos que degradan la materia orgnica hacindola nuevamente disponible para las

plantas (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), evitando que el mundo sea un vertedero;

mientras otros juegan un papel importante en el desarrollo y avances tecnolgicos de la humanidad.

Los microorganismos de mayor importancia pertenecen a los dominios Archaea, Bacteria y

Eucarya, en donde, encontramos como primeros representantes a las bacterias, las ms numerosas,

encargadas de sostener la vida en nuestro planeta. Estos organismos ancestrales han colonizado

exitosamente cada nicho existente (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), muchas pueden

resultar benficas para ser utilizadas con fines biotecnolgicos, agrcolas, biomdicos, ecolgicos

y de biorremediacin (Morales-Garca et al., 2010). Otros microorganismos de gran importancia

son los micro hongos, estos constituyen un grupo muy numeroso y presentan una amplia

distribucin en la naturaleza, contribuyendo a la descomposicin de la materia orgnica y

participando en los ciclos biolgicos (Pontn, Moragues, Gen, Guarro, & Quinds, 2002).

El uso de los microorganismos ha sido importante en el enfrentamiento y solucin de los

graves problemas de la humanidad (Gonzles, de Oca Martnez, Rivern, & Nez, 2006), en la

agricultura, alimentacin, salud y en la bsqueda de nuevas fuentes de energa y la conservacin

del medio ambiente. Todo esto ha sido posible gracias a la capacidad de estos para desarrollar

variedad de funciones bioqumicas; para Atlas (citado por Olalde Portugal & Aguilera Gmez,

1998) dicha capacidad se basa en la posibilidad de llevar a cabo una enorme cantidad de

reacciones: oxidaciones, reducciones y precipitaciones, y que de manera directa o indirecta

gobiernan todos los procesos en la tierra (pg. 289).

Los recursos microbiolgicos (microorganismos, genes e informacin) son la materia prima

esencial para el avance de la tecnologa, las ciencias de la vida (Ivshina & Kuyukina, 2013), el

desarrollo de medicamentos farmacuticos, agentes agroqumicos, biocontroles, cosmticos y

productos industriales (Ten Kate, 1995). Adems, con el surgimiento de los medios de cultivo para

el crecimiento y el xito de los primeros aislamientos de microorganismos, se marc la necesidad

de preservarlos para el futuro y que los gobiernos tuvieran el compromiso de apoyar la

conservacin de toda la biodiversidad microbiana, logrando la inclusin de este tema en el

desarrollo de las polticas ambientales (Gonzles et al., 2006).

El mtodo de preservar la diversidad de microorganismos en el planeta, fuera de sus

ambientes, ecosistemas y nichos, ha sido la creacin de colecciones biolgicas, cuyo principal

objetivo es mantener las cepas en un estado viable sin cambios morfolgicos, fisiolgicos o

genticos (Montes de Oca et al., 2008). Las colecciones de cultivos microbianos varan en forma,

funcin y tamao. Pueden ser pequeas, privadas, mantenidas por un solo investigador y limitado

a una fuente o taxones especficos (Dures Sette, Pagnocca, & Rodrigues, 2013).

14

El papel y las funciones de las colecciones microbianas como infraestructura bsica de

investigacin en ciencias de la vida, llevan una gran cantidad de similitudes con otras colecciones

ex situ (Stromberg, Dedeurwaerdere, & Pascual, 2013) de animales y plantas; pero se cuentan con

caractersticas especficas para los microorganismos. En primer lugar, los organismos microbianos

tienen una variacin gentica extremadamente alta y altos ndices de mutacin en la reproduccin

en las especies; por lo tanto se hace necesario mantener los organismos in vitro en colecciones ex

situ (Stromberg et al., 2013) a su lugar de recoleccin. En segundo lugar, las colecciones

proporcionan material para analizar estrategias de conservacin, asegurar los recursos genticos

ante futuras necesidades imprevistas e importantes; para proporcionar biomateriales autenticados,

para materiales de investigacin, exploracin y produccin as como su uso contemporneo por

parte de las entidades privadas y pblicas (Stromberg et al., 2013).

Los microorganismos al igual que otros seres vivos, poseen una nica e irremplazable

secuencia de ADN, por lo que su desaparicin implicara la prdida irreversible de un conjunto

nico de informacin (Olalde Portugal & Aguilera Gmez, 1998), de ah la gran importancia en la

creacin de comits, comisiones, federaciones y grupos de microbiologa como: World Federation

for Culture Collection (WFCC), International Union of Microbiological Societies (UMIS) entre

otros, encargados del establecimiento y desarrollo de colecciones de cultivo para la conservacin

ex situ de la diversidad microbiana que sostiene la vida en la tierra (WFCC, 2010b).

2.2. CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS.

En las colecciones es necesario establecer mtodos de conservacin confiables y especiales,

pudiendo realizarse a corto, mediano y largo plazo, para asegurar la ptima viabilidad,

almacenamiento y pureza (WFCC, 2010b) de los diferentes microorganismos. Para brindar

seguridad y reducir los riesgos de prdida, cada cepa debe mantenerse cuando sea posible en

mnimo dos mtodos (WFCC, 2010b) de conservacin, que consideren el tiempo a emplear en la

preservacin inicial, manipulacin y control peridico de las cepas, as como el espacio de

almacenamiento disponible y su importancia (Weng Alemn, Daz Rosa, & lvarez Molina, 2005).

Se debe tener especial cuidado con gneros y especies todava no conservadas en colecciones

(especies nuevas), contando con un rango amplio de procedimientos para determinar los protocolos

ptimos (WFCC, 2010a) de conservacin de estos.

2.2.1. Conservacin a corto plazo.

Comnmente se utiliza cuando el microorganismo en cuestin ser utilizado en un corto

periodo de tiempo. Suele utilizarse la tcnica de resiembra continua; en este, el microorganismo se

siembra en un medio adecuado (selectivo o no) y posterior a su crecimiento, es almacenado a 4C,

donde se mantiene para su uso, resembrndolo en un lapso de tiempo no superior a un mes

(Morales-Garca et al., 2010).

2.2.2. Conservacin a mediano plazo. Criopreservacin.

Este concepto agrupa a las tcnicas con las que se logran mantener la viabilidad de los

microorganismos de 2 a 5 aos (Weng et al., 2005). Existen variedad de tcnicas como la

desecacin el gel de slice o perlas de vidrio, el almacenamiento en parafina liquida (Weng et al.,

2005) o la congelacin. La inclusin de esta ltima tcnica en este grupo es discutida por algunos

autores, ya que hay quienes sostienen que tanto la liofilizacin como la criopreservacin (o

15

congelacin) son tcnicas de conservacin a largo plazo (Perry, 1995; Weng et al., 2005) y otros

insisten su inclusin en las tcnicas de conservacin a mediano plazo (Morales-Garca et al., 2010).

La criopreservacin consiste en congelar y almacenar las muestras a muy bajas temperaturas.

