1

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE

MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA

Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas

aeruginosa MBL-03 en condiciones de laboratorio

Br. OBED RICARDO LUJAN MEZA

Proyecto de tesis para obtener el ttulo de

Bilogo - Microbilogo

TRUJILLO-PER

2013

1

PROYECTO DE TESIS

I. GENERALIDADES

1. TITULO

Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas aeruginosa MBL-03 en

condiciones de laboratorio

2. PERSONAL INVESTIGADOR

2.1. Autor: Obed Ricardo Lujan Meza

Ex-alumno de la Escuela Acadmico Profesional de Microbiologa y Parasitologa de la

Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

2.2. Asesor: Dr. Juan Guevara Gonzlez

Profesor Principal a D. E. del Departamento de Microbiologa y Parasitologa de la

Facultad de Ciencias Biolgicas de la Universidad Nacional de Trujillo.

3. TIPO DE INVESTIGACION

3.1. De acuerdo al objetivo que persigue: Aplicada.

3.2. De acuerdo a la tcnica de contrastacin: Experimental.

4. RGIMEN DE INVESTIGACIN: Orientada

5. DEPARTAMENTO Y SECCIN AL QUE PERTENECE EL PROYECTO:

5.1. Departamento: Microbiologa y Parasitologa

5.2. Seccin: Microbiologa Aplicada

6. LOCALIDAD E INSTITUCIN DONDE SE EJECUTAR EL PROYECTO:

6.1. Localidad: Trujillo-La Libertad.

6.2. Institucin: Universidad Nacional de Trujillo.

2

7. CRONOGRAMA GENERAL DE ACTIVIDADES

N Actividades Responsables Ao 2013

Oct. Nov. Dic. Ene. Feb. Mar.

1 Recoleccin

de datos

Investigador

Asesor

2 Anlisis de

datos

Investigador

Asesor

3

Redaccin

de Informe

de Tesis

Investigador

Asesor

8. FECHA PROBABLE DE INICIO Y TRMINO:

8.1. Inicio: Octubre 2013

8.2. Trmino: Marzo 2013

9. HORAS SEMANALES DEDICADAS AL PROYECTO

10. RECURSOS NECESARIOS

10.1. Recursos Disponibles:

10.1.1. Personal:

Autores

Asesor

10.1.2. Local:

Laboratorio de Microbiologa Ambiental, Departamento Acadmico de

Microbiologa y Parasitologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, Universidad

Nacional de Trujillo.

RESPONSABLES HORAS

(SEMANALES)

Obed Lujan Meza 10 h

Juan Guevara Gonzlez (asesor) 3 h

3

10.1.3. Materiales y Equipos: Cantidad (unidades/gramos)

Balanza de un platillo OHAUS 01 u

Balanza Analtica Lmin 01 u

Estufa Alion 01 u

Horno 01 u

Autoclave 01 u

Cmara ultravioleta 01 u

Refrigeradora National 01 u

Probetas de 100 mL Simax 01 u

Probetas de 50 mL Simax 01 u

Pipetas de 0.1 mL Qualicolor 01u

Pipetas de 5 mL Qualicolor 02 u

Pipetas de 10 mL Qualicolor 02 u

Matraces de 100 mL Simax 02u

Matraces de 500 mL Simax 02 u

Balones de 150 mL Schott. Gen 01 u

Mecheros de vidrio 01 u

Gradilla 02 u

Esptula 01 u

Goteros 02 u

Pipetas Pasteur 02 u

Motores 6 v 06 u

Encendedor 03 u

Asas bacteriolgicas 01 u

Tubos de 16 x 180 mL 08 u

pH metro 01 u

Termmetro 100 C 01 u

Calculadora Cientfica 01 u

Tubos de ensayo 24 u

Frascos de vidrio boca ancha de 1L (biorreactores) 03u

Cultivo puro de Pseudomonas aeruginosa MBL 03

NaH2PO4. 2H2O 7.8 g

KH2PO4 6.8 g

4

MgSO4 0.2 g

Fe(CH3COO)3NH4 0.01 g

Ca(NO)34H2O 0.05 g

Placas Petri 24 u

10.2. Recursos No Disponibles:

Segn el Clasificador por Objeto de Gasto, en nuevos soles, aprobado por el Congreso de

la Repblica:

2.3 BIENES Y SERVICIOS

2.3.1 COMPRA DE BIENES

2.3.1 5 MATERIALES Y UTILES

2.3.1 5.1 DE OFICINA

2.3.1 5.1 2PAPELERIA EN GENERAL, UTILES Y MATERIALES DE

OFICINA

Material

(Caractersticas) Marca Presentacin Cantidad

Precio

Unitario

(S/.)

