Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente...

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Tesis de Posgrado

Desarrollo de oligonucleótidosDesarrollo de oligonucleótidosmodificados químicamente conmodificados químicamente conpotencial aplicación en terapiapotencial aplicación en terapia

génicagénica

Gallo, Mariana

2002

Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires

Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.

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Cita tipo APA:Gallo, Mariana. (2002). Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente con potencialaplicación en terapia génica. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de BuenosAires. http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3470_Gallo.pdf

Cita tipo Chicago:Gallo, Mariana. "Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente con potencialaplicación en terapia génica". Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales.Universidad de Buenos Aires. 2002.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_3470_Gallo.pdf

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Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamentecon potencial aplicación en terapia génica

Tesis presentada para optar por el titulo de Doctor de la Universidad deBuenos Aires

Autora: Mariana GalloDirector: Dr. Adolfo iribarren

Instituto de Investigaciones en Ingenieria Genética y Biologia Molecular(INGEBl-CONICET)

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesDepartamento de Química Biológica

2002

Development of chemically modified oligonucleotides withpotential application in gene therapy

Author: Mariana GalloDirector: Dr. Adolfo lribarren

Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular(lNGEBI-CONICET)

Universidad de Buenos Aires

Facultad de Ciencias Exactas y NaturalesDepartamento de Química Biológica

2002

“To make an end is to make a beginning. The end is where we start from.”

El inspector Morse

“The cat only grinned when it saw Alice. It looked good-natured, she thought: stillit had very long claws and great teeth, so she felt that it ought to be treated withrespect.‘Chesire Puss', she began, rather timidly, as she went on. 'Would you tell me,please, which way I ought to go from here?’That depends a good deal on where you want to get to' said the Cat.'I don' t know much care where' said Alice.'Then it doesn't matter which way you go' said the Cat.‘- so long as I get somewhere, ' Alice added as an explanation.'Oh, you' re sure to do that,’ said the Cat, 'if you only walk long enough. "’

Alice 's adventures in WonderlandLewis Carroll

Ya definido el procedimiento de Wilkins, falta examinar un problema de imposibleo dificil postergación: el valor de la tabla cuadragesimal que es base del idioma.Consideremos la octava categoría, la de las piedras. Wilkins las divide en comunes(pedemal, cascajo, pizarra), módicas (mármol, ámbar, coral), preciosas (perla,ópalo), transparentes (amatista, zafiro) e insolubles (hulla greda y arsénico). Casitan alarmante como la octava, es la novena categoría. Esta nos revela que losmetales pueden ser imperfectos (bermellón, azogue), artificiales (bronce, latón),recrementicios (limaduras, herrumbre) y naturales (oro, estaño, cobre). La bellezafigura en la categoría decimosexta; es un pez vivíparo, oblongo. Esasambigüedades, redundancias y deficiencias recuerdan las que el doctor Franz Kuhnatribuye a cierta enciclopedia china que se titula ‘Emporio celestial deconocimientos benévolos‘. En sus remotas paginas esta escrito que los animales sedividen en (a) pertenecientes al Emperador, (b) embalsamados, (c) amaestrados, (d)lechones, (e) sirenas, (t) fabulosos, (g) perros sueltos, (h) incluidos en estaclasificación, (i) que se agitan como locos, (j) innumerables, (k) dibujados con unpincel finísimo de pelo de camello, (l) etcétera, (rn) que acaban de romper el jarrón,(n) que de lejos parecen moscas. El Instituto Bibliográfico de Bruselas tambiénejerce el caos: ha parcelado el universo en 1000 subdivisiones, de las cuales la 262corresponde al Papa; la 282, a la Iglesia Católica Romana; la 263, al Día del Señor;

la 268, a las escuelas dominicales; la 298, al mormonismo, y la 294, albrahmanismo, budismo, sintoísmo y taoísmo. No rehúsa las subdivisionesheterogéneas, verbigracia, la 179: "Crueldad con lOsanimales. Protección de losanimales. El “dueloy el suicidio desde el punto de vista de la moral. Vicios ydefectos van'os. Virtudes y cualidades varias".

"El idioma analítico de John Wilkins"en Otras Inquisiciones.Jorge Luis Borges.

Resumen

Dentro del campo de la Terapia Génica, el concepto de oligonucleótidos como

potenciales agentes terapéuticos ha ganado credibilidad y atención. El fundamento de la

estrategia antisentido consiste en inhibir selectivamente la expresión de un determinado gen,

impidiendo asi la producción de una dada proteína mediante la acción de un oligonucleótido de

secuencia complementaria al ARN mensajero que codifica para esa proteina. Dentro de este

enfoque, las ribozimas, moléculas de ARN con una secuencia de bases y una estructura

tridimensional definidas y que presentan actividad enzimática, aparecen como una altemativa

interesante, ya que permiten incorporar a la acción antisentido de los oligonucleótidos su

actividad catalitica.

Debido a que los oligonucleótidos son degradados rápidamente por nucleasas

presentes tanto en suero como intracelularrnente, surge Ia necesidad de modificados

químicamente, Iocual permite obtener drogas con tiempos de vida medio adecuados.

En el caso particular de las ribozimas y otros análogos de ARN, es importante que las

modificaciones introducidas no afecten los requerimientos estructurales para la actividad o

función particular de estas moléculas. Entre las diversas modificaciones desarrolladas, las

modificaciones en Ia posición 2’ demostraron ser de utilidad. La presencia del hidroxilo-2’probó

ser de suma importancia en determinadas posiciones para el correcto plegamiento de las

moléculas de ARN. Debido a que ninguna de las modificaciones desarrolladas en la posición 2'

mantiene esta función, la utilización de una nueva generación de oligonucleótidos modificados

en la posición 2' del azúcar que conserven esta función resulta atractiva y prometedora para el

diseño de ribozimas estables en medios biológicos. Aquí se propone, por lo tanto, una nueva

clase de nucleótidos modificados, los 2'—C-metilnucleótidos,potencialmente útiles para ser

incorporados en determinadas posiciones de análogos de ARN resistentes a Ia degradación por

nucleasas. Se espera que cuando un 2'—C-metilnucleótidosustituya un n'bonucleótido particular

proveerá un hidroxilo-2'disponible para reproducir las interacciones terciarias del ARN; mientras

que la presencia del metilo,brindará resistencia a la degradación mediada por nucleasas.

En este trabajo, se sintetizó la 2'—C-metiluridinasiguiendo una ruta estereoselectiva, así

como también, la fosforamidita adecuada para la sintesis automatizada de oligonucleótidos,

"incluyendo la protección regioselectiva del grupo hidroxilo-Z'. Asimismo, se realizó un estudio

confonnacional de la 2'-C-metilur1'dina en solución por RMN y se comparó con resultados

.obtenidos por cálculos computacionales. Los resultados mostrarón que Ia conformación

preferida de este nucleósido es Ia misma que la de Ia un'dina natural, con Io cual ambas

moléculas posicionarían el hidroxilo-2' con Ia misma orientación. Con el tin de ensayar la

hipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación, se eligió como modelo biológico la

ribozima cabeza de martillo. Un estudio preliminar usando modelado molecular sugirió que la

introducción de estos monómeros en las posiciones de esta ribozima para las cuales se había

detectado que sus hidroxilos-2' tenían interacciones de orden terciario no parecía afectar la

conformación global de la ribozima, excepto en una posición particular. La 2'-C—metiluridinafue,

entonces, introducida en ribozimas cabeza de martillo dirigidas contra Ia región 5'-|ider/gag del

virus HIV-1en las posiciones de la un'dina del core catalítico cuyos hidroxilos-2' demostraron ser

importantes. Las ribozimas resultaron ser activas y tener una incrementada estabilidad frente a

nucleasas. Tambien se midió Ia afinidad por hebras complementarias de DNA y de RNA de

oligodesoxinucleótidos conteniendo un'dina, la nueva modificación o la (2’S)-2'-desoxi-2’-C

metiluridina.

Palabras clave: análogos de ARN, estrategia antisentído, ribozima cabeza de martillo, 2'-C

metilnuc/eótidos, resistencia a nucleasas.

VI

Abstract

Oligonucleotides have gained credibility and attention as potential therapeutic agents

based on the gene therapy principle. The fundament of the antisense strategy consists ¡n the

selective inhibition of the gene expression by means of an oligonucleotide canying a

complementary sequence to that of the mRNA that codifies for the target protein. In particular,

ribozymes, RNA molecules with a defined sequence and three-dimensional structure that show

enzymatic activity; appear as an interesting alternative, due to the fact that they combine the

antisense action with a catalytic activity.

Since oligonucleotides are rapidly degraded by nucleases present both, in serum and

intracellularly, it is mandatory to chemically modify them in order to obtain drugs with proper half

life times.

In the case of ribozymes and other RNA analogues, additional structural requirements

must be taken into account in order to preserve activity or a particular function. Among the

modifications developed so far, those involving the 2'-position proved to be useful, but they lack

the 2'-hydroxy| group. The presence of this function showed to be of great importance for the

correct folding of RNAmolecules. Therefore, the development of a new generation of 2'-modified

oligonucleotides canying the 2'-hydroxy| is a promising alternative for the design of resistant

ribozymes.

Having in mind this goal, a new kind of analogues is proposed in this work, the 2'-C

methylnucleotides. They are expected to be potentially useful for generating RNA mimics

resistant to the degradation by nucleases. This assumption is based on the hypothesis that when

a 2'-C-methylnucleotide substitutes a particular ribonucleotide, it willprovide a 2'-hydroxyl group

available for reproducing RNA tertiary interactions; and additionally, the presence of the 2’

methyl group willbring resistance to degradation mediated by nucleases.

The 2'-C-methy|uridine was syntehsized by a stereoselective strategy, the 2'-hydroxyl

group was regioselectively protected and the corresponding phosphoramidite for solid phase

synthesis of oligonucleotides was prepared. ln addition, a confonnational study of the 2'-C

methyluridine in solution was carried out by RMN techniques and these data were compared

VlI

V|l|

with those obtained by computational calculations. The results showed that the preferred sugar

confonnation of this nucleoside is the same than the one adopted by the natural uridvine,and

therefore, it is expected that both molecules wiIIposition the 2'-hydroy| group with the same

orientation. With the aim of testing our hypothesis, the new monomer was introduced in the

catalytic core of a hammerhead n'bozyme ¡n those positions where the 2'-hydroxyl group showed

to be important for the activity. The n'bozymes were targeted against the 5'-Iider/gag region of the

HIV-1. The modified n'bozymes were active in vitro and displayed an increased resistance to

nucleases. The affinity for RNA and DNA complementary sequences of oligonucleotides

containing the new modification and the (2'S)-2'deoxy-2'-C-methylurid¡ne is also reported.

Keywords: RNA analogues, antisense strategy, hammerhead n'bozyme, 2'-C-methylnucleotides,

resistance to nucleases

AgradecimientosQuisiera agradecer en esta vez a quienes me ayudaron de una forma u otra a realizar

este trabajo,"A mis viejos por su apoyo absolutamente incondicional y por quererme.A Adolfo,con quien crecí profesional y humanamente durante estos años, por ayudarme

cuando lo necesite y por la paciencia y comprensión (a veces, infinitas). Por ser, sobre todo, unagran y querida persona.

A Pauli, porque hizo que los primeros años fueran los más gratos, por ser unacompañera super solidaria y divertida y porque es una gran amiga.

A Ceci, con quien sufrimos por el HPLC y el sintetizador, día a día. Por su calmapaciencia.

A Javier, por sobre todo por la paciencia con la computadora los últimos días.A Rodrigo, por el buen humor y buena disposición. A Lourdes.A Eli, por las reacciones enzimáticas con mis moléculas y por Ia simpatía, a Silvia, por la

buena onda de siempre. A Luis, a Jorge, a los Alejandros y a los quilmeños todos.A Patricia.

A Eli Jares, por prestamos su computadora para el estudio computacional de laribozima.

A Edith y a Daniel, por los espectros y la hospitalidad y el apoyo.A Phillippe, un poco a pesar suyo.A Georg, por darme la oportunidad de trabajar con mis ribozimas en su laboratorio. Por

sus vinos caseros y su simpatía.A Rosel, por sus buenos consejos la amistad, y por el viaje a Berlín.A Ann, Markus y Winnie, por la cordialidad y el cariño en el frío invierno germano.A Daniel, sin cuya ayuda en arreglar el sintetizador hubiera sido imposible terminar la

tesis.

A Juli, en este caso, por los programas de modelado, los papers, la lectura instructivadel capítulo 5.

A Edoardo, por los meltings.A Juan, por los siempre alegres encuentros en el Instituto.A Isa, por el pollo con batatas y las correcciones, y la ayuda siempre que fue necesario.A Kariny a Diana por la compañía a altas horas de la noche y por estar siempre.Al209, por la impresora y Ia buena predisposición siempre.A Mari, por escuchanne y animarrne siempre. A la gente de su laboratorio, por la

centrífuga, los holders y por escuchar mis vanos lamentos.A Marta, por el cariño. estando lejos y estando cerca.A la toda gente de la secretaría, por el socorro en las situaciones más impensadas.AIresto de los becarios y compañeros del lNGEBI,por hacer que el trabajo de todos los

días sea más ameno.

A Leo, Mari, Francisco y Gladis (el ángel del café de las mañanas).A mis compañeros de Reg. Metabólica, por la paciencia y comprensión esta semana.

Ahora quisiera, en esta oportunidad, aunque no estoy segura que sea del todoadecuado, agradecer a la gente que quiero más allá del trabajo, de la ciencia (o más acá,mejor). Porque me parece que no hay muchas otras oportunidades explícitas de agradecer a laspersonas que hacen que la vida de uno (mía) sea mejor, más divertida, más placentera,justamente por eso. Y porque las quiero, con algún que otro motivo que no deja de ser unaexcusa atrás de Iofundamental, que es cariño, amistad, amor, ahi voy.

A Herr Pochitem y a Sweety por ser los mejores progenitores que me pudieron tocar. ABrother, por estar siempre dispuesto a ayudarme y por ser creativo y divertido. A Monk por darlesiempre para adelante (¿como hace? Me pregunto). A Lady, que me agarra. Por ser mi familia ypor estar siempre juntos. Al abuelo que siempre me ayudó con mi casa y con el resto de lascosas.

A Granny que siempre está conmigo, aún ya no estando.A Lilushka, porque vivircon ella, hace que llegara casa sea más lindo, porque es una

alegría llegar y que este en casa o que ella llegue yo estando, por los desayunos y tardes de solo lluvia, por las pelis juntas, porque es paciente y soporta mi caos infernal, interior y exterior.Porque me encanta que vivamos juntas.

A Juli, por ser una amiga incondicional, porque el cariño que me transmite es infinito,porque me cuida y me escucha y entiende. Porque no hay palabras.

A Georgi, por la dulzura, por la comprensión sin limites, por los momentos vividos.A Man, por el entusiasmo y la alegria, por el envidiable optimismo del cual me es

imposible, lamentablemente, contagianne. Por la fidelidad y lealtad sin límites.A Vale, por los libros, por la ayuda, Ia confianza incomprensible.A Diani por estar siempre conmigo durante la carrera y siempre, por ser una gran

amiga.A Karin, porque no se puede decir con palabras, por ser una amiga de fierro (aunque

ella es estrictamente de carne y hueso).A Astrid por la risa, por la risa contagiosa, porque la extraño.A Isa, por compartir los cines, las cervezas, las charlas, algún nivel de demencia.A Sebas, por el gracioso optimismo pesimista que, de vez en cuando, profesa, por ser

un gran amigo. Por los almuerzos y los cines en todos lados y tiempos.A Pablososo por ser más que bueno.A Astrid y a Galo, por los vinos en Paris yen cualquier parte. A Ia familia que crece.A Pauli, por ser una amiga y por compartir esa sensación de los domingos.A Nano, un pn'mer compañero de cajón inolvidable, a Mati (que es rebueno) y a Axel.A Ale, que es un gran tipo, en cualquier circunstancia.A Ceci, por las vacaciones en Córdoba y (¿por qué va a ser...?), por los alfajorcitos, y

por las comdas juntas.A German, por ser amigos de los 30 en adelante. Por las charlas y los DVDsque nunca

se concretan.

A Javi, porque es mi vecino y me pone contenta, porque espero un guiso de lentejas. ACarloncha, que no sé por qué le doy n'sa.

A Tincho, por las corridas en Palermo y en la vida.A Sigman por los mails espiralados, los ascendentes y los descententes.A Juan por ayudarme en el camino del Samurai, siempre.

XI

A Marielita,que es mi prima más cercana aún estando lejos.A Gaby, a quien a pesar de todas las distancias sigo queriendo.AINegro por su incacabable ironía.A Martín, por las incertidumbres, que no se develan.A Man’n,por ser de las que nos pasan cosas.A Marielita, por el apoyo y por pensar en mi bienestar.A Juano, que toca tan lindo la guitarra.A Hieronimus, por las correcciones de estilo y los paseos en moto.A Horacio y a Gise.A Pablo por las cenas.A Pauli, porque más que compañera de labo es una gran, gran amiga.A Diego, que a esta altura ha de ser mi amigo más viejo y yo su amiga más desafinada.A Marian por todos estos martes de cneiclub, por el empleo del tiempo, que nos hicieron

amigos. A Flavia por Ia receta de la torta de queso. A Dari.A Mauricio, por la eterna picada. A Marto.A Lu, por la amistad reencontrada, y redescubierta.A Noe por las películas que no vimos juntas y a Amaicha, por las que veremos y por las

A Ale y a Chocha, a Greg y a Vale. A Esteban, porque porfin nos encontremos másseguido. A Rosa, por escuchanne, aunque sea su trabajo. A Tommy color y flia. A Gaby y flia. ANormi. A Sigmund y a su fiel amiga Loloshka.

A los objetos inanimados: gracias por el fuego, en algún punto porque con todo secrece, es inevitable, a los libros y a las peliculas, por dejar a uno evadirse y encontrarse.

Gracias a Lea por el epígrafe de Borges y porque no puedo dejar de quererio.

IIndice

Abreviaturas y Símbolos

Parte A. Introducción.

Capítqu 1. Introducción.1.1- Funciones biológicas y aplicaciones de los ácidos nucleicos ................ ..1.2- Acidos nucleicos. Estructuras de sus componentes1.3- Estructuras de doble hélices

1_4-Síntesis de nlignnurlnótidnq1.4.1- Síntesis de ADN

1.4.1.1- Perspectiva histórica1.4.1.2- Síntesis automatizada de ADN

1.4.2- Sintesis en fase sólida de ARN

1.5- Oligonucleótidos modificados1.5.1-Estrategia " “un

1.5.1.1- Modificaciones en el esqueleto fosfato ................................ ..1.5.1.2- Modificaciones en el azúcar

1.5.1.3- Avances en Ia terapia antisentido1.6- Ribozimas

1.6.1- Ribozima cabeza de martillo1.6.1 .1- El mecanismo de hidrólisis de la ribozima cabeza de

martillo

1.6.1 .2- La ribozima cabeza de martillo como potencialherramienta en terapia génica

1.6.1.3- Ensayos clinicos que involucran ribozimas como agentesternpól ¡tirnq

1.7- Alcance de la Tesis

11

15

16

1618

31

40454749

52

54

55

5960

XII

Parte B. Parte experimental.