Esto permite la eliminacin del agua libre disponible, y que en el interior de los individuos, slo

una proporcin del total de agua se convierta en hielo (Perry, 1995, pg. 23),

El almacenamiento de los microorganismos en un rango de -60 a -80 C a menudo conduce

a un buen nivel de viabilidad, teniendo en cuenta que se pueda tolerar una cierta prdida de la

viabilidad del cultivo (Perry, 1995) por parte del laboratorio. Este mtodo es costoso debido a la

infraestructura y equipos (ultracongeladores) necesarios para conservar las clulas a -80C

(Morales-Garca et al., 2010). Heckly (citado por Perry, 1995) indica que ante estas bajas

temperaturas, la viabilidad celular es casi independiente del perodo de almacenamiento; adems

se cree que los individuos criopreservados, siguen siendo genticamente estables.

Hublek (2003), menciona una gran cantidad de factores que intervienen en la efectividad de

la criopreservacin de microorganismos, desde las caractersticas propias del individuo (cepa,

especie, tamao y forma de celda, fase de crecimiento al momento de congelar, composicin de las

clulas, etc.), as como los factores antes (composicin del medio de crecimiento, pH, temperatura

de incubacin), durante y posterior al proceso de criopreservacin (densidad poblacional,

aditivos, temperatura y duracin del almacenamiento), e incluso en su descongelacin.

Los aditivos crioprotectores son compuestos qumicos de gran afinidad por el agua y son

utilizados para disminuir los daos durante el proceso de congelacin (Gonzles et al., 2006, pg.

16). Estos protectores se pueden clasificar segn su peso molecular (bajo o alto) o segn su tasa

y/o capacidad de penetracin: los penetrantes, de bajo peso molecular, que desplazan el agua

intracelular evitando la formacin de hielo (por ejemplo el glicerol), y los no penetrantes, de alto

peso molecular, que promueven la rpida deshidratacin de la clula (por ejemplo los glcidos)

(Hublek, 2003).

2.2.3. Conservacin a largo plazo.

Este concepto agrupa a las tcnicas que adems de minimizar al mximo el riesgo de cambio

gentico en las clulas, mantiene un buen nivel de viabilidad por 10 aos o ms (Weng et al., 2005).

La ms popular es la liofilizacin.

2.2.3.1. Liofilizacin.

La liofilizacin consiste en la eliminacin del agua de una sustancia congelada por

sublimacin del hielo bajo alto vaco y a presiones muy bajas (Gonzles et al., 2006) utilizando un

equipo llamado liofilizador. Si la liofilizacin es exitosa, se puede asegurar una viabilidad

posliofilizacin por varios aos de los microorganismos, sin embargo, dicho xito depende de

mltiples factores, entre otros, como los mencionados por Hublek (2003) para la criopreservacin

(puesto que la liofilizacin posee una etapa de congelacin); as mismo el tiempo de liofilizacin,

los parmetros de liofilizacin, el medio, aditivo o lioprotector usado, tipo de liofilizador o

accesorio utilizado, influyen en el producto final.

16

El proceso de conservacin de microorganismos por liofilizacin se puede dividir en mltiples

etapas, desde la formulacin del protector, hasta el modo en que se recuperarn los individuos de

las muestras liofilizadas (Figura 1).

Figura 1. Esquema general de la conservacin de microorganismos mediante el proceso de

liofilizacin. Las barras claras representan las tres etapas propias de la liofilizacin. As mismo, se

representa el efecto de cascada en trminos de la viabilidad de las muestras.

a) Formulacin. Se entiende como la mezcla de clulas con cualquier solucin protectora, que tras la

eliminacin del disolvente, permita obtener un producto (liofilizado) deseado. La solucin

protectora ayuda a sobrevivir a las bacterias el proceso de liofilizacin. Estas soluciones

pueden ser simples (soluciones de glcidos) o complejas (sueros de animales) (Ops

Diagnostics, 2015).

Las soluciones protectoras ptimas contienen principalmente un soluto protector,

denominado lioprotector que estabiliza las clulas cuando se elimina el disolvente (agua);

y un agente de matriz que permite que toda la muestra mantenga una forma estable (pastilla

o torta) durante y despus de la liofilizacin (Figura 2). Algunos lioprotectores en

determinadas concentraciones actan como su propia matriz, por ejemplo, la sacarosa al

10% (Ops Diagnostics, 2015).

La formulacin tambin comprende el medio y el tiempo de crecimiento de los

microorganismos antes de liofilizarse, pudiendo variar de si se parte de un cultivo slido en

agar o de un cultivo lquido, hasta que sean cultivos slidos densos (edad de 1-2 das) o

lquidos en fase estacionaria. Cuando se parte de un medio lquido, y si es posible, las

clulas se centrifugan, retirando el medio de cultivo, y el sedimento se re-suspende con un

volumen igual de solucin protectora (Ops Diagnostics, 2015), o de lioprotector (Grauer,

Grunberg, & Zardo, 2015). Para cultivos desde agar, suele lavarse la placa/tubo con 5-10

ml de medio protector, posteriormente recogido con una pipeta estril (Ops Diagnostics,

2015). Aunque en esto ltimo se evita la centrifugacin, se obtiene un mayor nmero de

clulas partiendo de cultivos lquidos (Grauer et al., 2015).

17

Figura 2. Esquema de un producto correctamente liofilizado y sellado.

Fuente: Adaptado de Jennings, T. A. (2008). Lyophilization, Introduction and Basic Principles (pg. 5).

New York: Informa Healthcare USA, Inc.

b) Congelacin. La congelacin es la primera etapa del mtodo de liofilizacin, y uno de los ms

importantes para el xito de este. Su funcin consiste en obtener una matriz en donde est

separado el disolvente de los solutos. Cuando se congela la formulacin, el agua del medio

acuoso forma cristales de hielo en tanto que los solutos se limitan a la regin intersticial

entre los cristales de hielo (Jennings, 2008), la matriz entonces formada disminuye el

movimiento del agua en la regin intersticial a casi 0, adems proporciona una estructura

con resistencia casi nula, al flujo de vapor de agua durante las etapas de secado (Jennings,

2008).

Disminuir el flujo de agua rpidamente es importante para evitar as la excesiva

concentracin de solutos; un proceso de congelado ideal disminuye el efecto de

concentracin de solutos, evitando el estrs osmtico y permitiendo una organizacin

espacial de los componentes de la formulacin en forma similar a antes del congelamiento

(Grauer et al., 2015).