Precio

Total

(S/.)

Plumn marcador Artesco unidad 2 2.50 5.00

Papel bond A4 80 g Atlas Paquete 1000 1 15 15.00

Bolgrafos Pilot unidad 2 2.80 5.50

Etiquetas adhesivas Atlas unidad 2 2.00 4.00

Flder manila unidad 10 0.5 5.00

Tijera Artesco unidad 1 1.50 1.50

Cintasde embalaje Celux unidad 1 1.00 1.00

Cinta Masking Shurtape unidad 1 2.00 2.00

Hoja Adhesiva Alpha unidad 1 1.00 1.00

Subtotal (1) 40.00

5

2.3.1 5.3 ASEO, LIMPIEZA Y COCINA

2.3.1 5.3 1 ASEO, LIMPIEZA Y TOCADOR

Material

(Caractersticas) Marca Presentacin Cantidad

Precio

Unitario

(S/.)

Precio

Total

(S/.)

Detergente Ace 160 g. 1 1.40 1.40

Lavavajilla Ayudn 350 g. 1 2.50 2.50

Leja Clorox 500 mL 1 1.30 1.30

Toallas

absorbentes

Scotch-

Brite Unidad 3 2.00 6.00

Papel Toalla Elite Unidad 1 4.80 4.80

Algodn CKF 500 g 1 12.50 12.50

Esponja de lavado Scotch

Brite Unidad 2 1.00 2.00

Jabn de tocador Neko Unidad 1 1.80 1.80

Frasco de plstico Artesco 100 mL 1 1.00 1.00

Despensero Sumac Unidad 1 22.80 22.80

Guantes Rubbercare Caja 1 16.00 16.00

Mascarillas Careplus Caja 1 10.00 10.00

Agua destilada Dropaksa Litro 5 2.50 12.50

Alcohol 96% Jennfar Litro 1 6.00 6.00

Ron de Quemar - litro 2 3.00 6.00

Sub Total (2) 106.60

6

2.3.1 8.2 MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y ACCESORIOS

MEDICOS, QUIRURGICOS, ODONTOLOGICOS Y DE LABORATORIO

2.3.1 8.2 1 MATERIAL, INSUMOS, INSTRUMENTAL Y ACCESORIOS

MEDICOS, QUIRURGICOS, ODONTOLOGICOS Y DELABORATORIO

Material

(Caractersticas) Marca Presentacin

Cantidad/

envase

Precio

Unitario

(S/.)

Precio

Total

(S/.)

Agar agar en polvo Dropaksa Frasco, plstico 100 g. 30.00 30.00

FeSO4.7H2O Merck Frasco, vidrio 100 g. 50.10 50.10

Peptona 1% Merck Frasco, plstico 20 g. 7.30 7.30

Extracto de carne

0.3% Merck Frasco, plstico 6 g. 5.70 5.70

Cocina elctrica - - 01 15.00 15.00

Pisetas Dropaksa Frasco, plstico 250 mL 10.00 20.00

Perxido de

hidrgeno Merck Frasco, plstico 30 mL 5.60 5.60

Sub Total (3) 133.7

2.3.2 CONTRATACION DE SERVICIOS

2.3.2 2.2 SERVICIOS DE TELEFONIA E INTERNET

2.3.2 7 SERVICIOS PROFESIONALES Y TECNICOS

Tipo de Servicio Unidad Cantidad Precio

Unitario

Precio Total

(S/.)

Fotocopias en negro pginas 300 0.05 15

Impresiones en negro y

color pginas 800 0.10 80

Empastado del informe

de tesis 240.00

7

Pago de anlisis de

muestras (LASACI) 27 20 480

Sub total (4) 815.00

Sub totales Precio (S/.)