Capitqu 2. Parte experimental.2 .. . . .

2.1.1- Reactivos

2.1.2- Cromatografias y material para purificación....................................... ..2.1 .3- Enzimas

2.1.4- Radioisótopos2,1,5- Rrrffpm

2.1 .6- Cultivo de células

2.2- Metodos generales y m1 'r ' ‘ 2.3- Metodologia

2.3.1- Síntesis de los monómeros

2.3.2- Síntesis y purificación de oligonucléotidos ......................................... ..2.3.2.1- Síntesis en fase sólida automatizada de oligonculéotidos.........2.3.2.2- Ensayo del catión DMTr2.3.2.3- Análisis y purificación de oligonucleótidos por HPLC .............. ..2.3.2.4- Síntesis y purificación de oligodesoxinucleótidos y

nlignrrihnnr rrlnr’rtidne

2.3.3- Marcado de los oligonucléotidos con 32Pen 5' ................................... ..2.3.4- Ensayo RNasa A2.3.5- Purificación de las ribozimas por gel2.3.6- Estudios de hibridización de oligonucleótidos modificados ................ ..2.3.7- Estudio de la actividad ¡n vitrode las ribozimas ................................. ..

2.3.8- Cultivo y Iisado de células2.3.8- Estudio de Ia estabilidad de las ribozimas en distintos fluidos ........... ..

Parte C. Resultados y discusión.

Capitulo 3. Estudio computacional.3.1- Objetivos3.2- Fundamento del análisis computacional3.3- P J ns

3.4- Discusión3.5- l" “ 4 ns

Capítulo 4. Sintesis de los monómeros.4.1- Intrndrrrriñn4.2- Sintesis de Ia 2'-C—metiluridinamodificada

4.3- Preparación de la fosforamidita de la 2'-C4.4- Avances en Ia preparación de otros 2'-C4.5- Conclusión

L'l 'J .¡nn

lpñqidnq

103103104112113

115115119124128

XIII

Capítulo 5. Estudio conformacional.5.1- Objetivos5.2- Análisis conformacional por RMN

5.2.1- Constantes de acoplamiento5.2.2- NOE5.2.3- Discusión

5.3- Comparación con estudio computacional y estructura de rayos X........ ..5.3.1- Métodos semiempin‘cos5.3.2- Método ab ¡nitio5_3_3-Diqrnqión

5.4- Conclusión general

Capitulo 6. Síntesis oligonucleótidos.6_1- Intrnrlur‘r‘ión

6.2- Síntesis automática delos oligonucleótidos por el método de lasfosforamiditas

6.3- Determinación de la eficiencia de acoplamiento ................................... ..6.4- Síntesis y purificaciónde oligodesoxinucleótian6.5- Preparación de oligodesoxinucleótidos conteniendo la

(2'S)-2’-desoxi-2'-C- “nina6.6- Síntesis de nlignrrihnnurlnñtidnc6.7- Síntesis de oligodesoxinucleótidos conteniendo un'dina ....................... ..6.8- Síntesis de 2'-O-metiloligombonucleótidos6.9- Síntesis de oligodesoxinucleótidos conteniendo la

2'-C. "' “¡inn6.10- Sintesis de las ribozimas modificadas6.11- Conclusión

Capítulo 7. Estudios de hibridización de oligonculéotidosmodificados

7.1- Objetivos7.2- Resultados7,3- nicmciñn7.4- Conclusión

Capitulo 8. Actividad y estabilidad de las ribozimasmodificadas.

8.1- Introducción8.2- Diseño de las ribozimas modificadas8.3- Estudios de actividad ¡n vitrode las ribozimas

129129129134136138138141

146147

149

149152153

156157165166

167178186

189190194199

201201204

XlV

8.4- Estabilidad de las n'bozimas en diferentes fluidos biológicos ............... ..8.5- nicriición8.6- Conclusión

Parte D. Conclusiones y perspectivas.

Capítulo 9. Conclusiones generales y perspectivas.9.1- Conclusiones generales9.2- Pampnrtlvnc

Apéndices.

Apéndice I. Conformación de nucleósidos y nucleótidos.A.I.1-Ángulos de torsión y sus rangos. Definición de ángulos

de torsión en (nlign)nurlpótidne.A.I.2-Tecnologias para elucidación estructural de ácidos

nucleicos y sus PñmpnnnntneA.I.3-Plegamiento del azúcarA.I.4-Orientación de Ia baseA.I.5- Orientación alrededor del enlace C4‘-CS’

Apéndice ll.Ciclos del sintetizador automáticoTabla A.II.1-Ciclo de síntesis de ADNen escala 0.2 umol.......................... ..Tabla A.II.2-Ciclo de síntesis de ARTNen escala 0.2 umol........................ ..Tabla A.II.3-Procedimiento automático para la finalización de

la sintesis de un oligodesoxinucleótidoTabla A.II.4-Procedimiento automático para Ia finalización de

la síntesis de un nlignrrihnnnrlnñtidn

Apéndice lll.Espectros de RMN.A.III.1-2'-C-Metiluridina (compuesto 8)

A.III.1.1-‘3C

A.III.1.2-1H

A.III.2-2'-O-TetrahidropiraniI-5'-O(4.4’-dimetoxitr¡til)-2’-C-metiluridina3'-(2-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita) (compuesto 13) ................................

A.III.2.1-13C

A.IIl.2.2-1H

A.III.2.3-31P

......210213215

217222

225

228228232233

235237

239

240

243243244

244243

246

XV

Abreviaturas y Simbolos - 1

Abreviaturas y símbolos

AcOEtTEAA

ACN

AcOH

ADN

DCA

EDTA

2'-O-MeARNTsOHARN

TCA

aq.AdeA

ADPATP

AC20anh.

aPAr

BPBz

PBSC

Cit

CDC|3Li

cCPGc.c.d.HPLC

CPM

acetato de etiloacetato de trietilamonioacetonitriloácido acéticoácido desoxirribonucleicoácido dicloroacéticoácido etilendiaminotetracéticoácido 2'-O-metilribonuc|eico

ácido p-toluensulfónicoácido ribonucleicoácido tn‘cloroacéticoacuosoadeninaadenosinaadenosina S’oifosfatoadenosina 5’-trifosfatoanhídrido acéticoanhidro/a

antiperiplanaran'lo

azul de bromofenolbencilobuffer fosfato salinocitidinacitosinaclorofonno deuteradocoeficientes cinéticoconcentrado

controlled-pore-glass (esferas de vidriode poro controlado)cromatografía en placa delgadacromatografía líquida de alta resolucióncuentas por millón

Abreviaturas y Simbo os - 2

DABCO 1,4-diazabiciclo[2,2,2]octanoDCE dicloroetanoDCM diclorometano

DEPC dietil pirocarbonatoDHP dihidropiranoDMSO dimetilsulfóxido

DMSO-da dimetilsulfóxido perdeuteradoDMTr dimetoxitritllo

EtzO dietil éter

DMAP 4-dimetilaminopin‘dinaDMF dimetilfonnamida

DTT 1,4-ditiotreitoldd doble dobleted doblete

dt dobletripleteNOE efecto nuclear Overhauser

eq equivalente/sEtOH etanol

EP éter de petróleoPh feniloTBAF fluoruro de tretabutilamonio

Guan guanlnaG guanosinaMs mesitiloUMe 2'-C-meti|un'dinaMeOH metanol

m multipleten. d. no determinadoMNO óxido de N-metilmorfolina

pb pares de basesppm partes por millónPy pin'dinaPM peso molecularRF relación de frente

RMN resonancia magnética nuclearrpm revoluciones por minutoSFB suero fetal bovino

s singuletesa singulete anchos sólidosc sinclinalss solución saturadaTBDMS tert-butil dimetilsililo

Abreviaturas y Simbolos - 3

THF tetrahidrofurano

THP tetrahidropiraniloTIPDS 1,1,3,3-tetraisopropildisiloxanoTEMED N,N,N', ïtetrametjlendiamina

t1/2 tiempo de vida medioT timidinaTim timinaTs tosiloTEA tn'etilaminaTMS trimetilsilano

t tn'pleteTBE tn's borato EDTA

Tn's tn'sltn's(hidroximetil)aminometano]UV ultra violeta

ODs unidades de densidad ópticaUra uraciloU uridinaXC xileno cianol

Pan‘e A

Introducción

Introduccion. Capítqu 1 —5

Capítulo 1

Introducción

1.1- Funciones biológicas y aplicaciones de los ácidosnucleicos.

Nuestra comprensión de las bases de Ia biología molecular fue profundamente

enriquecida a partir de dos importantes descubrimientos. Primero, el rol genético del ADN en

organismos vivientes fue reportado en 1944 por Avery, McLeod y McCarty.1 Ellos descubrieron

que una cepa de pneumococcus no virulenta podía ser transformada irreversiblemente en una

especie virulenta por tratamiento con una muestra de ADN purificado a partir de una cepa de

bacterias virulentas. Con este experimento los autores concluyeron que el responsable de Ia

actividad transformadora era el ADN y se puso en evidencia cuán inadecuados eran los

conocimientos que se tenían en ese momento sobre la quimica y la estructura de los ácidos

nucleicos para explicar ese descubrimiento. Como resultado, una gran masa de científicos

dirigió su atención al ADN y pronto se vio que para que un progreso real fuera posible era

necesario primero establecer las bases químicas de la naturaleza de los ácidos nucleicos.

Segundo, Ia estructura de doble hélice complementaria del ADN fue eIucidada en 1953 por

Watson y Crick2y el mecanismo de replicación de las moléculas de ADN fue inmediatamente

reconocido. Estos descubrimientos nos permitieron entender cómo Ia información genética es

1Avery, O. T.; McLeod, C. M.; McCarty, M. J. Exp. Med. 1944, 79, 137-158.

introduccion. Capítulo i - 6

almacenada y transmitida de una generación a la siguiente a través de Ia sintesis de una hebra

complementaria de cada una de las hebras progenitoras.

En cuanto al ARN, Ia mayoría de sus diferentes tipos y sus respectivas funciones

fueron comprendidos en los ’503 y 60’s. Las funciones más representativas del ARN involucran

el ARN mensajero, el ARN de transferencia y el ARN ribosomal. EI ARN mensajero (ARNm) es

el producto de la transcripción del ADNy es el transportador de Ia información genética, que es

traducida en la sintesis de proteínas. EI ARN ribosomal (ARNr)está complejado con proteínas

para formar ribosomas, las organelas donde ocurre Ia síntesis de proteínas. EI ARN de

transferencia (ARNt) sirve como molécula adaptadora entre los aminoácidos y el código

genético de tripletes en eI ARNm. Sin embargo, según se ha aprendido más recientemente, el

ARN desempeña roles más amplios e inesperados. El ARN prima en Ia sintesis de ADN

durante la replicación. EI ARN puede almacenar Ia información genética en virus y retrovirus, y

copiarse a ADN por la transcnptasa reversa. Complejos de ARN con proteinas, llamados

ribonucleoproteínas nucleares pequeñas, se descubrió que procesan secuencias intrónicas de

transcriptos del ADN genómico.3 Más aún, el ARN puede tener actividad enzimática.4 Asi, el

ARN parece ser único entre todas las otras biomoléculas porque tiene la posibilidad de

combinar el geno - y el fenotipo en una sola molécula. Esta versatilidad subrayó la importancia

evolutiva del ARN y dio lugar a la hipótesis de un mundo primitivo basado en el ARN. En ese

sentido, es relevante la demostración que el ARN es capaz de catalizar su propia

polimen'zación. 5

Por otra parte, los monómeros de los ácidos nucleicos, nucleósidos y nucleótidos,

tienen funciones biológicas diversas. Algunas de éstas se conocen desde hace muchos años,

por ejemplo, el ATP que funciona como moneda energética de las células, y Ia adenosina que

combinada con cofactores forma los pares de nicotinamida adenina dinucleótidos (NAD y

2 Watson, J. D.; Crick, F. H. C. Nature 1953, 171, 737-738.

3 Sharp, P. A. Science 1987, 235, 766-771.4 Cech. T. R. Science 1987, 236, 1532-1539.

5 Gesteland, R. F. y Atkins, J. F. The RNA Wor1d1998, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor. New York.

Introducción. Capitulo 1 - 7

NADH)y de fosfato de nicotinamida adenina dinucleótidos (NADP y NADPH) que actúan como

coenzimas en reacciones redox. Más recientemente, Ia adenosina cíclica monofosfato (AMPc)y

la guanosina cíclica monofosfato (GMPc)demostraron ser segundos mensajeros cruciales en el

controlde una amplia variedad de procesos celulares.

Los progresos en el desarrollo de nuevas metodologías y técnicas han permitido una

mejor comprensión de la base molecular de las actividades biológicas de los ácidos nucleicos.

Entre estos métodos es posible destacar el desarrollo de:

nuevas técnicas de electroforesis para analizar secuencias, tamaño y

estructura de los ácidos nucleicos y sus complejos con proteínas;

técnicas de RMN multidimensionales para determinar estructuras de

moléculas en solución y métodos más precisos de rayos X para la elucidación de estructuras

cristalinas;

métodos de computación para la acumulación y análisis de datos de una

gran variedad de ácidos nucleicos que permiten el estudio de secuencias y el reconocimiento

de regularidades que dan lugar a generalizaciones estructurales, han señalado similitudes

entre moléculas relacionadas funcional y evolutivamente y han sugerido estructuras comunes

en ARNs con funciones particulares;

desarrollo de bases de datos tennodinámicos para la predicción de

estructuras secundarias y terciarias que son cada vez más confiables;

métodos para preparar eficientemente ácidos nucleicos sintéticos o purificar

los naturalmente producidos en cantidades suficientes para estudios físicos y aplicaciones in

vivo;

síntesis de secuencias azarosas (random) y el diseño de procesos de

selección eficientes han dado lugar a la identificación de moléculas con propiedades

particulares de unión o funciones catalíticas novedosas,

Ia secuenciación de ADN, la construcción y clonado de genes y la

tecnología de ADNrecombinante han colaborado para Ia integración de Ia genética molecular y

Ia quimica de proteínas. Así como también, la reacción en cadena de la polimerasa que permite

Introducción. Capítulo l - 8

ampliar secuencias definidas de ácidos nucleicos de fonna definida y eficiente.

Estas nuevas herramientas, han posibilitado avances en la comprensión de los ácidos

nucleicos no sólo para el mejor entendimiento de sus funciones biológicas, sino que también

han expandido los usos de estas moléculas en biologia molecular, terapia y diagnóstico y

abierto otros campos de investigación. Entre ellos, se pueden destacar el desarrollo de

bibliotecas combinatorias para aislar e identificar secuencias de ARN e, incluso de ADN, para

llevar a cabo reacciones artificiales o unirse a sustratos inusuales; el uso de ácidos nucleicos y

sus análogos con fines terapéuticos y de diagnóstico; Ia generación de microchips que se

utilizan para secuenciación, diagnóstico y validación de targets, entre otros usos. Finalmente,

en los últimos años ha cobrado relevancia el proyecto genoma humano que proveerá

importante información sobre nuestra composición genética y, al mismo tiempo, ha dado lugar a

nuevos dilemas éticos y morales.

En particular, los avances en el estudio de la quimica de los ácidos nucleicos

permitieron, no solamente la eficiente síntesis quimica de ADN y ARN, sino también de

análogos con propiedades particulares que posibilitaron la detección más sensible de

secuencias, el reconocimiento de moléculas particulares, la incrementada estabilidad en fluidos

biológicos, etc. Análogos sintéticos de oligonucleótidos tienen aplicaciones en terapia, y varios

han alcanzado el estadío de ensayos clínicos en humanospara el tratamiento de infecciones

sistémicas y locales, asi como también de algunos cánceres. También los monómeros de los

ácidos nucleicos tienen importantes aplicaciones terapéuticas, nucleósidos modificados

químicamente son usados como drogas para el tratamiento del SIDAy otros infecciones virales.

Estos nuevos campos y aplicaciones han expandido notablemente el estudio y la investigación

de la quimica de los ácidos nucleicos.

1.2-Ácidos nucleicos. Estructuras de sus componentes.

introduccion. Capitulo 1 - 9

Los ácidos nucleicos son polímeros generados a partir de un arreglo lineal de

monómeros llamados nucleótidos (figura 1.1). EI número de monómeros en un ácido nucleico

puede ir desde BO,como en el ARNt hasta más de 10Ben un cromosoma eucan'ótico. La unidad

es el par de nucleótidos (par de bases) para ácidos nucleicos doble hebra o un nucleótido para

ácidos nucleicos de hebra simple. El ADN está compuesto por 2’-desoxirribonuc|eótidos y el

ARN por n'bonucleótidos. Todos los nucleótidos están constituidos por tres componentes: una

base (purina o pin'midina), un azúcar pentosa (D-n'bosa en el ARN o 2'-desoxi-D-ribosa en el

ADN)y uno o más gmpos fosfato. Las pun'nas principales son adenina (Ade) y guanina (Guan)

en ambos ácidos nucleicos y las pin‘midinas son citosina (Cit) y timina (Tim), en el ADN y

citosina (Cit) y uracilo (Ura), en el ARN.

Figura 1.1. Estructura básica de los ácidos nü’cleicos.En el DNA, B= Ade. Cit. Guan o Tirn y R= H; en el RNA B= Ade, Cit,

Guan o Ura y R=OH.

Los nucleótidos son los ésteres fosfato de los nucleósidos, que están compuestos por

Ia base nitrogenada y el azúcar. En los nucleósidos (ver figura 1.2) un nitrógeno de Ia base

nitrogenada, el N1 de las pin'midinas o el N9 de las purinas, está unido al C1' de la pentosa.

Este enlace está del mismo lado del anillo del azúcar que el hidroximetilo05' y se define como

enlace lt-glicosídico. El azúcar está cerrado en un anillo de cinco miembros (furanosa). (Los

carbonos del azúcar se designan con una “prima”para diferenciados de los de Ia base.)

En los nucleótidos uno (o a veces dos) de los hidroxilos de la pentosa está(n)

esterificado(s) con una o más funciones fosfato. Nucleósidos monoésteres del ácido

¿reduccion Casi.

pirofosfórico son nucleósidos difosfato y, por extensión, nucleósidos monoésteres del ácido

tripolifosfóricoson nucleósidos trifosfato. Finalmente, nucleótidos cíclicos son nucleósidos que

tiene dos hidroxilos vecinos de Ia pentosa esterificados por un fosfato simple, formando un

diéster cíclico.

deso>dajenosina desoñgmlsína desoxicitidim tim'dna

H H H

HH H H HH H

o“ _°H OH OH OH OH “OH OHadenosma guarnina cifidjna uracilo

Zb.

Figura 1.2. Estructuras de los principales nucleósidos. a. Estructuras de los cuatro principales desoxinucleósidos.b. Estructuras de los cuatro principales n'bonucleósidos.