La temperatura y el tiempo para una congelacin completa de la formulacin

dependen de la naturaleza de la misma. Nireesha et al. (citado por Grauer et al., 2015) indica

que la microestructura de la matriz establecida durante el congelado generalmente define la

microestructura del producto seco, de ah que una correcta congelacin, reduce la

desnaturalizacin trmica del liofilizado, inmoviliza componentes de la solucin, y evita

la formacin de espuma cuando se aplica el vaco (Adams, 2007).

c) Secado primario. Corresponde a la segunda etapa de la liofilizacin, adems es la de ms larga

duracin. En este etapa, la presin se reduce y la temperatura de la formulacin congelada

es elevada, dando lugar a la sublimacin (Figura 3) y migracin de vapor de agua (Grauer

et al., 2015) desde el congelado hacia el condensador del liofilizador. Sin embrago, dicha

temperatura (llamada temperatura de interface) debe estar por debajo de la temperatura

eutctica, de colapso, de transicin vtrea (Tg), para minimizar el dao de la muestra

(Adams, 2007).

18

Figura 3. Diagrama de fases mostrando el punto triple del agua. Se indican los requerimientos de presin

y temperatura que hacen posible la sublimacin del agua durante la liofilizacin.

Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pg. 19). Journal of Validation Technology, 18-23.

El tiempo para el secado primario depende de mltiples factores, como la

composicin de la solucin protectora, la porosidad del congelado, la calidad o resistencia

de la matriz, la cantidad de muestras, as como tambin el volumen de la formulacin entre

otros. Respecto al volumen, para las bacterias, las muestras rara vez tienen que ser grandes

y por lo general son de 0,25 a 0,5 ml (Ops Diagnostics, 2015). Aunque no existe un

volumen establecido, hay que tener en cuenta que un volumen mayor requiere de ms

tiempo.

Segn Ops Diagnostics (2015), un perodo de secado primario de un da es suficiente,

pero es aconsejable probar esto antes de liofilizar una gran cantidad de muestras, teniendo

como gua un tiempo de liofilizacin de una noche.

La etapa de secado primario finaliza cuando todos los cristales de hielo se han

eliminado de la formulacin, y el volumen ocupado por la torta resultante es equivalente a

la de la matriz congelada (Jennings, 2008, pg. 6).

d) Secado secundario. Es la tercera y ltima etapa de la liofilizacin. Al terminar el secado primario, se ha

eliminado el agua mvil de la muestra. Sin embargo, existe agua atrapada dentro del slido

amorfo que es ms difcil de eliminar (Fetterolf, 2010). La cantidad de agua es discutible,

ya que flucta en funcin de la temperatura y las caractersticas propias de los

19

constituyentes de la formulacin, por ello algunos autores sugieren que oscila entre el 5-

10% w/w del producto seco (Jennings, 2008) o del 2-4% (Ops Diagnostics, 2015).

La reduccin del contenido de humedad en la torta se logra por desorcin (Adams,

2007), sin reducir el volumen de la misma (Jennings, 2008). Esto se consigue aumentando

la temperatura y reduciendo la presin parcial de vapor de agua en el recipiente (Jennings,

2008) o manteniendo las bajas presiones del secado primario, durante el secado secundario

(Ops Diagnostics, 2015). Es importante que la temperatura no se incremente velozmente, y

que se mantenga por debajo de la temperatura de transicin vtrea, la cual, aumenta

conforme el agua es eliminada (Fetterolf, 2010).

Segn Ops Diagnostics (2015), esta etapa es relativamente corta, con una duracin de

1 a 2 horas, aunque Grauer et al. (2015) indica que representa entre el 30-40% del tiempo

total del proceso; as mismo Fetterolf (2010) manifiesta que puede ser un proceso largo,

con una duracin de hasta varios das. Esto resulta importante puesto que la cantidad de

agua residente luego del secado, afecta la tasa de prdida de viabilidad durante el

almacenamiento (Grauer et al., 2015, pg. 16)

Finalmente, al ser removida la humedad residual, la muestra (denominada en adelante

liofilizado) alcanza la estabilidad (Grauer et al., 2015), obteniendo un contenido en forma

de torta porosa (Figura 2), o pastel esponjoso con poca (inferior al 1%) o nula humedad

residual (Fetterolf, 2010).

Las tres etapas del proceso de liofilizacin, en funcin de la temperatura y la presin

y en contraste con el diagrama de fases del agua, pueden ser observadas en la Figura 4.

Figura 4. Descripcin global del proceso de liofilizacin. De 1-3, Congelamiento (1-2 presin

atmosfrica); de 3-4, secado primario; de 4-5, Secado secundario.

Fuente: Fetterolf, D. M. (2010). Lyophilization (pg. 19). Journal of Validation Technology, 18-23

20

e) Sellado y almacenamiento. Terminado el proceso de secado secundario, se deben sellar los viales al vaco (de ser

posible) o de forma hermtica tan pronto como sea posible, debido a que la torta actuar

como una esponja que absorbe vapor de agua del ambiente (Fetterolf, 2010), aunque

tambin es posible agregar al liofilizado un gas inerte (Adams, 2007), e incluso algunos

laboratorios depositan perlas de slice.

Los liofilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente. Sin embrago, aunque

se logre un correcto sellado al vaco, no se puede asegurar una larga vida til en condiciones

ambientales, ya que la estabilidad de la torta disminuye con el tiempo, y se alcanza mayor

supervivencia cuanto menor sea la temperatura de almacenamiento (Grauer et al., 2015),

por ello, lo mejor es almacenar los liofilizados a 4 C en la oscuridad (Ops Diagnostics,

2015), reduciendo las posibilidades de prdidas aunque haya quedado agua despus del

secado.

f) Reactivacin o rehidratacin. Es el proceso por el cual se restaura el liofilizado a su formulacin original, esto

implica la adicin de un volumen de diluyente conocido a la torta seca (Jennings, 2008;

Grauer et al., 2015). La dilucin rpida (inferior a un minuto) y completa de una torta al

agregar el diluyente (Jennings, 2008), da cuenta de un correcto proceso de liofilizacin.

Tiempos de reconstitucin excesivamente largos, la prdida de potencia, o la formacin

de una solucin turbia son indicios de un proceso de liofilizacin inadecuada o un mal

funcionamiento del equipo de liofilizacin (Jennings, 2008, pg. 11).

La recuperacin de las clulas, sin embrago, tambin se ve afectada por factores como

el volumen de diluyente (procurando sea el mismo usado previo a la liofilizacin), el tipo

de diluyente, su temperatura, su pH, la osmolaridad (Grauer et al., 2015), la potencia del

lioprotector (Jennings, 2008), entre otras propiedades de la solucin resultante.

Grauer et al. 2015, sugieren la utilizacin de medios de cultivo nutritivos no

selectivos para la recuperacin de los microorganismos, con el fin de evitar el estrs

osmtico que pueden causar las soluciones diluidas; sin embargo, algunos laboratorios

venden los diluyentes de rehidratacin especficos para cada microorganismo o de forma

estandarizada se utiliza buffer de agua peptonada o buffer fosfato.

Ops Diagnostics (2015), indican que una tasa de supervivencia superior al 50% se

considera aceptable por muchos laboratorios.

