“PROTONACIÓN DE LA BASE CITOSINA EN OLIGONUCLEÓTIDOS”

CIENCIA NZADA

Unidad Querétaro

“PROTONACIÓN DE LA BASE CITOSINA EN OLIGONUCLEÓTIDOS”

MAESTRO EN TECNOLOGÍA AVANZADA

IBQ. MAR GARCÍA

DIRECTORES

DR. REYNALDO CARLOS PLESS ELLING y DRA. EVA GONZÁLEZ JASSO

Santiago de Querétaro, Qro. Junio del 2007

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN APLICADA Y TECNOLOGÍA AVA

TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

PRESENTA:

ÍA DEL ROSARIO JOVITA MORALES

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

“PROTONACIÓN DE LA BASE CITOSINA EN OLIGONUCLEÓTIDOS”

MARÍA DEL ROSARIO JOVITA MORALES GARCÍA

AGRADECIMIENTOS

Mi labor de estudiante para llegar a la culminac e este trabajo, tuvo como principal apoyo a mi familia, por toda su ayuda y comprensión, les dedico con todo mi amor este logro que

también es de ustedes, le doy Gracias a Dios por contar con ustedes:

A mi Mam : Jovita

Emilio Antonio,

Elisa María y

Marco Antonio: Mis hijos

Antonio: Mi esposo

Federico Alonso: Mi hermano

Nuevamente, le doy Gracias a rme brindado la oportunidad de e

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Así como a los Directores de CICATA – IPN Unidad Qro, por todo su apoyo a la realización de mis estudios: Dr. Adrián Luis García Dr. Joaquín Salas Rodríguez.

Por su ardua labor y dirección de esta Tesis mis sinceros agradecimientos al

Dr. Reynaldo Carlos Pless Elling y a la Dra. Eva González Jasso. Por su valiosa revisión al trabajo escrito, les doy gracias a: Dr. Jorge Adalberto Huerta Ruelas, Dr. Pedro Alberto Vázquez Landaverde y M. en C. Reydezel Torres Martínez.

A quienes de una o de otra forma contribuyeron a la realización de este trabajo,

al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, que me otorgó beca económica con el registro 195273, y a la Fundación TELMEX, por su ayuda tanto económica como material: Muchas

Gracias.

Junio 2007

ión d

á

mi Adorada Alma Mater, por habe

star en sus registros escolares al:

García y

i

ÍND

Página

ÍNDIC v

ÍNDICE DE TABLAS viii

RESUMEN ix

SUMMARY x

INTRODUCCIÓN 1

ANTECEDENTES 3

FUNDAMENTOS TEÓRICOS

1. ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS 4 2. NOMENCLATURA DE L 6

4. PROPIEDADES FIS 8

4.1 Distribución de carga 8 4.2 Tautomerí 8 4.3 Interacción 9

12 13

4.6 17

M

2. REACTIVOS 23

3. DISEÑO EXPERIMENTAL 27 3.1 Principios químicos

3.2 Determinación de la ecuación matemática para un sistema ácido-base

3.2.1

ICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL i

ÍNDICE DE FIGURAS iv

E DE GRÁFICAS

OS ÁCIDOS NUCLEICOS 3. FUNCIONES BIOLÓGICAS 7

ICOQUÍMICAS

a entre las bases

4.3.1 Interacciones por puentes de hidrógeno 9 4.3.2 Interacciones por apilamiento (stacking) 12

4.4 Ionización 4.5 Absorción UV

Equilibrio protonación/desprotonación

JUSTIFICACIÓN 21

OBJETIVO 21

ATERIALES Y MÉTODOS 1. INSTRUMENTACIÓN 22

27

30

Resolución de la ecuación matemática 31

3.2.1 Titulación experimental del sistema ácido-base 31

3.2.2.1 Sistema base NaOH →ácido HCl

32

3.2.2.2 Sistema ácido HCl →base NaOH

32

3.2.2.2 Sistema base NaOH - NaCl

ii

0.01M→ácido HCl 30

3.3 Determinación de la ecuación matemática para un sistema ácido-base en presencia

rtiguador: cacodilato de sodio 34 .1

del amo

3.3 Resolución de la ecuación matemática

Titulación experimental del sistema ácido-base en presencia del amortiguador: cacodilato de sodio 3.3.2.1 Titulación ácida del sistema cacodilato de

sodio 0.01 M

3.3.2.2 Titulación ácida del sistema cacodilato de sodio 0.003 M

ión de la ecuación matemática para e en presencia de ácido acético

.1

34

3.3.2 34

34

34 3.4 Determinac

un sistema de titulación ácido-bas 3.4

35

Resolución de la ecuación matemática ón experimental del sistema ácido-base

ador: ácido acético

RESULTROL

1. UV de la solución de cacodilato de sodio 0.01 M

1. e la solución de cacodilato de sodio 0.01 M

1.3 a

1.4 Compa T y de , en solución de cacodilato de sodio 0.01 M

Espectro de la solución de d-TTTTTT y de la solución del

.2 Titulación de d-TTTTTTT

bilidad del sistema

ES PROPIEDADES ÓPTICAS A TRANSICIÓN DEL GRUPO CITOSINA EN

UCLEOTÍDICO

MENTAL DEL pKa DE LA BASE UCLEÓSIDOS rimental del pK de citidina

a -desoxicitidina . ETER DO

NTRA ENAMAÑO, CONACOD LATO DE SOD 50

. TRO EXPERIMENTO

CONCLUSIONES

35 3.4.2 Titulaci

en presencia del amortigu

35 ADOS Y DISCUSIÓN

1. ESPECTROS Y TITULACIONES DE CONT

1 Espectro de absorción 39 2 Titulación d 39

Espectro de absorción de la solución de 2’-desoxicitidin 41 ración de los espectros de absorción de d-TTTTTT

d-TTTCTTT41

1.4.1 oligómero d- TTTCTTT

41

1.4 42 1.5 Esta 43

2. COMPARACIÓN DE DIFERENTTO DE LPARA EL SEGUIMIEN

EL ENTORNO OLIGON

44

3. DETERMINACIÓN EXPERICI ITOS

3.1 NA EN SIMPLES NDeterminación expe

a

del pK de la 2’

41

3.2 Determinación experimentalMINACI

42 4 D ÓN DEL pKa PARA LA BASE CITOSINA CUAN

SE ENCUET

OLIGONUC EL SIS

LEÓTIDOS DE DIFERENTE TEMA AMORTIGUADOR

C I IO (0.01 M) → HCl

5 O S S 5 6

58

iii

SUGERENCIAS

LOS I 58

BIBLIOG

NE O 61

57

G AR O

RAFÍA 59

A X

iv

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

1. Estructuras de las bases en el ARN y el ADN 4

2. Ejemplos de bases modificadas 5

3. Estructuras de los azúcares presentes en el ARN y ADN 5

4. Estructuras de la citidina y de la 2’-desoxicitidina 6

5. Tramo de cadena sencilla de ADN 7

6. Centros dadores/aceptores de puentes de hidrógeno en las bases nitrogenadas

8

7. Tautomería amino-imino y ceto-enol de las bases nitrogenadas 9

8. Pares de bases Watson-Crick de las dobles hélices de ADN y de ARN

10

9. Apareamientos tipo Hoogsteen 10

10. Apareamientos tipo Watson-Crick reverso(rWC) y tipo Hoogsteen (reverso)

11

11. Espectros de absorción característicos de adenosina 5’-monofosfato

15

12. Espectros de absorción característicos de citidina 5’-monofosfato

15

13. Espectros de absorción característicos de guanosina 5’-monofosfato

16

14. Espectros de absorción característicos de timidina 16

15. Gráfica de transición calculada con la ecuación Henderson-Hasselbalch

20

16. Espectro MALDI-TOF del nonaméro d-TTTTCTTTT 25

17. Espectro MALDI-TOF del heptámero d-TTTCTTT 25

18. Espectro MALDI-TOF del pentámero d-TTCTT 26

19. Espectro de absorción UV de la solución de cacodilato de sodio 0.01M, a 25 ºC

37

20. Espectro de absorción UV de 2’-desoxicitidina a 25 ºC, a

dos diferentes pH

39

21. Espectro de absorción UV para d-TTTTTTT a 25 ºC

40

22. Espectro de absorción UV para d-TTTCTTT a 25 ºC

40

v

ÍNDICE DE GRÁFICAS Página

1. Evaluación gráfica de pKa para la tit lación del heptámero 28

ntal, oligómero

32

a

32

experimental sistema sin oligómero

33

34

6. H teórico y el pH experimental sistema Cl, a 25ºC y sin oligómero

35

sistema C y sin oligómero

36

dio 0.01 M sin 5ºC

38

dio 0.01 M sin a 25ºC

39

01 M, 41

11.

u

2. Comparación del pH teórico y el pH experimesistema NaOH – HCl a 25ºC y sin

3. Comparación del pH teórico y el pH experimental sistemHCl – NaOH a 25ºC y sin oligómero

4. Comparación del pH teórico y el pHNaOH – HCl, en presencia de NaCl, a 25ºC y

5. Comparación del pH teórico y el pH experimental sistema cacodilato de sodio 0.01 M – HCl, a 25ºC y sin oligómero

Comparación del pcacodilato de sodio 0.003 M – H

7. Comparación del pH teórico y el pH experimentalácido acético – NaOH, a 25º

8. Titulación de la solución de cacodilato de sooligonucleótido con HCl, a 2

9. Titulación de la solución de cacodilato de sooligonucleótido con HCl,

10. Titulación de d-TTTTTTT en cacodilato de sodio al 0.con HCl a 25 ºC

Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl uimiento

44a 25ºC, usando A280*/A240* como parámetro de seg

12. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl * como parámetro de seguimiento

44

0.01 M - HCl seguimiento

44

45

90-A300)dil como parámetro de seguimiento

45

- HCl 25 ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimiento

47

0.01 M - HCl 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimiento

48

a 25ºC, usando A280*/A260

13. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio a 25ºC, usando A300*/A260* como parámetro de

14. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01M - HCl a 25ºC, usando A300*(dil) como parámetro de seguimiento

15. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M – HCl a 25ºC usando (A2

16. Titulación de citidina en cacodilato de sodio 0.01 M a

17. Titulación de 2'-desoxicitidina en cacodilato de sodioa

vi

18. Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01M – HCl a 25ºC, usando A280*/A * como parámetro de seguimiento

19. Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01M/NaCl 0.1M – HCl a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimiento

49

1M –

50

21. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01M – HCl, o 50

22. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01M/NaCl 0.1M – iento 50

23. Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01M/NaCl 1M – iento 51

24. Titulación del nonámero en cacodilato de sodio 0.01M – HCl 51

25. 0.1M – iento 51

26. 0.01M/NaCl 1M – to

27. H – HCl a 25ºC,

,

62

30. Titulación del pentámero a ω = 0.11

31.

63

63

34.

64

37. 64

38. 65

260 49

20. Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01M/NaCl HCl, a 25ºC usando A280*/A260* como parámetro de seguimiento

a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimient

HCl, a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguim

HCl a 25ºC, usando A */A * como parámetro de seguim280 260

a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimiento

Titulación del nonámero en cacodilato de sodio 0.01M/NaClHCl a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguim

Titulación del nonámero en cacodilato de sodio HCl a 25ºC, usando A280*/A260* como parámetro de seguimien

52

Titulación del heptámero en NaOusando A280*/A260* como parámetro de seguimiento 54

28. Titulación del nonámero en ácido acético 0.1M -NaOH a 25ºC* como parámetro de seguimiento usando A280*/A260

55


62

Titulación del pentámero a ω = 1.01 62

32. Titulación del heptámero a ω = 0.01

33. Titulación del heptámero a ω = 0.11 Titulación del heptámero a ω = 1.01

63

35. Titulación del nonámero a ω = 0.01

36. Titulación del nonámero a ω = 0.11 Titulación del nonámero a ω = 1.01

64

Titulación de 2’-desoxicitidina a ω = 0.015

vii


65


41. del pentámero a ω = 0.01

70

71

44. n

71

72

47.

n

73

73

51.

52. lación

Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación

65

70

42. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del pentámero a ω = 0.11

43. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del pentámero a ω = 1.01 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulaciódel heptámero a ω = 0.01 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del heptámero a ω = 0.11

71

45.

46. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del heptámero a ω = 1.01 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del nonámero a ω = 0.01

72

48. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulaciódel nonámero a ω = 0.11

72

49. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del nonámero a ω = 1.01

50. Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación de la 2’-desoxicitidina a ω = 0.01 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación de la 2’-desoxicitidina a ω = 0.11

73

Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titude la 2’-desoxicitidina a ω = 1.01

74

viii

ÍNDICE DE TABLAS

Página

1 Capacidad de apareamiento de bases en los pares con “balanceo”

3 sorbancia a diferentes 17

5 s titulaciones con y sin oligómero 29

9 la citosina en diferentes

11 dos por evaluación local de los

12 l pKa basadas en dos tipos diferentes de evaluación matemática

74

13 Comparación de las correcciones del pKa con fundamento en ajustes basados en interpolación entre los dos puntos más cercanos al punto medio de transición, o basados en el ajuste lineal de los tres puntos con los valores más bajos de (pH)preliminar

75

11

2 Valores de pKa de las bases en nucleósidos y nucleótidos 13

Valores del máximo de ablongitudes de onda y pH

4 Pesadas de agua a 25ºC 23

Diferencias de pH entre la

6 Razones teóricas de varios parámetros ópticos para d-TTTCTTT 42

7 Comparación de los valores de pKa del d-TTTCTTT 43

8 Razones experimentales comparadas con las razones teóricas 46

Valores de pKa a 25°C de

oligonucleotidos 49

10 Cambio relativo del valor A280*/A260

* 52

Valores de (pK ) determinaa preliminar

datos en comparación con valores determinados por ajuste matemático sigmoidal

66

Comparación de las correcciones de

RESUMEN ix

RESUMEN l pKa de las bases nitrogen propensión a su protonasprotonación, se ve afec po de las cargas negativas de

los grupos fosfato del ADN, que propicia la protonación de los grupos nitrogenados, ficulta tonaci n a eren la a conte de

ta snaturalización de ADN o ara estructuras planea a

nanoe a base de hebras de ADN. rm de las bases nitrogenadas en el ADN sería valiosa, u ases nitroge as

e p esta tes e p n simple nucleósido la

orada en el centrod ebra senc El d tudiado hasta el momento.

Los o odelo fueron sometidos a titulaciones ácidas o básicas, para s re el valor de pKa de la citosina al ser

p arámetro para el seguimiento c araron varios

parám bsorción de los oligon finalmente la razón de absorbancias A280/A260 co el más idóneo. Además, a partir del estudio de varios sistemas de ajuste y control del

s ilato de sodio al a controlada, la

acidific n los oligómeros en estudio. Los v es , determinados a

2 , nte iguales h sta claram ina dentro del si iden el efecto de campo de se heterocíclica. Por lo general, una mayor fuerza iónica de la solución reduce el valor de pKa de la base citosina en el oligómero, reflejando un apantallamiento parcial del efecto de campo eléctrico de los fosfatos por el electrolito; al más alto valor de fuerza iónica examinado, en cloruro de sodio al 1 M, el efecto de campo eléctrico se vio prácticamente nulificado. La comparación del pKa de la citosina ubicada al centro de oligómeros de varios tamaños, a saber pentámero, heptámero y nonámero, en condiciones comparables de fuerza iónica, no mostró tendencias claras, lo que indica que, para una evaluación del efecto de campo eléctrico de los fosfatos, el pentámero ya es lo suficientemente largo como para servir de modelo aceptable para una hebra sencilla extendida de ADN. En conclusión, se obtuvo información muy importante acerca del comportamiento de los valores de pKa de la citosina, en diferentes condiciones, estos valores pueden ser aplicados en la mejora de técnicas de biología molecular usadas actualmente.

Ede

adas del ADN, es decir latada por el efecto de cam

ción o

y didich

su desprotonación. Estas transiciones de protonación o despros bases son de importancia en el ámbito biológico, ya que interfi

ón econ

form ción correcta de sus pares de bases. También son de interés en el xto cierde d

s técnicas en biología molecular, por ejemplo en la decuenciación, así como pble hélice previa a su se

scala, construidas sobre ldas

Info ación al respecto del pKa

ya q e es de esperar que los valores de protonación de las biferentes en el caso polinucleotídico y en el nucleosídico, debido al efecto d

nadserán dcam o de los grupos fosfato en los polinucleótidos. El objetivo de is fucomprotona

arar la protonación (pKa) de la base citosina en ución (pK ) de una sola base citosina incorp

con de a

esoxirribonucleótidos que sirven como un modelo de ADN de holigo illa. pKa e la base citosina en estas condiciones no ha sido es

ligonucleótidos mevaluar incor

la magnitud del cambio que uforada a un oligonucleótido. Como p

espe trofotométrico de la transición en estas titulaciones, se competros ópticos, concernientes con los espectros de aucleótidos, eligiéndose mo

pH, 0.01

e seleccionó como el más confiable el de la solución de cacodM, que se tituló con ácido clorhídrico para lograr, de maneración paulatina de la solución, ya co alor

de pK5ºC

a del grupo citosina en el entorno de varios oligómeros cortos fueron en los casos que se examinaron entre prácticameente mayores (hasta por 0.6 unidades de pH) al pKa del grupo citos

mple nucleósido de referencia, 2’-desoxicitidina, lo que pone en ev los grupos fosfato, que propicia la protonación de la ba

a

cia

RESUMEN x

SUMMARY

The pKa of the nitrogenous bases in DNA, i. e. their propensity for protonation or deprotonation is influenced by the field effect of the negative charges on the phosphate groups in the DNA, which facilitates the protonation of the nitrogenous groups and makes their deprotonation more difficult. The protonation/deprotonation transitions in these bases are important in the field of biology, as they interfere with the correct formation of the base pairs. They are also of interest in the context of certain molecular biology protocols, e. g. in the denaturation of double-stranded DNA preparatory to its sequencing, as well as for programmed nanoscale structures, built on the basis of DNA strands. Information on the pKa of the nitrogenous bases in DNA would be of value, as it is expected that the protonation values of the nitrogenous bases will be different for the polynucleotidic case and for the nucleosidic case, due to the field effect of the phosphate groups in the polynucleotides. The objective of this thesis was to compare the protonation (pKa ) of the cytosine base in a simple nucleoside with the protonation (pKa ) of a single cytosine base located in the center of oligodeoxyribonucleotides that serve as models for single-stranded DNA. The pKa of the cytosine base under these conditions has thus far not been studied. The model oligonucleotides were subjected to acid or base titrations, to evaluate the magnitude of the change in pKa which the cytosine undergoes when it is incorporated in an oligonucleotide. Several optical parameters were compared as the parameter to use in the spectrophotometric monitoring of the transition in these titrations; the absorbance ratio A280/A260 was finally chosen as the most appropriate. Also, based on an examination of various systems for adjustment and control of the pH, 0.01 M sodium cacodylate was chosen as the most reliable; it was titrated with hydrochloric acid to achieve, in a controlled manner, the gradual acidification of the solution containing the oligonucleotides of interest. The pKa values of the cytosine group in the context of various short oligomers, determined at 25°C, were, in the cases examined, from virtually identical to clearly larger (by up to 0.6 pH units) compared to the cytosine group in the simple reference nucleoside, 2’-deoxycytidine, which evidences the field effect of the phosphate groups facilitating protonation of the heterocyclic base. In general, greater ionic strength of the solution reduces the pKa value for the cytosine in the oligomer, indicating a partial screening of the electric field effect of the phosphates by the electrolyte; at the highest value of ionic strength examined, in 1 M sodium chloride, the electric field effect was virtually abolished. A comparison of the pKa for cytosine located at the center of oligomers of various sizes, viz. pentamer, heptamer, and nonamer, under comparable conditions of ionic strength, did not show up any clear tendencies, which indicates that, for an evaluation of the electric field effect of the phosphates, the pentamer is already sufficiently long to serve as an acceptable model for an extended single strand of DNA. In conclusion, information about the behavior of cytosine pKa values under different conditions was obtained. These values can be sed, to enhance currently employed moleu cular biology protocols.