Sub totales 1 40.0

Sub totales 2 106.60

Sub totales 3 133.7

Sub totales 4 815.0

TOTAL 1095.3

11. FINANCIAMIENTO

Autofinanciamiento

II. PLAN DE INVESTIGACION

1. REALIDAD PROBLEMATICA

En la actualidad el principal problema ambiental es la contaminacin, principalmente

ocasionada por las industrias; como la produccin de acero, minera, cemento y curtido de

pieles que vierten sus efluentes o residuos, conteniendo metales pesados, tales como Cu, Zn,

Ni, Cr y Pb. 1, 2, 3 12 En las zonas contaminadas por la actividad industrial, las concentraciones

de estas sustancias txicas a menudo exceden los niveles que se encuentran normalmente en

el suelo, medio acutico, los canales, y sedimento.4, 5 Tales metales pesados en aguas

superficiales ocasionan un problema muy grave, tanto para el medio ambiente como para los

sistemas biolgicos, ya que estos elementos no son biodegradables y se acumulan en los

tejidos vivos; ingresan al medio ambiente afectando la fertilidad de los suelos o contaminando

las aguas subterrneas y superficiales, dificultando su utilizacin para el consumo humano o

animal. 3, 6, 7.13

La acumulacin de metales txicos, por ejemplo, Cd, Cr, Cu, Hg y Zn, en los seres humanos

tiene varias consecuencias desfavorables, tales como anormalidades en el crecimiento y

desarrollo, carcinognesis, defectos en el control neuromuscular, retraso mental, mal

funcionamiento renal, bloqueando grupos funcionales de enzimas vitales y una amplia gama

de otras enfermedades.1, 8

8

Uno de los metales pesados que ms utilizado es el cromo ya que es utilizado en la metalrgica,

cromado, limpieza y procesamiento de metales, aleaciones, plantas de energa atmica,

conservacin de madera, fabricacin de pinturas y pigmentos, galvanoplastia e industrias de

curtiembre 5, 8, 9, 10, 14, 15 Esta sustancia ha sido identificado por el Medio Ambiente de EE.UU.

Agencia de Proteccin (EPA de los EE.UU., 1998) como uno de los 17 metales txicos que

presentan el mayor peligro en el medio ambiente.10 Ms de 170.000 toneladas anuales de

residuos de Cr se descargan al ambiente como consecuencia de las actividades industriales.

Del total de Cr utilizado en la industria del cuero, el 40% se retiene en el lodo; la eliminacin

en la tierra y los cuerpos de agua ha provocado un aumento en los niveles de cromo llegando

incluso a 30000 mg/Kg. 11

Los lmites mximo permisibles de cromo en el medio ambiente son: 0.4 mg/kg, para suelos

agrcolas y suelo residencial/parques; 1.4 mg/kg para Suelo Comercial/Industrial/

Extractivos; 0.05 mg/L para aguas superficiales destinadas a la produccin de agua potable,

agua para consumo humano y aguas superficiales destinadas para la recreacin. 32, 33, 34

El cromo existe en distintos estados de oxidacin, variando desde Cr II hasta Cr VI. En la

naturaleza las especies dominantes son el Cr VI y el Cr III.15, 18, 24 El Cr VI , en el ambiente,

est presente como cromato ( CrO42-) y dicromato (Cr2O7

2-) 4, 5, 6, 8, y es el estado con ms

elevada toxicidad ya que es mvil, se adsorbe fcilmente, es soluble en agua, y tiene un elevado

perodo de residencia en las aguas superficiales y subterrneas, lo que supone un riesgo para

la salud de los seres humanos y animales, afectando adems el desarrollo y crecimiento de las

plantas; adems est demostrado que es mutagnico, irritante, corrosivo y cancergeno 6 , 7, 9, 12,

16, 17, 19, 20 . Mientras que el Cromo III es menos soluble, por lo tanto, menos mvil, y mucho

menos txico que el Cr (VI); en el ambiente est presente formando complejos estables con

ligandos orgnicos o inorgnicos; estudios refieren que el cromo III es relativamente

inofensivo debido a su insolubilidad e incapacidad de atravesar las membranas celulares. 9, 12,

21 Adems el cromo III es un micronutriente esencial para los humanos, para el metabolismo

de la glucosa y grasas y el buen funcionamiento de la insulina. 5, 7, 8

La reduccin del Cr VI a Cr III es utilizado para desintoxicar aguas residuales contaminadas

con Cr.9 Tradicionalmente esto se logra mediante mtodo qumicos y biolgicos. 20. Los

mtodos qumicos implican el ajuste del pH, el uso de cidos y bases fuertes, sustancias