2.2.3.2. Control de calidad de un producto liofilizado.

Las propiedades fsicas generales son importantes porque dan niveles altos de confianza a

nivel comercial y tienen en su mayora un efecto directo sobre la BSR y el efecto que las

condiciones de almacenamiento tendrn sobre la viabilidad de las cepas y las propiedades del

mismo. Las propiedades observadas de un liofilizado obedecen a una combinacin entre los

parmetros de la formulacin y el proceso de liofilizacin, por ello, permiten el seguimiento y la

deteccin de falencias (Jennings, 2008).

21

Esta evaluacin permite caracterizar las diferentes propiedades fsicas, qumicas y el efecto

que las condiciones de almacenamiento tendrn sobre dichas propiedades. Jennings (2008) y Tic

G. (1987), recogen algunos de las tpicos a tener en cuenta para el control de calidad de un producto

liofilizado, por ejemplo, las propiedades generales fsicas de la torta (color, volumen, temperatura

de transicin, textura, porosidad, densidad, contraccin o colapso, estado del vial, entre otras, que

en lo posible deben ser contrastadas con las de la formulacin), su grado de higroscopicidad (la

capacidad del liofilizado de absorber agua atmosfrica), la velocidad de redisolucin o

reconstitucin, la estabilidad (de la torta, el microorganismo o el lioprotector; evaluada de forma

natural o acelerada), nivel de humedad residual, posibles contaminantes, entre otras.

2.2.3.3. Equipamiento para liofilizar.

Como ya se mencion inicialmente, el proceso de liofilizacin, requiere de un equipo llamado

liofilizador (Figura 5), este equipo consta esencialmente de tres partes:

a) Un sistema o bomba de vaco, que reduce la presin del ambiente de la cmara que contiene el material a secar. Suele estar conectado a un filtro de aceite que funciona como trampa

para evitar que los vapores del solvente entren al interior de la bomba y lo daen. El nivel

de vaco requerido debe ser entre 50 y 100 bar (Grauer et al., 2015, pg. 9) aunque 200

bar son aceptables.

b) Un condensador con circuito de refrigeracin, que comunica con la cmara de secado y condesa el vapor de disolvente producto de la sublimacin, sobre una superficie enfriada

inferior a los -40C.

c) Cmara o accesorio de secado, que es donde se coloca el material a secar. Segn Nireesha et al., (2013) puede ser de tres tipos:

- Manifold o colector mltiple. - Rotary. - Tray style, de bandejas con o sin estante de taponado, ste ltimo cuenta con un sistema

para sellado al vaco de las muestras liofilizadas ubicadas en las bandejas.

Figura 5. Esquema general de un liofilizador y sus componentes. En la imagen, el liofilizador usa una

cmara de secado Tray style sin estante de taponado de tipo industrial.

Tomado de http://slideplayer.com.br/slide/84760/ el 15 de Agosto de 2015.

22

3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar el estado de criopreservacin de cinco cepas bacterianas mediante pruebas de

viabilidad, y liofilizacin de las mismas, evalundolas frente a tres compuestos protectores.

3.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Evaluar el estado de la criopreservacin de cinco cepas bacterianas utilizando tcnicas de recuento

en placa estndar.

Evaluar tres lioprotectores para liofilizacin de cepas microbianas.

Realizar los ajustes a los protocolos de seguridad existentes para la criopreservacin.

Disear y estandarizar los protocolos para el proceso de liofilizacin a partir de las cinco cepas

bacterianas trabajadas con el lioprotector que presente los mejores resultados.

23

4. METODOLOGA

La metodologa general del presente trabajo fue dividida en cuatro fases, como es ilustrado en la

Figura 6:

Figura 6. Metodologa. Aunque las cuatro fases de este trabajo siguen una secuencia lgica de eventos,

algunos procesos dentro de cada fase fueron realizados en conjunto con otra.

4.1. FASE INICIAL.

4.1.1. Acervo Microbiano.

De la coleccin de colorantes (CM-CR001-011) del Banco Gentico del laboratorio de

microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital

Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC), se seleccionaron las cinco cepas bacterianas con mejores

resultados individuales en la biodecoloracin de una mezcla de colorantes residuales generados por

el laboratorio de microbiologa; estas corresponden a CR004, CR005 (sustituida posteriormente

por CR009), CR006, CR007 y CR010, segn los resultados del trabajo de grado desarrollado por

Rodrguez (2013). Todas estaban conservadas por el mtodo de criopreservacin (o

criocongelacin) a una temperatura de -85 C 1C.

4.1.2. Eleccin de los protectores.

4.1.2.1. Crioprotectores.

El agente protector utilizado fue glicerol Anhidro (99.999%) (Mallinckrodt, Mxico) en

proporcin 67% v/v segn lo establecido por Martnez & Mayorga (2013).

4.1.2.2. Lioprotectores.

Para la eleccin de los agentes protectores y sus concentraciones en %p/v (Tabla 1), se

tuvieron en cuenta diferentes estudios: en contraposicin a Hensel (1994), se tomaron

concentraciones superiores al 9% de Glucosa (Merck, Darmstadt), de forma aleatoria. En cuanto a

las concentraciones de sacarosa (Merck, Darmstadt) se tuvo en cuenta los estudios de Zayed &

Roos (2004) y Palmfeldt, Radstrm, & Hahn-Hgerdal (2003). Para la leche descremada

(Proleche, Colombia) se tuvieron en cuenta los estudios de Palmfeldt et al. (2003). Dichos estudios

fueron tomados como referencia terica, aunque los microorganismos en ellos especificados, no

correspondan con los del presente trabajo.

Criterios de eleccin de los

microorganismos as como de

los lioprotectores a evaluar.

Evaluacin de los mtodos de

conservacin (criopreservacin

y liofilizacin).

Ajustes a la liofilizacin

para la generacin de

protocolos.

Proceso de Datado

Fase inicial

Fase intermedia 1

Fase intermedia 2

Fase final

24

Tabla 1. Lioprotectores y sus respectivas concentraciones utilizadas.

Lioprotector Glucosa Sacarosa Leche descremada

Concentracin

%p/v

10% 4% 10%

11.7% 10% 15%

27% 15% 20%

4.2. FASE INTERMEDIA 1.

4.2.1. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin.

En este trabajo se evaluaron dos mtodos de conservacin (criopreservacin y liofilizacin),

dicha evaluacin se realiz en trminos de tres (3) indicadores, valorados previamente (pre) y

posteriormente (pos) al mtodo en s.

4.2.1.1. Viabilidad.

Para evaluar este indicador se utiliz:

a) Conteo directo con cmara de Neubauer 1/10mm (Boeco), siguiendo la metodologa planteada por Valencia Z. (2004). Sin embargo, para obtener el nmero de bacterias, se

utiliz la ecuacin planteada por Bastidas (2015):

No de bacterias/ml=

*Fd: Factor de dilucin =

El conteo directo con cmara de Neubauer solo se realiz previamente al mtodo de conservacin

evaluado.

b) Conteo de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa, segn lo descrito por Valencia Z. (2004) y Camacho et al. (2009). Para el clculo de UFC/ml se

utiliz la siguiente frmula:

UFC/ml = N de colonias

Los clculos y resultados fueron expresados siguiendo la metodologa planteada por

Camacho et al., (2009) y solo para los casos especiales se utiliz los planteamientos del Instituto

de Salud Pblica del Gobierno de Chile (2008). Estos conteos se realizaron pre y pos en la

liofilizacin, y solo pos a la criopreservacin, en medio Standard Plate Count (SPC) (Oxoid,

England).