INTRODUCCION - 1 -

de cargas negativas, y a valores de pH suficientemente ácidos puede ocurrir

INTRODUCCIÓN

El ADN (ácido desoxirribonucléico) es una estructura que contiene una secuencia monótona de grupos fosfato y 2-desoxirribosa en estricta alternancia, donde cada 2-desoxirribosa además está covalentemente enlazada a una de las cuatro bases canónicas del ADN: adenina, guanina, citosina o timina. El desempeño funcional de esta molécula polimérica depende, tanto para la replicación y reparación del ADN como para su transcripción hacia ARN mensajero, de la formación de pares de bases específicos, del tipo G:C o A:T (o A:U en el caso de una doble hélice híbrida de ADN:ARN) entre bases ubicadas en dos hebras poliméricas que corren en paralelo. Este apareamiento altamente específico de las bases se da a través de múltiples puentes de hidrógeno, donde la posición donadora de una base se coloca en posición opuesta a una posición aceptora de la base compañera. Para que se pueda realizar esta conjunción regular de estos enlaces de hidrógeno, es necesario que cada una de las dos bases complementarias se encuentre en el estado de protonación o desprotonación correcto; para las cuatro bases canónicas del ADN, esto se da cuando estas bases se encuentran en estado electroneutral; es decir que los grupos de adenina, guanina, citosina y timina no deben de estar ni protonizados ni desprotonizados. Esta condición impera para el ADN en las condiciones fisiológicas de pH, es decir, a valores de pH cercanos a 7.

En estas condiciones, la hebra del ADN lleva una carga negativa en cada uno de sus grupos fosfato, es decir lleva una carga negativa por unidad nucleotídica, lo que representa una alta densidad lineal de carga negativa. En cambio, las bases nitrogenadas del ADN no llevan carga en estas condiciones de pH. Sin embargo, estas bases contienen grupos funcionales que tienen características de ácido o de base débil. En consecuencia, a valores de pH suficientemente alcalinos se puede dar desprotonación de algunas de estas bases (guanina y timina), con la formación local

INTRODUCCION - 2 -

protonación de ciertas bases (citosina, adenina y guanina) con formación local de cargas positivas. Estas transiciones de p tonación o desprotonación de las bases nitrogenadas son de importancia en el á bito biológico, ya que interfieren con la formación correcta de los pares de bases itrogenadas. También son de interés en el contexto de ciertos protocolos en iología molecular, por ejemplo en la desnaturalización de ADN de doble hélice revia a su secuenciación, así como para estructuras planeadas a nanoescala, construidas sobre la base de hebras de ADN.

Por lo anterior, existe un interés en determinar de manera cuantitativa la tendencia de las bases en el ADN para su protonación o desprotonación, es decir, en medir los valores de pKa que caracterizan esta siciones. Estos valores han sido reportados por diversos grupos de investigadores para las unidades monoméricas del ADN, por ejemplo para 2’-desoxirribon sidos y 2’-desoxirribonucleótidos. Sin embargo, no existe un reporte confiable para el pKa de una base dada dentro de un entorno polinucleotídico u oligonucleotídi . Información al respecto sería valiosa, ya que es de esperar que los valores pKa de las bases nitrogenadas serán diferentes en el caso polinucleotídico y en l mononucleotídico. Esto se debe a que en el caso polinucleotídico domina el efecto de campo de los grupos negativos de los

s a lo largo de la hebra, que debiera de facilitar la ADN, ya que esto implica formación de una nueva

carga positiva en un ambiente de cargas n gativas, y dificultar la desprotonación de las bases del ADN, que conlleva la formación de una nueva carga negativa dentro de un entorno de alta densidad lineal de c rgas negativas, lo que aumenta aún más

oléculas modelo para el

rom nb p

s tran

ucleó

code e

fosfatos, densamente colocadoprotonación de las bases del

e

asela densidad eléctrica negativa. Por lo que anticipa, que en el entorno del ADN los

valores de pKa de las bases nitrogenadas se recorrerán a valores mayores, en comparación con los valores de pKa que se registran para las mismas bases en la situación monomérica.

También es de esperar que las características electrolíticas de la solución tengan una influencia importante sobre los valores de pKa de las bases nitrogenadas en la situación polimérica, ya que una alta fuerza iónica tenderá a apantallar el efecto de campo de los fosfatos, por lo que se espera que los valores de pKa de las bases del ADN se acercarán más a los valores de pKa que ostentaban en la situación monomérica.

De ahí se deriva que un conocimiento cuantitativo de los valores de pKa que rigen la protonación o desprotonación de las bases nitrogenadas del ADN representaría una contribución valiosa a nuestro entendimiento de la biofísica de los ácidos nucleicos. La manera más confiable de establecer estos valores es determinarlos para una base de interés en un entorno de otras bases que no sufran el mismo tipo de transición, de manera que el cambio físico que se monitorea en el experimento se pueda interpretar inequívocamente como la manifestación de la transición de la base de interés. Para este fin, se pueden diseñar, como mADN de hebra sencilla, oligodesoxirribonucleótidos de tamaño moderado, con una sola base ionizable en el intervalo de pH de interés, ubicada en el centro del oligonucleótido, rodeada de otras bases que sirven para representar de manera idealizada al ADN en general, con sus efectos de campo eléctrico de los grupos fosfato, pero sin interferir en la medición del cambio que evidencia la base central. Todas las bases nitrogenadas del ADN, por presentar sistemas de dobles enlaces conjugados en sus anillos de purina y pirimidina, absorben intensamente la luz en la región espectral del ultravioleta cercano, por lo que la técnica que se utilizó en la

INTRODUCCION - 3 -

parte experimental de esta tesis fue: espectrofotometría de absorción UV. En el presente trabajo se examinó de esta manera la protonación del grupo citosina dentro de una seguidilla de timinas no protonizables, en oligodesoxirribonucleótidos de tamaños que van desde pentámeros hasta nonámeros, a 25°C, en soluciones acuosas a diferentes fuerzas iónicas.

ANTECEDENTES

Raukas y Kooli (2003) examinaron, por métodos ópticos, el comportamiento del homodecanucleótido d-C10 (decadesoxirribonucleótido que contiene únicamente bases citosina), en solución de cacodilato de sodio al 0.01 M, que además contenía NaCl al 0.2 M y EDTA al 0.1 mM. La titulación de esta solución a 20ºC con HCl llevó en el extremo a una situación de protonación completa de las bases citosina, con un punto medio de transición a pH 6.3, que fue interpretado como el punto de formación completa del complejo hemiprotonado del tipo dC:⋅dC+, es decir, una corta doble hélice hemiprotonada. También examinaron, en estas mismas condiciones, al oligonucleótido d-A14C4T14, que debiera dar un duplex conformado por pares de base A:⋅T, del tipo de Watson-Crick, en las partes exteriores, con una parte central conformada por pares de base hemiprotonadas, nuevamente del tipo dC:dC+. En este caso el punto medio de la transición fue cercano a pH 5. Este estudio es claramente diferente de los experimentos que se reportan en esta tesis, misma que propone determinar valores de pKa de la base citosina en el entorno nucleotídico en situaciones que excluyen la complicación adicional de formación de estructuras de doble hélice.

El oligonucleótido estudiado por Jaumot y col. (2003), d-CTTCCTCCTCT, fue titulado a 25ºC en una solución que contenía cacodilato de sodio al 0.01 M y cloruro de

ontundentemente los grupos fosfato, de manera que el efecto de

magnesio al 50 mM. En este caso no se pueden dar interacciones de múltiples hebras; sin embargo, el punto medio de la transición reportado por estos autores, a pH 4.32±0.04, no representa más que un pKa promediado sobre varias citosinas en entornos diferentes, incluso citosinas que aparecen en seguidilla, además que la alta concentración del ión magnesio utilizada en estos experimentos debiera de enmascarar ccampo de estos fosfatos sobre la protonación de las citosinas estará negado casi por completo. Este mismo oligonucleótido (d-CTTCCTCCTCT) fue también examinado por Xodo y col. (1991), a 45ºC, en solución de acetato de sodio al 100 mM, NaCl al 50mM, cloruro de magnesio al 10 mM, dando un punto medio de transición de pH 4.4±0.2, que se debe interpretar como valor promedio de los diferentes grupos citosina presentes en el oligómero. A nivel de homopolímero, el poli(dC) fue estudiado por Inman (1964), quién describió la formación de una estructura de doble hélice hemiprotonada, ya completamente formada a un pH de 6.5, en condiciones de 25°C y a una concentración de iones de sodio Na+ de 0.05 M.

Ninguno de estos antecedentes aborda la problemática de la ionización del grupo citosina en el entorno oligonucleotídico de la simple manera que se propone en el presente trabajo, a saber, el estudio de una sola citosina protonizable rodeada en un oligonucleótido de longitud considerable por bases no protonizables.

INTRODUCCION - 4 -

FUNDAMENTOS TEÓRICOS 1. ESTRUCTURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS Los dos tipos fundamentales de ácidos nucleicos, el ácido ribonucleico (ARN) y el cido desoxirribonucleico (ADN), desempeñan una función crucial en el almacenaje

la información genética, así como en la biosíntesis de las proteínas (Sinden, 1994).

áy la transmisión de

Los componentes elementales de los ácidos nucleicos son: bases nitrogenadas, pentosas y fosfatos. La unión entre una base y una pentosa se denomina nucleósido, y la unión que involucra una base, una pentosa y un fosfato se denomina nucleótido. Las bases nitrogenadas son estructuras nitrogenadas aromáticas y planas. Su clasificación está en función de su estructura como bases púricas (derivadas de la purina) y bases pirimídicas (derivadas de la pirimidina). Las bases más comunes en los ácidos nucleicos son: adenina, citosina, guanina y timina en el ADN, y adenina, citosina, guanina y uracilo en el ARN; las estructuras de éstas se muestran en la figura 1.

Figura 1 Estructuras de las bases en el ARN y el ADN

(a) bases púricas (b) bases pirimídicas (Sinden, 1994) No obstante, es común encontrar otras bases en los ácidos nucleicos, especialmente en el ARNt (Watson y col., 2004). También es posible tenerlas alteradas por modificaciones químicas de las bases naturales, para lo cual se presentan algunos ejemplos en la figura 2.

INTRODUCCION - 5 -

Figura 2 Ejemplos de bases modificadas (Kamiya, 2003) Los nucleósidos más comunes en los ácidos nucleicos, están formados por la unión de una de las bases antes citadas y una pentosa. Las pentosas que aparecen en los ácidos nucleicos son la 2-desoxi-D-ribosa en el ADN y la D-ribosa en el ARN. Los mencionados azúcares son anillos furanosídicos que adoptan conformaciones en los cuales 1 o 2 átomos están afuera del plano que está definido por el resto, como se aprecia en la figura 3 (Sinden, 1994).

Figura 3 Estructuras

Ribosa 2-Desoxirribosa

de los azúcares en el ARN (RIBOSA) y el ADN (2-DESOXIRRIBOSA)

En los nucleósidos, las bases pirimídicas se enlazan al azúcar a través del N1 y las bases púricas a través del N9. Este enlace es de tipo covalente y se conoce como enlace glucosídico. El cual puede presentarse en dos formas anoméricas conocidas como α y β; la forma β es la única que se presenta en la naturaleza, y tiene configuración cis de la base nitrogenada en relación con el grupo CH2OH del azúcar.

INTRODUCCION - 6 -

La figura 4 presenta ejemplos de un ribonucleósido y del 2´-desoxirribonucleósido correspondiente, específicamente del β-D-ribonucleósido de la citosina y del β-D-2’-desoxirribonucleósido de la citosina, generalmente mencionados como citidina y 2’-desoxicitidina, respectivamente. Estos dos nucleósidos se utilizaron en el trabajo experimental de esta tesis.

Figura 4 Estructuras de la citidina (izquierda) y de la 2’-desoxicitidina (derecha)

Los nucleótidos se forman como resultado de la esterificación de la pentosa de un nucleósido con un fosfato. La unión puede incluir cualquiera de los grupos hidroxilo libres del azúcar, aunque sobre todo involucra los grupos 3’-OH o 5’-OH.

Los ácidos nucleicos son cadenas de nucleótidos, unidos a través de puentes de fosfato, que por una parte se enlazan con el C3’ de la pentosa de un nucleósido y por otra con el C5’ de la pentosa de otro nucleósido. Al enlace que se forma se le denomina enlace fosfodiéster. Los polímeros forman largas cadenas, con un aspec o idéntico en todas ellas, a saber la secuencia monotonamente repetida fosfat -ribosa-fosfato-ribosa en el ARN, y fosfato-desoxirribosa-fosfato-desoxirribosa en el DN, y otro aspe ses unidas a las

, de tal forma que la secuencia de las bases lo la o del tallo, es altamente informativa. Es por ello que a lo largo de las bases

nitrogenadas, se dan las interacciones específicas en que los ácidos nucléicos se ven involucrados(Velásquez y col, 2004). 2. NOMENCLATURA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

En la nomenclatura de las bases nitrogenadas sólo se enumeran los átomos del anillo aromático, y los substituyentes se nombran con el mismo número del átomo al que están unidos (Bloomfield y col., 2000).

La nom la

to

Ap

cto variable, a saber la secuencia de las baentosas. El tallo de la molécula de ADN, compuesto de grupos fosfato y

desoxirribosa en alternancia, carece de contenido informático; simplemente tiene un papel estructural. En cambio las bases nitrogenadas ubicadas a lo largo de este tallo, presentan una amplia variedad de secuencias, ya que en cada posición se puede encontrar cualquiera de las cuatro bases canónicas (A, C, G y T). Por ende, para un tramo tan corto como lo es un decanucleótido puede ya existir un total de 410 o sea 1048576 secuencias diferentesa rg

enclatura de la ribosa/desoxirribosa comienza por el carbono unido abase, que se denomina 1’ y se sigue de tal manera que el carbono unido al grupo

–CH2OH es el 4’. El carbono del grupo exocíclico –CH2OH se caracteriza por el número 5’. Las posiciones dentro del grupo siempre se indican con “prima”, para distinguir este sistema de numeración del sistema de la base nitrogenada.

INTRODUCCION - 7 -

Las cadenas se nombran a nivel de estructura primaria por la secuencia de las bases, como se muestra en la figura 5. El hecho de que cada fosfato esté unido a

HACIA LA TERMINAL 5’ TIMINA

ADENINA

CITOSINA

GUANINA

una posición 5’ de una pentosa y una posición 3’ de otra pentosa causa una direccionalidad que se mantiene a lo largo de la cadena polinucleotídica, que se expresa como dirección 5’-3’. Esta direccionalidad se debe de tomar en cuenta al considerar la secuencia de las bases en la escritura de un determinado polinucleótido: por ejemplo, la secuencia local (5’)-TACG(3’) que se muestra en la figura 5 es totalmente diferente de la s

HACIA LA TERMINAL 3’

Figura 5 Tramo de cadena sencilla de ADN con la secuencia local (5´)-TACG-(3´) (adaptado de Sinden, 1994)

ecuencia (3’)-TACG-(5’), la que normalmente e escribiría (5’)-GCAT-(3’).

omérica, en aspectos

n

adenina dinucleótido fosfato (NADP ) (Saenger, 1984).

s

3. FUNCIONES BIOLÓGICAS

Los nucleótidos no sólo sirven de elementos fundamentales en la estructura de ADN y del ARN, también pueden ser importantes en una forma moncentrales de la función celular, por ejemplo: adenosina 5’-trifosfato (ATP) como almacén energético; adenosina 3’,5’-monofosfato cíclico (cAMP) como mediador eprocesos hormonales y segundos mensajeros en el control de la glucogenólisis (Mathews, 1999) y los que actúan como coenzimas: flavina adenina dinucleótido (FAD), nicotinamida adenina dinucleótido (NAD+) y nicotinamida

+

INTRODUCCION - 8 -

Los nucleótidos son activos en el metabolismo, principalmente en forma de nucleósido trifosfato: el GTP y ATP se producen a través del metabolismo nergético.

4. PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS

4.1 Distribución de carga eléctrica

Las bases son estructuras polares, con m dipolares que pueden ser elevados y una distribución de carga tal que átomos (por ejemplo oxígenos carbonílicos) se concentra una cantidad significativa de carga negativa, mientras que en otros (por ejemplo hidrógenos unidos a N) se concentra una porción notable de carga positiva (Saenger, 1984). Es a través de estos centros con carga parcial que en las bases pueden formar pu

La figura 6 muestra la distribución de los potenciales dadores y aceptores de puentes de hidrógeno en los grupos adenina, guanina, timina y citosina.

e

omentosen ciertos

entes de hidrógeno.

F

Adenina Guanina Timina Citosina eptores de puentes de hiigura 6 Representación de centros dadores/ac drógeno en las bases

itrogenadas. Los centros dadores se muestran con una flecha apuntando hacia fuera; los centros es se muestran con una flecha apuntando hacia dentro (adaptado de Bloomfield y col., 2000)

entendimiento de las interacciones específicas en que es la forma tautomérica preferencial que presentan

, que estaban investigando en esa

naceptor Esto constituye una pauta compleja de dadores y aceptores de puentes de hidrógeno, que confiere a las bases su capacidad de reconocimiento específico con otras bases, lo cual se refleja incluso cuando se unen a compuestos análogos de bases, como en el caso de algunas drogas (Pullman y Pullman, 1971).