9

precipitantes, reductores qumicos tales como los sulfuros y sustancias frricas. 8, 12, 14 Estos

mtodos qumicos pueden ser bastante costosos, requieren de mucha energa o altas

cantidades de reactivos y pueden crear otras formas de desechos, adems, en concentraciones

muy bajas, estos mtodos son ineficientes. 5, 12, 14, 20, 22 Los mtodos biolgicos utilizan a

microorganismos para la reduccin de Cr VI; en recientes aos, la biorremediacin por

microorganismos est siendo considerada como una alternativa para la reduccin de Cr VI,

ya que se ha reconocido la capacidad de biosorcin, bioacumulacin y biorreduccin de Cr

VI por bacterias, hongos y alga; y estos mtodos son ms econmicos, ms eficientes, no

utilizan elevada energa y no son toxicos.5, 12, 22

Se han realizado diversos estudios, para reducir el Cr VI utilizando bacterias como:

Staphylococcus saprophyticus, Bacillus sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas

mendocina, Escherichia coli, Desulfovibrio sp., Microbacterium sp., Shewanella oneidensis., Arthrobacter sp.,

Acidithiobacillus thiooxidans, Enterobacter 8, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 27, 29, 30 las levaduras Candida sp., Candida

maltosa, y los hongos filamentosos Penicillium sp., Trichoderma inhamatum y Aspergillus niger. 23, 26

La utilizacin de Pseudomonas sp 9, 12, 28, 31 en este proceso de biorremediacin est muy

generalizada, puede utilizarse en procesos aerbicos, tanto como anaerbicos 11, 16, 22, 27; la

capacidad biorremediativa que tiene este gnero de bacteria se debe a la presencia de genes

en su plasmido.27 Las enzima involucrada en este tipo de biorremediacin es la cromato

reductasa.27, 12

Debido a que a nivel local se han realizado pocos trabajos en relacin a este tema y conociendo

el potencial en el uso de microorganismos para tratar de eliminar sustancias toxicas del medio

ambiente; se hace necesario iniciar estudios en estos temas para, de esta manera, ayudar a

disminuir la cantidad de contaminantes en el medio ambiente, y as mejorar el desarrollo de

nuestra regin. En tal sentido se justifica la realizacin de esta investigacin que tiene por

objetivo evaluar la Reduccin de Cromo (VI) en efluente de curtiembre por Pseudomonas

aeruginosa MBL-03 en condiciones de laboratorio

2. PROBLEMA

Cul es el efecto de Pseudomonas aeruginosa MBL 03 sobre el Cromo VI proveniente del

efluente de una curtiembre del Distrito del Porvenir, en condiciones de laboratorio?

10

3. OBJETIVOS

Evaluar el crecimiento de P. aeruginosa MBL-03 en efluente de curtiembre conteniendo

cromo VI, en un sistema aireado y agitado.

Evaluar la reduccin del cromo VI por parte de P. aeruginosa MBL-03, en el laboratorio

de anlisis fsico-qumicos LASACI.

4. HIPOTESIS

Implcita

5. DISEO DE EXPERIENCIA

Diseo estmulo creciente

6. MATERIAL Y PROCEDIMIENTO

6.1. MATERIAL

Muestra:

Cultivo de Pseudomonas aeruginosa MBL-03, del cepario del Laboratorio de

Microbiologa Ambiental de la Universidad Nacional de Trujillo.

Cuatro litros de efluente de curtiembre conteniendo Cr VI, del distrito Trujillo,

Provincia Trujillo, departamento la Libertad

6.2. PROCEDIMIENTO

6.2.1. Diseo y ensamblaje de Biorreactores

Se fabricara 5 biorreactores (tanque agitado y aireado) con frascos de vidrio de 1.7 L

de capacidad provistos de 4 deflectores de 1 x 11 cm, con motores de 6 V que sern

regulados a 3 V para su funcionamiento, y un agitador Rushton. Los biorreactores

sern conectados a un sistema de aireacin previamente purificado. 35

Todos los biorreactores sern esterilizados en cmara UV durante 2 horas.