En los ácidos nucleicos la cadena de polinucleótidos se forma de manera que el OH-3'

de un nucleótido se une al OH-5' del próximo nucleótido a través de un enlace fosfodiéster. La

parte constante de los ácidos nucleicos es su esqueleto, compuesto de los azúcares y los

fosfatos. la parte variable es su secuencia de cuatro bases diferentes, que lleva la información

genética (figura 1.1).

La caracteristica más importante del ADN es la doble hélice, Ia cual determina el rol

genético del ADN. En esta doble hélice dos hebras de ADN se enrollan alrededor de un eje

introducción. Capitulo 1 - 11

común en direcciones opuestas. Las bases están adentro de Ia hélice y el esqueleto azúcar

fosfato está del lado externo. Las bases de una cadena forman pares de bases precisos con Ia

cadena opuesta a través de puentes de hidrógenos. La adenina se aparea con la timina

formando dos puentes de hidrógeno y la citosina con la guanina a través de tres puentes de

hidrógeno (figura 1.3). Esta complementariedad de bases permite el almacenamiento y la

transmisión de la información genética.

7N

H\N/H---"ofi/g ofim/N N /N NH,.---"'\”/ \R

T "/ l lR

A-T G-C

Figura 1.3. Pares de bases Watson-Crickformados por puentes dehidrógeno entre A y T y entre G y C.

La estructura covalente del ARN difiere de Ia del ADN de dos maneras. Primero, el

azúcar contiene un 0H-2' adicional. Segundo, el ARNen vez de timina tiene uracilo. Casi todos

los ARNs son simple cadena excepto algunos ARNs virales. Sin embargo, el ARN forma

algunas estructuras helicoidales locales. Este rasgo implica que el ARN adopta diversos tipos

de estructuras secundarias, tales como doble hélices, horquillas y protuberancias. Además.

debido a Ia presencia del OH-2' el ARN adopta también múltiples tipos de estructuras terciarias

y se pliega en diversas confonnaciones, Io que da lugar a los distintos roles biológicos que

tiene.

1.3-Estructuras de doble hélices.

introduccion. Capitulo i wt2 e

C2"9nd0

Fgura 1.4. Tres representaciones de estructuras de ADNdoble hélice. De derecha a izquierdalas formas A, B y Z, conteniendo cada uno 20 pares de bases.

a. vista longitudinal, b. vista desde un extremo y c. modelo de cintas, d. detalle de la conformación del azúcar enlas hélices Ay B.

A partir de estudios de diferentes patrones obtenidos por difracción de rayos X se han

propuesto varios clases de modelos de ácidos nucleicos doble hebra. Sólo tres de ellos han

sido verificados: la formas A, B y Z. EI ADN adopta generalmente la forma B en condiciones


fisiológicas, y tiende adoptar Ia forma A en condiciones de más baja humedad y alta

concentración de sales. La forma Z-ADNestá estabilizada por alta concentración de sales y

favorecida por secuencias altemadas de C-G. El ARN está restringido a la forma A debido a Ia

presencia del OH-2'.

Para permitiruna comparación de los aspectos estructurales generales de estas

¡sofonnas (su tamaño relativo, longitud, profundidad y ancho de sus surcos) en la figura 1.4 se

muestran tres representaciones diferentes de las hélices tipo A, B y Z de ADN (a. vista

longitudinal, b. vista desde un extremo y c. modelo de cintas). Hay veinte pares de bases en

cada modelo. A continuación de definen las caracteristicas relevantes en Ia comparación:

EI surco menor se define como el lado de las pares de bases que miran hacia el

esqueleto azúcar-fosfato; el surco pn'ncipales el restante.

EI ancho de cada surco se calcula como la menor distancia entre fosfatos a través

del surco, menos 5.8Á, que representan la suma de los radios de Van der Waals de

los dos grupos fosfato.

-La profundidad del surco menor es la distancia entre P y N2 de G, N3 de A o O2

de C o T, menos la suma de los respectivos radios de Van der Waals.

La profundidad del surco mayor es Ia distancia entre P y 06 de G, N6 de A y O4 de

T y N4 de C. De nuevo se deben restar la suma de los respectivos radios de Van

der Waals.

A continuación detallamos los principales aspectos que diferencian a las formas A, B y

A y B giran hacia la derecha y pueden ocurrir con cualquier secuencia, Z gira hacia

la izquierda y ocurre cuando hay alternancia de pun'nas y pin’midinas.

A es gruesa y comprimida a lo largo del eje de Ia hélice, Z es elongada y delgada,

P es una forma intermedia.

El desplazamiento perpendicular de los pares de bases respecto del eje de Ia

hélice es un aspecto característico. En el ADN B, las bases están en el eje de la

hélice, el desplazamiento es muy pequeño, en promedio es 0.8 Á. En Ia forma A el

introducción, Capitulo 1,- “.4

desplazamiento promedio es de cerca de - 4 Á. En el ADNZ, el desplazamiento es

en el sentido opuesto, aproximadamente, de 3 a 4 Á.

Una consecuencia de la diferencia de los desplazamientos de los pares de bases

es el diferente patrón de los surcos mayor y menor. El ADN B tiene un surco mayor

ancho y uno menor angosto, ambos de similar profundidad. La forma A, tanto de

ADN como de ARN, tiene un surco principal, angosto y profundo y el menor es

ancho y llano. En el ADN Z, el "surco" mayor es de hecho algo convexo y el menor

es profundo pero angosto.

El ángulo de torsión promedio en el ADN B es de 36 ° (aunque hay un amplio rango

entre 24 y 51 °), dando asi diez pares de bases por vuelta. En el ADN A el

promedio de ángulo de torsión es de 31 °, habiendo así once pares de bases por

vuelta. En el ADN Z hay doce pares de bases por vuelta, pero la repetición en la

hélice es de dos pares de bases (pun'na-pirimidina),entonces el ángulo de torsión

principal es de 60 °, dividido de forma desigual entre un escaló G-C de 50 ° y un

escalón C-G de 10 °.

El plegamiento del azúcar tiende a ser C3’-endo en A y C2'-endo en B. En Z Ia

conformación es C2'-endo en C y C3’-endo en G. La conformación del azúcar es

determinante de la estructura de la doble hélice, ya que como se muestra en Ia

figura 1.4.d la conformación C3'-endo acorta la distancia del enlace

intemucleotídico respecto de Ia CZ'-endo generando una doble hélice mucho más

compacta, forma A, en comparación con Ia B que es más elongada y claramente

muestra los surcos mayor y menor.

El enlace glicosídico es anti en A y B y alterna sin en G y anti en las C en el ADN-Z.

Los pares de bases en la forma A están inclinadós en un ángulo grande respecto al

eje de la hélice; en las formas B y Z s encuentran casi perpendiculares.

Los datos de un gran número de estructuras cristalinas muestran que la forma Z es

mucho más rígida que las formas A o B.-El ADN B es el más flexible y puede

torcerse colapsando su surco mayor.

Introducción. Capitulo l - 15

1.4-Síntesis de oligonucleótidos.

Unos de los más desafiantes e importantes aspectos en el campo de Ia investigación

química de los ácidos nucleicos es el desarrollo de métodos confiables para la síntesis quimica

de oligonucleótidos de secuencia definida. Un oligonucleótido, sea de ARN o de ADN es una

cadena simple consistente en un número de nucleósidos unidos por puentes fosfodiéster,

formados entre un grupo OH-3' de un nucleósido y un OH-5' de otro, como en los ácidos

nucleicos naturales. En el contexto de los ácidos nucleicos el prefijo oligo denota pocos

residuos nucleosidicos; en contraposición a poli que implicamuchos.

El objetivo fundamental en la síntesis de oligonucleótidos es Ia formación de un enlace

éster entre una función activada de fósforo de un nucleótido con el grupo hidroxilo de otro,

formando finalmente el enlace fosfodiéster natural. Dado que los ácidos nucleicos son

altamente sensibles a un amplio rango de reacciones químicas, solamente condiciones suaves

de reacción pueden ser usadas en el ensamblaje de estas cadenas. Las bases heterocíclicas

son susceptibles a Ia alquilación, oxidación y reducción. El esqueleto fosfodiéster es vulnerable

a la hidrólisis. En el caso del ADN, la hidrólisis ácida ocurre mas fácilmente que Ia hidrólisis

alcalina, debido a la labilidad del enlace glicosldico, especialmente en el caso de pun'n

nucleótidos que sufren depurinación en condiciones de acidez relativamente suaves. El ARN

es, en cambio, susceptible a la hidrólisis alcalina, debido al ataque nucleofílico del OH-2’ al

grupo fosfato que resulta en la escisión de la cadena. Estas consideraciones limitanel rango de

reacciones químicas que pueden ser usadas en la preparación de oligonucleótidos a: 1

hidrólisis alcalinas suaves (muy suaves para el ARN), 2- hidrólisis ácidas suaves (muy suaves

para el ADN), 3- reacciones de desplazamiento nucleofílico suaves, 4- reacciones de

eliminación catalizadas por bases y 5- algunas reacciones rédox (por ejemplo, oxidaciones con

I2o Ag“ o eliminaciones reductivas usando zinc). Además, es muy importante en el proceso de

formación del enlace intemucleotídico, el bloqueo y desbloqueo selectivo de hidroxilos primarios

Introducción. Capítulo 1 - 16

y secundarios. Asimismo, los grupos reactivos amino de las bases y los grupos disociables del

fosfato necesitan protección. La síntesis de ARN tiene el requerimiento adicional del bloqueo

selectivo del OH-2'. Todos los grupos protectores deben ser eliminados en condiciones que no

dañen Ia cadena que se está sintetizando y que eviten reacciones laterales.

1.4.1- Síntesis de ADN.

1.4.1.1-Perspectiva histórica.

Michelson y Todd5 comenzaron el trabajo de Ia síntesis de oligodesoxinucleótidos

cuando reportaron en 1955 la primera síntesis química de un dinucleótido que contenía un

enlace intemucleotídico (3' —>5') idéntico al del ADN natural. Este trabajo precursor sentó las

bases para el desarrollo del método fosfodiéster por Khorana y colaboradores].B el cual fue

usado por dos décadas para la obtención de oligonucleótidos por métodos químicos. Este

grupo fue principalmente responsable del desarrollo de importantes técnicas como esquemas

de protección, procedimientos de fosforilación, reacciones de condensación y de

caracterización enzimática, las cuales jugaron un rol importante en el desarrollo de la química

moderna. La principal desventaja del método fosfodiéster es la naturaleza iónica del material de

partida y de los productos de condensación cuya separación y purificación requiere laboriosas y

largas cromatografías de intercambio iónico.

A fines de los “605 el método fosfotriéster (V) fue introducido por Letsinger y Ogilviefil-1o

A través de los años el enfoque fosfotriéster fue modificado y mejorado con Ia introducción de

nuevos reactivos condensantes y fosforilantes y de catalizadoresnucleofílicos particularmente

efectivos en aumentar Ia velocidad de formación del enlace fosfotriéster. Incluso, considerables

6 Michelson. A. M.; Todd, A. R. J. Chem. Soc. 1955, 2632-2638

7 Khorana, H. G. Pure Appl. Chem. 1968. 17. 349-381.

3 Agrawal, KcL.; Yamazaki, A.; Cashion, P. J.; Khorana, H. G. Angew. Chem. Int. Edit. 1972, 11, 451-459.

9 Letsinger. R. L.; Ogilvie, K. K. J. Am. Chem. Soc. 1967. 89. 4801-4803.

1°Letsinger. R. L.; Ogilvie. K. K. J. Am. Chem. Soc. 1969, 91, 3350-3355.


progresos se realizaron en la preparación química de oligorribonucleótidos por este método, a

pesar de la complejidad impartida por la presencia del OH-2', ya que deben ser protegidos

químicamente durante Ia elongación de Ia cadena. A principios de los ‘705 un método

fosfotn'éster mejorado fue desarrollado por Narang11 y por Catlin y Cramer.12 Usando este

método, el pn’mer oligonucleótido químicamente sintetizado y biológicamente activo fue

preparado por Bahl y Narang.13

A mediados de los '603, paralelamente, Letsingery Mahadevan14 ¡nvestigaron el uso de

un polímero orgánico como soporte para Ia síntesis de oligonucleótidos. Este concepto,

originalmente propuesto por Mem‘field15para Ia síntesis de péptidos, tiene Ia belleza que

permite Ia fácil separación del exceso de material de partida y de reactivos solubles, del

producto de reacción que se encuentra covalentemente unido a un soporte sólido insoluble y,

de esta forma, se eliminan teóricamente tediosos pasos de aislamiento y purificación, que

disminuyen, además, el rendimiento de Ia síntesis. Sin embargo. los primeros intentos de

síntesis de oligonucléotidos en fase sólida tuvieron poco éxito debido principalmente a los bajos

rendimientos obtenidos utilizando los derivados de fosforiéster (V)mencionados anteriormente.

Aprovechando Ia extrema reactividad de los reactivos fosfito, Letsinger introdujo el

método fosfotn'éster (Ill)para disminuir el tiempo involucrado en las reacciones de fosforilación /

condensación en Ia consthcción de cadenas más largas. Así, dos monómeros podían ser

ensamblados en minutos en lugar de en horas y el fósforo tn'valente ¡ntemucleotídico podía ser

oxidado al requerido fosfotriester fácilmente por I2acuoso.15 La combinación de este eficiente

método con la síntesis en fase sólida fue realizada por Matteucci y Caruthers17 en 1981,

quienes adoptaron geles de sílica derivatizados con desoxinucleótidos como soporte sólido

1‘ Narang. S.A.; Bhanot, 0.8.; Goodchild, J.; Wrghtman. R. H.; Dheer, S. K. J. Am. Chem. Soc. 1972. 94, 61836189.

‘2 Catlin. J. C.; Cramer, F. J. Org. Chem. 1973, 38. 245-250.

‘3 Baht, C. P.; Wu, P.; Itakura, K.; Narang S. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1976, 73. 91-94.

1‘ Letsinger, R. L.; Mahadevan. V. J. Am. Chem. Soc. 1965, 87, 3526-3527.‘5 Merrifield, R. B. J. Am. Chem. Soc. 1963, 85. 2149-2154. '

"5Letsinger, R. L.; Lusford. W. B. J. Am. Chem. Soc. 1976, 98. 3655-3661.‘7 Matteucci. M. D.; Caruthers, M. H. J. Am. Chem. Soc. 1981, 103. 3185-3191.

introducción, Capitulo 1 - 18

insoluble. En el mismo año, Beaucage y Canithers1B introdujeron una nueva clase de sintones

fosfito, 2’-desoxinucleósido-3'-O—(N,N-dimetilamino)-fosforamiditas, los cuales tienen mayor

estabilidad que los intermediarios de clorofosfito usados por Letsinger primeramente y no son

hidrolizados por agua ni oxidados por el oxígeno del aire. La eficiencia de estas

desoxinucleósido fosforamiditas permitió que las reacciones de acoplamiento, mediadas por el

1H-tetrazol, con los nucleósidos protegidos unidos a soportes derivados de sílica procedieran

dentro del minuto con rendimiento virtualmente cuantitativo. Estos progresos dieron lugar a la

síntesis automatizada de ADN.

Por otra parte, Garegg y colaboradores19 reportaron que un 2'-desoxinucleósido-3‘-O

hidrógeno fosfonato-5'-protegido reaccionaba rápidamente con 3'-Obenzoil timidina en

presencia de un agente activante para dar el correspondiente (3’ —>5') dinucleósido hidrógeno

fosfonato, que podia ser subsecuentemente oxidado a fosfato en presencia de |2 y agua en

medio básico. El uso de agentes activantes como cloruro de pivaloíl02°o de adamantoílo21

permitieron la automatización de este método. Sin embargo, es generalmente aceptado que el

enfoque H-fosfonato no es todavía tan eficiente como la metodologia de las fosforamiditas y

está limitado a la preparación de fragmentos cortos de ADN, con problemas arduos de

purificaciónde la secuencia deseada de las secuencias truncas.

1.4.1.2- Síntesis automatizada de ADN.

La síntesis de ADNes un proceso relativamente simple. Un átomo de fósforo unido ala

posición 3' de un nucleósido convenientemente protegido se acopla al hidroxilo 5' de otro

nucleósido. El pn'mer monómero es administrado en solución mientras que el segundo se

encuentra inmovilizadoen un soporte sólido. Además de la reacción de acoplamiento, otras tres

reacciones químicas son necesarias para preparar la cadena creciente para la adición del

‘3Beaucage, S. L.; Caruthers, M. H. Tetrahedron Lett. 1981, 22, 1859-1862. .

‘9Garegg, P. J.; Regberg, T.; Stawinsky, J.; Strómberg, R. Chem. Scr. 1985, 25, 280-282.2° Froehler, B. C.; Ng, P. G.; Matteucci, M. D. NucI. Acids Res. 1986, 14, 5399-5407.


próximo monómero: enmascaramiento, oxidación y detn'tilación. De esta forma se lleva a cabo

un ciclo de sintesis, agregando un monómero por vez. La secuencia y longitud deseadas son

definidas por el operador. Cuando la cadena es completada, el oligo crudo debe ser liberado

del soporte y desprotegido.

La síntesis es llevada a cabo con la cadena creciente unida a un soporte sólido, tal que

el exceso de reactivos que se encuentra en la fase líquida puede ser removido por filtración.

Por lo tanto, no son requen'dos pasos de aislamiento y purificación entre los ciclos.

Este soporte es una forma de perlas de vidriode borosilicato, cuyo tamaño de partícula

y de poro han sido optimizados para una eficiente transferencia de líquido (CPG, controlled

pare-glass).22 Las partículas tienen alrededor de 150 um de diámetro y poros de 500 Á, o de

1000 Á para sintetizar oligos de más de 60 bases, y no se hinchan en solución. EI soporte

sólido está derivatizado covalentemente con uno de los cuatro nucleósidos cuyos grupos

reactivos se encuentran bloqueados (los aminos exocíclicos de las bases A, C y G, se

encuentran acilados y el OH-5' se encuentra bloqueado con el grupo DMTr,un grupo protector

que se elimina en condiciones ácidas). El OH-3’del nucleósido (que corresponde al extremo 3'

de la secuencia que se va a sintetizar) se une al soporte a través de un adaptador (linker)con

un enlace succinato que es lábil a base y permite Ia remoción del ADNdel soporte después de

las síntesis mediante tratamiento con amoniaco, dejando el OH-3' libre. La unión del Iinker ai

CPG es via un enlace siloxano y todos los ganos silanol que no están den'vatizados son

bloqueados para prevenir reacciones laterales. La carga de nucleósido es de 27-40 pmol/g y

con esta fase se rellenan columnas que contienen filtros en sus extremos de forma de realizar

sintesis que contengan 40 nmol, 0.2, 1 ó 10 umol del nucleósido inicial,que son las escalas de

síntesis que permite realizar el sintetizador, de acuerdo a la cantidad final de oligonucleótido

que se requiera.