4.2 TAUTOMERÍA

Un aspecto importante para el participan los ácidos nucleicoslas bases nitrogenadas. Esto se debe a que en los diferentes tautómeros, se cambian las posiciones dadoras y aceptoras de puentes de hidrógeno, y las oposiciones oportunas de dadores de puentes de hidrógeno en una base con aceptores en otra base de la hebra opuesta, son fundamentales para la formación específica de los pares de bases A:T y G:C que se presentan a lo largo de todo el ADN de doble hélice. Tal es así que para su postulación de la estructura fundamental del ADN de doble hélice, Watson y Crick (1953) tuvieron que basarse en los resultados más recientes de los químicos

INTRODUCCION - 9 -

época, cuáles eran las formas tautoméricas importantes de las bases nitrogenadas del ADN. Todas las bases presentan varios tautoisómeros posibles que generalmente se studian por pares, lo cual es debido a que en los anillos hay átomos muy

por estar protonados en determinadas ura 7. La preferencia de una u otra forma otonación de los nitrógenos del anillo. A

as predominantes son las formas amino y ceto

igura 7 Representación de la tautomería amino-imino y de la tautomería ceto-enol de las bases

cíclico cerca de un N endocíclico. Se puede producir en la G, C, T primen un fuerte carácter ácido a las bases.

efectúan entre el átomo de hidrógeno de un enlace polar y un átomo

eelectronegativos, que van a competir circunstancias, como se muestra en la figdepende de los valores de los pK de prvalores fisiológicos de pH las form(Blackburn y Gait, 1996).

Fnitrogenadas del ADN (Watson y col., 1999) En la tautomería imino-amino se interconvierte un amino (—NH) exocíclico en un imino (=NH) exocíclico cerca de un N endocíclico. Se puede dar en G, A y C. En la

utomería ceto-enólica (lactama-lactima) se interconvierte un grupo ceto (=O) entaun enol (—OH) exoy U. Las lactimas im 4.3 INTERACCIONES ENTRE BASES

De todas las interacciones que afectan a los nucleótidos, las de asociación entre bases son las de mayor importancia, tanto funcional como estructuralmente. Las bases efectúan dos interacciones básicas: las de formación de puentes de hidrógeno en el plano de las bases (horizontal) y las de apilamiento (stacking) perpendiculares al plano de las bases.

4.3.1 Interacciones por puentes de hidrógeno

Los puentes de hidrógeno son interacciones principalmente electrostáticas que se

INTRODUCCION - 10 -

electronegativo, siendo en el caso de las bases del tipo N-H · · ·N y N-H · · ·O (Saenger, 1984). El reconocimiento entre bases se da por enlaces de hidrógeno. La

esto por Watson y Crick (WC) (figura 8), que se da en el DN de doble hélice.

especificidad y la solidez de las interacciones que involucran puentes de hidrógeno se da por cooperatividad: son generalmente varios puentes de hidrógeno que enlazan los diferentes grupos. Así en el ADN de doble hélice, el par de bases G:C contiene tres puentes de hidrógeno, mientras que el par de bases A:T contiene dos (Blackburn y Gait, 1996). A priori existen muchos patrones de formación de puentes de hidrógeno entre bases, pero en el ADN biológico el modo más común de reconocimiento es el propuA

Figura 8 Pares de bases Watson-Crick de l s dobles hélices de ADN y de ARN. A la izquierda: el par de bases A:T; a la derecha: el par de bases G:C. Se muestra el surco menor y el surco mayor de la hélice (Sinden, 1994)

Las características del apareamiento clásico WC son: (i) la preferencia por la coplanaridad de las dos bases, (ii) la formación de 3 puentes de hidrógeno para el apareamiento C:G y la formación de 2 puentes de hidrógeno para el apareamiento T(U):A, y (iii) la distancia del par de bases G:C y A:T es prácticamente la misma y el ángulo de inclinación de los 2 pares d bases muy similar (geometría isomorfa).

dad to pares G:C como pares A:T.

a

e Esto permite la formación de una doble hélice que ostenta una gran regularigeométrica a pesar de contener tan

Otro modo de unión importante, que se ha detectado experimentalmente en ciertos tipos de ADN, es el apareamiento Hoogsteen (H) (Blackburn y Gait, 1996). Este tipo de apareamiento sólo se puede formar entre bases A:T en condiciones de electroneutralidad, pero en ambiente ligeramente ácido también se puede formar entre las bases G y C, con la citosina protonizada, figura 9.

Figura 9 Apareamientos tipo Hoogsteen, a la izquierda: A:T, a la derecha: G:C+

INTRODUCCION - 11 -

Los pares Hoogsteen no son isomorfos a los pares Watson-Crick, ya que tienen un ángulo de 80° entre los enlaces glucosídicos (vs. 68±2° del par WC) y una separación de 8.6 Å entre los carbonos 1’ de los nucleósidos que participan en este par vs. 10.6±0.15 Å del par (WC). También se han detectado otros modos de unión como los apareamientos Watson-Crick reverso (rWC) y Hoogsteen reverso (rH) (figura 10), donde una de las bases del par está rotada por 180° respecto a la otra (Blackburn y Gait, 1996).

Figur rH (H

EbAseloAeco pareamiento dconca

Tabla 1 Apareamiento de bases tipo Watson-Crick y con balanceo

Base en la posición Bases reconocidas en el codón del ARNm

a 10 Apareamientos entre A:T del tipo rWC (Watson y Crick reverso), a la izquierda, y del tipooogsteen reverso), a la derecha (adaptado de Blackburn y Gait, 1996)

n los procesos de replicación, transcripción y traducción, el reconocimiento de las ases es principalmente por el par Watson-Crick, lo que conlleva la copia directa de DN (replicación) y la transformación de secuencia del ADN en su correspondiente cuencia (transcripción) en el ARNm. Al llevarse a cabo la traducción, la lectura de s tripletes del codón del ARNm, puede suceder que la base 5’ en el anticodón del RNt sufra desalineamiento estérico, permitiendo que se formen disposiciones de nlace de hidrógeno alternativas (no del tipo Watson-Crick), lo que se denomina mo “balanceo”. Teniendo en cuenta las diferentes posibilidades de a

e bases y la selectividad observada de los ARNt, Francis Crick (1966) estableció el njunto de reglas de balanceo, que a continuación se encuentran en la tabla 1. El

ucleósido raro inosina (I) se encuentra en algunos anticodones, en los que muestra pacidad de aparearse con A, U o C (Mathews y col., 2004).

5’ del anticodón Enlace Watson-Crick Balanceo U se aparea con A G C se aparea con G A se aparea con U G se aparea con C U I se aparea con C A, U

INTRODUCCION - 12 -

4

Lst iones dos bases se disponen aproximadamente paralelas una sobre la otra a una distancia cercana a 3.4 Å, evitando siempre contactos electrostáticos desfavorables. Desde el punto de vista termodinámico, en ambiente acuoso el estibamiento es realmente el impulsor principal de la formación de la doble hélice, ya que el estibamiento reduce el área de la interacción desfavorable entre las porciones hidrofóbicas de las bases nitrogenadas y el agua. También se debe de considerar una interacción del tipo de Van der Waals, favorable al estibamiento, que se basa en un tipo de fuerza intermolecular entre las bases cercanas, como consecuencia de la formación de dipolos permanentes entre ellas (Saenger, 1984).

Los puentes de hidrógeno en los pares de bases, por otra parte, ente formados, no pueden contribuir en forma prioritaria a la estabilización de los pares de bases, ya que en la forma disociada los dadores y aceptores dentro de las bases nitrogenadas están unidas por puentes de hidrógeno con el agua, de manera que la foh idrógeno entre las bases (Saenger,1984), con lo que la contribución de los puentes de hidrógeno a la

cran G suelen ser los más estables or lo que la estabilidad del apilamiento es en general la siguiente: purina:purina > pirimidin

4.4 IONI

El comp acterísticas más importan <pH<7.5), las bases nitrogenadas de los nu con las pentosas, que sólo pueden perder e ásicos (pH>12) (Fox y S , por tener un hidroxilo ionizable con un pKa≈1 (Blackburn y Gait, 1996), a valores de pH≥ 2 es

Esta tabla tiene de base la establecida por Saenger (1984), corrigiendo la indicación “Base en la posición 3’ del anticodón”, obviamente errónea, por “Base en la posición 5’ del anticodón”. .3.2 Interacciones por apilamiento (Stacking)

as bases también interaccionan entre ellas por interacciones de apilamiento o cking. En este tipo de interacca

correctam

rmación de los pares de bases involucra primero la ruptura de los puentes de idrógeno con el agua, y luego la formación de puentes de h

energía libre de la formación de los pares de bases es aproximadamente nula.

De manera que el cambio favorable en energía libre que acompaña a la formación de la doble hélice del ADN, en ambiente acuoso se debe primordialmente al estibamiento vertical de las bases que se da en esta estructura, y no a la formación de los puentes de hidrógeno. Estos tienen más bien un papel discriminador: la pérdida de puentes de hidrógeno entre el agua y las bases nitrogenadas de las hebras sencillas y la entrada de éstas en una doble hélice con malapareamiento, donde no se da la formación de nuevos puentes de hidrógeno entre base y base, o donde se dan estos puentes de hidrógeno, pero sólo tras un rearreglo a otro tautómero menos favorable, resulta en cada caso en una contribución desfavorable a la energía libre de formación de doble hélice. Los resultados de los experimentos de solubilidad han mostrado que los pares de bases que involu

, mientras que los que involucran T son los menos estables, p

a:purina> pirimidina:pirimidina (Saenger, 1984).

ZACIÓN

ortamiento ácido-base de los nucleótidos es una de sus cartes. En el intervalo fisiológico de pH (6.5cleósidos son neutras. Lo mismo ocurrel protón del grupo hidroxilo en medios extremadamente bhugar, 1952). En cambio el grupo fosfato internucleotídico

INTRODUCCION - 13 -

portador de una carga eléctrica de -1; es decir, los ácidos nucleicos se presentan c

Aa vés de protonación o desprotonación. Las bases

ctrica positiva mediante protonación , mientras que las bases guanina y

omo polianiones.

valores de pH alejados de neutralidad, las bases nitrogenadas en el ADN quieren cargas eléctricas, a trad

citosina, adenina y guanina adquieren carga eléen las posiciones N3, N1 y N7, respectivamentetimina pueden adquirir carga negativa por desprotonación de los grupos N1-H y N3-H, respectivamente. Los valores de pKa correspondientes a estas protonaciones o desprotonaciones, a 20°C y fuerza iónica de cero, se listan en la tabla 2, tanto para varios nucleósidos, así como para los 3’-fosfatos y 5’-fosfatos correspondientes. De esta tabla se observa que en estas especies monoméricas, la base citosina es la más básica dentro de un medio ácido (la más fácil de protonar), seguida de las bases adenina y guanina.

Tabla 2 Valores de pKa de las bases en nucleósidos y nucleótidos (de Blackburn y Gait, 1996)

Nucleósido (sitio de protonación o desprotonación)

pKa del nucleósido

pKa del nucleósido 3’-fosfato

pKa del nucleósido 5’-fosfato

Adenosina (N1) 3.52 3.70 3.88 Citidina (N3) 4.17 4.43 4.56 Guanosina (N1) 9.42 9.84 10.00 Guanosina (N7) 3.3 (3.5) (3.6) Timidina (N3) 9.93 ------ 10.47

La desprotonación se da con más facilidad para el grupo guanina que para el grupo timina. Se nota que para los monofosfatos correspondientes, los pKa se corren a valores mayores, es decir, en comparación con los nucleósidos, los nucleótidos son más fáciles de protonizar y más difíciles de desprotonizar. Esto se explica por el efecto de campo eléctrico del fosfato con su carga negativa: facilita la protonación de una base vecina, ya que esto crea una carga positiva, y dificulta la desprotonación de una base vecina, ya que esto crea otra carga negativa a corta distancia, lo que es energéticamente desfavorable. (Blackburn y Gait, 1996),

4.5 ABSORCIÓN UV

La espectroscopia de UV, es un método instrumental que mide transiciones s moléculas en donde se encuentran involucrados pares de

electrónicas de laelectrones no compartidos. La absorción de luz ultravioleta, (entre 200 – 400 nm), produce en las moléculas transiciones electrónicas las cuales requieren una energía, de 70 a 300 Kcal/mol que es de la magnitud de las fuerzas de enlace, por lo tanto, dichas transiciones involucran a los electrones de valencia, estos pasan de su estado de enlace a otro excitado de antienlace. Dichos estados son difíciles de describir, sobre todo cuando se trata de moléculas poliatómicas. La ley de Lambert-Beer (A = ε·c·l) indica que la absorción de luz a una determinada longitud de onda es

INTRODUCCION - 14 -

directamente proporcional a la concentración de una disolución de un compuesto. De la recta de calibración, la cual se obtiene al graficar los valores de absorbancia

riación en el espectro de absorción con el grado de otonación nizadas o

desprotonizadas d las formas utrales. La estructura del nucleósido o nucleótido poco modifica las características

de absorció ravioleta a pro ba nadas. Los valores de m a nit se pueden hacer exten tido y nucleósid ond lusive para oligonucleótido dos se acostumb eficiente extinción para el polí na sim ma d oeficient extinción de las bases const

En las figur 4 se an los s de n de las bases nitrogenada nidas los nuc s o nu os de adenina, citosina, gu ectivamente. Un o impor notar en estas

uras es el cambio significativo en el espectro de absorción que acompaña la otonación o desprotonación de las bases nitrogenadas.

en la ordenada frente a las correspondientes concentraciones, se obtiene la pendiente de la recta que es el coeficiente de absorción molar (ε), éste es un valor constante y único de cada sustancia. Generalmente los datos que se reportan en la literatura de UV son como coeficientes de extinción molar en función de su longitud de onda máxima. Las bases nitrogenadas del ADN, por presentar sistemas de dobles enlaces conjugados en los anillos de purina y pirimidina, absorben intensamente la luz en la región espectral del ultravioleta cercano, con un máximo de absorbancia alrededor de 260 nm. Esta longitud de onda de máxima absorción, así como el coeficiente de extinción a esa longitud de onda, son diferentes para cada una de las bases nitrogenadas. A través de los coeficientes de absorción reportados se realizan cuantificaciones de estas bases utilizando técnicas de espectrofotometría. Además,

puede relacionar la vasepr de los nitrógenos de las bases, ya que las formas proto

e las bases e absorción de difieren en su espectro dne

n de luz ult 260 nm pias de las ses nitrogerogenadas extinción molar deter

sivos a los nucleós y polinucleóti

inados par las bases s os corresp

ra estimar coientes. Inc

s de mero mediante u ple su e los c es deituyentes.

as 11, 12, 13 y 1 muestr espectro absorciós del ADN conte en leósido cleótidanina y timina resp aspect tante a

figpr

INTRODUCCION - 15 -

Figura 11 Espectros de absorción característicos de adenosina 5’-monofosfato, a valores de pH 2 y pH 7 (P-L Biochemicals, Inc. Circular No. OR-10)

Figura 12 Espectros de absorción característicos de la citidina 5’- monofosfato, a valores de pH 2 y pH 7(P-L Biochemicals, Inc. Circular No. OR-10)

INTRODUCCION - 16 -

Figura 13 Espectros de absorción característicos de guanosina 5’-monofosfato, a valores de pH 1, pH7 y pH 11 (P-L Biochemicals, Inc. Circular No. OR-

10)

Figura 14 Espectros de absorción característicos de timidina, a diferentes valores de pH

(Fox y Shugar, 1952)

INTRODUCCION - 17 -

Una comparación de estos espectros muestra que la citosina es la base que presenta los cambios más pronunciados entre el pH neutral y el pH ácido, circunstancia favorable para el presente proyecto que propone seguir la protonación de la base citosina en un oligonucleótido por espectrofotometría ultravioleta. La siguiente tabla resume para estos compuestos, a diferentes valores de pH, las longitudes de onda para el máximo de absorbancia, así como los coeficientes de absorción a diferentes longitudes de onda.

Tabla 3 Propiedades ópticas de AMP, CMP, GMP y timidina

λmáx

(nm) ε240

(M-1 cm-1) ε260

(M-1 cm-1)ε290

(M-1 cm-1) ε300

(M-1 cm-1)ε280

(M-1 cm-1) AMP pH 7 pH 2

259 257

6160 6430

15380 14650

2580 3200

120 610

15 15

CMP pH 7 pH 2

271 280

6880 1550

7330 6080

720 1301

2610 9010

130 2840

GMP pH 11 pH 7 pH 1

258 252 256

9460 11870 6570

11560 14640 11700

7220 9590 7950

1310 4070 5910

1

410 2100

2

Timidina

62O0

2000

200 pH 7 pH 12

268 268

2900 2900

8800 8800

62O0 2000 200

.6 EQUILIBRIO PROTONACIÓN-DESPROTONACIÓN

l equilibrio que rige la protonación reversible de una base determinada en el mbiente acuoso se describe de manera cuantitativa a través de la ecuación:

4

Ea

[ ] [ ][ ] aKBH

HB=

×+

+

Ecuación #1

onde [B], [H+] y [BH+] son las concentraciones molares de la base y de la forma rotonizada de la base, respectivamente, en una situación de equilibrio, y [H+] es concentración de iones hidronio en la solución. Para mayor precisión, debieran de sarse en esta ecuación las actividades, aB, aH+ y aBH+, respectivamente; sin mbargo, excepto en casos de concentraciones elevadas (por encima de 1 M), los alores de actividad son prácticamente iguales a los valores de molaridad, por lo ue es usual, por comodidad, usar estos últimos valores. El cociente Ka, valor onstante para determinada temperatura y determinado ácido BH+, se denomina onstante de disociación del ácido BH+, y sirve para describir de manera cuantitativa

la acidez de la especie BH+, es decir su propensión a disociarse según la representación:

BH+ → B + H

n el presente trabajo, se da un valor de 5.0 x 10-5 M (Fox y Shugar, 1952) para el Ka

dplauevqcc

+

A manera de ejemplo, para el nucleósido 2’-desoxicitidina, objeto de mediciones e

INTRODUCCION - 18 -

del ácido conjugado, es decir para la forma protonizada de la 2’-desoxicitidina. En un contexto experimental, es más apropiado manejar la ecuación 1 en su forma logarítmica:

[ ][ ] [ ]+=

HK

BHB aloglog Ecuación # 2

Esta ecuación s

e puede reescribir como:

[ ][ ]

[ ] [ ] MMHBH 11lolog

+

+

De lo q ulta:

HKa log−Ka logg =

B=+ Ecuación # 3

u se re

[ ] [ ]

[ ]+−BH

BMM 1

log1

log Ecu # 4

Las

+

=H

+Ka log− ación

expresiones [ ]

MH

1

+

y M

Klog− a se a1

cost n ab com y pKa,

respect nte, o qu uació pued cribir siguiente forma:

log− umbra reviar o pH

ivame por l e la ec n 4 se e rees en la

[ ]

[ ]++=BpKpH a log

BH

Ecuación # 5

sta es la ecuación de Henderson-Hasselbalch para el caso de la base B y su ácido +. Relaciona el pH de la solución, en situación de equilibrio, con las es de equilib o de as fo as B y BH n a ese pH.