6.2.2. Reactivacin del cultivo

Las bacterias de un cultivo stock de P. aeruginosa MBL-03 se sembrarn en 5 ml de

Caldo Nutritivo e incubados a 37 C por 18 horas.

11

6.2.3. Evaluacin de pureza del cultivo

El cultivo reactivado ser sembrado por superficie en agar nutritivo e incubado a

37C por 24 horas. Se observarn las caractersticas macromorfolgicas de las

colonias y las caractersticas micromorfolgicas mediante coloracin Gram. Luego

se sembrar en agar glutamato y en 10 mL caldo glutamato para observar si existe la

produccin de pioverdina y piocianina respectivamente.

6.2.4. Tratamiento del Efluente de Curtiembre

El efluente de curtiembre ser filtrado en papel filtro estril para retirar partculas

suspendidas. Luego el efluente pasar por una membrana filtrante de 0.44 um de

dimetro de poro para eliminar bacterioflora contaminante y asi evitar la interferencia

con la accin de P. aeruginosa MBL-03.

El efluente filtrado ser llevado al laboratorio de anlisis fsico-qumicos de la

Facultad de Ingeniera Qumica LASACI, para medir la cantidad exacta de Cromo

VI; y se har un recuento en placa para determinar la presencia o ausencia de

bacterias, incluyendo el gnero Pseudomonas.

6.2.5. Adaptacin del P. aeruginosa MBL-03

Al cultivo reactivado se le aadir volmenes de 25 ml del efluente tratado

conteniendo Cromo VI por cada 100 de volumen de suspensin bacteriana para

lograr su adaptacin permaneciendo as por 4 das a 37 C 36

6.2.6. Preparacin del Medio Mnimo de Sales

El medio mnimo de sales contendr: 15.6g Na2HPO4.2H2O; 13.6g KH2PO4; 0.4 g

MgSO4; 0.02 Fe(CH3COO)3NH4; 0.1 Ca(NO)34H2O. Disuelto en 2 litros de agua

destilada.

6.2.7. Preparacin del inculo de P. aeruginosa MBL-03

A partir de la etapa de adaptacin, se obtendr una concentracin final de 9x108

UFC/mL, para cada biorreactor se requerir un volumen de inoculo de 100 mL; Se

corroborara mediante recuento en placa por siembra en superficie, en agar nutritivo.

12

6.2.8. Inoculacin en los sistemas

En los cuatro biorreactores se colocar 700 mL que corresponden al total de afluentes

de curtiembre tratado a distintas diluciones: muestra sin diluir (T1), 1/2 (T2), 1/5

(T3) y 1/10 (T4), luego se les adicionara 100 mL de inoculo y 400 mL de medio

mnimo de sales., haciendo as un total de 1200 mL de volumen de trabajo,

conformndose asi los cuatro sistemas de tratamiento. Los sistemas se mantendrn

en agitacin y aireacin constante durante 9 das a 37 2 C.

Se tendr adems un testigo, donde los volmenes utilizados corresponden al sistema

de muestra sin diluir a excepcin del inoculo, que ser reemplazado con agua destilada

estril.

6.2.9. El efecto de P. aeruginosa se evaluar mediante la determinacin del

Crecimiento bacteriano y la concentracin residual de Cromo VI

6.2.9.1. Evaluacin del crecimiento

Se tomar 10 mL de cada biorreactor a tiempo cero y cada 3 das, durante 9

das; se centrifugara a 3500 rpm durante 15 minutos; se proceder a separar

el sobrenadante del sedimento, el sedimento se suspender en agua destilada

y se realizara diluciones al dcimo de cada contenido; para luego sembrar por

superficie para el recuento en placa, por duplicado; utilizando para ello las

dos ltimas diluciones.

6.2.9.2. Evaluacin de la concentracin residual de Cromo VI

El sobrenadante de cada muestra se le determinar la concentracin de

Cromo VI en el laboratorio LASACI a tiempo cero y cada 3 das durante 9

das.

Todo el procedimiento se har por triplicado.

6.2.10. Anlisis Estadstico

Los datos encontrados se analizarn por el mtodo estadstico ANAVA. Con el

propsito de determinar si existe diferencia significativa entre los valores: problema

- testigo del crecimiento y entre los valores: problema - testigo de la concentracin

residual de cromo VI.

13

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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