21Andrus,A.; Efcavitch. J. W.; McBride, L. J.; Giusti, B. Tetraedron Left. 1988, 29, 861-864.

22Adams. S. P.; Kavka, K. S.; Wykes, E. J.; Holder, S. B.; Gallupi, G. R. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 661-666.


También hay disponibles soportes sólidos de poliestireno23con la forma de partículas

hidrofóbicas de 50-70 pm que tienen poros de 1000 Á y que tienen enlazados a su superficie

adaptadores (linkers) aminoetilo a los cuales se enlaza el OH-3' del nucleósido protegido. Como

su superficie es inerte, reacciones secundarias son menos probables. En esta tesis los soportes

utilizados fueron del tipo CPG. o

0°“: o °°“° 1/1“N NxO Oel;N N0M” 0M“

Figura 1.5. Sintones B-cianoetil-N.N-diisopropilfosforamiditas de desoxibonucleósidos.A: 5'-O—DMTr-N2-isobutinl-2'-desoxiguanosin-3'-O—B-cianoetil-N.N-diisopropil fosforamidita.

B: 5'-O-DMTr-N6-benzo¡I-2'-desoxiadenosin-3'-O-B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.C: 5'-O—DMTr-N4—benzoiI-2'-desoxicitidin-3'-O-B-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita.

D: 5'-O-DMTr-timidin-3'-O—B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

Los monómeros para la síntesis corriente de ADN en fase sólida son [3

cianoetilfosforamiditas de 2'-desoxinucleósidos completamente protegidas (figura 1.5).

Tienen los siguientes grupos funcionales:

23Andrus, A.; McCollum, C. Tetrahedron Lett. 1991, 32, 4069-4072.


1. Un grupo diisopropilamino sobre un fósforo tn'valente unido al OH-3'.24 La

fosforamiditaes estable hasta que se hace altamente reactiva por el agregado de tetrazol, que

protona este gmpo, transfonnándolo así en un buen grupo saliente.

2. Un grupo protector B»cianoeti|o sobre el fósforo en 3'. Este grupo previene

reacciones secundarias y ayuda a la solubilidad de las fosforamiditas. Se elimina al final de Ia

síntesis con amoniaco. EI amoniaco actúa como base y remueve uno de los protones sobre el

metileno al cual está unido el grupo ciano. Este anión se forma en pequeña proporción, pero

inmediatamente ocurre una reacción de (¿eliminación para formar acn’lonitrílo y el grupo

intemucleotídico fosfodiéster desprotegido. EI acrilonitn'lo, entonces, reacciona

irreversiblemente con amoniaco para dar 3-aminopropionitn'lo,que es inerte.

3. Un grupo dimetoxítn'tilo (DMTr) sobre el OH-5'. Este gmpo es removido por

ácido en el ciclo de síntesis para dejar el 0H-5' disponible para Ia reacción de acoplamiento.

4. Grupos protectores sobre los aminos exocíclicos de las bases adenina,

citosina y guanica. Diferentes grupos son usados para proteger los aminos exocíclicos de las

bases, los grupos protectores tradicionales son benzoílo para Ia citosina y Ia adenina e

isobutirilo para la guanina; Ia timina no tiene aminos exocíclicos, por Io tanto, no necesita

protección. Estos grupos previenen reacciones laterales y son removidos después de la síntesis

con amoniaco. Se requiere un tratamiento de 8-12 h a 55 °C en amoniaco concentrado. Este

es el paso más lento en Ia sintesis de oligonucleótídos en fase sólida, y no es sorprendente que

haya gran interés en la búsqueda de nuevos grupos protectores de las bases que sean más

Iábiles. [En esta tesis se usaron para Ia síntesis de oligodesoxinucleótidos los grupos

protectores tradicionales; en cambio, para la preparación de 2'-O-meti|r¡bonucleótidos y

oligorribonucleótidos, se usó un grupo protector alternativo desarrollado más recientemente (el

fenoxiacetilo) que no requiere un tratamiento tan prolongado en medio alcalino (estos sintones

son denominados fosforamiditas de química de desprotección rápida, y son especialmente

efectivas para Ia síntesis de oligom'bonucleótidos, ver más adelante).]

2‘MCBn'de,J. L.; Caruthers, M. H. Telrahedron Lett. 1983. 24. 245-248.


La sintesis en fase sólida de ADNcomienza con la selección del material de la

columna que contiene el residuo protegido del extremo 3' unido al soporte, ya que con el

sintetizador automático la sintesis ocurre en dirección 3' —>5', aprovechando la alta reactividad

del grupo OH-5' primario. Este hecho contrasta con la biosintesis de ácidos nucleicos que

procede en sentido inverso, o sea, en dirección 5' —>3'.

Dado que la quimica de las fosforamiditas es muy sensible a Ia humedad y al oxigeno,

los reactivos son mantenidos bajo atmósfera de gas inerte para protegerlos del aire. El gas

también sirve para presurizar las botellas de los reactivos y administrar éstos a Ia columna de

sintesis. Normalmente se usa argón que tiene la ventaja de ser más denso que el aire y protege

a los reactivos si hubiera alguna pérdida en el equipo. Un volumen muerto en la columna de

síntesis permite que las partículas de la fase sólida sean suspendidas al pasar el solvente entre

ellas, lo cual asegura un eficiente mezclado de la fase sólida y los reactivos en solución.

Se debe seleccionar la escala de sintesis que se va a realizar, de acuerdo a la

masa de oligo requerida, y las columnitas se cargan con la cantidad de fase adecuada para esa

escala. En la figura 1.6 se muestra el ciclo de sintesis. El ciclo es el mismo en todas las

escalas, lo que varía son las cantidades de reactivos administradas y los tiempos de reacción,

que fueron optimizados para cada escala (ver el apéndice Il, el programa del sintetizador para

un ciclo de sintesis en escala 0.2 umol).

aAssz"

BASE.“DM

NCCHZCH¡O—P\

1.Detritilación

TCAenDCM

2.Activación/

\ acoplamiento

p

TetrazolBASEz

DMTrO

NiPr;

BASE;

FINAL5.Deprotecciónn(basesyfosfatos)y\“35‘liberacióndeloligoo

delsoporte

NCCH¡CHZO-—P

BASE:P

O

4.Oxidación.

l ¡2/py/HZO3.EnmascaramlentoP

N-metilimidazollAc20

:0

BASE."CH:

ABASE,”o

NCCHQCHZO

O

Introducción. Capítqu 1 - 23

Figura1.6.Ciclodesíntesisdeoligodesoxinucleótidos

enelsintetizadorautomático.

introduccion. Capítulo 1 - 24

Como mencionado anteriormente. cada cicloestá compuesto de cuatro pasos:

1. Detritilación

2. Acoplamiento

3. Enmascaramiento

4. Oxidación

Estas reacciones son repetidas en ese orden hasta que todas las bases son

agregadas. Una vez que Ia sintesis es completada, el ADN crudo es liberado del soporte y

desprotegido.

1. Detritilación. La detritilacíón es el primer paso del ciclo de sintesis. El grupo

lábil a ácido DMTres removido del monómero unido al soporte por ácido tricloroacético (figura

1.7). Este proceso libera el OH-5’del nucleósido para la reacción de acoplamiento. Antes de la

detritilacíón se realiza un lavado con ACN del soporte para eliminar trazas del reactivo anterior.

Subsecuentemente, se administra Ia solución de TCA en DCM. Como la detritilacíón en

condiciones anhidras es reversible, la reacción se completa removiendo el catión reactivo de la

columna de síntesis a través de un flujo de argón que empuja el liquido fuera de la columna

hacia el puerto de colección de tn'tilo.Se realizan varios agregados de TCA y, finalmente, un

lavado con ACN para remover los residuos de TCA que pudieran detritilar la fosforamidita

entrante. Después de la detritilacíón, el OH-5' es el único nucleófilo capaz de participar en el

siguiente paso de acoplamiento.

CH;

DMT P’0 o BASE HO BASEP

CCI3C02H en DCM

Figura 1.7. Detritilación. 0°“ 3

La hidrólisis del grupo DMTr produce un color naranja característico del catión que es

Introducción. Capitulo i - 25

extremadamente útil para monitorear el progreso de la sintesis. EI catión liberado se puede

cuantificar espectrofotómetricamente y ésta es una indicación de Ia cantidad de fosforamidita

que sufrió el acoplamiento en el ciclo anterior.

Una reacción secundaria es la escisión de la unión glicosídica, a la cual son

especialmente susceptibles las purinas cuyos aminos están protegidos. El mecanismo procede

con la inicial protonacíón del N7 del anillo purinico, lo cual incrementa Ia labilidad del enlace

entre el C1' y el N9 de la purina. La ruptura de este enlace conduce a la formación del

hemiacetal en el azúcar correspondiente. Los oligos que contienen sitios apurínicos son

escindidos durante el tratamiento con amoniaco. Cada purina está expuesta a depurinación en

cada paso de detritilación, por lo tanto, purinas más cercanas al extremo 3' tendrán un mayor

tiempo de exposición acumulada a ácido y una mayor probabilidad de sufrir depurinación. En

general, esta reacción secundaria solamente es significativa en el caso de oligos largos,

siempre que el tratamiento con TCA no se extienda más allá de los tiempos especificados en

los ciclos.25

2. Acoplamiento. Antes de comenzar el acoplamiento, para asegurar que el

soporte se encuentre anhidro y libre de nucleófilos se realiza un extensivo lavado con ACN.

Cualquier nucleófilo extraño competirá con el OH-5' unido al soporte por Ia fosforamidita

entrante y disminuirá Ia eficiencia de acoplamiento. La columna es entonces secada con un

flujo de argón para remover el ACN residual. Entonces, el intermediario activado es creado por

el agregado simultáneo de tetrazol, que actúa como catalizador, y la nueva fosforamidita a la

columna de reacción. El tetrazol, ácido débil (pKa = 4.8), protona el grupo amino de la

fosforamidita que se transforma en un buen grupo saliente y la fosforamidita se vuelve

susceptible al ataque nucleofilico. Es, entonces, una tetrazoíl-fosforamidita el intermediario

activado en la reacción de acoplamiento (figura 1.8).25Un exceso molar de tetrazol asegura

que toda la fosforamidita estará activada y un exceso de fosforamidita respecto de OHs-5'

promueve que la reacción de acoplamiento sea casi cuantitativa (> 98 %). En el paso de

25Tanaka, T.; Letsinger, R. L. NucI. Acíds Res. 1982, 10, 3249-3260.26Dahl, O. Phosphorous and Sulfur 1983, 18, 201-204.

introduccion. Capitulo 1 - 26

acoplamiento, el grupo OH-5’ libre ataca el fósforo electrofílico de Ia fosforamidita entrante

activada para formar un enlace intemucleotídico, el cual es un enlace fosfito triéster y el dímero

es formado. El intermediario es tan reactivo que la reacción se completa en menos de 30 seg.

El grupo OH-5’ de Ia nueva fosforamidita está también protegido con DMTr para evitar que

reaccione consigo misma y autopolimen’ce.

3.

DMTrO o mass" DMTrO o mse’NAN-tl_|N N

l’ ’ T/P\ . ./P\¡Per OCH2CH2CN IPrzT 0CH26H26N

H

H0 o BASE”DMTrO o BASE,

V DMTrO o mse’VW

<——T-ocuzcnzcn fo o suse” P

NAN/ \OCH2CHZCNl_|N N

Figura 1.8. Paso de activación y acoplamiento.

Enmascaramiento. Como no todos los OHs-5’libres sufrieron la reacción de

acoplamiento (cerca de un 2 % no reaccionó), un paso de enmascaramiento es necesario para

prevenir subsiguientes elongaciones de la cadena fallida, ya que, si estos OHs-5'

permanecieran libres, podrian propagarse en los próximos ciclos de síntesis. Una compleja

mezcla de secuencias fallidas, la mayoría con un nucleótido menos que el producto, seria

entonces generada y estas impurezas, que tienen propiedades muy similares al oligonucleótido


deseado, harian el aislamiento del producto muy dificultoso.El proceso de enmascaramiento se

realiza por acetilación de los OHs-5' que no reaccionaron, volviéndolos así inertes a las

subsiguientes adiciones de monómeros. La acetilación se realiza administrando iguales

volúmenes de anhídrido acético y N-metilímidazola Ia columna de reacción. Al mezclarse los

reactivos generan un poderoso agente acetilante (figura 1.9). Los dos reactivos se administran

separadamente porque el agente acetilante activo es inestable. La reacción se realiza en

presencia de una base, usualmente piridina o 2,6-Iutidinapara neutralizar el ácido acético que

se genera. Una vez que ocurre Ia acilación, el exceso de reactivos se elimina mediante flujo de

argón. El tiempo necesario para que reaccione el 1 ó 2 % de los 0Hs-5' que permanecen libres

es de unos pocos segundos. Es importante no extender este tiempo más de lo necesario para

minimizar la pérdida de grupos cianoetilos de los enlaces intemucleotídicos y Ia formación de

productos no deseados por modificaciónde las bases.

o o N/m lo n

was!

¿{YMA.

Figura 1.9. Enmascaramiento de las cadenas que no sufrieron el acoplamiento.

Como las cadenas que si reaccionaron tienen sus OHs-5' bloqueados con DMTrno son

afectadas por este paso. Los extremos 5’-aceti|ados permanecen no reactivos en todos los

ciclos siguientes y son removidos al final de Ia sintesis durante el tratamiento con amoniaco.

Aunque este paso no es imprescindible para la síntesis, minimiza Ia longitud de las impurezas.

Io cual simplifica grandemente el proceso de purificación, porque Ia. separación de

oligonculéotidos n-1 del producto deseado es más difícil que la separación de secuencias

introducción. Capítulo l - 2Q

tmncas que son más cortas; y, además, permite ahorrar reactivos, porque las secuencias

fallidas competirán con el oligonucleótidos de cadenas completa para por las fosforamiditas

entrantes.

4. Oxidación. El enlace intenucleotídico formado es un enlace fosfito

(trivalente) tn'éster. Este enlace fosfito es inestable y susceptible al ataque de ácidos y bases.

Por lo tanto, inmediatamente después del enmascaramiento, el fósforo (Ill)es oxidado al estable

fosfato (V) tn'éster. El agente oxidante es |2 en una solución básica de Py en THF. con agua

como agente donor de oxígenos. Cuando la solución oxidante se administra a Ia columna de

reacción, un complejo |2- Py forma un aducto con el fósforo tn'valente, el cual es descompuesto

por agua con Ia producción de un gmpo fosfato tn'éster (figura 1.10).

DMTrO o BASEP DMTrO o BASEP

Ile-¿OIPy/THF T

F|’—OCH—¿CH2CN ———> 0=FI>—OCH2CHZCNP P

o o BASE o o BASE

Wo WM

Figura 1.10. Oxidación del fósforo tn'valente.

La pin'dina también tiene Ia función de neutralizar el ioduro de hidrógeno que se

genera. La reacción ocurre en alrededor de 30 seg y los excesos de Ia solución de ¡odo se

eliminan por flujo de argón y van'os lavados de ACN. Esto es particularmente importante, ya que

Ia solución oxidante contiene agua. Se ha demostrado que es más eficiente realizar primero el

enmascaramiento y posteriormente la oxidación del fósforo, debido a que si se realiza primero

la oxidación, eventuales trazas de agua de Ia solución oxidante pueden formar ácido acético

durante el enmascaramiento.Esto expondría innecesariamente los oligos a ácido y, además,


disminuiría Ia eficiencia del enmascaramiento.27 Se ha observado experimentalmente, además,

que Ia permutación de los pasos enmascaramiento / oxidación, conduce a niveles mucho

mayores de 2,6-diaminopurina, que si se llevan a cabo en el orden establecido. 23

Con la oxidación el ciclo de adición de un nucleótido es completado. el extremo 5' del

oligómero se encuentra protegido con DMTr.Entonces, el ciclo se repite hasta que Ia sintesis

de Ia secuencia es finalizada. La adición del último monómero puede realizarse, de acuerdo al

proceso de purificación, de forma que el DMTr permanezca unido al oligómero o puede ser

eliminado, opciones DMTr-Ony -Off del sintetizador, respectivamente. En general, se usa Ia

opción DMTr-Oncuando el método de purificación usado es HPLC o cartuchos de fase reversa,

y el grupo DMTr se elimina posteriormente en forma manual. El DMTr del extremo 5' se

remueve automáticamente al finalizar Ia sintesis si Ia purificación se hace por electroforesis en

gel de poliacrilamida o por HPLC de intercambio iónico.

WV'VVVW

W WW“NHs I

o=p-oc N l)

l ttCl'bC ——> 0=T_OHBASE°BASE

\ NH3

OCOClfiI-tzCONHClpl-QCHZSH ope OH

NH:

Figura 1.11. Liberación del oligonucleótjdo crudo y desprotección final.

5 Liberación del soporte y desprotección final del ADNcrudo. En este punto

el oligonucleótido deseado y las secuencias truncas acetiladas en 5' se encuentran unidos al

27Applied Biosistems. October 1988. The effect of the synthesis cycle on the chemical authenticity of the syntheticDNA.Nucleic Acids Research News, issue 7.

inirod cción. Capitulo i - 30

soporte, con las bases y los grupos fosfatos todavía protegidos. El oligómero debe ser entonces

liberado del soporte sólido y completamente desprotegido para obtener un ADNbiológicamente

activo (figura 1.11).

La desprotección de los grupos fosfato y la hidrólisis del ADN del soporte se realizan

simultáneamente en forma automática mediante cuatro tratamientos consecutivos de amoniaco

concentrado, durante una hora. La escisión del soporte ocurre debido a la amoniólisis del

enlace éster entre el puente del soporte y el OH-3’ del nucleósido inicial. Con lo cual, el ADN

sintetizado tiene un OH-3' libre. El oligo ando con sus bases protegidas disuelto en amoniaco

concentrado es forzado fuera de la columna de reacción y colectado en un vial a través de un

flujo de argón. En el vial se realiza Ia desprotección de las bases en la misma solución de

amoniaco pero fuera del instrumento a 55 °C durante 8-15 h. Este procedimiento también

hidroliza los acetilos de las secuencias enmascaradas. La desprotección de las bases es un

proceso de amoniólisis en el cual el amoniaco actúa como nucleófilo que ataca el carbonilo de

los grupos protectores amida.

EI oligonucleótido desprotegido está listo para ser purificado. La importancia de una

buena técnica de purificaciónes usualmente desatendida. El oligonucleótidodeseado debe ser

resuelto de un gran número de impurezas que se acumulan después de un gran número de

reacciones, preferentemente en un solo paso.

Los dos métodos de separación más usados para Ia purificación de oligonucleótidos

son:

1- Geles de electroforesis de poliacrilamida: separa oligonucleótidos en virtud de

su diferencia de carga. Esta técnica es particularmente útil para purificar oligos largos (> 50

residuos), pero está limitada a pequeña escala (hasta 1 mg). Tiene muy buena resolución, un

residuo en oligonucleótidos de más de cien bases de longitud.

2- HPLC: es especialmente útil para obtener oligonucleótidos de alta pureza.