El porcentaje de viabilidad o tasa de supervivencia pre y/o pos al proceso de conservacin,

fue calculado a travs de la ecuacin propuesta por Morales-Garca et al., (2010):

Tasa de supervivencia (BSR %) = *DD: Despus de la desecacin

**AD: Antes de la desecacin

N Total de bacterias contadas 250000

Fd* N de cuadrados contados

g o ml de muestra

g o ml de muestra + g o ml de diluyente

1

Factor de dilucin

1

ml de muestra

Log (1 + N UFC/ml DD*) x 100

Log (N UFC/ml AD**)

25

4.2.1.2. Estabilidad Morfolgica.

Para evaluar este indicador se realiz:

a) Conteo en placa (caractersticas macroscpicas): Se elabor un formato (anexo 1) con las caractersticas macroscpicas descritas por Valencia Z. (2004), Prez & Mota (2006) y Daz

(2009), para las colonias desarrolladas en superficie, a partir del procedimiento de conteo

de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa. Se utiliz un

contador de colonias CC-1 (Boeco).

- Se seleccion solo una de dos placas, de una dilucin, conteniendo siempre un nmero de

UFC representativas, segn el rango estipulado por Camacho et al., (2009).

- Las caractersticas macroscpicas fueron observadas en al menos el 80% de las colonias

de la placa seleccionada.

b) Tincin de Gram (caractersticas microscpicas): Posterior al procedimiento anterior, se realiz una coloracin de Gram de tres (3) colonias diferentes para comprobar la

compatibilidad morfolgica con el microorganismo esperado (Snchez & Corrales, 2005,

pg. 24).

Se compararon con las caractersticas microscpicas y macroscpicas descritas por

Rodrguez (2013) y la informacin de la base de datos para cada cepa. De igual forma se tom

registro fotogrfico para la base de datos a travs de un microscopio Axio Scope A1 (Zeiss) con

cmara AxioCam ICc5 (Zeiss) usando el programa ZEN 2 LITE Blue, y un estereoscopio (Zeiss)

con cmara Canon G9.

4.2.1.3. Pureza.

Para evaluar este indicador se tuvo en cuenta los resultados de la estabilidad morfolgica en

cada conteo de clulas viables realizado por el mtodo de conteo de microorganismos mediante

tcnica de extensin superficial en placa.

4.2.2. Recuperacin de los microorganismos.

Para la recuperacin de los microorganismos se tom un criovial de cada cepa bacteriana,

sometido a una temperatura de 37C (Arcos, Ossa, & Daz, 2004) en bao serolgico, con agua

destilada, hasta su descongelacin, por aproximadamente cinco (5) minutos (Martnez & Mayorga,

2013). Los crioviales se introdujeron en bao serolgico una vez se lleg a la temperatura deseada,

no antes.

De cada criovial se tom un (1) ml con micropipeta, previamente agitado con Vrtex Genie

2T (Thomas Scientific) nivel 7 (2240rpm) por diez (10) segundos, diluyndolo en un tubo con

nueve (9) ml de medio SMPG (Martnez & Mayorga, 2013). Dicho tubo fue rotulado como T01 y

posteriormente fue colocado en incubadora a 25 C 1C de 18-24 horas.

Se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin a cada criovial (Thomas

Scientific, 5150636) por cepa, luego de preparado el tubo T01, antes de la incubacin. Se

compararon los resultados con los respectivos datos disponibles de la precriopreservacin

consignados en la base de datos del banco de cepas y los trabajos de grado de Martnez & Mayorga

(2013) y Rodrguez (2013).

26

4.2.3. Criopreservacin.

4.2.3.1. Precriopreservacin.

Pasado el tiempo de incubacin, se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de

conservacin al tubo T01, con el fin de determinar el nmero de clulas totales y viables de la

muestra. El conteo en Cmara de Neubauer se realiz solo hasta el final de los procedimientos de

preservacin, por lo cual una vez preparadas las diluciones, estas fueron llevadas a nevera a 4C

1C, para evitar la generacin de nuevas clulas.

4.2.3.2. Preparacin del inculo bacteriano y ejecucin de la criopreservacin.

Se sigui el protocolo de criopreservacin establecido por Martnez & Mayorga (2013),

consignado en el manual de procedimientos del laboratorio de microbiologa de la Facultad del

Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, con

algunas variaciones:

Con pipeta estril de 5ml, se depositaron en cinco (5) crioviales 1,2ml de glicerol anhidro estril.

Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 15s; diluyndolo en nueve (9) ml de medio SMPG nuevo (T02).

Posteriormente se tomaron alcuotas desde T02 de 600l, previo Vrtex nivel 7 por 15s, depositadas en cada criovial, para aforar un volumen final de 1800l. Se rotularon y se

realiz Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 5s para su homogenizacin.

Inmediatamente despus de la homogenizacin, fueron puestos en el Freezer Premium U570

(New Brunswick), a una temperatura de -85C 1C, en los respectivos racks para reemplazar los

crioviales existentes de la cepa en cuestin.

Este procedimiento se realiz en cabina de flujo laminar (Esco biotech) para evitar la

contaminacin del medio, procurando adems, no sobrepasar veinte (20) minutos (Martnez &

Mayorga, 2013), desde la extraccin de la alcuota de T01 y la congelacin, esto con el fin de evitar

la generacin de nuevas clulas.

4.2.4. Liofilizacin. Etapa 1.

4.2.4.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano.

Se parti del tubo T01 de cada cepa bacteriana, como inculo inicial para el proceso de

liofilizacin. Se extrajo un (1) ml de muestra del tubo T01, previamente agitado con Vrtex nivel

7 (2240rpm) por 15s, diluyndolo en nueve (9) ml agua destilada estril (T03).

4.2.4.2. Ejecucin de la liofilizacin.

Partiendo del tubo T03, previamente agitado con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 15s, se

extrajeron alcuotas de cien (100) l, veintisiete (27) veces, depositados en cada uno de los

crioviales a liofilizar. En cada criovial, se adicionaron novecientos (900) l de lioprotector, en tres

crioviales por cada concentracin de lioprotector, de los tres lioprotectores estudiados (Tabla 2).

Con el fin de que la concentracin de lioprotector en el interior del criovial fuera lo ms

exacta posible al adicionarle la alcuota del tubo T03, se utilizaron las siguientes ecuaciones para

su preparacin:

27

Donde el volumen inicial y la concentracin inicial corresponden al protector al momento de

ser preparado, en tanto que el volumen final y la concentracin final (Tabla 2) corresponden al

protector luego de agregada la alcuota del tubo T03.