Si expresamos la concentración total de las formas B y BH por c, y la fracción del tal que está en la forma protonizada, BH+, por α, obtenemos que:

Éconjugado BHconcentracion ri l rm + que se establece

+

to

[B] = (1-α) x c y [BH+] = α x c

De ahí que la ecuación 5 se puede reescribir:

[ ]

[ ]( )

αα

αα −

+=××−

+=+= +

1log1loglog aaa pKc

cpKBH

BpKpH

De lo cual:

αα−

=−1logapKpH

INTRODUCCION - 19 -

Considerando las equivalencias de pH y pKa, de la ecuación 4, esta última queda:

[ ]M

Hlog+

− + M

Ka

1log =

αα−1log

1

l quitar logaritmo: A

[ ]+HKa =

αα−1

Al despejar a α queda:

[ ]

[ ]++

+=

HKH

a

α

Esta es la ecuación de Hill, que relaciona el grado de protonación de la base B con el

n la constante de disociación d BH+, para el caso de una simple disociación ácida, sin efectos de cooperatividad o nticooperatividad. Nótese que, para el extremo ácido, es decir para valores de pH

por mucho menores al pK , el valor de α se acerca a 1, es decir la situación se ión total:

ara

pH de la solución y co el ácido conjugado

aa

acerca a protonac

[ ]P [ ]++

=HK

α : +H

a[ ]

[ ][ ]

[ ][ ] 1lim ==

+ ++⟩⟩+

HHKaKH a

n cambio, para valores de pH claramente recorridos, con relación al pKa, hacia el

++ HH

Erégimen básico (es decir, para pH >> pKa), el valor de α se acerca a cero, es decir el grado de protonación es despreciable:

Para [ ]

[ ]++

+=

HKH

a

α : [ ][ ][ ] 0lim =

+ +

+

⟨⟨+

HKH

aKH a

Para el caso hipotético de la protonación de una base B cuyo ácido conjugado BH+ de α vs. pH calculado

ara la transición entre una situación donde la base está prácticamente res de pH alrededor de 7, y en una

izada (α ≈ 1), a pH alrededor de .

tiene un valor de pKa de 4.68, la figura 15 muestra el trazo penteramente desprotonizada (α ≈ 0), a valoituación donde la base está casi totalmente protons

2

INTRODUCCION - 20 -

lculada por la ecuación de Henderson-Hasselbalch, para pKa = 4.68

terés notar q para el punto medio de la transición, es decir para [B] = [BH ], o sea α = 0.5, el pH es numéricamente igual al pKa, lo que se puede omprobar de la manera siguiente:

Figura 15 Gráfica de transición ca

Es de in ue,

+

c

Para [ ]

[ ]++

+=

HKH

a

α y α = 0.5:

0.5 = [ ]

[ ]++

+ HKH

a

Al despejar a

[ ]+H [ ]+= HKa que al aplicar las equivalencias correspondientes, rinde:

pKa = pH

e ahí se desprende que, para sistemas de protonación donde se da una simple ansición entre dos estados definidos, el pKa se puede determinar simplemente omo el valor de pH para el cual la transición se da justamente en un 50%.

Dtrc

0

fr

0,2acc

0,4

1

0 2 4 6 8 10

ión

rot

izada 1,2

0,8on

0,6 p

pH teórico

INTRODUCCION - 21 -

JUSTIFICACIÓN

a importancia del presente trabajo radica en que es el primero en cuantificar el pKa trínseco para una de las bases canónicas del ADN, a saber, la citosina, en un ntorno polinucleotídico de hebra sencilla. El caso que se trata aquí es de especial terés, ya que entre las bases canónicas la citosina es la que tienen el punto de ansición de protonación/desprotonación más cercano al intervalo fisiológico de pH, or lo que es más probable a tener ingerencia en procesos biológicos. La rotonación del grupo citosina en la situación polinucleotídica es importante por ausar la desnaturalización de ADN de doble hélice así como propiciar la formación e ADN de triple hélice en tramos de polipirimidina:polipurina: polipirimidina. Por onsiguiente, los resultados obtenidos en el presente trabajo son de potencial

onstrucción planificada de estructuras a nanoescala basadas en polinucleótidos.

Cuantificar el pKa de la base citosina cuando se encuentra incorporada en oligodesoxirribonucleótidos, en comparación con el pKa de la citosina en un

OBJETIVOS PARTICULARES

tificar e Ka de la base citosina incorporada en posición central en desoxirrib nucleótidos de diferentes tamaños.

b) Cuantificar el pKa de la base citosina incorporada en posición central en oxi ibonucleótidos, en función de la fuerza iónica de la solución.

Lineintrppcdcaplicabilidad en el área del diagnóstico molecular por hibridación así como en la c

OBJETIVO OBJETIVO GENERAL

simple nucleósido.

a) Cuan l poligo o

oligodes rr

MATERIALES Y MÉTODOS - 22 -

1. INSTRUMENTACIÓN

tómetro y termostato metro marca Perkin Elmer modelo Lambda 35, número

temperatura de trabajo del

de paso de luz, con 4 mL de capacidad.

z que se utilizaba se

02, respectivamente.

1.3 Micropipetas Se utilizaron micropipetas modelo Pipetman, de Rainin Instruments LLC, EUA, de diferentes capacidades: 0 a 2 μL, 0.2 a 20 μL, 20 a 200 μL y 100 a 1000 μL. Para cada una de ellas, previamente se realizó una verificación de los volúmenes de agua medidos y su peso correspondiente, para determinar la repetibilidad de las mediciones, así como su precisión, tomando en cuenta la densidad del agua. Los resultados de estas tablas muestran poca variabilidad en las pesadas y buena precisión, por lo que se concluye que la precisión y la exactitud en cada una de ellas, son aceptables. A continuación se presentan ejemplos de

MATERIALES Y MÉTODOS

1.1 EspectrofoSe utilizó el espectrofotóde serie 101N3111304. Para controlar la compartimiento de celdas, éste estaba conectado mediante mangueras con el termostato marca VWR, modelo 1160S, número de serie G31333. Las celdas son de cuarzo, de 1 cm.

1.2 Potenciómetro Se utilizó el potenciómetro marca Conductronic modelo PC45, número de serie 6733279151. Las lecturas de pH se efectuaron con un microelectrodo marca Orion, modelo 911600. El potenciómetro cada veestandarizaba en dos puntos de referencia (pH 7 y pH 4), utilizando soluciones estándar de J.T.Baker No.5608-02, lote T31C07 y No.5606-02, lote B37C


mediciones con micropipetas P-20 y P- justadas a volúmenes de 10 μL y 100 μL, respectivamente, realizadas a 25 C.

Tabla 4 Pesadas de agua a 25ºC, realizadas con micropipetas

MICROPIPETA

10 µL

MICROPIPETA

100 µL

200 a°

PESO (g) PESO (g) 0.0100 0.1003 0.0097 0.1002 0.0100 0.1003 0.0102 0.1002 0.0099 0.0999 0.0100 0.1003 0.0098 0.0998 0.0100 0.1003 0.0097 0.0997 0.0101 0.1001

xx =0.00994±0.00016g =0.10011±0.00023g

De acuerdo a los valores publicados para el agua (CRC, 1979), 10 µL y 100 µL de agua destilada, medidos a 25ºC, debieran pesar 0.00997 g y 0.09971 g, res

1.4Se marca Ohaus, modelo Vogayer, número de serie D3

2. En teóolig tock se preparaban can mL aproximadamente, dicha preparación se realizó por pes

2.1a) gra10

b) 0 M valorada de HCl se preparó a partir de reactivo grado ana marca Baker, lote 18C15, con agua desmineralizada rec

c) Cohirtéresttra

d) Valoración de NaOH (Orozco, 1999): Se ocupó biftalato de potasio (C6H4(COOH)COOK) grado reactivo analítico, marca J.T.Baker, lote M29616,

pectivamente.

Balanza analítica empleó la balanza analítica 561118493351.

REACTIVOS cada una de los experimentos fue necesario realizar previamente los cálculos ricos de las cantidades a utilizar, tanto en concentración como en cantidad del onucleótido y de las soluciones a utilizar. De las soluciones stidades entre 1 mL y 10 o para lograr una mejor exactitud en los títulos.

Químicos NaOH: solución stock 1.0 M valorada de NaOH se preparó a partir de reactivo do analítico, marca Merck, lote 905256, con agua. Se almacenó en alícuotas de

mL en tubos Falcon a 10°C.

HCl: solución stock 1.lítico 38%(p/p), ientemente hervida. Se almacenó en alícuotas de 10 mL en tubos Falcon a 10°C.

Agua desmineralizada: Se obtuvo de la Compañía Agua Pura, S.A. de C.V., Villa rregidora, Querétaro. Antes de ser utilizada para fines de experimentación, se vió la cantidad necesaria de agua por 5 minutos, con agitación constante, al mino de este tiempo se tapó herméticamente el recipiente y se dejó enfriar. De a forma el CO2 atmosférico, el cual se incorpora al agua durante su nsportación y almacenaje, es eliminado y excluido.


prede mente de biftalato de potasio, con e eyer de 125 mL, y se disol na con la solución de hidró r colocada en una bureta, usando una solución de fenolftaleína al 0.1% de 1 a 2 gotas, como indicador. lculó la normalidad separadamente en si los val btenidos erían en la cuarta decimal, el promedio s se consideró la norma e la solución.

e) Valoración de HCl: se tituló con la sol ción de NaOH 1 M valorada, utilizando solución de fenolftale .1% (1 a 2 go as) como indic 2.2 Amortiguadore

a) Cacodilato de sodi olución stock 0.02 M de cacod sodio se preparó a partir de cacodilato trihidratado, 98%, marca S lote 064K0127, con agua desmineralizada recientemente hervida. Se almace alícuotas de 10 mL en tubos Falconb) Ácido acético glacial: La solución de a ido acético se preparó a partir de ácido

.3 Oligonucleótidos sintéticos

vee año

hacia arriba, sintetizados a concentración de 50 nmol o 1 μmol. abajo, por lo general se adquirieron los oligonucleótidos a escala

ajo experimental: pentámero, onámero. Por lo general, el valor de m/e de la banda principal

de masa molecular menor (a m/z 2371.4, 2065.9 y

se pueden hacer para los

viamente secado a 125°C por dos horas. Para titular la solución 1 M de hidróxido sodio, se pesó 5 porciones de 0.35 – 0.40 g aproximada

xactitud de 0.1 mg. Se transfirió cada porción a un erlenmvió en 20 mL de agua destilada hervida, y se tituló cada u

xido a valora Se ca

cada caso; ores o sólo dif de ello como lidad d

uína al 0 t ador.

s

o: La s ilato dede sodio igma,

nó en a 10°C.

cacético glacial 99.8%, marca J.T.Baker, lote N16C58, y con agua desmineralizada recientemente hervida. Se almacenó en alícuotas de 10 mL en tubos Falcon a 10°C.

2

Se obtuvieron de la compañía QIAGEN Operon de EUA. Esta compañía prooligonucleótidos de secuencia especificada por el cliente, generalmente del tamde hexanucleótidos Para el presente trde 1 μmol, lo que permitió realizar al menos 12 determinaciones experimentales con cada oligonucleótido. Su presentación es en forma de liofilizado y se reciben acompañados de su espectro de masas, obtenido en la modalidad de MALDI/TOF, lo que permite evaluar si el producto presenta la pureza requerida para el tipo de experimento planeado. A continuación se muestran los espectros de los oligonucleótidos que se utilizaron en este trabheptámero y ncoincide satisfactoriamente con el peso molecular calculado para el oligonucleótido pedido. En el espectro de masas del nonámero d-TTTTCTTTT (figura 16) se notan cantidades pequeñas de iones 1450.8), corresponden a las secuencias truncadas d-TTTCTTTT, d-TTCTTT y d-CTTTT. En su totalidad, estos materiales no exceden al 1% del total del pico molecular, por ende no tendrán ingerencia notable en los resultados de los experimentos de titulación. Además se perciben, a mayor masa molecular, cantidades significativas de iones que deberán corresponder a aductos con diferentes multiplicidades del ión sodio (Nordhoff y col., 1992). En las condiciones de los experimentos de titulación, estos materiales adquirirán en su promedio los contraiones que imponen las condiciones de la solución, es decir se comportarán de igual manera como el material que aparece como pico molecular predominante en el espectro de MALDI-TOF. Observaciones similares espectros de masas del heptámero y del pentámero (figuras 17 y 18).


Figura 16: Espectro MALDI-TOF del nonaméro d-TTTTCTTTT. El ión molecular del oligómero deseado aparece a m/z = 2675.6. El peso molecular teórico del nonámero es de 2660.78. Tales desviaciones (0.6% en este caso) son comunes en experimentos de MALDI-TOF cuando

no se efectúan con un extremo cuidado.

Figura 17 Espectro MALDI-TOF del heptámero d-TTTCTTT. El ión molecular del oligómero deseado aparece a m/z = 2064.0. El peso molecular teórico del heptámero es de 2052.4


Figura 18 Espectro MALDI-TOF del pentámero d-TTCTT. El ión molecular del oligómero deseado aparece a m/z = 1434.2. El peso molecular teórico del pentámero es 1444.0

La cantidad real del oligonucleótido, entregada por el fabricante, se expresa en términos de unidades de densidad óptica a 260 nm. Una unidad óptica a 260 nm es la cantidad de oligonucleótido que, disuelta en 1 mL de agua, daría un valor de A260 igual a 1.00 en una celda de 1 cm de paso. Por ejemplo, para la muestra del heptámero d-TTTCTTT utilizada en el presente trabajo, el fabricante especificó que consiste de 65 unidades ópticas. A partir de la Ley de Lambert-Beer inicialmente se calcula una concentración nominal:

= en donde:

sería la absorbancia nominal a 260 nm, en este caso con un valor de

65, si el oligonucleótido fuera disuelto en 1 mL de agua y medido en una cubeta de 1 cm de paso.

la

de los respectivos de cada una de las bases que lo componen, que en este caso es 68.9x103 M-1 cm-1.

260A 260ε lc

260A

260ε es el coeficiente de absorción molar a 260 nm, para el heptámetro es

uma 260εs


es la concentración molar expresada como Vn

e

c ; cuando esta expresión se

sustituye en la ecuación de Lambert-Beer, al desp jar a y calcular su valor se obtiene como resultado para este caso un valor de 0.94 µmol de oligonucleótido.

Se disuelve el liofilizado con agua desmineralizada recientemente hervida, para obtener una solución stock a una concentración aproximada de 1 unidad a 260 nm/µL, que se almacena a -10°C.

3. DISEÑO EXPERIMENTAL Experimentalmente, el desafío central del presente trabajo fue delinear el grado de protonación de la base citosina integrada en oligonucleótidos, en función del pH de la solución. Esto requirió de una metodología para dar seguimiento al pH de la solución a través de una titulación. Por no disponer de un sistema integral que permitiera monitorear el pH de la solución en forma continua, se decidió dar seguimiento al pH a través de:

A) Establecer la ecuación matemática que rige un sistema ácido-base, asándose en: la ley de conservación de masas, la ley de acción de masas y

B) on los que se obtiene la respectiva gráfica.

lculo ntidades de las soluciones amortiguadoras, de los oligonucleótidos y de

la solución titulante. Siempre se realizaron pesadas en cada uno de los pasos de las adicio de l solucion del experimento hasta su fin, con la finalida parar las das con las calculadas. La sol n la celda de cuarzo se mezcló con ayuda de un microimán. Las medicion el esp 325, 300 uras de n de titulante y la temperatura de trabajo a 25ºC. Se dejaba calentar 20 minutos la lámpara de UV. Todas las mediciones se efectuaron en la modalidad de doble haz, contra aire. Se seleccionó aire como el medio dsecuen racelreg añadía la cantidad de oligonucleótido en estudio, y se registraba las absorbancias de la solución resultante. Generalmente

n

b el imperativo de electroneutralidad.

esolver la ecuación matemática para determinar los valores de pH teóricos Rc

C) Realizar una titulación preliminar del sistema en estudio sin oligonucleótido con monitoreo continuo de pH por medición potenciométrica, para establecer las condiciones de referencia de pH.

D) Realizar mediciones potenciométricas puntuales en muestras de la titulación con el oligonucleótido, en etapas cercanas al punto medio de la transición de interés.

Previo a los experimentos de titulación del oligonucleótido, se requirió el cáde las ca

nes as es, desde el iniciod de com cantidades adiciona

ución ees de absorbancia en estos experimentos, se realizaron en

ectrofotómetro, previamente programado a las longitudes de onda de , 290, 280,270, 260, 250 y 240 nm; se realizaron entre dos y tres lectbsorbancia en cada adicióa

e referencia debido a su estabilidad óptica a través del tiempo. La cia de lectu s de absorbancia fueron: el blanco de referencia, en una

da de cuarzo vacía; en seguida se colocaba la solución amortiguadora, se istraba sus absorbancias; luego se


se retirasiguie asol rcamesel 280 260

absorbancias que en cada adición se iban obteniendo. Siempre que era necesario retque

La determinación a de las titulaciones utilizando dos métodos, el geométrico y el analítico. El método analítico se

rigin versión 6.1, con el cual se llevo a cabo la os reportados con el método geométrico.

ba una alícuota de 160 µL para realizar la primera lectura de pH. Las ntes mediciones de absorbancias eran para c da una de las adiciones de

ución titulante. Para llevar a cabo las lecturas de pH ce nas al pKa, punto dio de la transición, fue necesario realizar cálculos de la propiedad óptica eccionada para el seguimiento, A /A , directamente de las lecturas de

irar las alícuotas de 160 µL, no se rebasaba el volumen mínimo de 2500 µL la celda requería para poder leerse en el espectrofotómetro.

del valor de pK se hizo en cada una

realizó con el programa Ocomparación de los resultad

En el geométrico se requirió del trazo previo de la curva de titulación que se obtuvo a partir de los resultados de la propiedad óptica seleccionada A280

*/A260*,

graficada en función del pH determinado en el experimento preliminar sin oligonucleótido. Como ejemplo se muestra en la gráfica 1 la curva experimental de la titulación del heptámero d-TTTCTTT, a 25ºC, en cacodilato de sodio al 0.01 M, con HCl.

Gráfica 1 Ejemplo de evaluación gráfica de pKa, para la titulación del heptámero

n la evaluación de esta gráfica se trazó la meseta inferior y la meseta superior en ada curva, se dividió entre dos la distancia que interviene entre ellas, con este alor se interpoló en la parte central de la curva para obtener en el eje de las bscisas, el valor correspondiente de pH, valor preliminar de pKa 4.67, en la escala e pH determinada en el experimento preliminar correspondiente.

n el experimento de titulación del oligonucleótido las mediciones puntuales de pH resentaban desviaciones respecto a los valores determinados en el experimento in oligonucleótido, como se muestra en la tabla 5. Para el punto de medición de H más cercano al punto medio de la transición óptica (a pH 4.71, en la escala el experimento sin oligonucleótido), se determinó una diferencia de +0.05 entre l valor medido en la titulación del oligómero y el valor medido en el ensayo reliminar, por lo que se sumó la diferencia de 0.05 al valor de pKa determinado n la escala de pH del ensayo preliminar (4.67), para obtener un valor de pH final e 4.72.