HPLC de intercambio iónico resuelve los oligonucleótidos predominantemente sobre Ia base de

su diferencia de carga y es útil tanto con fines analíticos como preparativos para purificar oligos

2° Farranoe. I. K.; Eadie, J. S.; lvarie, R. Nucl. Acids Res. 1989, 18, 1231-1245.


de hasta 50 monómeros. HPLC de fase reversa separa los compuestos de acuerdo a su

hidrofobicidad. Aquí Ia posición de elusión de un oligonucleótido completamente desprotegido

es difícil de predecir. Una más confiable identificación de los productos se logra dejando el

altamente Iipofílicogrupo DMTr en el extremo 5' del oligonucleótido, que es entonces bien

resuelto de las secuencias más cortas que sufrieron el enmascaramiento y no contienen el

DMTr.Una alternativa rápida pero menos eficiente es el uso de cartuchos de fase reversa para

separar las secuencias que tiene el grupo DMTrde aquellas que no lo tienen.

En el caso que permanezca el grupo DMTr en el extremo 5‘, puede ser removido

manualmente después de la purificación por HPLC o por cartucho de fase reversa, por

tratamiento con AcOH 80 % en agua durante 20 min a temperatura ambiente.

El desarrollo de una metodología eficiente para la preparación de

oligodesoxinucleótidos sintéticos ha tenido un fuerte impacto en campos como biología

molecular, biofisica, biotecnología, diagnóstico y terapia. Los oligodesoxinucleótidos

constituyen el reactivo básico de la reacción en cadena de Ia polimerasa (PCR), son usados

como primers para secuenciación, como sondas para aislar y pun'ficargenes, como mutágenos

sitio-específicos y como herramientas para estudiar interacciones ADN-proteína. Más aún, tanto

la cristalografía como muchos estudios biofisicos para la elucidación estructural del ADN,

pueden atribuir sus más importantes avances al advenimiento de la síntesis en fase sólida del

ADN, que permitió tener las cantidades adecuadas de oIigonucléotidos requeridas para tales

tecnologías. Además, la sintesis en fase sólida ha posibilitado la obtención de oligonucleótidos

con esqueletos modificados, bases no convencionales, con marcas no radioactivas en sus

extremos 3'- o 5’- terminales útiles en terapia, diagnóstico y biología molecular.

1.4.2-Síntesis en fase sólida de ARN.

Si bien la importancia del ARN en procesos celulares es indiscutible; es de remarcar

que, más recientemente, el descubrimiento de ARNs cataliticosm0 ha atraído enormemente Ia

atención de la comunidad cientifica hacia el campo del ARN, en el plano académico y el

aplicado. La investigación en estas áreas ha demostrado el requerimiento de un método

práctico para sintetizar ARN.

Trabajar con ARN es más complicado porque el hidroxilo-2' hace que el ARN sea

mucho más susceptible que el ADN al ataque por RNasas, que son enzimas ubicuas que

hidrolizan rápidamente las hebras de ARNy son difícilesde remover. Por lo tanto, es necesario

trabajar en condiciones de esterilidad.

Existen dos enfoques para obtener ARNs: uno es Ia transcripción ¡n vitro;31el otro, Ia

sintesis quimica. La preparación enzimática de ARN (usando, por ejemplo, la T7 ARN

polimerasa), a pesar de haber demostrado ser una herramienta eficiente para producir

secuencias especificas de ARN,adolece de algunas desventajas. Primero, depende altamente

de la secuencia y de Ia longitud; la secuencia tiene que empezar en 5' con G y oligonucleótidos

cortos son muy ineficientemente transcriptos y dan productos heterogéneos. Además, la T7

ARNpolimerasa puede sufrir iniciaciones abortivas y puede agregar una base no deseada en Ia

cadena de ARN después de la terminación, Io cual complica considerablemente Ia purificación.

Finalmente, no es posible incorporar bases modificadas en posiciones específicas con el uso de

templados de ADN,ya que muchos nucleótidos modificados no son reconocidos por la enzima.

La síntesis química de ARN, no tiene las desventajas de Ia síntesis enzimática, pero

también tiene algunas dificultades. La complejidad de Ia preparación química de

oligorribonucleótidos surge de a la presencia del OH-2'. Este hidroxilo hace que el ARN sea

Iábil a la degradación química en condiciones básicas, pero más substanciales son los

problemas relacionados con la protección selectiva del OH-2', que han retrasado los avances

en la preparación quimica de oligorribonucleótidos respecto a los oligodesoxinucleótidos. Es

necesario proteger los OHs-2' selectivamente durante la síntesis y desprotegerlos luego, en

29Kruger, K.; Grabowski, P. J.; Zaug, A. J.; Sands, J.; Gottschilng, D. E.; Cech, T. R. Cell 1982, 31, 131-157.3°Guerrier-Takada, C.; Gardiner, K.; Marsh, T.; Pace, N.; Altman. S. Cell 1983, 35, 849-857.

31Milligan, J. F .; Groebe, D. R.; Vlfitherrell,G. W.; Uhlenbeck. 0. C. Nucl. Acids Res. 1987, 15, 8783-8398.


condiciones que no afecten la integridad de la cadena sintetizada. El grupo protector elegido

para esa función debe cumplir, entonces, con requisitos generales como permanecer intacto

durante la elongación de la cadena, o sea, debe poseer estabilidad frente a ácidos, a agentes

oxidantes y a las condiciones alcalinas de desprotección de las bases y de los grupos fosfato y,

finalmente, tiene que ser cuantitativamente removido en condiciones suaves al final de la

síntesis sin interactuar con el enlace 3' —>5' fosfodiéster vecino, ya sea produciendo Ia

hidrólisisde la cadena o la migración de los grupos fosfato.

Además, el grupo protector de 2’ afecta estéricamente Ia formación del enlace fosflto

triéster durante la sintesis, resultando los acoplamientos mucho más lentos y las eficiencias de

acoplamiento suelen ser menores que en el caso de la sintesis de ADN.

Un gran número de grupos protectores fue explorado para su uso en la protección de

los OHs-2' en Ia síntesis de oligorribonucleótidos. Los grupos más confiables en términos de su

selectividad de introducción y facilidad de remoción sin la formación de productos secundarios

son los ganos acetales lábiles a ácido. Un ejemplo es el grupo 2'-O-tetrahidropiranilo, que fue

exitosamente aplicado a la síntesis de oligorribonucleótidos,32v33Sin embargo, lamentablemente

resultó ser demasiado inestable para sobrevivir a los sucesivos ciclos de detritilación,-"4v35con Io

cual, su uso está restringido a la preparación de secuencias cortas, de menos de 20 bases.

Reese36 introdujo el grupo 4-metoxitetrahidropiran-4-ilo (Mthp) como alternativa; pero, este

grupo demostró ser aún más inestable que el tetrahidropiranilo a ácido. Los grupos 1-(2-cloro-4

metilfeniI)-4-metoxipiperidin-4-ilo (Ctmp) y 1-(2-fluorofenil)-4-metoxipiperidin-4-ilo (Fpmp) fueron

diseñados por Reese37.38 de forma que su velocidad de hidrólisis fuera virtualmente

independiente del pH en el rango afectado por la síntesis (pH 1 - 3). No obstante, la

concomitante remoción del 2'-O-Ctmp y 2’-O-Fpmp fue también observada durante el

32Kierzek. R.; Caruthers, M. H.; Longfellow, C. E.; Swinton, D.; Turner, D. H.; Freier. S. M. Biochemistry1986, 25,7840-7846.

33Koizumi, M.; Iwai, S.; Ohtsuka, E. FEBS Lett. 1988, 239, 285-288.

3‘ Taimura, H.; Fukazawa, T.; Sekine. M.; Hata. T. Nucl. Acids Symp. Ser. #181987. 269-272.35Taimura, H.; Sekine. M.; Hata, T. Chem. Lell. 1987. 1057-1060.35Reese, C. B.; Saflhill, R.; Sultson, J. E. J. Am. Chem. Soc. 1970, 89, 3366-3368.37Reese, C. B. Nucleosides &Nucleotides 1987. 6. 121-129.

ya ' " ru. " ¡ ",1ILLTOGUCCIOH.oapzt no 1 - se

tratamiento ácido requerido para la detn’tilaciónde 5'. Una solución alternativa al problema de Ia

compatibilidad de los grupos protectores de 2' y 5' es el reemplazo del DMTr con un grupo

protector de 5’ que sea removido bajo condiciones no ácidas. En este contexto, los grupos 9

fluorenilmetoxicarbonilo39 y levunilo“o han sido utilizados en conjunción con grupos Iábiles a

ácido en 2' para la sintesis de oligorribonucleótidos. Sin embargo, debido a que no pueden ser

usados de forma intercambiable con los convencionales DMTr usados en la síntesis de

oligodesoxinucleótidos estas estrategias han carecido de interés comercial.

El grupo fotolábil 2-nitrobenzoilo fue usado como grupo protector de 2' en los métodos

fosfotriéster,41 fosforamidita42 y fosfonato.43 Con todo, Ia desprotección completa es un

verdadero problema en oligos más grandes que 20 bases.

EI problema de Ia protección de 2' ha sido parcialmente resuelto con el uso del grupo

tert-butildimetilsililo(TBDMS),que arroja razonables eficiencias de acoplamiento, se elimina con

un tratamiento con el ión básico fluoruro una vez finalizada Ia síntesis y es totalmente

compatible con las condiciones ácidas de detritilación.“ Este grupo es el que se usa

actualmente en la síntesis de rutina del ARN y ha permitido la síntesis de oligorribonucieótidos

de más de 77 bases.45

La figura 1.12 muestra las fosforamiditas de ribonucleósidos usadas como sintones

para la preparación de oligom’bonucleótidosen este trabajo. Los grupos protectores para las

funciones 5' y fosfato son los mismos que para Ia síntesis de ADN. Para los grupos amino

exociclicos de las bases se pueden usar los mismos grupos que para ADN (benzoílo para

citidina y adenosina e isobutirilo para guanosina, figura 1.12. b = benzoílo y c= isobutirilo). Sin

embargo, una parcial hidrólisis de los grupos TBDMS durante el prologado tratamiento básico

requerido para la desprotección de las bases ha sido observada, con la subsiguiente escisión

33Reese, C. B.; Thomson, E. A. J. Chem. Soc. Perkin Trans. ¡1988, 2881-2885.

39Decout, J. L.; Ogilvie, K. K. Nucleosídes &Nucleotides 1985, 4, 271-272.4° Lehman, C.; Xu, Y. Z.; Christodoulou, C.; Tan, Z. K.; Gait, M. J. NucI. Acids Res. 1989, 17, 2379-2390.

4‘ Tanaka, T.; Orita, M.; Uesigu, S.; Ikehara, M. Tetraedron 1988, 44, 4331-4338.42Tanaka, T.; Tamastukuri, S.; Ikehara, M. Nucl. Acids Res. 1987, 15, 7235-7248.

43Tanaka, T.; Tamastukuri, 8.; Ikehara, M. Nucl. Acids Res. 1986, 14, 6265-6279.

44Hakimelahi, G. H; Proba, Z. A.; Ogilvie, K. K. Can. J. Chem. 1982, 60, 1106-1113.


de la cadena por el ataque de los OHs-2' liberados a los grupos fosfodiésteres vecinos en el

medio básico de Ia amoniólisis. Si bien, se advirtió que el agregado de etanol al amoniaco

concentrado disminuye dramáticamente la velocidad de la hidrólisisdel TBDMS,es conveniente

el uso de fosforamiditas de quimica de desprotección rápida. Estas fosforamiditas tienen sus

bases protegidas con grupos más lábiles que no requieren un tratamiento tan drástico en medio

básico para ser removidos, con lo cual la degradación de las cadenas sintetizadas es menos

probable y el tiempo implicadoen la desprotección de las bases disminuye considerablemente.

EIgmpo protector para las bases que se usó para las síntesis de oligorribonucleótidos en esta

tesis es el fenoxiacetilo (figura 1.12.c).

La metodologia para la sintesis de ARN es muy similar a la utilizada para Ia síntesis en

fase sólida de ADN. En el ciclo básico de sintesis (figura 1.13), un soporte sólido, al cual se

halla anclado mediante su OH-3' el nucleósido inicial protegido en 5' con DMTry en 2' (o en 3’)

con TBDMS, está contenido en Ia columna de reacción. Los ciclos de adición de cada

monómero están compuestos por los mismos pasos que los descritos para la síntesis de ADN.

Lo que cambia fundamentalmente respecto a la preparación de ADN es el tiempo de

acoplamiento que debe ser extendido de 30 seg a 15 min debido aI impedimento estérico en la

posición 2'; además, Ia liberación del oligo sintetizado del soporte requiere el doble de tiempo

por el mismo motivo; y, finalmente, un paso extra de desprotección del grupo protector de los

OHs-2’debe ser realizado.

45Ogilvie, K. K.; Usman. N.; Nicoghosian, K.; Cedergren. R. J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1988, 85, 5764-5768.

Inïroducción. Capítulo 1 - 36

O NH R

N N x Ïí« I f ji <JÜ‘ oN / N /N NH R N

DMTI’O DMTrO0 0

O CH3 o o H3 CH3/\/0—||° Si CH3 NO_IL Si CH3

NC | Á I NC lN CH3 CH3 A N CH3 CH;

JÏ oHN R (LNHf5; Nko

O DMTFODMTrO

O

o o ÏH3 CH3o o ÏH3 CH3 l CHI . o a/\/0-P \5"_+’CH3 N _¡I: Sl'NC Á

NC ¡Á | N CH CHaN CH3 CHa C \\_ 3_D ©

a.R- Vo

Figura 1.12. Sintones fosforamiditas de n'bonucleósidos.A: a. 2'-O-TBDM&5'-ODMTr-NÍ-fenoxiaceth-guanosin-3'-O-B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

c. 2'-O-TBDMS-5'-O-DMTr-Nï-isobutiril-guanosin-3'-OB-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita.B: a. 2'-O-TBDMS-5'-O-DMTr-NG-fenoxiacetil-adenosin-3'-O-I3-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

b. 2'-O-TBDMS-5'-O-DMTr-NB-benzo¡I-adenosin-3'-O-B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

C: a. 2'-O-TBDMS—5'-O-DMTr-N4-fenoxiacetil-citidin-3'-O-ÍS-cianoetiI-N,N-diisopropilfosforamidita.

b. 2'-O-TBDMS-5'-O-DMTr-N4-benzoil-citidin-3'-O-I3-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

D: 2'-O-TBDMS-5'-O-DMTr-uridin-3'-O-ÍS-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

BASE,"

NCCH2CH¡0——-P

\NiF'r2

2.Activación/n acoplamiento

Tetrazol

1.Detritilación

TCAenDCM

BASE;

BASE;

4.Oxidación.¡¡Py¡Ho3.Enmascaramlento22 N-metmidazoI/ACZO

FINAL.NCCHZCH20—:05.Deproteccióndelasbases,fotatosyIBASE‘D liberacióndeloligodelsoporte

NHJoMeNHz

6.Desprotección2’-0Hs

TBAFoTEA.3HF

eAsEf'

Figura1.13.Ciclodesíntesisdeoligorribonucleótidosenunsintetizador

automático.

Introducción. Capítqu 1 - 37 —

introducción. Capitulo l - 38

Si bien el grupo TBDMS ha sido usado exitosamente en la preparación de

oligorribonucleótidos biológicamente activos de moderada longitud y con razonable rendimiento

usando el método de las fosforamiditasflfin47no es una solución completamente satisfactoria al

problema de la protección del OH-2’. Las razones son: una parcial migración de los sililos,43el

incompleto desbloqueo de los OHs-2' cuya desprotección debe ser cuidadosamente

monitoreada y la dificultosa eliminación de las sales de sililo.49Además, la síntesis de los

monómeros es ineficiente y la separación de los no deseados 3'-O- de los 2'-O-sil¡léteres da

problemas a gran escala y, finalmente, la eficiencia de acoplamiento de las fosforamiditas de

n'bonucleósidos es bastante menor que Ia observada para las de desoxinucleósidos.

Un nuevo grupo que aparece como prometedor es el 2'-o-(tri¡sopropyl)si|yloxymethyl

(TOM), que tiene un impedimento estérico mucho menor, con lo cual, los tiempos de

acoplamiento no deben ser tan prolongados, tiene una estructura acetal estable a las

condiciones básicas y débilmente ácidas de la sintesis, previniéndose así su migración del 02‘

al 03', y es fácil, confiable y rápidamente desprotegido.5° La aplicabilidad de este nuevo grupo

protector deberá ser demostrada con su uso.

Los avances en la preparación de oligorribonucleótidos en fase sólida, que involucran

el uso de nuevos agentes activantes más eficientes, de nuevos reactivos y de condiciones de

desprotección más inocuas y que requieren tiempos menos prolongados y progresos en las

técnicas de purificación49-51han permitido Ia preparación de cantidades apropiadas de ARN

para estudios estructurales, la búsqueda de nuevos aptámeros (moléculas de ARN con una

estructura tridimensional determinada que les permite reconocer ligandos especificos) y la

generación y evaluación de ribozimas sintéticas.

‘5 Usman, N.; Ogilvie, K. K.; Jiang, M. Y.; Cedergren, R. L. J. Am.Chem. Soc. 1987, 109, 7845-7854.

47Gasparutto, D.; Livache. T.; Bazin. H.; Dupla. A. M.; Guy, A.; Khorlin. A.; Molko, D.; Roget, A.; Teoule, R. Nucl.Acids Res. 1992, 20, 5159-5166.43Mileki. J.; Dembek, P.; Antowiak, W. Z. Nucleosides &Nucleotides 1989, 8. 463-474.

‘9 Sproat, B.; Colonna. F.; Bashar, M.; Tsou, D.; Andrus. A.; Hampel, A.; Vinayac. R. Nucleosides &Nucleotides1995, 14, 255-273.

5° Pitsch, 8.; Weiss, P. A.; Jenny, L.; Stutz. A.; Wu, X. He/vetica Chímica Acta 2001. 84, 3773-3795.5‘ Wincott, F.; DiRenzo, A.; Shaffer, C.; Grimm. 8.; Tracz, D.; Workman, C.; Sweedler, D.; Gonzalez. C.; Scaringe,S.; Usman, N. Nucl. Acids Res. 1995, 23, 2677-2684.


1.5-Oligonucleótidos modificados.

Los avances alcanzados en síntesis en fase sólida de oligonucleótidos han posibilitado,

entonces, el desarrollo de nuevas áreas de investigación en biología molecular y en biologia

estructural, así como también, la búsqueda de nuevos principios terapéuticos. Sin embargo, el

espectro de aplicaciones de los oligonucléotidos puede ser extendido aún más mediante Ia

introducción de modificaciones químicas en su estructura.

Los oligonucleótidos conjugados, resultantes del acoplamiento con una o más

moléculas que les confieren propiedades particulares, constituyen una clase de análogos útiles.