Con un aforo de volumen total de un (1) ml en el criovial tapado (alcuota ms protector), se

agit con Vrtex nivel 2 (640rpm) por siete (7) segundos para su homogenizacin.

Posteriormente, a los crioviales se les retiraron las tapas plsticas y fueron tapados con Parafilm

(Pechiney, PM-996) esterilizado, realizando seis (6) perforaciones concntricas en la superficie

con aguja hipodrmica 21G x 1. Los crioviales fueron congelados en nitrgeno lquido por

15min aproximadamente, depositados en los flask y llevados a un liofilizador (ModulyoD, Thermo

Scientific) de 24-48 horas, a una presin inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura

inferior a -45C, usando el colector mltiple (manifold).

Terminado el proceso, se retiraron los viales del liofilizador y fueron trasladados a la cmara

de flujo laminar para evitar contaminacin de las muestras; all se les retir el Parafilm, se les tap

con tapas estriles y se les rotul.

Tabla 2. Nmero de repeticiones (y tubos), segn lioprotector y concentracin.

Lioprotector Concentracin

%(p/v)

Serie

A B C

Glucosa

10% 1 1 1

11.7% 1 1 1

27% 1 1 1

Sacarosa

4% 1 1 1

10% 1 1 1

15% 1 1 1

Leche

descremada

10% 1 1 1

15% 1 1 1

20% 1 1 1

Total crioviales segn N 9 9 9

Total crioviales usados por cepa 27

4.2.4.3. Posliofilizacin (Rotulado y almacenaje).

Cada criovial fue rotulado posterior al proceso de liofilizacin, utilizando una etiqueta o

rtulo (Figura 7) que contiene la siguiente informacin:

Cdigo de la cepa: Cdigo asignado para cada microorganismo en la base de datos, el Freezer y el banco de liofilizados. Corresponde a la descripcin del tipo de coleccin

biolgica (coleccin microbiolgica, CM), siglas de la coleccin (Colorantes, CR),

nmero de la cepa en la coleccin (004) y el tipo de vial (Trabajo, T).

Nivel de riesgo Biolgico: Se utiliz una escala de colores para la clasificacin de los microorganismos infecciosos por grupos de riesgo (Tabla 3), con base al manual de

bioseguridad en el laboratorio de la OMS (2005). Esta clasificacin por grupos de riesgo

28

es exclusivamente para el trabajo de laboratorio (OMS, 2005, pg. 1). El grupo de riesgo

biolgico solo aparece en las muestras liofilizadas, no en las criopreservadas, ya que stas

tienen rtulos distintos.

Ubicacin en el banco de liofilizados: Muestra la ubicacin exacta de cada vial. Corresponde a la bandeja (BAN A), la fila (F1) y el espacio dentro de la fila (1). Adicional

a ello, se menciona el lioprotector utilizado y sus concentracin en este vial.

Fecha: Muestra la fecha en la cual el vial es sellado e ingresa a la coleccin.

Figura 7. Rtulos creados para los viales liofilizados.

Posterior al proceso de rotulado, los crioviales fueron almacenados en una caja con

recubrimiento interno de espuma de poliuretano, a temperatura ambiente y protegido de la luz.

Tabla 3. Cdigo de colores propuesto segn la clasificacin de los microorganismos infecciosos por

grupos de riesgo de la OMS.

C.C.* en

CM-UDFJC Grupos de riesgo Descripcin

Grupo de riesgo 1

Riesgo individual y

poblacional escaso o nulo.

Microorganismos que tienen pocas probabilidades de

provocar enfermedades en el ser humano o los animales.

Grupo de riesgo 2

Riesgo individual

moderado, riesgo

poblacional bajo.

Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades

humanas o animales pero que tienen pocas probabilidades

de entraar un riesgo grave para el personal de

laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente.

Grupo de riesgo 3

Riesgo individual elevado,

riesgo poblacional bajo.

Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades

humanas o animales graves, pero que de ordinario no se

propagan de un individuo a otro. Existen medidas

preventivas y teraputicas eficaces.

Grupo de riesgo 4

Riesgo individual y

poblacional elevado.

Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades

graves en el ser humano o los animales y que se

transmiten fcilmente de un individuo a otro, directa o

indirectamente. Normalmente no existen medidas

preventivas y teraputicas eficaces.

Grupo de riesgo

desconocido

Agentes desconocidos. Para su manipulacin referirse al

manual de bioseguridad en el laboratorio de la OMS

(2005).

Nota: *Cdigo de Color. Fuente: Adaptado de OMS. (2005). Manual de bioseguridad en el laboratorio

(pg. 1). Ginebra: Ediciones de la OMS. Recuperado de http://www.who.int/csr/resources/publications

/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf

29

4.2.5. Rehidratacin o Reconstitucin. Etapa 2.

Se realiz una prueba de estabilidad natural en trminos del aspecto fsico y la viabilidad de

cada liofilizado luego de un perodo prolongado de tiempo (Grauer et al., 2015) en almacenamiento

a temperatura ambiente. Por ello, la rehidratacin de los crioviales se realiz en tres intervalos de

tiempo (Tabla 4).

Tabla 4. Rehidratacin de los crioviales.

Primera rehidratacin Segunda rehidratacin Tercera rehidratacin

Serie A (3-5) Serie B (32-34) Serie C (56-61) Nota: Intervalos de tiempo medidos en das, contados desde el da de almacenaje, en los cuales se rehidrat

cada serie de crioviales (nueve crioviales rehidratados por serie, ver Tabla 2). El aspecto fsico de cada

liofilizado fue datado antes de cada rehidratacin y comparado con su estado antes del almacenaje.

Los crioviales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37C, tomando

el tiempo de reconstitucin, luego incubados a 25C 1C por 30min y agitada con Vrtex nivel

2 (640rpm) por 7s. Posteriormente, se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de

conservacin. El indicador de viabilidad se evalu solo con el mtodo de conteo de

microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa.

Con base a los resultados anteriores y utilizando como criterio la ms alta BSR con cada

lioprotector entre las tres series durante la prueba de estabilidad natural para cada cepa, se eligi el

lioprotector y la concentracin de ste, que permiti obtener un mayor nmero de clulas viables

posliofilizacin y que ofreci adems una menor variacin durante la prueba, para la liofilizacin

definitiva de las cepas en estudio. Dicho lioprotector se estableci adems como el lioprotector

general para las bacterias del banco de liofilizados y el cepario madre de liofilizados, del Banco

Gentico del laboratorio de microbiologa de la Facultad del Medio Ambiente y Recursos Naturales

de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (CM-UDFJC).