Ecvad

Epspdeped


Tabla 5 Diferencias de pH entre el valor medido en la titulación y el medido en las condiciones de referencia

pH1

titulación con

oligómero

pH2

titulación sin

oligómero

ΔpH = pH1 - pH2

6.26 6.06 +0.20 5.47 5.28 +0.19 4.76 4.71 +0.05 2.76 2.74 +0.02

En se o mente medettitu Esta) rados de contaminación de la solución por dióxido de carbono atmosférico en el experimento de ensayo (relativamente rápido) y en la titulación en presencia del oligonucleótido (relativamente tardado). b) el efecto amortiguador que los grupos citosina por sí mismos ejercen a lo largo de la titulación (la solución de oligonucleótido contenía grupos de citosina protonizable a una concentración de aproximadamente 10-5 M , lo que debiera de recorrer la curva de pH nominalmente hacia el lado ácido). c) el efecto de otras impurezas que podrían acarrear los oligonucleótidos recibidos del proveedor, que ya no fueron sometidos a purificaciones posteriores en nuestras manos.

Los valores de (pKa)final obtenidos mediante este procedimiento llevan un error que se estima en +

muchos de los experimentos de titulación de las soluciones de oligonucleótidos bservó una diferencia notable entre los valores de pH potenciometrica

didos en diversos puntos del experimento y los valores de (pH)preliminar erminados para adiciones idénticas del titulante, en el experimento preliminar de lación de la solución sin oligonucleótido.

as desviaciones pueden reflejar: diferentes g

0.08 unidades de pH. A este estimado se llega de la siguiente manera. un error d

La medición potenciométrica del pH (ya con control de temperatura) traee + 0.02 unidades de pH. El estimado de los valores de meseta para

Alall

280*/A260*, en conjunción con la incertidumbre involucrada en la interpretación de curva experimental en las inmediaciones del punto medio de transición, para egar al valor de (pKa)preliminar, lleva un error que se estima en + 0.03. Finalmente, l ajuste lineal para convertir los valores de (pKa)preliminar a (pKa)final contribuyen un rror adicional, estimado en

ee + 0.03. La suma total da un estimado de + 0.08 nidades de pH para el error global. La comparación de los u valores de pK

dlolare 3La

i) conservación de masas, establece que la cantidad de sustancia se mantiene constante a menos de que sea añadida, removida, generada o destruida.

a

eterminados en el presente trabajo para la citidina y para la 2’-desoxicitidina con s valores reportados para estos compuestos en la literatura sirven para confirmar confiabilidad, dentro de los márgenes de error encima estimados, de los sultados entregados por la metodología aquí empleada.

.1. Principios químicos os principios químicos subyacentes al cálculo teórico de valores de pH en solución cuosa son los siguientes:

La ley de la


blece que toda sustancia nii) La ley de acción de masas, esta o completamente

disociada alcanza un equilibrio de disociación: =C

donde es te rio de la reacción: B

iii) El imperativo de e alidad, establece qu ma de las cargas netas ositivas debe ser igual a la suma de las cargas netas negativas.

las adiciones.

ajustada al inicio a un pH moderadamente

e electroneutralidad en esta solución dicta:

[ ] [*B

la constan

] [ ]A*K

K de equilib

A +C

lectroneutr e la sup 3.2 Determinación de la ecuación matemática para un sistema ácido-base.

El desarrollo de esta ecuación se basa en los principios químicos arriba mencionados. Generalmente, la ecuación matemática es para determinar a [ ]+H , y on este valor, calcular el pH tras cada una de c

Consideramos una solución acuosabásico, mediante la adición de NaOH, que luego se acidificó gradualmente con adiciones de HCl. Con estas condiciones se desarrolló la ecuación matemática, para el cálculo de pH.

Para este fin, se parte de las siguientes consideraciones.

El producto iónico del agua es: [ ] [ ] W

-+ K=OH*H Ecuación #6 El imperativo d

[ ] [ ] [ ] [ ]−−++ +=+ OHClNaH Ecuación #7

De la ecuación # 6 se despeja a [ ]-OH :

[ ] [ ]+− =

HKOH w , que al sustituir en la ecuación # 7, rinde:

[ ] [ ] [ ] [ ] 0HKClNaH w- =++

++ -- Ecuación #8

Con la ecuación #8, si sabemos las concentraciones del ión sodio y del cloruro en la solución, podemos determinar fácilmente la concentración del ión hidrógeno, y a partir de éste, conocer el pH teórico.

Concentración del ión sodio [ ]V

nNa inicialNaOH=+


Concentración del ión cloruro [ ] [ ]V

Cl totalCl=−

solución.

n

umen total de la

Al a cuación # 3, queda:

H

en donde V es el vol

multiplic r por [ ]+H y sustituir estas igualdades en la e

[ ] [ ] [ ] [ ]( )HClNaOHH totalmezcla2+ + - 0H W =+ K- Ecuación #9

La cual es una ecuación cuadrática en [ ]+H , cuya solución está dada por:

[ ] [ ]( ) [ ] [ ]( )[ ] Wtotalmezclatotalmezcla K

42H ++=+

2HClNaOHHClNaOH --

stema. En donde

Ecuación # 10

La ecuación # 10 es la ecuación matemática teórica de este si[ ] [ ]mezclaNaOH es la concentración formal del NaOH agregado inicialmente y totalHCl es la concentración formal del HCl integral adicionado hasta el punto actual de la titulación. 3.2.1. Resolución de la ecuación matemática

n de temperatura de 25ºC para esta temperatura.

K

De

Para la resolución de la ecuación # 10 para la condicióse emplea el producto iónico del agua

W = 1.0081*10-14 M (CRC, 1978-1979)

l valor de [ ]+H calculado mediante la ecuación # 10 para cada etapa de la

lación se calcula el pH co te la ecuación: titu rrespondiente en cada caso median

[ ]M1

log=pH 10H+

3.2.2 Titulació

ara comprobar los valores de pH teóricos, obtenidos a partir de la ecuación atemática para este sistema, se establecieron los tres siguientes sistemas ácido-

base para su comprobació

Sistema base NaOH → ácido HCl

Lcose e se indicó específicamente tanto el ajuste

icial de la solución con NaOH (0.1 M) a pH 9.23, como las adiciones de HCl necesarias para la titulación. La solución de HCl se preparó en las concentraciones req estándar de HCl, para ser agregadas en alícuotas

petidas, de tal forma que se dieran en cada adición, reducciones de pH de proximadamente 0.1 a 0.2 unidades, lo cual se verificaba continuamente por la

medición directa del pH de la solución. Esto era con la finalidad de obtener una

n experimental del sistema ácido-base

Pm

n.

3.2.2.1

os experimentos en ausencia de amortiguador fueron previamente realizados sin ntener oligonucleótido con el sistema base NaOH → ácido HCl. Del cálculo teórico, elaboró la hoja de trabajo, en la qu

in

ueridas a partir de la solución rea


buena distribución d el experimento real, que involucraría al olig en la gráfica s de pH experimen n el intervalo desde pH 9 hasta

y nuevamente son menores a pH diferencia de pH, para el intervalo entre 9 y 5, se debe probablemente a

con olu

e valores de pH para onucleótido. Como se observa 2, en su mayoría los valore

tal con respecto al teórico, son menores e 5, mayores en el intervalo de pH 5 hasta pH 4 pH

4. Lataminación de la s ción de trabajo por dióxido de carbono atmosférico.

pH teórico

10

4

20.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

log micromoles de HCl

6

8

0.2 1.1

pH

pH experimental

mparación del pH teórico y el pH experimental, para el sistema NaOH – HCl a 25ºC y sin

3.2.2.2

Al inicialmente sin la dición de oligonucleótido, elaborando previamente la hoja de cálculo, inicialmente

la solución se gráfica 3 muestra los s de este experimento, en ella se observa que la mayoría de los valores

último n de

teórico, en esta solución que carece de amortiguador.

Go

ráfica 2 Coligómero.

Sistema ácido HCl → base NaOH

igual que en el anterior experimento, este sistema se ensayó a

ajustó a un pH 2.8 con HCl (0.1M). La resultadomedidos de pH en cada una de las adiciones de NaOH, son menores al pH teórico, sobre todo a valores de pH 4.2. La marcada discrepancia que se nota en el punto de la gráfica se puede explicar por un mínimo error en la concentracióNaOH titulante que causa que el valor de pH se dispare en comparación con el

pH teórico pH experimental

8

4

6

pH

2

0-0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

log micromoles de NaOH

Gráfica 3 Comparación del pH teórico y el pH experimental, para un sistema HCl – NaOH a 25ºC y sin oligómero.


3.2.2.3 Sistema base NaOH - NaCl (0.01M) → ácido HCl.

Partiendo de una solución acuosa de NaCl 0.01M, se recorrió el pH inicialmente a pH 10.8 por añadidura de NaOH, seguido de adiciones repetidas de HCl 0.1 M. El objetivo era determinar si este sistema podría ser el idóneo, en la comparación de pH teórico y pH experimental, en el intervalo que se requería para la determinación e pK (pH 4 hasta pH 5) de la base citosina. La gráfica 4 muestra los resultad a dos de

éste, en la cual se observa una marcada discrepancia entre los valores calculados y los valores medidos, atribuible a que en ausencia de amortiguador, errores mínimos en la concentración de la sosa o del ácido titulante, llevó a serias divergencias en el pH resultante, ante todo en las etapas cercanas al punto de neutralización, es decir, pH 4 hasta pH 10.

pH teórico

4

8

10

12

6pH

2

00,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 1,7 1,9 2,1 2,3


pH experimental

o

De la misma manera como en el caso del sistema sin amortiguador, se desarrolla la ecuación teórica para la determinación de pH para un sistema que contiene al amortiguador cacodilato de sodio a una concentración inicial de 0.01 M, que se va acidificando paulatinamente por la adición de alícuotas de HCl. La solución del sistema de ecuaciones es a través de un polinomio de tercer grado:

Gráfica 4 Comparación del pH teórico y el pH experimental, para el sistema NaOH - NaCl 0.010 M – HCl a 25ºC y sin oligómero. 3.3 Determinación de la ecuación matemática para un sistema de titulación ácido-base en presencia del amortiguador: cacodilato de sodi

[ ] [ ] [ ] [ ]( ) [ ] [ ]( ) 0KK-KHClHHClKNaCacodilatoHH WaWTOTALTOTALaTOTAL23 =++++ +++

Donde las constantes a utilizar son (CRC, 1978-1979):

KW = 1.0081*10-14 M2 a 25ºC -7 Ka = 6.4*10 M a 25ºC para el ácido cacodílico


3.3.1 Resolución de la ecuación matemática

La ecuación de tercer grado se resuelve para cada una de las adiciones de la solu n de HCl, utilizando el método de la doble división sintética (Nieves y Domínguez, 1999). Para cada uno de los valores de [ ]+H obtenidos, se calcula el valor de pH correspondiente. 3.3.2 Titulación expe

ció

rimental del sistema de titulación ácido-base en presencia del amortiguador: cacodilato de sodio

Para comprobar los valores de pH obtenidos de la ecuación matemática de este sistema, se propusieron dos diferentes concentraciones de cacodilato de sodio.

3.3.2.1 Titulación ácida del sistema cacodilato de sodio 0.01 M

Siguiendo el mismo protocolo que en el sistema sin amortiguador, se llevó a cabo la titulación ácida del sistema cacodilato de sodio 0.01 M, sin oligonucleótido. En la gráfica 5 se presenta la comparación de los pH teóricos con los pH experimentales en este experimento.

pH teórico

7

8

9

6

pH

4

5

2

3

0.5 1 1.5 2 2.5


pH experimental

Comparación del pH teórico y el pH experimental, para el sistema cacodilato de sodio 0.01M

– HCl, a 25ºC y sin oligómero.

uevamente, se nota que para el régimen de pH básico o moderadamente ácido lores de pH menores de los

óricos, un efecto que se puede atribuir a una contaminación por dióxido de o atmos

3.3.2.2 Titulaci

nto sin oligonucleótido para el sistema de cacodilato e sodio 0.003M. Los resultados se encuentran en la gráfica 6, en ella se observa

cia de las mediciones de pH con el microelectrodo y los valores e pH calculados para el intervalo desde pH 6 hasta pH 4.

Gráfica 5

Nexiste desviación de los resultados experimentales a vatecarbon férico.

ón ácida del sistema cacodilato de sodio 0.003 M

También se realizó el experimeduna buena concordand


2

3

4

5

6

7pH

8

9pH teórico

0.5 1 1.5 2 2.5

log micromoles HCl

pH experimental

ráfica 6 Comparación del pH teórico y el pH experimental, para el sistema cacodilato de sodio 003M – HCl a 25ºC y sin oligómero

nar el pH teórico de una solución inicialmente acidificada con ácido acético y luego basificada paulatinamente por la adición de alícuotas de NaOH. La solución del sistema de ecuaciones es también a través de un polinomio de tercer grado:

G0. 3.4 Determinación de la ecuación matemática para un sistema de titulación ácido-base en presencia de ácido acético.

De igual manera que en los casos anteriores con amortiguador, se desarrolló la ecuación para determi

[ ] [ ] [ ]( ) [ ] [ ] [ ]( ) 0KK-K-KHA-KNaHKNaHH WaWaTOTALaa23

=+++ +++++

3.4.1 Resolución de la ecuación matemática

La ecuación #18 de tercer grado se resuelve con el método de doble división sintética (Nieves y col., 1999), para cada una de las adiciones de NaOH. De cada uno de los valores de obtenidos, se calcula el valor de pH correspondiente. Donde las constantes utilizadas son (CRC, 1978-1979):

KW = 1.0081*10-14 M2 a 25ºC

tico 0.1 M para lograr un pH de la solución de 2.69, y se a un pH de 7. Los

cia entre las

[ ]+H

Ka = 1.754 x 10-5 M para ácido acético a 25ºC

3.4.2 Titulación experimental del sistema ácido-base en presencia del amortiguador: ácido acético

Se realizó esta basificación en ausencia de oligonucleótido. Se inició con una solución de acido acécontinuó con adiciones repetidas de NaOH al 0.4 M, hasta llegarresultados se muestran en la gráfica 7; en ella se observa la discrepanmediciones de pH con el microelectrodo y los valores de pH calculados. La gráfica 9 reúne el pH teórico y el pH medido en el experimento sin oligonucléotido para este sistema.


2

3

45

6

7

8

910

11

12

1.5 1.7 1.9 2.1 2.3 2.5

log micromoles de NaOH

pH

pH teórico pH experimental

OH a Gráfica 7 Comparación del pH teórico con el pH experimental, para el sistema ácido acético – Na25ºC y sin oligómero.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

- 37 -


1. ESPECTROS Y TITULACIONES DE CONTROL

1.1 Espectro de absorción UV de la solución de cacodilato de sodio 0.01 M

Solución de cacodilato de sodio 0.01 M, fue elegida como amortiguador durante la titulación de los oligómeros. Siendo éste el disolvente mayoritario, debe de cumplir con la característica de ser transparente a la radiación de UV en la región de 240 a 325 nm, intervalo de longitud de onda en el que se efectuaron las mediciones de absorbancia de cada uno de los experimentos reportados. Para comprobar lo antes escrito, se registró el espectro de absorbancia de una solución de cacodilato de sodio 0.01 M, desde 220 a 325 nm, a pH 7 y a pH 2. El espectro se presenta en la figura 19, en la que se observa que esta solución, en ambas condiciones, presenta valores muy pequeños de absorbancia.

Figura 19 Espectro de absorción UV de la solución de cacodilato de sodio 0.01M, a 25 ºC


- 38 -

1.2 Titulación de la solución de cacodilato sodio 0.01 M Como experimento de control se llevó a cabo una titulación del amortiguador, con HCl, en el intervalo de pH de 7 a 2, registrando los valores de absorbancia a longitudes de onda de 280 nm y 260 nm. s resultados presentados en las gráficas 8 y 9, muestran que tanto el valor de A28 como el de A260

* se reducen a lo largo de la titulación, ambos sufren un descens de alrededor de 0.012 en este intervalo de pH. Se notó además que para otras longitudes de onda, los valores de absorbancia (A240*, A250*, A270*, A290 ) también se recorrían de manera aproximadamente paralela, todas sufriend una rebaja por aproximadamente 0.012 entre pH 7 y pH 2. La causa probable pa este corrimiento paralelo no puede ser debido a cambios espectrales intrínsecos l cacodilato de sodio; sino más bien, se interpreta como un corrimiento de la lín l instrumento a lo largo de la medición que tardó varias horas. Estos cambios son despreciables, y no afectarán en medida apreciable los valores calculados para A280

*/A260* a lo largo de las

titulaciones de las soluciones con oligonucleótidos. Por ejemplo en la titilación del * * ulado sencillamente cambia de

r = 2.7 ; si estas razones de absorbancia se recalculan compensando para la disminución de 0.012, tanto para

os valores de A280*/A260

* serían s decir se obtienen

do no se

de

Lo0*

o

*oradeea base de

heptámero a ω=0.01, el valor de A280 /A260 calc0.722 a pH preliminar = 7.2 a 0.841 a pH prelimina

los valores de A280* como A260

* a pH 2.7, , los nuev0.722 y 0.844, a pH 7.2 y pH 2.7, respectivamente, eprácticamente los mismos valores de A280

*/A260* que se calcularon cuan

tomó en cuenta el cambio espectral de la solución de cacodilato de sodio.

-0.006

-0.004

-0.002

0.000

2 3 4 5 6 7 8

-0.014

-0.012

-0.010

-0.008

A280

*-A

280

*I

pH preliminar

Gráfica 8 Titulación de la solución de cacodilato de sodio 0.01 M sin oligonucleótido con HCl, a 25ºC


- 39 -

2 3 4 5 6 7 8

-0.016

-0.014

-0.012

-0.010

-0.008

-0.006

-0.004

-0.002

0.000

A26

0*-A

260*I

pH preliminar

Gráfica 9 Titulación de la solución de cacodilato de sodio 0.01 M sin oligonucleótido con HCl, a 25ºC

1.3 ESPECTRO DE ABSORCIÓN DE LA SOLUCIÓN DE 2’-DESOXICITIDINA

La Figura 20 presenta los espectros de absorción de la 2’-desoxicitidina, registrados en solución acuosa de amortiguador de cacodilato de sodio al 0.01 M, a valores de H de 7 y de 2, ambos a idéntica concentración de aproximadamente 10-4 M de

nucleósido. La presencia de una sola base en 2’-desoxicitidina presenta un espectro de absorción con bandas bien definidas a condiciones de pH 7 y pH 2, figura D. Estos espectros son semejantes a los reportados por P-L Biochemicals, Inc. (1976), para la citidina 5’-monofosfato, que se presentó en la figura 12 de esta tesis.

p

Figura 20 Espectro de absorción UV de 2’-desoxicitidina a 25 ºC, a dos diferentes pH


- 40 -

1.4 COMPARACIÓN DE LOS ESPECTROS DE ABSORCIÓN DE d-TTTTTTT Y DE d-TTTCTTTT, EN SOLUCIÓN DE CACODILATO DE SODIO 0.01 M 1.4.1 Espectro de la solución de d-TTTTTTT y de la solución de d-TTTCTTT

Se registraron los espectros de d-TTTTTTT (figura 21) y de d-TTTCTTT (figura 22), ambos a dos diferentes condiciones de pH 7 y 2. Para el caso de d-TTTTTTT se observa que los espectros a pH 7 y a pH 2 son prácticamente idénticos, es decir, las timinas no sufren un cambio significativo en sus características de absorción entre estas dos condiciones de pH. En cambio el oligómero que contiene a la base citosina rodeada de timinas presenta cambios espectrales notables, como resultado de la protonación que esta base ionizable sufre, entre estos dos valores de pH. Con lo cual se verifica la premisa del presente trabajo: el espectro de absorción de un oligonucleótido que contiene bases timinas y una base de citosina al centro, presenta únicamente el cambio espectral de la citosina, al recorrerse el pH de neutral a ácido.