Las moléculas acopladas pueden proveer una reactividad particular, como Iigamiento cruzado

con otros ácidos nucleicos o con proteínas o hidrolizar los ácidos nucleicos de una forma

selectiva. También pueden ser útiles como sondas no radiactívas o para secuenciación

automática. Otros conjugados importantes son aquellos que proveen interacciones

intennoleculares especiales como intercalación, incrementada penetración celular o

características de unión a ligandos particulares. Todas estas moléculas son ampliamente

empleadas en diagnóstico y en biología molecular.

Otro ejemplo de oligonucléotidos modificados es aquel que involucra oligonucleótidos

que llevan modificaciones en los mismos nucleótidos. EI principal propósito de estas

alteraciones es conferir a estas moléculas estabilidad en fluidos biológicos. En estos ambientes

(medios de cultivo para células, suero, citoplasma, etc.) los oligonucleótidos naturales son

rápidamente degradados por enzimas llamadas nucleasas, por lo tanto, el desarrollo de

modificaciones químicas es esencial para sus aplicaciones biológicas. Las modificaciones

pueden ser introducidas en la base, en el azúcar o en el grupo fosfato, aunque el diseño de

nuevas modificaciones es una tarea compleja, ya que diversos requerimientos químicos,

electrónicos y estéricos deben ser considerados. En el caso de análogos de ARN, además de

los requerimientos estructurales generales, es importante la formación de una molécula activa,

Jlot-4O!ntroducccn. Capiti

para lo cual se hace indispensable respetar exigencias de plegamiento e interacción

particulares.

Como estos análogos son esenciales para todas las aplicaciones in vivo de los

oligonucleótidos, mucho esfuerzo se ha realizado en este campo durante los últimos años. Tal

vez, el área donde el uso de oligonucieótidos modificados ha sido más prolífico es Ia estrategia

antisentido. en Ia cual las modificaciones químicas confieren características apropiadas tales

como hibn'dización, resistencia a nucleasas. penetración a las células, selectividad y buenas

propiedades fannacocinéticas y farmacodinámicas. La tecnología combinaton’aes otra área de

investigación en donde los oligonucléotidos y sus análogos están siendo empleados para el

desarrollo de aptámeros, nuevas n'bozimasy desoxirn'bozimascon nuevas propiedades.

1.5.1-Estrategia antisentido.

Los avances logrados en biologia molecular permitieron una mejor comprensión de la

base molecular de las enfermedades, Ia cual facilitó el desarrollo de nuevas drogas

apoyándose en un diseño racional.

El desarrollo de nuevos agentes terapéuticos basados en oligonucleótidos tiene su

origen en un nuevo campo denominado “antisentido” y es un ejemplo del diseño racional de

drogas basado en Ia química de oligonucleótidos. En 1978 Zamenick y Stephenson52 ilustraron

por primera vez la idea de esta estrategia, que consiste en la inhibición selectiva de Ia

expresión de un determinado gen con oligonucleótidos,demostrando que estas moléculas eran

capaces de inhibir la replicación del virus sarcoma de Rous en un sistema celular. El principio

involucrado en el enfoque antisentido es simple. Se deben sintetizar oligonucleótidos con una

secuencia de bases complementaria a un segmento del ARNmque da origen a Ia proteína cuya

producción se quiere inhibir. Este fragmento sintético reconocerá y se apareará con esa

secuencia objetivo y producirá la inhibiciónde Ia expresión génica. (figura 1.14).

52Zamenick, P. C.; Stephenson, M. L. Proc. Nail. Acad. Sci. USA 1978. 75, 280-284.


DNA

Ollgonucleóüdo éantisentldo

Figura 1.14. Esquema del enfoque antisentido para Ia inhibiciónespecifica de la expresión génica

Estos oligonucleótidos, llamados oligonucléotidos antisentido, bloquean de este modo,

la expresión dela proteína codificada por el ARN blanco. Si Ia proteína ¡nhibida es una proteína

esencial para el desarrollo de un proceso patológico, entonces los oligonucleótidos se

convierten en fármacos altamente específicos. Este efecto, es decir, el ataque de una

enfermedad a nivel genético es Ia base de Ia terapia génica.

El uso de oligonucleótidos en el campo de la terapia génica tiene van'as ventajas

respecto de las drogas tradicionales. En primer lugar, implica el ataque a una enfermedad en

un estadío más precoz, a nivel genético, que las drogas tradicionales que están dirigidas contra

proteínas, enzimas o receptores, que, a su vez, se encuentran en gran número de copias,

requiriendo así menor concentración de droga para producir el mismo efecto terapéutico. En

segundo lugar, esta estrategia ofrece un enfoque general, ya que involucra el uso de un mismo

tipo de compuestos químicos, los nucleótidos, para la producción de fármacos contra una

amplia gama de enfermedades. Éstos, unidos en diferentes combinaciones, darán lugar a

secuencias adecuadas para producir drogas contra diversas enfermedades, por ejemplo,

introducción. Capitulo i - 42

cánceres o virus, debido al hecho que todas las proteínas son sintetizadas por el mismo

mecanismo. Finalmente, estas moléculas prometen una gran especificidad ya que una

secuencia de quince a veinte bases es univoca en el genoma humano. Por lo tanto, la

hibridización de un oiigonucleótido antisentido corto, de alrededor de 15-20 bases, a su ARNm

complementario deberia proveer alta especificidad.

La exitosa aplicación de oligonucleótidos para bloquear la expresión génica in vivo

requiere, primeramente, que el ARNm blanco esté accesible a los oligonucleótidos antisentido.

El blanco puede no ser accesible a los oligonucleótidos debido a estructuras terciarias del

ARNm o bien in vivo debido a Ia interacción con proteinas. Por un lado, nuestro conocimiento

para predecir la estructura terciaria del ARN hasta el momento es muy limitado. Por otro lado,

los mecanismos de interacción con proteinas celulares son poco conocidos y es dificil de

evaluar a pn'oricómo afectarán estas interacciones Ia acción inhibitoriade los oligonucleótidos.

Estos hechos dificultan Ia selección del sitio de hidrólisis que debe ser determinado

experimentalmente y optimizado para cada ARN blanco.

Segundo, es necesario lograr la eficiente incorporación de los oligonucleótidos en las

células blanco y la co-localización de los mismos con su blanco una vez que los

oligonucleótidos entraron en las células. A pesar de que los oligonucléotidos son polianiones y

que teóricamente no deberian ser capaces de atravesar eficientemente la membrana celular, la

acumulación de oligonucleótidos en el citoplasma celular indica que las células están equipadas

para incorporar estos polianiones.

Básicamente, hay dos enfoques para lograr la inhibición especifica de la expresión

génica mediante la estrategia antisentido. Uno es el uso de la expresión endógena de la hebra

antisentido mediante el uso de vectores virales y el otro involucra la administración exógena de

los oligonucleótidos sintetizados químicamente. El primer enfoque supera fácilmente la eventual

barrera de la penetración celular. Sin embargo. con el uso de vehículos de administración como

liposomas o proteinas de revestimiento de virus el problema de la administración en las células

podria ser también marginalizado para oligonucleótidos sintetizados automáticamente. La

ventaja de la administración exógena es que evita potenciales riesgos relacionados con la


incorporación de particulas virales en el organismo y que pueden diseñarse oligonucleótidos

con mejores propiedades de especificidad y estabilidad.

Numerosos reportes han demostrado la capacidad de los oligonucleótidos antisentido

para bloquear Ia función de un gen específico, tanto in vitro como in vivo. Estas moléculas

están siendo corn'entemente investigadas como agentes terapéuticos para el tratamiento de

infecciones virales, cánceres y enfermedades inmunes y varios ensayos clinicos están siendo

llevados a cabo.53

Aunque los primeros intentos fueron llevados a cabo utilizando oligonucleótidos no

modificados, pronto fue evidente que su uso como agentes terapéuticos estaba limitado a

causa de su inestabilidad en fluidos biológicos, debido a las ubicuas nucleasas que degradan

rápidamente los oligonucleótidos de ADN y de ARN, hidrolizando la unión fosfodiéster. Para

superar este problema considerables esfuerzos han sido dedicados a construir análogos más

estables que demuestren tiempos de vida razonables in vivo.54 El diseño de oligonucleótidos

químicamente modificados es un proceso complejo, desde que no sólo una incrementada

resistencia a nucleasas es deseable, sino que también deben formarse duplexes estables.

La importancia de la hibn'dización es demostrada por la correlación de la actividad

antisentido observada en experimentos en cultivo celular e in vivo con la afinidad de los

oligonucleótidos modificados por sus hebras complementarias, siendo esta afinidad expresada

como la temperatura de fusión de los duplexes.55s55La absorción UV de un ADN dúplex se

incrementa en un 20-30 % cuando es desnaturalizado, los puentes de hidrógeno son rotos, y

las dos hebras son separadas. Está hipocromicidadde Ia doble hélice se debe al acoplamiento

entre dipolos de transición de pares de bases vecinos apilados. El punto medio de esta

transición térmica es conocido como temperatura de fusión. Cuanto más estable es la doble

53Murakira, A. Trends Mol. Med. 2001, 7, 430-431.

54Stein, C. A.; Krieg, A. M. (Editores) Applied Antisense Oligonucleotide Technology 1998, New York, Wiley-LissInc.

55Zelleger, T.; Miyake, H.; Cooper, S.; Chi, K.; Conklin. B. S.; Monia, B. P.; Gleave, M. E. J. Phann. Exp. Ther.2001, 298, 934-940.

55Altmann, K. H.; Fabbro, D.; Dean, N. M.; Geíger, B. P.; Müller, M.; Nicklin, P. Biochem. Soc. Trans. 1996, 24. 630637.

Introducción. Capitulo i - 44 ¡J

cadena, a mayor temperatura se produce la desnaturalización. Por lo tanto, la temperatura de

fusión es una medida de la estabilidad del híbrido y de la afinidad del oligonucleótido por su

ARN blanco y es un parámetro de interés a determinar para analizar la aplicabilidad de una

nueva modificación.

Además, la modificación debería, en teoria, también mejorar la penetración celular y la

distribución en células y tejidos para un blanco particular.

La hibridización de un oligonucleótido a su ARNm blanco puede llevar a la suspensión

del procesamiento, transporte o traducción del ARNm por bloqueo físico o por activación de la

RNasa H intracelular, que es una enzima que produce la hidrólisis del ARN de un dúplex híbrido

ARNzADN.Como la acción de esta enzima solamente degrada el ARNm, el oligonucleótido

permanece disponible para unirse a un nuevo ARNm blanco y puede actuar cataliticamente,

con lo cual tiene mayor actividad biológica. Desafortunadamente, esta enzima es muy sensible

a alteraciones estructurales del oligonucleótido antisentido, y la mayoría de las modificaciones

no son compatibles con este mecanismo. Más aún, la enzima reconoce híbridos ADN : ARN

muy cortos, de 4 a 6 pb solamente, y esto genera resultados inespecíficos RNasa H

dependientes debido a la hidrólisis de ARNs mensajeros de secuencias parcialmente

complementarias al oligonucleótido antisentido diseñado.57

Modificacionesquímicas pueden ser hechas sobre el azúcar, sobre el esqueleto fosfato

internucleotidico o sobre la nucleobase. El alcance de las modificaciones en la nucleobase está

bastante limitadodebido a que los requerimientos de la formación de pares de bases deben ser

respetados para mantenerla especificidad de Ia estrategia antisentido. De todas formas hay un

número considerable de oligonucleótidos modificados en sus bases que han demostrado ser

potencialmente útiles-53'59

El interés del laboratorio está centrado fundamentalmente en las modificaciones que

involucran el esqueleto fosfato y el azúcar. En lo que sigue se comentarán brevemente las

57Crooke, S. T. Biochím et Biopys. Acta 1999, 1489, 31-44.

5° Luyten. I.; Herdewijn, P. Eur. J. Med. Chem. 1998, 33, 515-578.59Herderwijn, P. Antisense and Nucl. Acids Drug Dev. 2000. 10. 297-310.

Introducción. Capitqu 1 - 45

modificaciones más difundidas de este tipo de análogos. Una descripción química detallada de

las modificaciones desarrolladas en oligonucléotidos pueden buscarse en la literatura.‘5°-l51

1.5.1.1-Modificaciones en el esqueleto fosfato.

BASE

5- oH

H

i use

O=lÍ—R¡o

o

H

o u

a. R1: CH3 R2: 0 metilfosfonatob. R1=NHAIqui R2=0 toslorarnidato

c. R1: S' R2: O losforotioatod. R1=O' R2=N (N3' '> P5') losforamidato

Figura 1.15. Modificaciones del esqueleto fosfato.

EIblanco de la acción de las nucleasas es eI fosfato intemucieotídico y, por Io tanto, las

primeras modificaciones ensayadas involucraban este grupo. Por otra parte, un problema

común asociado a estos compuestos aniónicos es la ineficiente permeación de las membranas

celulares. Basándose en esta observación, análogos neutros fueron desarrollados:

metilfosfonatos (figura 1.15.a) y fosforamidatos (figura 1.15.b). Estos oligómeros pueden ser

fácilmente preparados sobre soportes sólidos en sintetizadores automáticos. Aunque presentan

una incrementada resistencia a nucleasas, ellos exhiben una menor afinidad por el ARN,

respecto a las secuencias madres basadas en enlaces del tipo P-O. Esta reducida afinidad ha

sido atribuida al centro asimétrico generado en cada átomo de fósforo modificado, el cual en Ia

5°Seeberger, P. H.; Caruthers, M. H. Modified oligonucleotides as antisense therapeutics. En Stein, C. A.; Krieg, A.M. (Editors). Applied Antísense Oligonucleotide Technology. 1998, New York: Wiley-Liss, Inc._51-72.


síntesis en fase sólida conduce a la formación de mezclas diasteromén'cas con afinidad por el

ARN variable. El uso de estos análogos ha sido también limitado debido a la carencia de

reclutamiento de la RNasa H y, fundamentalmente, debido a problemas relacionados con una

persistente pobre penneación celular y baja solubilidad.

Los fosforotioatos, son los análogos más ampliamente estudiados (figura 1.14.c) y son

considerados "la primera generación de compuestos antisentido". Son fácilmente sintetizados

con alto rendimiento, sus híbridos con el ARN son reconocidos por Ia RNasa H y exhiben

incrementada resistencia a nucleasas y propiedades farmacocinéticas favorables. La pn'mera

droga aprobada por la FDA contiene esta modificación y otros fosforotioatos antisentido

mostraron resultados prometedores en ensayos clínicosfi2 A pesar de estos hechos, estos

análogos, como los metilfosfonatos, vuelven el enlace quiral, y entonces exhiben una leve

reducida afinidad. Sin embargo, la pn'ncipaldesventaja para su uso en el desarrollo de agentes

terapéuticos es su tendencia a unirse no específicamente a proteínas, lo cual puede ser la

causa de efectos laterales no deseados cuando son administrados ¡n vivo.‘53Así, esta

modificación no provee una solución completamente satisfactoria y general para el diseño de

inhibidores de la expresión génica potentes y altamente específicos.

Otra modificación del esqueleto fosfato recientemente desarrollada son los (N3'—>P5’)

fosforamidatos (figura 1.15.d), en los cuales el oxígeno 3' ha sido reemplazado por NH.

Aunque estas moléculas no activan Ia RNasa H, han mostrado alentadores resultados dado

que aumentan la temperatura de fusión dramáticamente y proveen una muy buena resistencia

a nucleasas.64

1.5.1.2- Modificaciones en el azúcar.

5‘ Freier, S. M.; Altmann, K. H. Nucl. Acids Res. 1997. 25, 4429-4443.

52Guga. P.; Koziolkiewicz, M.; Okuszek, A.; Stec, W. J. Oligo(nuc|eoside phosphorothioate)s. En Stein, C. A.; Krieg,

A. M. (Editors), Applied Antisense OIigonuc/eotide Technology. 1998, New York: Vlfiley-Liss,Inc., 23-50.53Srinivasan, S. K.; Tewary, H. K.; Iversen, P. L. Antisense Res.Dev. 1995, 5, 131-139.

5‘ Gryaznov, 8.; Skorsky, T.; Cucco. C.; Nierborowska-Skorska, M.; Chiu, C. Y.; Lloyd, D.; Chen, J. K.; Kozolkiewics,M.; Calabretta, B. Nucl. Acids Res. 1996, 24, 1508-1514.


BASE

É_ oR1

I R’

0=ï—0‘°—%

a.R1 H R2=F 2'-desoxi-2'-fiuoro|igonucleótidob.R1=H R2: NHz 2'-aminoZ'desoxioIigonudeótidoc.R1=H R2=O-alquil 2'-Oalquiloligombonudeótido

Figura 1.16. Modificaciones en el azúcar.

Una amplia variedad de modificaciones en el azúcar ha sido introducida en

oligonucléotidos para incrementar su afinidad y estabilidad a nucleasas. Las modificaciones que

han demostrado mayor utilidad involucran la posición 2', debido a que sustituyentes en esta

posición determinan Ia conformación del azúcar. Un sustituyente electronegativo desplaza el

equilibrio confonnacional hacia Ia conformación norte (C3'-endo) que es consistente con

dúplexes de ARN. Esta conformación en la hebra antisentido preorganiza la molécula para su

unión al ARN. Se observa que cuantomás electronegativo es el sustituyente en 2', mayor es el

desplazamiento y mayor es la temperatura de fusión. Asi, 2'-desoxi-2'-fluoroligonucleótidos

(figura 1.16.a) constituyen los híbn'dos más estables, no obstante, no muestran suficiente

resistencia a nucleasas para aplicaciones ¡n vivc. Por otro lado, los 2'-amino-2’

desoxioligonucleótidos (figura 1.16.b), debido a la más baja electronegatividad del átomo de

nitrógeno, tienden a adoptar Ia conformación sur (C2'-endo) y, por Io tanto, demuestran una

afinidad por el ARN reducida, respecto a los oligorribonucleótidos naturales.

Los 2'-O-alqu"oligorribonucleótidos65 (figura 1.16.c) también estabilizan el dúplex, con

55Iribarren, A. M.; Sproat, B. S.; Neuner, P.; Sulston, I.; Ryder, U.; Lamond, A. I. Proc. Natl. Ac. Sci. USA 1990, 87,7747-7751.

lntroduccxon. Capítulo ’l - 48

sustituyentes más pequeños resultando en una mayor estabilidad que los más grandes,

probablemente, debido a interferencia estérica de las cadenas alquilo mayores con otras partes

del dúplex o a disrupción de la estructura de solvatación del agua en la gruta menor de Ia doble

hélice. Por otro lado, sustituyentes más grandes en la posición 2’ mejoran la resistencia a

nucleasas. Considerando esta tendencia, fue sorprendente que los 2'-O-derivados del etilen

glicol, tales como los análogos 2’-metoxi-etoxi o 2'-metoxi-tn'oetoxi, mostraran una elevada

afinidad.66Este resultado puede ser explicado como una consecuencia de la preorganización

estructural de la hebra modificada debido a su conformación C3'-endo y a la orientación gauche

adoptada por los grupos etilenglicol, que permite la acomodación de la cadena lateral en la

gruta menory una hidratación favorable.67 Los 2'-O-a|quiloligonucleótidos son conocidos como

la segunda generación de compuestos antisentido.