4.3. FASE INTERMEDIA 2.

Sobre la base de los datos obtenidos en los procedimientos anteriores, con el nimo de

generar un protocolo funcional, aumentar el porcentaje de viabilidad a largo plazo, la estabilidad

de los liofilizados y dado que para esta etapa se parti de cultivos puros sobre medios slidos, se

realizaron variaciones en los procesos de preliofilizacin, liofilizacin y posliofilizacin, para la

liofilizacin definitiva y almacenaje de los viales en el banco de liofilizados y el cepario madre de

liofilizados.

4.3.1. Liofilizacin definitiva.

Una vez seleccionado el lioprotector y determinada la concentracin ptima, para cada cepa

de estudio, se realiz la liofilizacin definitiva.

4.3.1.1. Preliofilizacin y preparacin del inculo bacteriano.

Partiendo de un cultivo de entre 24-48 horas en medio SPC, se tomaron 4 asadas con

abundante crecimiento microbiano, inoculando un tubo (T04) con diez (10) ml de lioprotector

general. Posteriormente se agit con Vrtex nivel 7 (2240rpm) por 45s. Esto se realiz para cada

cepa.

30

4.3.1.2. Ejecucin de la liofilizacin.

El tubo T04 de cada cepa bacteriana, como inculo inicial para el proceso de liofilizacin

definitiva, se extrajeron cuatro (4) alcuotas de un (1) ml, previamente agitado con Vrtex nivel 7

(2240rpm) por 15s, que se depositaron en cuatro (4) viales de vidrio (Kimble Glass, 62113D-2)

posteriormente tapados con tapn de divisin. Cada vial se agit con Vrtex nivel 2 (640rpm) por

7s para su homogenizacin.

Se destaparon parcialmente los viales y se congelaron en nitrgeno lquido por 15min

aproximadamente para ser llevados al liofilizador (usando manifold) de 24-48 horas, a una presin

inferior a 0,266 mbar (200mTorr) y a una temperatura inferior a -45C.

El proceso de destape parcial y congelacin se realiz en cmara de flujo laminar para evitar

al mximo la contaminacin. El transporte de los viales desde la cmara de flujo laminar al

liofilizador se hizo en recipiente de poliestireno expandido cerrado conteniendo nitrgeno lquido,

para evitar contaminacin y descongelacin.

4.3.1.3. Posliofilizacin.

Cada vial fue debidamente rotulado posterior al proceso de liofilizacin. Dos viales,

designados como trabajo (T) y stock (S), fueron almacenados en el banco de liofilizados (anexo 2)

a temperatura ambiente. Un tercer vial fue almacenado en el cepario madre de liofilizados (Lf)

(anexo 3) que se encuentra en el interior de una nevera a 4C 1C.

4.3.1.4. Rehidratacin.

El cuarto vial de cada cepa fue rehidratado de la misma forma que los crioviales en el proceso

de rehidratacin de la etapa 2 y por ende las mismas condiciones de almacenamiento.

Adicionalmente se compararon los resultados con los obtenidos en la etapa 2 para verificar posibles

cambios en la viabilidad al partir de un medio slido.

4.3.2. Control de calidad de la liofilizacin y ajustes tcnicos.

Se llev un control de calidad de los liofilizados durante todo el trabajo con el nimo de

identificar falencias en el proceso de liofilizacin. Al identificarlas, se decidi repetir la

liofilizacin definitiva con los nuevos parmetros para aumentar la viabilidad a largo plazo de las

cepas estudio.

4.3.2.1. Propiedades fsicas generales.

Se observaron diferencias en volumen (encogimiento), color, textura, brillo, aspecto de la

torta y fractura de los crioviales y viales, teniendo como punto de comparacin la formulacin

luego de congelada. Esto se realiz para:

- Crioviales de la fase intermedia 1. - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.1). - Viales de la fase intermedia 2 (numeral 4.3.3).

4.3.2.2. Contaminacin.

Se observaron las placas sembradas cada vez que se realizaron pruebas de viabilidad, en

bsqueda de colonias no pertenecientes a las bacterias de estudio.

31

4.3.2.3. Tiempo de redisolucin o reconstitucin.

Se midi el tiempo de reconstitucin de cada criovial rehidratado en la etapa 2 de la fase

intermedia 1 y, el tiempo de los crioviales que contenan el lioprotector general, fue comparado

con el tiempo de reconstitucin de los viales de la liofilizacin definitiva y los viales sometidos a

la prueba de estabilidad acelerada.

4.3.3. Pruebas adicionales.

Para estas pruebas solo se us la formulacin del lioprotector general y la cepa CM-CR010,

por su alta tasa de crecimiento respecto a las dems cepas evaluadas.

4.3.3.1. Prueba de higroscopicidad msica.

Se liofilizaron (usando el estante de taponado) cuatro (4) viales y cuatro (4) crioviales con el

lioprotector general. Tres de cada tipo de vial se dejaron abiertos al aire libre (Tic G., 1987), se

tomaron los pesos con balanza analtica (AND, GR-200) en intervalos de diez (10) minutos por

una (1) hora y se promediaron sus pesos. El cuarto vial y criovial, se abrieron solo una vez, luego

fueron sellados completamente, tomando sus pesos de la misma forma ya descrita.

Para determinar si existe un tiempo mximo admisible de cerrado, se midi el contenido de

agua absorbida por parte del lioprotector general en funcin del tiempo, utilizando la ecuacin

descrita por Garca C. (2007):

*Wt (%) es el contenido de agua absorbida en el tiempo t (min)

*Mt (kg) es el peso medido en el tiempo t (s)

*Mo (kg) es el peso seco de la muestra

4.3.3.2. Prueba de estabilidad acelerada.

Se liofilizaron dos (2) viales de esta cepa, uno fue rehidratado a los cero (0) das y el otro

luego de siete (7) das en el interior de la cmara de envejecimiento, ambos en las condiciones que

se muestran en la tabla 5. Adicionalmente se dataron sus propiedades fsicas generales al finalizar

el secado y antes de rehidratar.

Tabla 5. Prueba de estabilidad acelerada.

N vial t T - HR

1 0 - ambiente - 25%

2 7 - 37C - 100%

Nota: Se muestran las condiciones a las que los viales fueron sometidos. t= Tiempo en das;

T=Temperatura; HR=Humedad relativa. La prueba de estabilidad se realiz en una cmara de

envejecimiento artesanal (ver anexo 4) en condiciones de temperatura y humedad controladas.

Los viales fueron rehidratados con 1ml de Buffer agua peptonada 0,1% a 37C, luego

incubados a 25 C 1C por 30min y agitada con Vrtex nivel 2 (640rpm) por 7s. Posteriormente,

se realiz evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin midiendo viabilidad con el mtodo

de conteo de microorganismos mediante tcnica de extensin superficial en placa.