Figura 21 Espectro de absorción UV para d-TTTTTTT a 25 ºC

Figura 22 Espectro de absorción UV para d-TTTCTTT a 25 ºC


- 41 -

1.4.2 TITULACIÓN DE d-TTTTTT Además, como experimento de control para confirmar dicha premisa se realizó una titulación de d-TTTTTTT en solución de cacodilato de sodio 0.01 M, iniciando a pH 7 y finalizando a pH 2. El resultado de esta titulación se presenta en la gráfica 10, se observa que A280

*/A260* se reduce por 3.2%, de 0.695 a 0.673, entre pH 7 y pH 2;

es menor la disminución entre pH 6 y pH 2, que se calcula de 1% aproximadamente. En cambio, los valores de A280

*/A260* cuando se tituló el

oligonucleótido d-TTTCTTT van en aumento aproximadamente por un 16.4.%, entre pH 6 y pH 3.

0.695

2 3 4 5 6 7 8

0.670

0.675

0.680

0.685

0.690

A280

*/A260

*

pH preliminar

Gráfica 10 Titulación de d-TTTTTTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, con HCl a 25 ºC

1.5 ESTABILIDAD DEL SISTEMA Una de las características deseables en es trabajo experimental fue la de determinar la estabilidad del sistema de medición. Para lo cual se reportan a continuación los valores de (pKa)preliminar obtenidos de los ajustes sigmoidales a los datos experimentales de titulación, considerando por separado los datos de primera lectura, segunda lectura y tercera lectura, de una misma titulación, para el caso del heptámero a ω = 1.01. En cada punto de la titulación el intervalo de tiempo entre el juego de primeras lecturas y segundas lecturas, así como entre segundas y terceras lecturas, fue de aproximadamente 55 segundos, y en promedio el tiempo en cada una de las series de lecturas fue de 5.5 minutos.

Número de lectura pKa

Primera 6.0098 Segunda 6.0124 Tercera 6.0113

te


- 42 -

Estos resultados demuestran, que ya desde la primera lectura se están detectando orrectamente los cambios espectrales que sufre la base citosina, en la titulación

gitudes de onda) más idóneo para la evaluación de las titulaciones, reviamente se realizaron los cálculos teóricos del cambio en estos parámetros a

dos diferentes valores de pH correspondientes a la situación del grupo citosina sin carga eléctrica (pH 7) y con el grupo citosina protonado al 100% (pH 3). Los datos teóricos se obtuvieron a partir de los espectros de absorción para la 2’-desoxicitidina y para la timidina reportados por Fox y Shugar (1952), calculando los valores de

cácida a la cual es sometida químicamente.

2. COMPARACIÓN DE DIFERENTES PARÁMETROS ÓPTICOS PARA EL SEGUIMIENTO DE LA TRANSICIÓN DEL GRUPO CITOSINA EN EL ENTORNO OLIGONUCLEOTÍDICO Para poder seleccionar el parámetro óptico (razón o diferencia de absorbancia a diferentes lonp

ε para el heptámero como simple sumatoria sobre los correspondientes valores de ε de las bases constituyentes. Las propiedades ópticas consideradas, fueron: coeficientes de extinción a una longitud de onda determinada (ε 300), o diferencias entre coeficientes de extinción a dos longitudes de onda determinadas (ε 290 -ε 300), o razones entre los coeficientes de extinción a dos determinadas

longitu de onda, por ejemplo,des 240

280

εε

, 260

280

εε

o 260

300

εε

(Tabla1).

Tabla 6 Razones entre los valores a pH 3 y a pH 7, para varios parámetros ópticos, calculados teóricamente para el heptámero d-TTTCTTT

( )

( )462.1=

ε240

ε

ε2pH

240

280

ε7pH280

( )

( )164.1=

εεεε

7pH

2pH

260

280

260

280

( )

( )92.3=

εεε

2pH

300

260

300

ε7pH

260

( )( ) 28.3

ε300

ε30 =7pH

2pH0

( )( )( )( ) 315.1=

ε-εε-ε

7pH

2pH

300290

300290


- 43 -

Sobre la base de estos cálculos, comparando los cambios que ocurren entre pH 7 ypH 2, el parámetro óptico que presenta el mayor cambio porcentual, entre loexaminados, es la razón ε300/ε260, que aumen

s

ta por un factor de 3.92 de pH 7 a pH , por lo que se esperaría que al graficar los resultados experimentales de

ue es claramente baja para la absorción a 300 nm. Por

c

2A300*/A260* versus pH medido en el ensayo preliminar, se evalúe significativamente mejor la transición de la acidificación. Sin embargo, existen otras consideraciones más allá del cambio relativo en la propiedad óptica a seguir, como lo es la intensidad de la señal, qende, se efectuó una comparación del seguimiento de diferentes parámetros ópticos a lo largo de la protonación experimental del heptámero d-TTTCTTT, titulando a partir de cacodilato de sodio al 0.01 M por adición de HCl, sin otra sal agregada. Se realizó el cálculo del pKa en las gráficas obtenidas con los diferentes parámetros ópticos (gráficas 11 a 15), y los resultados se presentan en la tabla 7. Tabla 7 Comparación de los valores de pKa del d-TTTCTTT obtenidos de gráficas con diferentes cál ulos de razones o diferencias de absorbancia a diferentes longitudes de onda Parámetro óptico de seguimiento

A280*/A240*

A280*/A260*

A300*/A260*

A300*dil

(A290*-A300*)dil

Gráfica 11 12 3 14 1 15 pKa 4.72 4.76 4.89 4.86 4.84 En esta tabla, los asteriscos denotan que los valores de absorbancia empleacorrigieron en cuanto a la línea base, por sustracción del v

dos se alor de absorbancia a 325

nm. Para los parámetros que no implican una razón entre dos absorbancias, como lo son A300*dil y (A290*-A300*)dil, la abreviación “dil” indica que, además, los valores utilizados en el seguimiento de la transición fueron, en cada punto, corregidos por el efecto de dilución que se da a lo largo de la titulación.

Estos resultados indican que no existe una diferencia mayor entre los valores de pKa, obtenidos con el uso de las diferentes medidas ópticas. Esto no es de sorprender, si consideramos que el cambio físico del oligómero entre pH 7 y pH 2 debe ser una simple transición entre dos estados definidos, que debiera manifestarse en igual medida independientemente del parámetro óptico que se haya utilizado para monitorear la transición.

Entre los diferentes parámetros ópticos de seguimiento que se comparan en la tabla 7 el parámetro que arroja el valor menor de pKa es A280*/A240*. Esto podría estar relacionado a que a 240 nm el HCl agregado a lo largo de la titulación contribuye a la absorbancia en medida significativa. Cabe recordar que en estos experimentos no se compensó para estos efectos (lo que se podría haber hecho, por ejemplo por añadidura de un volumen igual del titulante a una celda de referencia), por lo que es aconsejable efectuar el se imiento de la transición a longitudes de onda donde los reactivos adicionados sean transparentes, es decir, por encima de 240 nm.

A continuación se muestran las gráficas de las que se derivan los valores de pKa listados en la tabla 7.

gu


- 44 -

2,2

2,3

2,4

2,5

2,6

2,7

2,8

2 3 4 5 6 7 8pH medido en el ensayo preliminar

A2

80

*/

A2

40

*

Gráfica 11 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC,

usando A */ A * como parámetro de seguimiento 280 240

0,84

0,86

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

2 3 4 5 6

A2

80

*/

0,8

0,82

7 8

A2

60

*

pH medido en el ensayo preliminar

Gráfica 12: Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A280*/ A260* como parámetro de seguimiento

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

A3

00

*/A

26

0*

02 3 4 5 6 7 8


ráfica 13 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A300*/ A260* como parámetro de seguimiento

G


- 45 -

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07


A3

00

*(d

il)

Gráfica 14 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A300*(dil) como parámetro de seguimiento

0,180,190,2

0,210,220,230,240,250,260,27

2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5


(A2

90

*-A

30

0*

)(d

il)

to

or otra parte, se realizó para cada una de las gráficas anteriores, el cálculo de razones de cambio entre pH 7 y pH 3 de los diferentes parámetros ópticos a partir de los valores de meseta que se presentan en las gráficas. Estas razones de cambio experimentales se comparan, en la tabla 8, con las correspondientes razones de cambio obtenidas de manera teórica, que ya se habían listado en la tabla 7.

Gráfica 15 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando (A290 - A300)dil como parámetro de seguimien P


- 46 -

Tabla 8 Comparación de las razones de cambio entre pH 7 y pH 2 determinadas experimentalmente con las razones de cambio teóricamente calculadas, para varios parámetros ópticos

Razones de cambio calculadas a partir de

los datos de Fox y Shugar,(1952)

Razones de cambio determinadas

experimentalmente Con las gráficas 11 a la 15 de esta tesis.

( )

( )7pH

2pH

240

280

240

280

εεεε

1.462

1.36

( )

( )7pH260

280

εε 1.16

1.16

2pH260ε

280ε

4

( )

( )7pH

2pH

260

300

260

300

εεεε

3.92

3.5

( )( )7pH

2pH

300

300

εε

3.28 3.62

( )( )( )( )7pH

2pH

300290

300290

ε-εε-ε

1.315 1.32

e nota que, por lo general, las razones de cambio teóricas y las experimentales oinciden razonablemente. La desviación que se verifica para el cambio en el

partir de estas comparaciones, se decidió utilizar de aquí en adelante el parámetro A280

*/A260* para el seguimiento e la transición de protonación ya que, a

pesar de mostrar un cambio porcentual relativamente bajo entre pH 7 y pH 3, de todos modos se produce una curva lisa y bien desarrollada, basada en valores de absorbancia relativamente altos.

Scparámetro A280*/A240* (valor teórico: 1.462, valor experimental: 1.36) se debe probablemente a un aumento del valor de A240 a valores bajos de pH en el experimento, debida a la absorbancia del HCl añadido, lo que debiera redundar en una disminución del valor del cambio relativo en el parámetro A280*/A240*, al entrar en el régimen ácido.

Ad


- 47 -

3. DETERMINACIÓN EXPERIMENTAL DEL pKa DEL GRUPO CITOSINA CONTENIDO EN SIMPLES NUCLEÓSIDOS

3.1 Determinación experiment a

Se realizó esta acidificación c solució codilato de sodio (0.01 M) que contenía citid entrac x10-4 M. Los resultados se muestran e os n valor final de pKa de 4.06, a 25ºC, para estas condicione s en la literatura son pKa = 4.17 (Clauwaert y tockx, 1968), a 20ºC y sin amortiguador, así como valores (extrapolados a cero fuerza iónica) de pKa = 09 y pKa = 3.99, reportados por Wróbel y col. (1970) ºC y 30ºC, respec ente, de lo que se obtiene un estimado de pKa = 4.04 para la citidina a 25ºC. Esto representa una congruencia aceptable entre los valore de la literatura y los resultados que se obtuvieron en el presente trabajo. Esta congruencia demuestra que las técnicas utilizadas en el presente trabajo arroj ltados confiables.

al del pKa de la citidin

on HCl a partir de una ina a una conc

n acuosa de caión aproximada de 1 resultados se deriva us. Valores reportado

n la gráfica 16. De est

S4.

para 20 tivam

s

an resu

0,81

1,21,4

1,61,8

22,2

2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5


A28

060

*

Gráfica 16 Titulación de la citidina en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento

eterminación experimental del pKa de 2’-desoxicitidina

a determinado en el presente trabajo y el reportado en

*/A2

3.2 D

Se realizó esta acidificación con HCl a partir de cacodilato de sodio (0.01 M), con la presencia de desoxicitidina a una concentración aproximada de 1x10-4 M. La curva de titulación se muestra en la gráfica 17. De esta curva se deriva un valor final de pKa de 4.08 para estas condiciones, valor que se debe comparar con el reportado por Fox y col. (1953), pKa 4.25 para la 2’-desoxicitidina, sin especificación de temperatura, en ausencia de amortiguador. Nuevamente se da una congruencia aceptable entre el valor de pKla literatura. La titulación ácida de 2’-desoxicitidina, también se llevo a cabo en solución de cacodilato de sodio 0.01 M , en presencia de NaCl 0.1 M y 1 M. Los resultados de (pKa)final para ambos casos están incluidos en la tabla 9.


- 48 -

22,2

A2

60

*

1,61,8

0,81

1,21,4


A2

80

*/

Gráfica 17 Titulación de la 2'-desoxicitidina en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento

4. DETERMINACIÓN DEL pKa PARA LA BASE CITOSINA CUANDO SE ENCUENTRA EN OLIGONUCLEÓTIDOS DE DIFERENTE TAMAÑO, CON EL SISTEMA AMORTIGUADOR CACODILATO DE SODIO (0.01 M) → HCl

La tabla 9 muestra, para 25ºC y en un sistema de amortiguador de cacodilato de sodio (0.01M)-HCl, los valores de pKa de la base citosina en el nucleósido, así como en oligonucleótidos de diferentes tamaños, a diferentes fuerzas iónicas. Éstas se logran por adición de NaCl a diferentes concentraciones. La fuerza iónica listada es la que rige a la mitad de la transición.

diferente tamaño,

ω = 1.01

Tabla 9 Valores de pKa a 25ºC de la base citosina en oligonucleótidos de a diferentes fuerzas iónicas, obtenidos al graficar A280*/A260*

OLIGONUCLEÓTIDO ω = 0.01 ω = 0.11 d-TTCTT 4.54 4.54 4.38 d-TTTCTTT 4.76 4.29 4.24 d-TTTTCTTTT 4.66 4.49 4.25 2’-desoxicitidina 4.13 4.14 4.22

La inspección de los resultados de pKa listados, muestra que en todos los casos el pKa de la citosina en el entorno oligonucleotídico es mayor que el valor del pKa de la citosina en el simple desoxirribonucleósido, 2’-desoxicitidina, determinado experimentalmente con el mismo sistema amortiguador, a la misma concentración de NaCl. Esto es lógico, dada la carga eléctrica negativa de los grupos fosfatos del oligómero, que debiera facilitar la formación de un grupo positivo vecino. Se observa como una tendencia general que un aumento en la fuerza iónica resulta en una disminución del valor de pKa, lo que es el resultado anticipado, ya que la sal debiera de apantallar el efecto de campo eléctrico de los grupos fosfato. A la mayor fuerza iónica ensayada (ω = 1.01) los valores de pKa de los oligonucleótidos ya no quedan significativamente por encima del valor (pKa. 4.22) del nucleósido de comparación (2’-desoxicitidina a ω = 1.01), lo que indica que a esta concentración


- 49 -

de sal el efecto de campo de los fosfatos ya se ve esencialmente apantallado por completo.

Los valores de pKa determinados para el simple nucleósido, 2’-desoxicitosina, se presentan prácticamente insensibles a la fuerza iónica de la solución, talvez con una ligera tendencia hacia valores mayores de pKa al aumentar la concentración de sal, lo que representa el resultado esperado.

Con los datos obtenidos no se nota una diferencia clara del pKa de la citosina para los oligómeros modelo de diferentes longitudes. Esto significaría que el efecto de la cadena de fosfatos ya se da aproximadamente por completo con un oligómero tan corto como el pentámero. Es ante todo en las condiciones de baja fuerza iónica que se habría esperado un mayor efecto de longitudes mayores del oligonucleótido. A continuación se presentan las gráficas de A280*/A260*vs. pH medido en el ensayo

a tabla preliminar, de las cuales se obtuvieron los resultados de pKa presentados en l9.

0,840,860,880,9

26

0*

0,740,760,780,8

0,82

4,8 5,3

A2

80

*/

5,8 6,3 6,8

A

o parámetro de seguimiento


ráfica 18 Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, G usando A280 */ A260* com

0,9

0,7

0,75

0,8

0,85

1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5


A2

80

*/

A2

60

*

Gráfica 19 Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01 M/ NaCl 0.1 M - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento


- 50 -

0,9

0,820,840,860,88

A2

60

*A

28

0*

/

0,740,760,780,8

1,5 2,5 3,5 4,5 5,5 6,5 7,5 8,5

a epH medido en el ens yo pr liminar

Gráfica 20 Titulación del pentámero en cacodilato de sodio 0.01 M/ NaCl 1 M - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento

0,70,720,740,760,780,8

0,820,840,86

2 3 4 5 6 7 8


A2

80

*/

A2

60

*

G ráfica 21 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

0,8

0,82

0,84

0,86

2,3 3,3 4,3 5,3 6,3 7,3 8,3pH medido en el ensayo preliminar

A2

80

*/

A2

60

*

pt l 0.1 M - HCl a Gráfica 22 Titulación del he ámero en cacodilato de sodio 0.01 M / NaC

25ºC,usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento


- 51 -

0,68

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

0,8

0,82

0,84

1,8 2,8 3,8 4,8 5,8 6,8 7,8pH medido en el ensayo preliminar

A2

80

*/

A2

60

*

Gráfica 23 Titulación del heptámero en cacodilato de sodio 0.01 M/ NaCl 1 M - HCl a 25ºC,

miento usando A280 */ A260* como parámetro de segui

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

0,8

0,82

2 3 4 5 6 7pH medido en el ensayo preliminar

8

A2

80

*/

A2

60

*

Gráfica 24 Titulación del nonámero en cacodilato de sodio 0.01 M - HCl a 25ºC, usando A 80 */ A 60* como parámetro de seguimiento 2 2

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

0,8

0,82

2 3 4 5 6 7


8

A2

80

*/A

26

0*

Gráfica 25: Titulación del nonámero en cacodilato de sodio 0.01M / NaCl 0.1M - HCl a 25ºC,

usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento


- 52 -

0,65

0,67

0,69

0,71

0,73

0,75

0,77

0,79

0,81


A2

80

*/

A2

60

*

Gráfica 26 Ti del nonámero lato de sodio 0.01 M / NaCl 1 M - HCl a

Para una comparación de las gráficas 18-26 en cuanto al cambio del valor de A280*/A260* que se da en cada una de ellas entre pH 7 y pH 3, la tabla 10 reúne los valores del cambio relativo que se dio en cada caso. Estos valores se calcularon como el cociente entre el valor de A280*/A260* en la meseta a pH alrededor de 7 y el valor de esta razón en la meseta alrededor de pH 3. Tabla 10: Cambio relativo del valor de A280*/A260* entre pH 7 y pH 3, para oligonucleótidos de diferente tamaño y diferentes fuerzas iónicas.