Como los 2'-O-alquiloligorribonucleótidos no soportan el mecanismo de la RNasa H.

una estrategia para lograr una actividad catalítica consiste en el uso de análogos quimén'cos.

Éstos consisten en dos tipos de modificaciones puestas juntas en una misma molécula

antisentido, que permite aprovechar las propiedades beneficiosas de ambas químicas. En

general, tienen dos segmentos: uno contiene el derivado capaz de reclutar la RNasa H (como

los fosforotioatos) y otro provee una incrementada afinidad de unión al ARN (como los 2'-O

anuiloligornbonucleótidos). Resultados exitosos han sido obtenidos usando esta estrategia en

experimentos en cultivo de células y en modelos animales.68

Todos los conceptos discutidos más arriba indican que aún deben introducirse mejoras

en el diseño de oligonucleótidos antisentido para obtener agentes terapéuticos altamente

potentes, especificos y estables.

1.5.1.3-Avances de la terapia antisentido.

55Altmann, K. H.; Fabbro. D.; Dean, N. M.; Geiger, B. P. ; Müller, M.; Nicklin. P. Biochem. Soc. Trans. 1996, 24. 630637.

57Tereshko, V.; Portmann. 8.; Tay, E. C.; Martin. P.; Natt. F.; Altmann, K. H.; Egli. M. Biochemistry 1998, 37, 1062610634.

53Agrawal, S. Biochimica et Biophysica Acta 1999. 1489. 53-68.

Introd cción. Capitulo 1 - 49

El campo de la terapia antisentido ha atraído enormemente .Ia atención de la

comunidad científica durante Ia última década. Hay una gran cantidad de literatura reciente en

Ia cual se demuestra el mecanismo antisentido para la inhibiciónde proteinas responsables de

procesos patogénicos y un gran número de ensayos clínicos con oligonucleótidos que están

siendo llevados a cabo. Recientemente, Ia primera droga basada en esta estrategia ha sido

aprobada por la FDA (el VirtaveneTM,un fosforotioato para el tratamiento de retinitis inducida

por citomegalovirus en pacientes con SIDA)y más de una docena de nuevos oligonucleótidos

anitsentido se encuentran en varios estadios de los ensayos clinicos. En el año 2000 más de

200 patentes concemientes a secuencias antisentido fueron publicadas69 y, actualmente,

muchas de las empresas farmacéuticas importantes tienen un departamento dedicado al

desarrollo y aplicaciones de oligonucleótidos modificados para el tratamiento de diversas

enfermedades.

De las diferentes modificaciones ensayadas, los fosforotioatos (primera generación de

oligonucleótidos antisentido) son los que han sido más extensamente estudiados en van'os

sistemas modelo y muchos se encuentran en ensayos clinicos en humanos.7° Sobre la base de

los conocimientos ganados con estos análogos, la segunda generación de oligonucleótidos

antisentido (2'-O-alquiloligonucleótidos), que es superior a los fosforotioatos, fue introducida.

Sin embargo, el desarrollo de nuevas y más eficientes modificaciones es un área de continua

investigación.71

Entre las diversas aplicaciones de los oligonucleótidos en eI campo de la terapia, el uso

de estos compuestos como agentes antivirales ha demostrado resultados prometedores.72 Los

blancos involucran proteínas y enzimas que juegan un rol crucial en el ciclo de replicación

celular del virus. Entre los diversos virus cuya proliferación ha'sido inhibida mediante el uso de

59M Orr, R.; O'Neill, C. F. CUIT.Opin. Mol. Ther. 2000, 2, 325-331.

7°Agrawal, S. Trends Biotechnol. 1996, 14, 376-387.7‘ Stein, C. A.; Kn'eg, A. M. (Editors), Applied Antísense Oligonucleotide Technology. 1998, New York: Vlfiley-Liss,Inc.

72Agrawal, S.; Shao, Q. Curr. Opin. Chem. Biol. 1998, 2, 519-528.


oligonucleótidos antisentido se pueden destacar: el HIV,el citomegalovirus, el herpes simplex,

el virus de Epstein-Barr, el virus respiratorio sincitial, las heptatitis B y C, el papiloma virus

humano y el virus de la influenza. También se han realizado avances sustanciales en el uso de

oligonucleótidos para eI tratamiento de cánceres, que incluyen supresión de Ia expresión de

oncogenes (i.e. bcr-abl), factores de crecimiento (i.e. factor de crecimiento derivado de las

plaquetas, factor de crecimiento de fibroblastos, factor de crecimiento endotelio vascular, factor

de crecimiento transfonnante [3), factores de transcripción (i.e. c-Myb y c-Myc), proteínas

quinasas (i.e. proteína quinasa A y C-a, c-Raf y Prim-1), citoquinas (i. e. factor estimulante de

colonias de monocitos y granulocitos factor de tumor necrosis-on) y productos de genes de

resistencia a multi-drogas (i.e. BCI-2, MDM2-p53). Muchos oligonucleótidos dirigidos contra

estos blancos se encuentran en ensayos clínicos en humanos, en Ia tabla 1.|, se indican

algunos ejemplos.

Los resultados en diversos modelos de enfermedades apoyan la posibilidad del uso de

oligonucleótidos antisentido en combinación con otros agentes antivirales o para tratamientos

de cánceres y, por consiguiente, también se han usado oligonucleótidos antisentido en

combinación con otras drogas, para superar, por ejemplo, Ia resistencia a determinados

agentes.

Por otra parte, hay reportados estudios prometedores con oligonucleótidos antisentido

para el tratamiento de enfermedades causadas por bacterias, de procesos inflamatorios y de

enfermedades cardiovasculares.

No obstante, los progresos en esta área son evidentes, queda aún mucho por aprender

en cuanto a vectores de administración, desarrollo de nuevos análogos, respuestas inmunes,

farmacodinámica de los oligonucleótidos y sobre la traducción de los modelos de laboratorio a

estudios clínicos. Cabe destacar que progresos en aplicaciones especificas están siendo

llevados a cabo y Ia considerable actividad en el campo resultará en avances aún mayores.

PRODUCTO

o Formivirsen/ISI S 2922

o ISIS 2302

o ISIS 132

o GEM 91

o G 3139

o ISIS 3251/CGP 64128Ao ISIS 5132/CGP 69846A

ENFERMEDAD

CMV retinitis

Crohn’sdeseaseColitits ulcerosa

rechazo de transplantepsoriasisInfección sistémica CMVSIDA e infección HIV-1

Linfoma no-HodgkinAML, CML, AML/CMLCancer

Cancer

Introducción. Capituio 1 - 51

ENSAYO

Aprobado por FDA

FaseII

FasellFasellFaselhl

Fasel

Fase l

Tabla 1.I. Algunos oligonucleótidos antisentido que seencuentran en ensayos clinicos.

1.6- Ribozimas.

Las ribozimas son moléculas de ARN catalítico. El nombre deriva de una combinación

de ácido ribonucleico y enzima. La primera ribozima descubierta fue la ribozima del Gano 1,

una secuencia de 413 nucleótidos aislada del precursor del ARNr 268 de Tetrahymena

(errnophila.73En presencia de Mg" y de guanina, como cofactor, una secuencia determinada

de ese ARN fue escindida y los dos extremos remanentes fueron unidos entre sí. El hecho

remarcable fue que esta reacción ocurría en completa ausencia de proteínas. En 1983 otra

ribozima fue reportada, Ia M1 - ARN de Ia ribonucleasa P." En condiciones de alta

concentración de Mg“, el componente de ARN de este complejo de ARN —proteína pudo

hidroiizar su ARN sustrato, el pre-ARNt, para obtener el extremo 5' del ARNt maduro. El

descubrimiento del ARN catalítico revolucionó las hipótesis sobre el origen de Ia vida, desde

EMPRESA

Isis

Isis

Boen'ngerlngelheim

Hybridon

HybridonGenta/Lynx

Isis/Novartis

Isis/Novartis

73Kruger, K.; Grabowski. P. J.; Zaug, A. J.; Sands, J.; Gottschling, D. E.; Cech, T. R. Cell 1982. 31, 147-157.

introducción. Capitulo i - 52

que no sólo es capaz de crear un genotipo, como en los virus, sino también un fenotipo. Así, la

molécula primordial a partir de la cual evolucionó la vida podría haber sido un ARN

autorreplicante. Más aún, eI descubrimiento de nuevas ribozimas, el uso de técnicas de

selección ¡n vitro que ha permitido aislar secuencias con nuevas propiedades cataliticas, la

elucidación de estructuras y Ia comprensión de mecanismos de acción de una variedad de

ribozimas en los últimos años ha producido una explosión de aplicaciones potenciales.

1.6.1- Ribozima cabeza de martillo.

En línea con el trabajo de Altman y Cech, se demostró que una secuencia de ARN

aislada del ARN satélite del RSV (n'ngspot virus) del tabaco catalizaba in vitro su propia

hidrólisis]5 Otra secuencia con propiedades similares fue aislada del ARN satélite del SBV

(sunb/otch virus) de la palta30 y más tarde en otros ARNs patogénicos. La auto-hidrólisis de

estos ARNs son escisiones sitio-específicas de enlaces fosfodiéster en presencia de iones

metálicos divalentes, pero en ausencia de proteinas, para generar extremos OH-5’ y

fosfodiéster 2’-3’cíclicos terminales. Este proceso de auto-hidrólisis es necesario para la

replicación de estos ARNs circulares pequeños.

El análisis comparativo de estas secuencias reveló una estructura secundaria consenso

alrededor del sitio de hidrólisis?”7 Debido a la forma de T del modelo de la estructura

secundaria, esta clase de ribozimas fue llamada cabeza de martillo y es el motivo de ARN

catalitico más simple y más pequeño identificado hasta el momento (figura 1.17).

Experimentos de mutación y deleción, demostraron una secuencia mínima consenso

que es requerida para mantener la actividad. El dominio catalitico de Ia ribozima cabeza de

martilloconsiste en tres hélices de longitud variable y un núcleo formado por nucleótidos simple

cadena en la juntura de esas tres hebras doble cadena. Interesantemente, los nucleótidos

74Guerrier-Takada. C.; Gardiner, K.; Marsh. T.; Pace, N.; Altman, S Cell 1983, 35, 849-857.

75Buzayan, J. M.; Hampel. A.; Bruening. G. Nature 1986, 323, 349-353.

75Hutchings. C. L.; Rathjen, P. D.; Forster, A. C.; Symons, R. H. Nucl. Acids Res. 1986, 14, 3627-3640.

introducción. Capitulo t - 53

conservados están situados principalmente en esta región del núcleo responsable de Ia

actividad catalítica.

z-NI ‘u\\ ,

Brazo III N-MN'

N"..N' u u . l u u

¿MU srtrode hrdrolrsrsA14 X

x 5'->3' liy' N' N' NV \

l NNin ! l l l j‘.!il "Cm" NNNN\\//NNNRÁ Brazo]‘

Brazo II ¡1; G“ 'U ¡A 5;7 6.

Figura 1.17. Estructura secundaria de Ia n'bozimacabeza de martillo.

Se cree que la ribozima cabeza de martillo forma una estructura especifica

tridimensional, en la cual la unión del ión magnesio juega un importante rol estructural y

catalítico. A partir de estructuras de rayos X y de experimentos de mediciones de transferencia

de energia de resonancia de fluorescencia (FRET), de electroforesis en geles y de

birrefringencia eléctrica transiente se vio que la ribozima tiene forma de Y. Las hélices I y IIse

encuentran próximas y constituyen los brazos de la Y y Ia hélice lll constituye Ia base. La

secuencia conservada CUGA sufre un agudo giro (dominio 1), y la hélice lIse extiende a través

de pares de bases no convencionales G:A y AzG,y se empalma con la hélice Illde forma más o

menos colineal (dominio 2) (figura 1.18).

77Forster, A. C.; Symons, R. H. Cell 1897, 49, 211-220.

introducción, Capítulo 1 - 54

dA16.5U15.5

Figura 1.18. Estructura terciaria de Ia ribozima.

1.6.1.1- El mecanismo de hidrólisis de la ribozima cabeza de martillo.

Un mecanismo que involucra catálisis ácido-base, está implicado en la hidrólisis

mediada por la ribozima cabeza de martillo.A partir de experimentos donde reemplazaron uno

de los oxígenos del fosfato del sitio de hidrólisis por un átomo de azufre para obtener un Sp- o

un Rpfosforotioato se llegó a Ia conclusión que el mecanismo procede con inversión de Ia

configuración en el fósforo del sitio de hidrólisis. Se propuso, por consiguiente, un mecanismo

(ver figura 1.19) 73que consiste en un desplazamiento nucleofílico bimolecular (SNz), con un

ataque en línea del OH-2' al fósforo, que conduce a los productos através de 'Ia formación de

un estado de transición bipiramidal trigonal.

Por otro lado, para que Ia catálisis proceda eficientemente un ión metálico debe estar

unido directamente al oxígeno pro-Rpen el sitio de hidrólisis, según se demostró sobre Ia base

de experimentos de rescate de la actividad de ribozimas en las cuales ese oxígeno era

7°Van Tol, H.; Buzayan, J. M. Feldstein, P. A.; Eckstein, F.; Bruening. G. Nucl. Acids Res. 1990. 18, 1971-1975.


sustituido por azufre, cuando el Mg“ es sustituido por Mn*.79Esta coordinación aI oxígeno del

fosfato que no participa del puente fosfodiéster podria ayudar en Ia catálisis estabilizando el

estado de transición de Ia reacción. Se postuló también la existencia de un hidroxilocoordinado

a otro ¡ón metálico que podria actuar como base para desprotonar el OH-2' de la n'bosa. Es aún

un punto de controversia si uno o dos ¡ones metálicos son requeridos para la catálisis y cuáles

son los detalles precisos de la hidrólisis.

NH: 5' NH: 5 NHZ5 ww

‘0*P'c¿3 [í 5*picg / N O‘P/O [1:\ N \ N4 la N o0 o O o o o

H O0' \ 90o ¡“WM eïwmpbq'“ o__p/—-opro-R.\ '50 pro-R. o ' 0 R oH’P e ÉÏO pro-p—.. oI \ o’ MOH)(H:O)..¡]' + “5'O 0 wsp o pro-So

0 0OH

. 0

°“ OHo o OHA.” \ oA"

3.

Figura 1.19. Mecanismo de reacción mediado por la ribozima cabeza de martillo.(Puede haber uno o más iones metálicos involucrados en Ia catálisis.)

1.6.1.2- La ribozima cabeza de martillo como potencial herramienta en terapiagénica.

Las ribozimas cabeza de martillo naturales catalizan una reacción de hidrólisis

intramolecular; después de producida esta reacción las ribozimas quedan inactivas (figura

1.17). Desde este punto de vista, la acción de estas ribozimas puede ser considerada quasi

catalítica. Sin embargo, pueden ser diseñadas ribozimas cabeza de martillo que actúen en

trans, en las cuales dos moléculas de ARN pueden interactuar para formar una estructura

cabeza de martillo activa.80Esta construcción puede realizarse de forma que la mayoría de los

79Slim, G.; Gait, M. J. Nucl. Acids Res. 1991, 19, 1183-1188.

3°UIhenbeck, 0. C. Nature 1987, 328, 596-600.

introducción.Capitulo i -

nucleótidos conservados sean parte de un solo fragmento y el fragmento restante. que es el

que sufre Ia hidrólisis (fragmento sustrato), tenga muy pocos requerimientos, salvo Ia

complementariedad de bases con el fragmento de Ia ribozima propiamente dicho. La ventaja de

esta diseño es que Ia secuencia catalitica de Ia ribozima puede catalizar la hidrólisis de varias

moléculas de sustrato (recambio múltiple). El fragmento de Ia ribozima tiene una estructura

minima de alrededor de 30 nucleótidos que mantiene la actividad, que consiste en el núcleo

catalitico conservado y dos regiones flanqueantes complementarias a la secuencia del sustrato

(figura 1.20).

N N sustrato

ribozima N N\ AuA c

N A NNNNN NGNCG12 NNNNN

NNCNGA CG3 U4

U G7A5

Figura 1.20. Estructura mínima de una ribozima cabeza de martillotrans-activa que mantiene Ia actividad.

(Se señalan las secuencias de Ia ribozima y el sustrato.)

De acuerdo con este esquema es teóricamente posible el diseño de ribozimas cabeza

de martillo dirigidas a prácticamente cualquier secuencia blanco, generándose asi una con

actividad endorribonucleasa altamente especifica. Una atractiva aplicación de estas ribozimas

es la hidrólisis y, por lo tanto, la inactivación de transcriptos génicos ¡n vivo. Los genes son

expresados universalmente via transcriptos de ARN (ARN estructurales y funcionales o ARNm

para la síntesis de proteínas). Si estas secuencias génicas transcriptas son conocidas, seria

posible dirigir una o más ribozimas contra ARNs específicos y Ia actividad de estas ribozimas

podria ser la base para el desarrollo de una nueva clase de drogas basadas en el principiode


Ia terapia génica.

Las ventajas teóricas del uso de ribozimas cabeza de martillo como potenciales

agentes terapéuticos son:

- su pequeño tamaño, que posibilitasu eficiente preparación vía síntesis química,

- los pocos requerimientos de secuencia del sustrato, que hacen de la ribozima cabeza

de martillouna droga de aplicabilidad general,

- su acción catalítica, que implica que pueda producir el efecto inhibiton’odeseado a

una menor concentración que los correspondientes oligonucleótidos antisentido,

- que el ARNm hidrolizado, como resultado de la acción de la ribozima, es inactivado

biológicamente deforma irreversible.

Ribozimas ya han probado ser efectivos inhibidores de la expresión génica, tanto ¡n

vitro como in vivo!"-82

Con el fin de obtener agentes terapéuticos basados en ribozimas, es indispensable

modificar químicamente estas estructuras. Estas modificaciones, como en la estrategia

antisentido tradicional, deben conferir resistencia a nucleasas y características de hibn'dización

y penetración celular adecuadas. En el caso de ribozimas, como en otros análogos de ARN, el

diseño de nucleótídos modificados se vuelve más complejo, ya que un correcto plegamiento del

ácido nucleico es necesario para mantenerla actividad o función particular.