32

4.3.4. Control de esterilidad.

Todos los medios, reactivos y soluciones lioprotectoras fueron esterilizados en autoclave

Tuttnauer (3850 EL) a 121C y 210Kpa por 20 minutos; las puntas de micropipetas, los viales,

crioviales y sus respectivas tapas, fueron esterilizadas en las mismas condiciones de presin y

temperatura en un tiempo de 15 minutos. Los materiales de metal y vidrio restante (como cajas de

Petri y pipetas), fueron esterilizados en horno Binder a 160C por 120 minutos.

Se realizaron controles constantes durante el desarrollo de todo el trabajo, desde la

preparacin de medios hasta el sellado de los viales, como se describe a continuacin:

4.3.4.1. Medios.

Se realiz control de esterilidad al agua peptonada (Oxoid, England) (en solucin de

rehidratacin y para las diluciones seriadas), al caldo SMPG, al medio SPC, a las soluciones

lioprotectoras y al glicerol anhidro; dejndolos en incubacin en las mismas condiciones de las

siembras de 24-48 horas luego de su esterilizacin. Se determin como indicador de contaminacin

cambios pticos (turbidez u opacidad) en los medios lquidos y presencia de colonias en medios

slidos.

4.3.4.2. Ambiente.

a) Nevera de almacenamiento de los medios y protectores. El proceso de control de ambiente se realiz con medio SPC dejando una caja de Petri

abierta en el interior de la nevera (Thermolab, 14-E0107) evitando pasar por encima de

estas al abrir las cajas. El periodo de exposicin fue de 15 a 30 minutos, dejndolos en

incubacin de 24-48 horas en las mismas condiciones de incubacin de las cepas de trabajo.

b) Cabina de flujo laminar. Se realiz el mismo procedimiento que en la nevera de almacenamiento, pero en este

caso la caja de control de ambiente se dej abierta desde el inicio hasta el final de los

procesos que requeran el uso de la cabina, esto es, tiempos de exposicin de hasta 3 o 4

horas. Este control se llev a cabo cada vez que se usaba la cabina de flujo laminar.

4.3.4.3. Tcnicas de siembra y manipulacin de elementos.

Aunque la mayor parte del trabajo se desarroll en el interior de la cabina de flujo laminar,

se procur mantener un adecuado control de asepsia en el trabajo, siguiendo no solo los protocolos

de uso de la cabina, sino adems un riguroso uso de elementos de proteccin como guantes y

tapabocas. Los guantes puestos y las micropipetas (Brand) fueron desinfectados constantemente

con alcohol 70% al iniciar el trabajo con cada cepa.

4.4. FASE FINAL.

4.4.1. Base de datos.

Se realiz una revisin a la base de datos del Banco de cepas creado por Martnez & Mayorga

(2013) en el programa Access, modificando algunos aspectos generales he introduciendo una

seccin para la informacin de los organismos liofilizados.

33

4.4.2. Fichas de resumen.

Se crearon unas fichas de acceso inmediato a las cepas de la coleccin, tanto del Freezer

como del banco de liofilizados, utilizando el programa Word 2013.

4.4.3. Revisin de etiquetas y logstica del banco de cepas en el Freezer.

Se realiz una revisin de la informacin en los rtulos de los crioviales y de etiquetas en las

cajas respecto a la base datos, con el nimo de verificar si se haban cumplido los protocolos y la

logstica establecida por Martnez & Mayorga (2013) y detectar la presencia o ausencia de posibles

falencias.

4.4.4. Formatos de control del banco de liofilizados.

Se crearon formatos utilizando el programa Word 2013, para el control de cepas en el banco

de liofilizados partiendo de los formatos establecidos por Martnez & Mayorga (2013) en la seccin

de criopreservacin.

Tabla 6. Formatos de control del banco de liofilizados y cepario madre de liofilizados.

Cdigo Tipo de registro Ubicacin Uso

FLf-01 Registro de entrada de cepas.

Archivero del laboratorio y Base

de datos

Cuando ingresa una nueva cepa

a la coleccin.

FLf-02 Proceso de liofilizacin.


de datos

Cuando se realice liofilizacin a

una cepa.

FLf-03 Registro de control de calidad.


de datos

Al rehidratar una cepa de la

coleccin y antes de liofilizar

una cepa para la coleccin.

FLf-04 Solicitud salida de cepas.


de datos

Cada vez que una cepa sea

pedida y salga del banco de

liofilizados.

Fuente: Adaptado de Martnez Bentez, H. L., & Mayorga Burgos, L. P. (2013). Implementacin de un

sistema para el mantenimiento de cepas de bacterias en el laboratorio de microbiologa de la Facultad del

Medio Ambiente y Recursos Naturales de la Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas (Tesis de

pregrado). (pg. 44). Universidad Distrital Francisco Jos de Caldas, Bogot, Colombia.

4.4.5. Manual de procedimientos.

Se realiz una revisin de la cartilla de procedimientos elaborada por Martnez & Mayorga

(2013). Se tom la decisin de restructurarlo y editarlo utilizando el programa Publisher 2013.

34

5. RESULTADOS

5.1. RECUPERACIN DE LOS MICROORGANISMOS Y EVALUACIN DE LA

CRIOPRESERVACIN.

A raz de la evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin en cada criovial por cepa,

se recuperaron del Freezer las cepas CM-CR004, CM-CR006, CM-CR007 y CM-CR010 utilizando

el criovial SS (semistock) de cada uno. En cuanto a CM-CR005, se utilizaron los cinco (5)

crioviales dispuestos en el Freezer, pero no fue posible recuperarla, por lo cual fue reemplazada

por CM-CR009, la sexta mejor respecto al criterio de eleccin de cepas.

Con los datos del proceso precriopreservacin de las cepas de inters correspondientes a la

coleccin de colorantes, consignados en el trabajo de Martnez & Mayorga (2013), en conjunto con

los datos de viables poscongelacin del presente trabajo, se calcul la BSR para cada cepa (Tabla

7). Se encontr que los porcentajes de BSR son superiores al 70% luego de dos (2) aos de estar

en criopreservacin (Figura 8), salvo CM-CR005.

Al comparar los datos de la BSR obtenidos en este trabajo con los datos del trabajo de

Martnez & Mayorga (2013) (slo se compararon los datos de la cepa CM-CR010, ya que las dems

cepas no figuran en su trabajo) se encontr un porcentaje inferior de recuperacin

poscriopreservacin por parte de las autoras, por lo cual se revis la metodologa, encontrando un

error metodolgico al calcular la BSR en su trabajo. Usando los datos de resultados prueba de

viabilidad poscongelacin, tabla 19 (en Martnez & Mayorga, 2013, pg. 54), se corrigi la BSR

para esta cepa, evidenciando ser la cepa ms resistente al proceso de criopreservacin, entre las

evaluadas, con alrededor de 6.6% de cada luego de dos aos en el Freezer (Tabla 7 y Figura 8).

Tabla 7. Evaluacin de la eficacia del mtodo de conservacin (criopreservacin).

Nota: Se muestran los resultados al evaluar la conservacin de las cinco (5) ce

Pruebas de viabilidad a cinco cepas bacterianas...

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