Oligonucleótido ω =0.01 ω =0.11 ω=1.01

tulación en cacodi 25ºC, usando A */ A * como parámetro de seguimiento 280 260

d-TTCTT 1.185 1.205 1.177 d-TTTCTTT 1.165 1.158 1.166 d-TTTTCTTTT 1.131 1.134 1.129

Se observa que, para un oligonucleótido dado, el aumento relativo en el valor de A280*/A260*, al correr de pH 7 a pH 3, es relativamente insensible a la fuerza iónica en que se efectuó el experimento, pero sí se distingue de manera significativa entre los diferentes oligonucleótidos. Promediando a través de las diferentes fuerzas iónicas ensayadas, los valores promedio de este cambio relativo son: 1.19, 1.16 y 1.13, respectivamente, para el pentámero, el heptámero y el nonámero. Evidentemente, el cambio relativo en el parámetro óptico tendrá que disminuir al aumentar el tamaño del oligómero, ya que la contribución óptica de la citosina como único grupo que sufre el cambio óptico entre pH 7 y pH 3 se verá relativamente menguada al aumentar el número de grupos timina que permanecen sin cambio a través de este intervalo de pH. El cambio relativo de A280*/A260* para el caso del nonámero es aún muy significativo, lo que sugiere que con estas técnicas será

na revisión de las gráficas 18-26 muestra que las curvas de transición pueden resentar formas muy diferentes. Se esperaría que las curvas debieran de tener la

misma forma general, característica de una simple transición entre dos estados

posible de dar seguimiento a la protonación de una base citosina solitaria incluso en n ivoligonucleótidos sig ificat amente más largos.

Up


- 53 -

definidos, tal y como se muestra en la curva teórica de la Figura 18. Las gráficas experimentales 18-26 debierían de presentar todas la misma forma, y solamente estar recorridas una con respecto a otra por las diferencias de pía. Sin embargo, algunas de las gráficas muestran curvas de la transición muy inclinadas, que parecieran indicar una transición altamente cooperativa (noción ilógica en nuestro caso que involucra un solitario grupo protonizable dentro del oligómero), mientras que en otros casos la transición tiene una forma muy somera, que pareciera indicar anticooperatividad en la transición (noción igualmente ilógica). En la consideración de estas curvas experimentales de transición se debe de tener en cuenta que el parámetro de la abscisa es el pH medido en el ensayo preliminar sin oligonucleótido, que en la presentación gráfica de titulación del oligómero se utilizó simplemente como parámetro de referencia. Este parámetro no sólo se encontró recorrido

untos de la jado de la

olinealidad con respecto al pH bla 2 de la sección Materiales y étodos, donde las diferencias entre pH actual y pH medido en el experimento sin ligonucleótido varían en medida significativa a lo largo de la titulación). Esto hace ue haya distensión y/o compresión a lo largo del intervalo de pH incluido en un

l punto medio de la transición ara determinar el pK . Es decir no se consideran los demás puntos, que en una

la transición.

En c s ha escri o en esta e aborda en form a la prob a antes me muestra en detalle los cálculos que enen entre l icas experim A280*/A260

*

vs. os re s en términ valores de ( listados en la abla 9. También contiene una comparación detallada de los procedimientos

respecto al parámetro del pH actual (medido directamente en contados p) muy aletitulación del oligonucleótido sino que podría presentarse

actual (veáse la tacMoqexperimento de titulación de oligonucleótido, así como también comparativamente entre diferentes experimentos. De ahí que la transición se puede ver más o menos inclinada en las diferentes gráficas. Cabe recordar que, en ausencia de un sistema que permitiera monitorear el pH de manera directa a través de todo el experimento, en esta tesis se decidió adoptar un enfoque sobre ep a

gráfica con valores significativos de abscisas a lo largo de la transición serían informativos en cuanto a la cooperatividad de

onexión con esta ituación se to un Anex tesis, qua detallad lemátic ncionada. En él, primero se

intervi as gráf entales de(pH)preliminar y l sultado os de pKa)final

Talternativos que se consideraron para: 1) obtener el valor de (pKa)preliminar (es decir el valor de pKa en la escala de

(pH)preliminar que proviene del experimento preliminar), y 2) efectuar la corrección local para convertir el resultado de la forma de (pKa)preliminar

a (pKa)final, es decir al valor de pKa de la citosina de interés en la escala real del pH de la solución del experimento de titulación del oligonucleótido.

La descripción general para la determinación del valor de (pKa)preliminar , es:

a) la evaluación gráfica de los puntos coordenados de A280*/A260* vs. (pH)preliminar, con un enfoque en las mesetas superior e inferior de la gráfica experimental y en la parte media de la curva,

b) la evaluación matemática de todos los puntos coordenados de A280*/A260* vs. (pH)preliminar, mediante un ajuste sigmoidal.

La descripción general para la conversión local de la escala de (pH)preliminar a (pH)medido:


- 54 -

a) conversión por interpolación utilizando de las mediciones potenciométricas efectuadas durante la titulación del oligonucleótido sólo las dos que se ubican más cercanas al punto medio de la protonación,

b) conversión basada en un ajuste lineal que correlaciona todas las mediciones potenciométricas efectuadas durante la titulación del oligonucleótido con los valores de (pH)preliminar correspondientes obtenidos en el experimento preliminar. Para fines del presente trabajo, la conversión local de la escala de (pH)preliminar a (pH)medido, se realizó como se indica en la alternativa a).

5. OTROS EXPERIMENTOS Aparte de los experimentos obtenidos con el sistema cacodilato de sodio 0.01 M → HCl, ya referidos, también se realizaron titulaciones de oligonucleótidos en diferentes sistemas con o sin amortiguador. Esta última variable fue de interés especial, porque la determinación del pKa del grupo citosina dentro del oligonucleótido fue en condiciones de muy baja fuerza iónica (con ω ≤ 0.001). Estas titulaciones exploratorias se llevaron a cabo en la parte inicial del presente trabajo, en un afán de definir un procedimiento que permitiera determinar los valores de pKa de manera confiable. Por varias razones, estos intentos no fueron satisfactorios, de manera que el enfoque quedó sobre el sistema cacodilato de sodio 0.01M → HCl, como el más idóneo. Sin embargo, las gráficas 24 y 25 muestran la transición con el sistema sin amortiguador (NaOH → HCl) y con amortiguador (ácido acético → NaOH), respectivamente.

0,780,8

0,820,840,86

0,70,72

1,5 3,5 5,5 7,5 9,5

0,740,76

A2

80

*/

A2

60

*


Gráfica 27 Titulación heptámero en NaOH - HCl a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento Las gráficas demuestran que estos sistemas de ajuste de pH también sirven para determinar transiciones completas de protonación (gráfica 24) o desprotonación

, valores similares a los que fueron determ nados para el heptámero y el nonámero (alrededor de 1.16 y 1.13,

(gráfica 25). Los valores de cambio relativo de A280*/A260* a pH 7 y a pH 3, se calcularon en 1.154 y 1.158, respectivamente

irespectivamente) en el sistema cacodilato de sodio 0.01M – HCl (tabla 10).


- 55 -

0,8

0,82

0,68

0,7

0,72

0,74

0,76

0,78

28

0*

/A

26

0*

2 4 6 8 10


A

cabo en los experimentos con sistema de cacodilato e sodio al 0.01 M), de manera que no se pudieron hacer los ajustes correctos de H para obtener un valor significativo.

Gráfica 28 Titulación del nonámero en ácido acético 0.1M - NaOH a 25ºC, usando A280 */ A260* como parámetro de seguimiento Es de esperar que en todos estos sistemas los valores de pKa para la citosina en el entorno oligonucleotídico fueran semejantes. Esto no se pudo confirmar para los experimentos representados en las gráficas 24 y 25, ya que en el periodo cuando se realizaron estos experimentos el procedimiento experimental aún no contemplaba mediciones puntuales del pH en etapas inmediatamente vecinas al punto medio de la transición (como se llevó a dp

CONCLUSIONES -56-

CONCLUSIONES

1) El seguimiento de la titulación de la base citosina en oligonucleótidos

sintéticos se puede realizar por espectrofotometría de UV. Varios parámetros n de

s ellos dando valores semejantes de pKa.

4) Para los oligómeros, un aumento de la fuerza iónica se relaciona con una tendencia del pKa a disminuír moderadamente, lo que probablemente refleja un apantallamiento parcial del efecto de campo de los fosfatos por la alta concentración de sal. A la más alta fuerza iónica estudiada en este trabajo (ω = 1), el pKa de los oligonucleótidos apenas excede al pKa del nucleósido, 2’-desoxicitidina, lo que indica que a esta fuerza iónica el efecto de campo de los fosfatos está nulificado casi por completo.

5) No se encontró un efecto claro del tamaño del oligonucleótido sobre los valores de pKa del grupo citosina, para los casos estudiados: pentámero, heptámero y nonámero.

6) El sistema de cacodilato de sodio al 0.01 M, titulado con HCl, demostró ser apropiado para los estudios que se llevaron a cabo en esta tesis. Se obtuvieron resultados preliminares con otros sistemas de ajuste de pH (sistema sin amortiguador o sistema de ácido acético con ajuste por adición de NaOH) que probablemente también se pudieran utilizar.

ópticos demostraron ser aptos para el monitoreo de la transicióprotonación de la citosina, todo

2) La magnitud del cambio observado para los diferentes parámetros ópticos utilizados en el monitoreo de la protonación del grupo citosina fue similar a la magnitud de ese cambio calculada sobre la base de los espectros reportados para los monómeros constituyentes.

3) Los valores de pKa de la base citosina integrada a los oligonucleótidos, son mayores que el pKa del simple nucleósido, 2’-desoxicitidina, lo que probablemente refleja el efecto del campo eléctrico de los grupos fosfato, en el caso de los oligómeros.

SUGERENCIAS - 57 -

SUGERENCIAS Como parte de las observacion esarrollo de este trabajo experimental, se proponen las ejorar la metodología de este trabajo y para complementar los sultados obtenidos:

es hechas a lo largo del d siguientes sugerencias para m

re 1 Control del CO2 atmosférico.- De preferencia, se debe de llevar a cabo todo el trabajo experimental en una atmósfera de control de nitrógeno o argón; con ello se tendría la seguridad de que los cambios de pH en la solución de titulación no son por la interferencia de CO2.

2 Medición continua de pH.- Establecer un sistema de medición que permita realizar para cada una de las adiciones de titulante una medición experimental de pH, de tal forma que se obtendría directamente una correlación entre el parámetro óptico de seguimiento de la titulación. 3 Titular oligonucléotidos de la forma d-CTTTTTT y d-TTTTTTC .- Con los resultados de estas titulaciones se podría estimar si existe una diferencia significativa del efecto de campo eléctrico de los fosfatos ubicados en la dirección 3’ con relación a la base protonizable, en comparación con los fosfatos que se ubican del lado 5’ de esa base. 4 Titular al oligonucleótido d-TCT.- Los resultados del presente trabajo indican que probablemente no hay diferencia entre los oligómeros de longitud de cinco, siete y nueve unidades nucleotídicas, en cuanto al valor del pKa de la citosina central, es decir, al parecer el pentámero ya ostenta toda la influencia de campo eléctrico posible, en cuanto a recorrimiento del pKa relativo a la situación del nucleósido, 2’-desoxicitidina. Es probable que el trímero d-TCT muestre un pKa intermedio entre los valores de pKa del nucleósido y de los oligonucleótidos modelo de longitud mayor. 5 Titular a mayor fuerza iónica.- De esta forma se podría determinar si existe diferencia significativa de los valores de pKa con los ya conocidos en este trabajo para fuerzas iónicas entre 0.01 y 1.01 y poder concluir a qué concentración de sal se nulifica por completo el efecto del campo eléctrico de los grupos fosfato.

GLOSARIO -58-

GLOSARIO Ácidos nucleicos: el ácido desoxirribonu N) y el ácido ribonucleico (ARN) son moléculas lineales, como hebras o cadenas, que contienen la información genética; están formadas por la nentes o “eslabones” llamados nucleótidos. El ADN tiene el azú l ARN, la ribosa; además, en el RN, en vez de la base timina hay uracilo.

y un azúcar (ribosa desoxirribosa), constituye un nucleótido, unidad básica de los ácidos nucleicos.

spectrometría de masas: (MALDI–TOF, del inglés matrix-assisted laser

o: fuera de un organismo vivo.

que se utiliza como molde cada una de sus hebras.

ecuencia: orden de nucleótidos o bases en una molécula de ADN o ARN.

Transcripción: lectura del mensaje codificado por el ADN que produce la síntesis de una cadena de ARN mensajero, ribosomal o de transferencia. Este proceso requiere señales regulatorias que permitan el inicio (promotores) y el fin de la transcripción (terminadores).

cleico (AD

secuencia de compocar desoxirribosa, y e

A ARNm: ácido ribonucleico mensajero Base nitrogenada: molécula orgánica que, junto con el fosfatooHay cuatro bases diferentes en el ADN: adenina, citosina, guanina y timina. En el ARN el uracilo sustituye a la timina. La información genética está dada por la secuencia de estas cuatro bases. Edesorption/ionization, time-of-flight): modalidad de la técnica de espectroscopia de masas que puede medir y analizar iones moleculares de alto peso molecular, sin descomposición, lo que la hace especialmente apta para el análisis de masas de macromoléculas. Nucleótidos: moléculas que constituyen los “eslabones” de los ácidos nucleicos. Cada nucleótido tienen un azúcar (distintos en el ADN -desoxirribosa- y en el ARN -ribosa-), un fosfato y una base nitrogenadas, o simplemente “base”. in vitr Oligonucleótido: cadena corta de nucleótidos. PCR (polimerase chain reaction): reacción en cadena de la polimerasa; es una amplificación exponencial in vitro de moléculas de ADN a través de múltiples ciclos de desnaturalización, hibridación de oligonucleótidos y síntesis enzimática de ADN. Replicación: síntesis de dos cadenas de ADN nuevas a partir de una molécula de ADN en S Traducción: proceso en el cual la secuencia nucleotídica del ARNm que contiene el mensaje genético determina el orden de los aminoácidos, de acuerdo con el código genético, para la formación de la cadena polipeptídica.

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(1991). Effect of 5-methylcytosine on the stability of triple-stranded DNA – a thermodynamic study. Nu , 5625-5631.

ngth dependence of protonation of cytidine and cytidine-5’-phosphate. Acta Biochim. Polon. 17

25. Watson,D.J., Baker,A.T., Bell,P.S., Gann,A., Levine,M. y Losick,R. (2004).

Molecular Biology of the Gene. 5th Edition. Pearson Benjamin Cummings, USA. Págs. 99-102;463-465.

26. Wróbel,A., Rabczenko,A. y Shugar,D. (1970). Conformation of Acid Forms of

polyC: Temperature and ionic stre, 339-349.

ANEXO - 61 –

ANEXO Comparación de diferentes métodos para la determinación del pKa de la base citosina en el entorno oligonucleotídico o nucleosídico: Todos los valores de pKa para los varios oligonucleótidos del tipo d-TnCTn y de la 2’-desoxicitidina listados para varias fuerzas iónicas en la Tabla 9 de esta tesis, se obtuvieron por un proceso de dos etapas, a saber:

a) La determinación de un valor de (pKa)preliminar como el valor de abscisa para el ual la curva experimental de A280*/A260* vs pHpreliminar muestra el valor de ordenada

el xperimento (a pH ≈7) y en la meseta final de la titulación (a pH ≈ 2). Aquí el

to preliminar de titulación sin oligonucleótido, scala que se utiliza en el experimento de titulación con oligonucleótido a través de

r este (pKa)preliminar al (pKa)final, es decir a un

a preliminar

) El primer método se encuentra descrito en el capítulo de Materiales y Métodos.

etas superior e inferior de A280*/A260*, así como e una evaluación de la trayectoria en la región de transición de la curva,

o

el valor de abscisa

ara cada uno de los experimentos de titulación que

cexactamente intermedio entre los valores de A280*/A260* en la meseta inicial de(pKa)preliminar es el pKa expresado en la escala de (pH)preliminar, es decir de la escala de pH que se implantara del experimeneun protocolo idéntico de adiciones de ácido.

) Un cálculo correctivo para convertibvalor de pKa real, basado en las condiciones reales de la solución experimental de titulación del oligonucleótido, en la cual se habían efectuado contadas mediciones directas del pH a lo largo de la titulación. 1 Métodos alternativos para determinar el valor de (pK ) aEl cual consiste en una evaluación de la curva experimental de titulación, basada en estimados geométricos de las mesdconsiderando estrictamente los puntos inmediatamente vecinos al punto medio de transición, en correlación con sus respectivos valores de (pH)preliminar.

) El segundo método es un análisis por un algoritmo de ajuste sigmoidal, basadbequitativamente en todos los puntos experimentales de A280*/A260*, en correlación con sus respectivos valores de (pH)preliminar. El programa computacional que se aplicó es Origin (versión 6.1), el cual reporta

sultados para los valores de meseta de A280*/A260*, así comorepara el punto de la curva cuyo valor de A280*/A260* está exactamente intermedio entre los valores de las dos mesetas, y además el intervalo de confiabilidad para el ajuste en esta última zona. A continuación se presentan estos ajustes sigmoidales on sus respectivas gráficas, pc

se realizaron en esta tesis.

ANEXO - 62 –

5.0 5.5 6.0 6.5 7.0

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82

0.84

0.86

0.88

0.90

Data: Data1_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 0.00005R^2 = 0.98788 A1 0.88921 ±0.00221A2 0.75824 ±0.00203*

x0 5.76222 ±0.0027360

dx 0.02158 ±0.00261

A280

*/2

pH preliminar

Gráfica 29 Titulación del pentámero a ω = 0.01

0.80

0.82

0.78

2 3 4 5 6 7 8

0.72

0.74

0.76

0.84

0.86

0.88

0.90

0.92

Data: Data6_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 9.6015E-6R^2 = 0.99805 A1 0.89119 ±0.00094A2 0.7348 ±0.00094x0 5.85981 ±0.00274

±0.00243280*

/260

*

dx 0.07569A

pH preliminar


2 3 4 5 6 7 80.74

0.76

0.78

0.80

0.82

0.84

0.86

0.88

0.90

Data: Data1_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 6.8027E-6R^2 = 0.99839

280*

/A26

0*

A1 0.88525 ±0.00062A2 0.7536 ±0.00075x0 6.11825 ±0.001dx 0.01938 ±0.00091

A

pH preliminar


ANEXO - 63 –

2 3 4 5 6 7 80.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82

0.84

0.86

Data: Data1_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 0.00001R^2 = 0.9943 A1 0.84402 ±0.00132A2 0.72416 ±0.00093x0 4.71567 ±0.01371dx 0.28179 ±0.01209

A280

*/2

60*

pH preliminar

Gráfica 32 Titulación d heptámero a ω = 0.01

el

2 3 4 5 6 7 80.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82

0.84

Data: Data4_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 0.00003R^2 = 0.98815 A1 0.84617 ±0.00482A2 0.7222 ±0.00159x0 3.495 ±0.03848dx 0.33721 ±0.041A2

80*/A2

60*

pH preliminar

Gráfica 33 Titulación d heptámero a ω = 0.11

el

2 3 4 5 6 7 80.68

0.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82


A28

0*/A

260*

pH preliminar

Gráfica 34 Titulación del heptámero a ω = 1.01

ANEXO - 64 –

0.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82

2 3 4 5 6 7 8

Data: Data1_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 0.00001R^2 = 0.99256 A1 0.80533 ±0.00117A2 0.71534 ±0.00087x0 5.12012 ±0.01235dx 0.16992 ±0.01095A

280

*/A26

0*

Gráfica 35 Titulación d nonámero a ω = 0.01

pH preliminar

el

2 3 4 5 6 7 80.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80

0.82


A28

0*/A

260

*

pH preliminar

Gráfica 36 Titulación d nonámero a ω .11 el = 0

2 3 4 5 6 7 8

0.70

0.72

0.74

0.76

0.78

0.80


A28

0*/A

260*

pH preliminar

Gráfica 37 Titulación del nonámero a ω = 1.01

ANEXO - 65 –

2 3 4 5 6 7 80.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0


A28

0*/A

260*

pH preliminar

Gráfica 38 Titulación de la 2’-desoxicitidina a ω = 0.01

2 3 4 5 6 70.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4 Data: Data1_BModel: Boltzmann Chi^2/DoF = 0.00465R^2 = 0.98583 A1 2.20758 ±0.02166A2 0.97856 ±0.0253x0 5.87897 ±0.00814dx 0.07103 ±0.00927

A280

*/A

260*

pH preliminar


2 3 4 5 6 7 80.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2


A28

0*/A

260*

pH preliminar


ANEXO - 66 –

La Tabla 11 compara, para todos los experimentos de titulación, los valores de (pKa)preliminar determinados mediante estos dos métodos alternativos. Tabla 11 Valores de (pKa)preliminar determinados por evaluación local de los datos en comparación con

valores determinados por ajuste matemático sigmoidal

Molécula ω = 0.01 ω = 0.11 ω = 1.01

5.76 5.87 6.12 d-TTCTT

5.762 5.860 6.118

4.71 3.49 6.00 d-TTTCTTT

4.716 3.495 6.007

5.09 3.64 2.91 d-TTTTCTTTT

5.120 3.744 2.846

4.79 5.88 5.57 2’-desoxicitidina

4.789 5.880 5.540

En esta Tabla, los valores que se obtuvieron por evaluación gráfica están escritos en negritas. Se nota que, en general, hay una congruencia aceptable entre los valores de (pKa)preliminar determinados por los dos procedimientos alternativos. En algunos casos las discrepancias son más notables, por ejemplo para d-TTTTCTTTT a fuerzas iónicas de 0.11 y 1.01. Examinando las gráficas del ajuste matemático sigmoidal para estos casos, se observa que en la región de transición el trazo de la curva de ajuste está recorrido hacia valores mayores de abscisa, en relación al trazo bien defin e los puntos coord ados en esta región. Esto se debe a que el aju por lo tanto se ve más afectado por distorsiones en la curva que la simple evaluación local de la curva de titulación, que se enfoca en las inmediaciones del punto medio de la transición. Esto es de particular gravedad en los casos de d-TTTTCTTTT a fuerzas iónicas de 0.11 y 1.01, donde la curva experimental muestra un hombro significativo en la curva, a valores de (pKa)preliminar mayores al punto medio de la transición. Es significativo que en estos casos el coeficiente de determinación R2 calculado por el programa tiene valores relativamente bajos (0.986 y 0.983, respectivamente). Es por estas consideraciones que en el presente trabajo los cálculos del (pKa)preliminar se basaron en la simple interpolación lineal entre los puntos vecinos al punto medio de la protonación.

ido que reúnste matemático censa la curva entera, y

en

ANEXO - 67 –

2 Cálculo de corrección para convertir de (pKa)preliminar a (pKa)final

ste método radica en una interpolación lineal, o en dado caso extrapolación lineal, esde las dos mediciones potenciométricas más cercanas al punto medio de la

tA continuación se esultados que se prese la tabla 9 inación de de (pKa)pre alizó como en el primer imiento descrito apartado 1, de

Titu TCTT en cac de sodio al 0. n HCl:

a) Interpolación lineal entre los dos puntos más cercanos. Edransición, correlacionando valores de (pH)preliminar y (pH)medido.

presentan los cálculos para todos los rntaron en , la determ un valor limin se re se indica proced en el este Anexo.

lación de d-T odilato 01 M, co

(pKa)preliminar = 5.758

Pun l pHpreliminar 58 tienen: : Punto 1: pHpreliminar = pHmedido

preliminar = pHmedido = 4.3

Por interpolación entre estos

tos cercanos a de 5.7

5.76 ; = 4.56 Punto 2: pH 5.74 ; 6

dos puntos:

4.56 – 4.36 = (pKa)final – 4.36 → (pKa)final = 4.56 – 4.36 x (5.758 – 5.74) + 4.36 5.76 – 5.74 5.76 – 5.74 5.758 – 5.74

(pKa)final = 4.54 Titulación de d-TTCTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, NaCl al 0.1 M, con HCl:


Puntos cercanos al pHpreliminar de 5.758 tienen: Punto 1: pHpreliminar = 5.91 ; pHmedido = 4.81

Punto 2: pHpreliminar = 5.87 ; pHmedido = 4.53

4.81 – 4.53 = (pKa)final – 4.53 → (pKa)final = 4.81 – 4.53 x (5.872 – 5.87) + 4.53 5.91 – 5.87 5.872 – 5.87 5.91 – 5.87

(pKa)final = 4.54 Titulación de d-TTCTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, NaCl al 1 M, con HCl:



Punto 2: pH = 6.11 ; pH = 4.24 preliminar medido

.53 – 4.244 = (pKa)final – 4.24 → (pKa)final = 4.53 – 4.24 x (6.12 – 6.11) + 4.24

.13 – 6.11 6.12 – 6.11 6.13 – 6.11

(pKa)final = 4.38 itulación de d-TTTCTTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, con HCl:

6

T

Ka)preliminar = 4.71

untos cercanos al pHpreliminar de 4.71 tiene:

(p

P

ANEXO - 68 –

Punto 1: pHpreliminar = 4.71 ; pHmedido = 4.76 Punto 2: pHpreliminar = 4.71 ; pHmedido = 4.76

(pK ) = 4.76 a final

Titulación de d-TTTCTTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, NaCl al 0.1 M, con HCl:




Por interpolación entre estos dos puntos:

4.42– 4.11 = (pKa)final – 4.11 → (pKa)final = 4.42– 4.11 x (3.49 – 3.50 – 3.37 3.49 – 3.37 3.50 – 3.37

3.37) + 4.11

TTT e so 1 M, NaCl al 1 M, con HCl:

(pKa)final = 4.40

Titulación de d-TTTC en cacodilato d dio al 0.0

(pKa)p

en:

stos dos puntos:

.40– 4.00

reliminar = 6.004

Puntos cercanos al pHpreliminar de 6.004 tien Punto 1: pHpreliminar = 6.01 ; pHmedido = 4.40


Por interpolación entre e

4 = (pKa)final – 4.00 → (pK ) = 4.40– 4.00a final x (6.004 – 5.98) + 4.00

2

.01 M, con HCl:

6.01 – 5.98 6.004 – 5.98 6.01 – 5.98

(pKa)final = 4.3

Titulación de d-TTTTCTTTT en cacodilato de sodio al 0

(pK )

ar medido

= 5.04 ; pHmedido = 4.54

4.54

= 5.09 a preliminar

Puntos cercanos al pHpreliminar de 5.9 tienen: Punto 1: pH = 5.28 ; pH = 5.10 prelimin

Punto 2: pHpreliminar

Por interpolación entre estos dos puntos:

5.10– = (pKa)final – 4.54 → (pKa)final = 5.10– 4.54 x (5.09 – 5.04) + 4.54 – 5.04 ..5.28 – 5.04

Titulación de M, NaCl al 0.1 M, con HCl:

5.28 – 5.04 5.09

(pKa)final = 4

.66

d-TTTTCTTTT en cacodilato de sodio al 0.01

inar de 3.642 tienen:

liminar medido

sde estos dos puntos:


Puntos cercanos al pHprelim

Punto 1: pHpreliminar = 4.03 ; pHmedido = 4.97 Punto 2: pH = 3.78 ; pH = 4.76 pre

Por extrapolación de

ANEXO - 69 –

4 4.76.97– = (pKa)final – 4.76 → (pKa)final = 4.97– 4.76 x (3.642 – 3.96) + 4.76 4.03 – 8

CTTTT en cacodilato de sodio al 0.01 M, NaCl al 1 M, con HCl:

3.78 3.642 – 3.96 4.03 – 3.7

(pKa)final = 4.49 Titulación de d-TTTT

do = 4.28

s os


Puntos cercanos al pHpreliminar de 5.9 tienen: Punto 1: pHpreliminar = 3.00 ; pHmedido = 4.40 Punto 2: pHpreliminar = 2.93 ; pHmedi

Por extrapolación de de estos dos punt :

4.40– 4.28 = (pKa)final – 4.28 → (pKa)final = 4.40– 4.28 x (2.91 – 2.93) + 4.28 .00 – 93 3.00 – 2.93

(pKa)final = 4.25

ción d icitidina en cacodilato de sodio al 0.01 M, con HCl:

3 2.93 2.91 – 2.

Titula e 2’-desox

do = 4.03

s os


Puntos cercanos al pHpreliminar de 5.9 tienen: Punto 1: pHpreliminar = 5.04 ; pHmedido = 4.99 Punto 2: pHpreliminar = 4.76 ; pHmedi

Por extrapolación de de estos dos punt :

4.99– 4.03 = (pKa)final – 4.03 → (pKa)final = 4.99– 4.03 x (4.79 – 4.76) + 4.03 .04 – 76 5.04 – 4.76

(pKa)final = 4.13

ción d xicitidina en cacodilato de sodio al 0.01 M, NaCl al 0.1 M, con

5 4.76 4.79 – 4.

Titula e 2’-desoHCl:

( reliminar = 5.88pK ) a p

Puntosdo = 4.17

lim med = 3.94

.17–

cercanos al pHpreliminar de 5.9 tienen: Punto 1: pHpreliminar = 5.89 ; pHmedi

Punto 2: pH = 5.87 ; pHpre inar ido

Por extrapolación desde estos dos puntos:

4 3.94 = (pKa)final – 3.94 → (pKa)final = 4.17– 3.94 x (5.88 – 5.87) + 3.94 .89 – 5.89 – 5.87

n por corrimiento del poténciometro: + 0.08: (pKa)final =

itulac al 0.01 M, NaCl al 1 M, con HCl:

5 5.87 5.88 – 5.87

(pKa)final = 4.06 Correcció4.14

T oxiciti lato ión de 2’-des dina en cacodi de sodio

Ocurre en el punto: pHpreliminar = 5.57; pHmedido = 4.72


ANEXO - 70 –

(pKa)final = 4.72 Corrección por corrimiento del poténciometro: -0.50: (pKa)final = 4.22

) Cor ineal gráfico con los valores de pH medidos en la titulación.

e ido

ante el experimento de titulación del oligonucleótido, cercanas a z est , se ajusta linealmente y mediante la

mina el pKa final a partir del pKa

preliminar partado 1 de este anexo. A continua s lineales para cada uno de los

4.5

b rección de ajuste lEl segundo método consiste en graficar los valores coordenados de (pH)preliminar y d(pH) , tomando en cuenta todas las mediciones potenciométricas de pH que semed

hayan efectuado durla transición. Una ve ablecida la línea

steecuación matemática de la línea de aju , se detero con éto determinad el primer m do del a

ción se muestran las gráficas de los ajusteexperimentos:

5.74 5.75 5.76 5.77 5.78

4.8

ción

4.7

do e

n la t

4.6

pH m

edi

4.4

4.3

itula

preliminar

lación del pentámero a ω = 0.01

pH

Gráfica 41 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titu

5.80 5.82 5.84 5.86 5.88 5.90 5.92

4.8

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

tulación

n la ti

dido

epH

me

pH preliminar

áfica

Gr 42 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del pentámero a ω = 0.11

ANEXO - 71 –

5.0

6.11 6.12 6.13 6.14 6.15 6.16

4.9

4.8

pH m

edido en

la titulac

ión

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

pH preliminar

Gráfica 43 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del pentámero a ω = 1.01

2 ,5 3 ,0 3 ,5 4 ,0 4 ,5 5 ,0 5 ,5 6 ,0 6 ,5

2 ,5

3 ,0

3 ,5

4 ,0

4 ,5

5 ,0

5 ,5

6 ,0

6 ,5

pH m

edid

o en

la t

itul

ació

n

p H re l im in a r p

Gráfica 44 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del heptámero a ω = 0.01

3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 4.04.0

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

4.8

pH m

edido

en la

titulac

ión

pH preliminar

Gráfica 45 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del heptámero a ω = 0.11

ANEXO - 72 –

5.90 5.92 5.94 5.96 5.98 6.00 6.023.6

3.7

3.8

3.9

4.0

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

pH m

edid

o en

la titulación

pH preliminar

Gráfica 46 Correlación del pH preliminar con el p medido en la titulación del heptámero a ω = 1.01

H

5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

pH m

edid

o en

la titul

ació

n

pH reliminarp

Gráfica 47 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación del nonámero a ω = 0.01

3 ,5 4 ,0 4 ,5 5 ,0 5 ,5 6 ,0 6 ,5 7 ,04 ,5

5 ,0

5 ,5

6 ,0

6 ,5

7 ,0

pH m

edid

o en

la t

itula

ción

p H p re lim in a r


ANEXO - 73 –

2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.154.2

4.3

4.4

4.5

4.6

4.7

4.8

pH m

edido en

la titulación

pH preliminar


4.75 4.80 4.85 4.90 4.95 5.00 5.05

4.0

4.2

4.4

4.6

4.8

5.0

pH m

edido en

la titulac

ión

pH preliminar

Gráfica 50 Correlación del pH preliminar con el pH medido en la titulación de la 2’-desoxicitidina a ω = 0.01

4.6

5.87 5.88 5.89 5.90 5.91

3.9

4.0

4.1

4.2

4.3

4.4

4.5

pH m

edido

en la

titulación

pH preliminar


ANEXO - 74 –

5,52 5,53 5,54 5,55 5,56 5,57 5,58 5,59 5,60 5,61

4,4

4,5

4,6

4,7

4,8

4,9

5,0

5,1

pH m

edid

o en

la t

itul

ació

n

pH prelim inar


La Tabla 12 compara los ajustes para convertir de (pKa)preliminar a (pKa)final, que se obtuvieron con los dos métodos alternativos antes señalados.

Tabla 12 Comparación de las correcciones del pKa basadas en dos tipos diferentes de evaluación

matemática

ω= 0.01

ω= 0.11

ω= 1.01

-1.22 -1.33 -1.74 Pentámero -1.19 -1.36 -1.63

+0.05 +0.80 -1.76 Heptámero +0.12 +0.91 -1.68

-0.43 +0.85 +1.34 Nonámero -0.36 +1.08 +1.21

-0.66 -1.82 -0.85 2’-desoxicitidina -0.69 -1.82 -1.05

Los ajustes calculados a partir de la interpolación o extrapolación lineal local, basado en los dos puntos más cercanos al punto medio de la transición, se denotan en negritas. La evaluación de esta tabla comparativa, muestra que en muchos casos, los ajustes calculados son similares para los dos métodos. Esto se da en los casos donde, en el gráfico del ajuste lineal con varios puntos, la recta de ajuste pasa cercana a los dos puntos utilizados en el ajuste por dos puntos (que por lo general, son a preliminar na diferencia notable entre los dos tipos de a ste, por ejemplo: pentámero a ω = 1.01, heptámero a ω =0.11 y ω = 1.01, nonámero a tres fuerzas iónicas diferentes, 2’-desoxicitidina a ω = 1.01. En estos, se observa que, localmente en los alrededores del punto medio de transición, la recta de ajuste que considera todos los puntos de

los puntos con menor valor de (pK ) ). Otros casos muestran uju

ANEXO - 75 –

pH medidos durante la titulación del oligómero está lejana a la línea que une los dos puntos coordenados locales. Lo cual se debe a que la línea de ajuste toma en cuenta la correlación para todos los puntos de (pH)medido a lo largo del experimento. Sin embargo, la correlación entre (pH)preliminar y (pH)medido no es necesariamente lineal sobre todo este intervalo, y si se hubiera deseado establecer esta correlación amplia, se hubieran hecho mediciones puntuales a todo lo largo del experimento (es decir, se hubiera prescindido de todo arreglo entre de (pH)preliminar y (pH)medido, y se hubiera efectuado todo el experimento como una determinación de absorbancias en función del (pH)medido). Esto no se pudo hacer, y en estas circunstancias la conversión de (pKa)preliminar a (pKa)final se debe hacer considerando sólo las correlaciones entre (pH)preliminar y (pH)medido para los puntos más cercanos a la transición, eliminando un efecto indebido de los valores de puntos lejanos de la transición. Es por estas consideraciones que en el presente trabajo el ajuste de (pKa)prelimi ar a (pKa)final se llevó a

ntos más cercanos al unto medio de transición, con los ajustes que toman en cuenta sólo los tres puntos

con los v bajos de (pK ) gráfica de (pH) vs. (pH) r. La

abla 13 Comparación cciones del amento en dos en interpolación entre los más cercan edio de tra asados

en el ajuste lineal de los tres puntos con los valores más bajos de (pH)preliminar

ω= 0.01 ω= 0.11 = 1.01

n

cabo mediante la interpolación entre puntos cercanos a la transición.

Cabe añadir que, como es de esperar, una mejor congruencia se logra al comparar los ajustes obtenidos de la interpolación lineal de los dos pup

alores más a preliminar medido prelimina

Tabla 13 compara estos ajustes. en la

T de las corre

dos puntos pKa con fundos al punto m

ajustes basansición, o b

ω

-1.22 -1.33 -1.74 Pentámero -1.21 -1.29 .74 -1

+0.05 +0.80 -1.76 Heptámero +0.12 +0.80 .75 -1

-0.43 +0.85 +1.34Nonámero -0.37 +0.91 +1.31

-0.66 -1.82 -0.85 2’-desoxicitidina -0.66 -1.82 -0.81

En comparación con la tabla 12 se nota que hay una mejor congruencia entre las correcciones derivadas de los ajustes basados en tres puntos coordenados entre (pH)preliminar y (pH)medido y las correcciones derivadas de interpolación entre los puntos más cercanos en la gráfica de (pH)medido vs. (pH)preliminar , estas últimas identificadas por negritas en la tabla 13. De todas maneras en la tabla 9 de esta tesis los datos de (pKa)final fueron basados en este último abordamiento como el más confiable experimentalmente.

“PROTONACIÓN DE LA BASE CITOSINA EN OLIGONUCLEÓTIDOS”

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