Hay reportados en literatura diversos estudios de ribozimas conteniendo nucleótídos

modificados que, no sólo son útiles para el desarrollo de ribozimas resistentes a nucleasas, sino

que también han permitido extraer información acerca del mecanismo de hidrólisis y de Ia

conformación activa de la ribozima y cuáles grupos son indispensables para Ia catálisis. Esta

información bioquímica sumada a estudios estructurales, ha permitido tener una idea de Ia

estructura de la ribozimaen su estado basal y de cuáles son los cambios conformacionales que

conducen al estado de transición y de qué grupos están involucrados en esos cambios. Sin

embargo, a pesar de la gran cantidad de estudios realizados hasta el momento, existen algunos

31Bramlage, B.; Luzí, E.; Eckstein, F. Trends Biotechnol. 1998, 16, 434-438.3?Usman, N.; Blatt, L. M. J. Clin. Inv. 2000, 106, 1197-1202.

lnïroduccion. Capítulo 1 v58

puntos que no han sido todavía resueltos relativos al número de los iones metálicos requeridos,

cuál es su posición en Ia estructura de Ia ribozima. con qué grupos interactúan y cómo

intervienen en la reacción catalizada por la ribozima. Tampoco está claro cómo es el

posicionamiento de los grupos en el estado de transición para lograr el ataque en línea del OH

2’ del sitio de hidrólisis al fósforo. Existen discordancias entre los resultados obtenidos de los

experimentos bioquímicos y aquellas interacciones identificadas en las estructuras de rayos X,

que todavía no han sido resueltas.

Los estudios con análogos reportados hasta el momento incluyen, entre otros, la

introducción de 2’-desoxinucleótidosfll84 fosforotioatos,35-352'-O-alqui| ARN (2'-metoxiB7y 2'-O

alilBB),2'-amino-,85,36-39-9° 2’-fluoro-‘3‘5-39'n91y 2’-C-alquil-2'-desoxinucleótidos.92 Entre todas las

modificaciones ensayadas, las modificaciones en la posición 2' resultan ser promison'as para su

introducción en ribozimas cabeza de martillodebido a que son fácilmente introducidas y a que

brindan estabilidad frente a nucleasas sin producir cambios notables en Ia estructura global de

la ribozima.

Desde Ia primera observación de catálisis de ARN hace veinte años por una gran

molécula de ARN en cís, se han hecho significativos avances en la aplicación de este concepto

básico de ARN enzimático al desarrollo de potenciales drogas. Es ahora posible diseñar

ribozimas cabeza de martillo trans activas, sintetizarlas y estabilizarlas químicamente,

administrarlas en células y testear su actividad en un creciente número de modelos celulares y

animales. A pesar de que muchos progresos quedan aún por hacer, el uso de ribozimas y

oligonucleótidos modificados como agentes terapéuticos parece ser un proyecto cada vez más

33Perreaull, J. P.; Labuda, D.; Usman, N.; Yang. J. H.; Cedergren. R. Biochemislry 1991, 30, 4020-4025.3‘Yang. J. H.; Usman, N.; Chartrand. P.; Cedergren, R. Biochemístry1992. 31, 5005-5009.35Shimaya, T.; Nishikawa. F.; Nishikawa. S.; Taira, K. Nucl. Acids Res. 1993, 21, 2605-2611.36Heidenreich, 0.; Benseler, F.; Fahrenholz, A.; Eckstein F. J. Chem. Biol. 1994. 269, 2131-2138.37Goodchild. J. Nucl. Acids Res. 1992, 20. 4607-4612.

3°Paollela. G.; Sproat, B. S.; Lamond, A. I. EMBO J. 1992, 11, 1913-1919.39Pieken, W. A.; Olsen, D. B.; Benseler, F.; Aurup, H.; Eckstein. F. Science 1991. 252, 314-317.9°Williams, D. M.; Pieken. W. A.; Eckstein, F. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 918-921.

9’ Olsen, D. B.; Benseler, F.; Aurup, H.; Pieken, W. A.; Eckstein. F. Biochemistry1991, 30, 9735-9741.

92Beigelman, L.; Karpeisky, A.; Matulic-Adamic. J.; Haeberli, P.; Sweedler. D.; Usman, N. 1995. Nucl. Acids Res.1995, 23. 4344-4442.

introducción. Capitqu ‘l - 59

factible.

1.6.1.2-Ensayos clínicos que involucran ribozimas como agentes terapéuticos.

Van'os grupos han demostrado Ia eficacia de las ribozimas en cultivos celulares y

modelos animales. Hasta Ia fecha, han sido reportadas tres ribozimas que se encuentran en

ensayos clínicos.93Una de ellas es una ribozima expresada a través de un vector retroviral y las

otras dos son ribozimas sintéticas. La primera está dirigida contra los exones tat y rev del HIV,

entró en las pruebas clínicas a finales de 1996 y actualmente está ensayos de fase lI en

pacientes con linfomas relacionados con SIDA. La segunda, ANGIOZYME,94tiene como blanco

el ARNm de FIt-1 (VEGF-R1), que es el receptor para el factor de crecimiento del endotelio

vascular. Esta ribozima antiagiogénica entró en ensayos de fase I a finales de 1998, en

ensayos de fase l/Ilen 1999 y actualmente superó los ensayos de fase IIpara varios tipos de

tumores. La tercera, HEPTAZYMEF’5es una ribozima dirigida contra Ia región 5' no traducida

del genoma del virus de la hepatitis C, ha completado recientemente los ensayos clínicos de

fase llllen pacientes con hepatitis C crónica. Estas ribozimas sintéticas resistentes a nucleasas

se generaron gracias a Ia incorporación de modificaciones químicas, en Ia posición 2' del

azúcar, principalmente 2'-O-metiln'bonuc|eótidos, que pudieron ser introducidos en todas las

posiciones con la excepción de aquellas en las cuales el OH-2' demostró ser importante para la

actividad. Estas ribozimas pueden ser fácilmente sintetizadas, pueden ser administradas

subcutáneamente o intravenosamente, tienen excelente especificidad, son bien toleradas,

demostraron no tener toxicidad significativa y funcionan bien en van'os modelos ¡n vitroein vivo.

La eficacia clínica de estas dos ribozimas está siendo ensayada actualmente. Si estas

ribozimas, u otras que se encuentran en desarrollos preclínicos, muestran un efecto clínico

adecuado, entonces Ia utilidadde ribozimas nucleasas-resistentes en medicina será un objetivo

93Usman, B. y Blatt, L. M. J. Clin. Inv. 2000, 106, 1197-1202.

9‘ Weng, D. E.; Usman, N. Curr. Oncol. Rep. 2001, 3, 141-146.95Lee, P. A.; Blatt. L. M.; Blanchard, K. S.; Bouhana, K. S.; Pavco, P. A.; Bellon. L.; Sandberg, J.A. Hepatology2000. 32. 640-646.

introducción, Capítulo i - 60

alcanzable, y muchas otras aplicaciones serán factibles. Las ribozimas sintéticas están

emergiendo como una nueva clase de agentes terapéuticos de amplioespectro.

1.7-Alcance de la Tesis.

Dado el creciente interés en el ARN, debido principalmente al descubrimiento

moléculas de ARNcon actividad catalítica y con estructuras terciarias tales que son capaces de

reconocer ligandos particulares (aptámeros), la obtención de cantidades importantes de ARNse

ha vuelto una necesidad esencial en el campo de la biofísica, biología molecular y para el

descubrimiento de nuevas drogas. Un primer objetivo de este trabajo consistió, por lo tanto, en

la puesta a punto en nuestro laboratorio de una metodología eficiente y confiable para la

síntesis en fase sólida de oligorribonucleótidos.

Teniendo en cuenta que los oligorribonucleótidos son particularmente susceptibles al

ataque de nucleasas existentes tanto en suero como dentro de las células, el desarrollo de

modificaciones químicas es esencial para sus aplicaciones biológicas. Entre las diversas

modificaciones posibles, las modificaciones en la posición 2' demostraron ser prometedoras.

Los 2'-O-alquiloligorribonucleótidos y otros mímicos de ARN probados hasta el momento, como

los 2'-amino- y 2’-fluoro-2’—desoxioligonucleótidos, carecen del OH-2'. Este hidroxilo, rasgo

distintivo del ARN, en determinadas posiciones demostró ser esencial para el plegamiento de

moléculas de ARN en conformaciones activas, como en los casos de ribozimas modificadas,

inhibidores de ribozimas, y aptámeros.

Considerando este hecho, proponemos un nuevo análogo de ARN modificado en el

azúcar, los 2’-C-metilnucleótidos, (figura 1.21) que conserva el 0H-2'. Esperamos que,

cuando un 2'-C-metilnucleótido sustituya a un ribonucleótido particular, proveerá un grupo OH

2' capaz de reproducir las interacciones terciarias de la ribosa natural. Adicionalmente, la

presencia del metilo se supone brindará resistencia a nucleasas y, por consiguiente, estabilidad

en fluidos biológicos.

introducción. Capítulo 1 - 61 —

B’E0

É II_o—r0- CH

0 OH

Figura 1.21. 2'-C-meti|nuc|eótidos.

Para sustentar la hipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación, era importante

que la orientación del OH-2' fuera la misma en los 2’-C-meti|nuc|eótidos que en los

ribonucleótidos naturales. Esta presunción se basaba en estudios realizados previamente en

nuestro grupo con compuestos relacionados los (2’S)-2'desoxi-2'-C-metilnucleósidos que

mostraron que la conformación preferida adoptada por el azúcar de estos compuestos es la

misma que la de los nucleósidos naturales.“ Dado Io cual, era razonable suponer que en

nuestro caso la presencia del OH-2' era un factor adicional que acentuaria Ia tendencia del

azúcar de los 2'-C-metilnuc|eósidos a adoptar la conformación del ARN. Para corroborar esta

conjetura, realizamos inicialmente una minimización por mecánica molecular de los 2’-C

metilnucleótidos, de la cual resultó que Ia conformación del azúcar era C3'-endo. Dado que esta

modificaciónseria útilen el desarrollo de análogos de ARNresistentes a nucleasas, en aquellas

posiciones donde la presencia del OH-2' es requerida para un correcto plegamiento o para una

función particular, elegimos como modelo para poner a prueba nuestra hipótesis la ribozima

cabeza de martillo. Elegimos la ribozima cabeza de martillo, por ser una molécula de interés

para el desarrollo de nuevas drogas. Esta molécula, por un lado, ha sido profundamente

investigada, su estructura y condiciones óptimas de actividad son conocidas y ha demostrado

ser eficiente en la inhibición especifica de Ia expresión génica in vitro e ¡n vivo. Por otro lado,

continúa siendo una molécula atractiva para su estudio, ya que quedan aún ciertos puntos por

95Cicero. D. 0.; Iribarren, A. M.; Bazzo. R. Appl. Magn. Reson. 1994, 7, 95405..


develar para lograr una comprensión completa de su compleja relación estructura-función.

Además, no se ha encontrado una modificación o conjunto de modificaciones que permitan

obtener ribozimas Io suficientemente estables y resistentes, y a que algunas posiciones han

debido permanecer hasta el momento sin modificar para retener una actividad apreciable.

Como primera aproximación, realizamos un estudio computacional de la ribozima tomando

como base una estructura de rayos X, disponible en una base de datos. lntrodujimos nuestra

modificación en las posiciones en las cuáles se habían detectado interacciones del OH-2',

realizamos una minimizaciónenergética y analizamos si esas interacciones se mantenían y si Ia

estructura global de la ribozima no se alteraba como resultado de Ia introducción de nuestra

modificaciónen esas posiciones determinadas. Los resultados de este estudio fueron positivos,

con Io cual, teníamos un punto de partida para comenzar el desarrollo de estos nuevos

monómeros.

Empezamos con la preparación de la uridina modificada. Realizamos, por consiguiente,

la preparación estereoselectiva de Ia 2'-C-metilun'dina y Ia generación final de la fosforamidita

correspondiente, propiamente protegida para Ia síntesis de oligonucleólidosen fase sólida.

Sobre Ia base de mediciones de RMN,de NOE y de constantes de acoplamiento homo

y heteronucleares, establecimos Ia configuración del C2' y la conformación preferida de la 2’-C

metilun'dina que resultó ser Ia misma que Ia de la un'dina natural. Hicimos una comparación de

los datos confonnacionales obtenidos experimentalmente por RMN con aquellos surgidos de

estudios de química computacional usando métodos semiempíricos y ab ¡nitío y con una

estructura emanada de cnstalografia de rayos X llevada a cabo previamente por otro grupo.

Pusimos a punto las condiciones para la sintesis en fase sólida de oligonucléotidos

conteniendo esta modificación, así como también condiciones adecuadas para su

desprotección y purificación.

Adicionalmente, a pesar de que la modificación no tenía como fin ser usada en el

diseño de oligonucleótidos antisentido, nos interesaba ver cómo era la afinidad por hebras

complementarias de oligonucleólidos conteniendo esta modificación. Teniendo en cuenta Ia

relación entre la conformación del azúcar y Ia afinidad de unión por el ARN como una variable

lntroducción. Capitulo 1 - 63

importante en el diseño de oligonucleótidos modificados, los derivados 2'-C-alquilo presentan

un caso interesante. Una mayor afinidad de unión aI ADN y al ARN se ha atribuido a una

conformación preferencial C3‘-endo de los azúcares, que preorganiza la hebra modificada para

adaptarse a la formación de un dúplex del tipo del ARN,que es más estable que la doble hélice

formada por ADNzADN. Sin embargo, oligonucleótidos conteniendo (2'S)-2'-desoxi-2’-C

metilnucleótidos, cuya conformación, como se mencionó más arriba, es C3'-endo, no

demostraron tener una afinidad incrementada por el ARN respecto de los

oligodesoxinucleótidos.97_98Para estudiar la influencia de Ia presencia de un grupo metilo en la

cara a del azúcar y la presencia de un átomo electronegativo en 2' en la afinidad de

oligonucléotidos modificados por hebras complementarias se sintetizaron

oligodesoxinucleótidos conteniendo: un'dina, 2'-C-metil y (2’S)-2’-desoxi-2'-C-metiluridina en

determinadas posiciones y se analizó su afinidad por ADNy ARN.

Finalmente, quisimos probarla hipótesis que esta modificación aportaría estabilidad a

nucleasas y un OH-2' quemimetiza las interacciones de los ribonucleótidos naturales en un

modelo biológico concreto, la ribozima cabeza de martillo. El problema entre el balance de

resistencia a nucleasas y actividad catalitica ha sido recientemente superado en forma parcial a

partir del diseño y síntesis de ribozimas genéricamente modificadas con aumentada estabilidad

a nucleasas y que conservan la actividad. Estas ribozimas contienen 30 residuos modificados

en la posición 2’ del azúcar (2’-O-metilribonucleósidos) y 5 pun’n-ribósidos esenciales son

mantenidos en las restantes posiciones. Las posiciones de las uridinas del núcleo catalitico

deben ser, además, modificadas alternativamente para obtener tiempos de vida razonables, ya

que las endorribonucleasas atacan preferencialmente a las pirimidinas, y la introducción de 2'

O-metiluridinas en esas posiciones disminuye importantemente la actividad. Sintetizamos y

purificamos, por lo tanto, estas ribozimas quimera conteniendo 2'-O-metil y ribonucleótidos y

nuestra modificación en las posiciones 4 y 7 del núcleo catalitico. Analizamos su actividad in

vitroy la estabilidad en diversos fluidos biológicos.

97Schmidt, C.; Bévierre, M. 0.; De Mesmaeker, A.; Altrnann, K, H. Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994, 4, 1969-1974.9°Cicero, D. 0.; Gallo, M.; Neuner, P. J.; Iribarren, A. M. Tetrahedron 2001, 57, 7613-7621.

Pan‘e B

Parte Experimental

Capítulo 2

Parte Experimental, Capítulo 2 - 65

Parte experimental

2.1- Materiales.

2.1.1- Reactivos.

Acetato de etiloAcetonitrilo

Acido acéticoAcido bóricoAcido clorhídrico (c)Acido etilendiaminotetracéticoÁcido fosfórico

Ácido p-toluensulfónico monohidratoÁcido dicloroacéticoÁcido tricloroacético

Ácido sulfúrico (c)AcrilamidaAdenosina

Agua deuteradaAlcohol ¡soamílico

Amoníaco (c)Anhídn'do acéticoAnhídn‘do4-tert-butilfenoxiacético / THF

ArgónAzul de bromo fenolBenzofenonaBicarbonato de amonioBicarbonato de sodio

J. T. BakerJ. T. BakerMerck

Merck

MerckGIBCO BRL

J.T.BakerICN BiomedicalsAIdrich

AIdrich

MerckGIBCO BRLPharma WaldhofAIdrich

AIdrich

MerckJ. T. Baker

ProligoAGA

SumaRiedel-de HaénRiedel-de HaénMallinckrodt

Bisulfito de sodioBorohidruro de sodioBromuro de metiltrifenilfosfoniotert-Butanol

n-Butil litio 1,6 M en hexanoCarbonato de sodio

fi-Cianoetoxi-N,N-d¡isopropilaminoclorofosfinaCilidinaCloroformoCloroformodeuteradoCloruro de amonioCloruro de benzoíloCloruro de oxaliloCloruro de t-butildimetisililo

Cloruro de 4,4'-dimetoxitritiloCloruro de sodioCloruro de mesitileno

Cloruro de p-toluensulfoniloCloruro de trimetilsililo

1,4-Diazabiciclo[2,2,2]octanoDibenzo-18-corona-6

2,5-DiclorofenolDicloroetanoDiclorometano

Dietilpirocarbonato3,4-Dihidro-2H-piranoN,N-Diisopropiletilamina4-DimetilaminopiridinaDimetilfonnamidaDimetilsulfóxidoDimetilsulfóxidodeuteradoDioxano

Eter de petróleo (35-60 °C)Eter etílicoEtanol absoluto

Fase sólida (ADN)Fase sólida (2'-O-MeARN)Fase sólida (ARN)Fluoruro de tetrabutilamonio 1 M en THF

Fosforamiditas (ADN)Fosforamiditas (2'-O-ARN)Fosforamiditas (ARN)Glicógeno

Darle Experimenïal. Capitulo 2 - 56

J.T.BakerAldrich

Aldrich

J. T. Baker

Acros OrganicsMallickrodt

ChemGenesPharma WaldhofMerckAldrich

MerckPanreacAldrich

Aldrich

ICN BiomedicalsMerckAldrich

Aldrich

ICN

Aldrich

Aldrich

Aldrich

J. T. BakerJ. T. BakerAmrescoAldrich

Aldrich

FlukaJ. T. BakerJ. T. BakerAldn'ch

MerckJ. T. BakerMerck

Merck

CPG

ProligoProligoAldn'ch

CPG

ProligoProligoBoehringer Mannheim Biochemica

Hidróxido de sodioHidruro de calcio

Hidruro de potasioIsopropil tn'metilsililéterlodo

2,6-LutidinaMarcador de PM de ADNMetanol

Metilamina 41 % en aguaN-MetilpirrolidinonaN,N’-MetilenbisacrilamidaN-MetilimidazolN-Metilmorfolina óxido monohidrato

Nitrógeno2-NitrofenolPentóxido de fósforoPersulfato de amonioPin'dinaSulfato de sodio anhidroTetrahidrofurano1H-Tetrazol

N,N',N’,N’-Tetrameti|endiamina

1,1,3,3-Tetraisopropi|-1 ,3-diclorodisiloxanoTetróxido de OsmioToluenoTn'etilaminaTn'flato de t-butildimetisililoTrihidrofluoruro de trietilamonioTrimetilclorosilanoTn'óxido de cromo

Tn's[tris(hidroximeti|)aminometano]-hidrocloruroUreaUn'dinaXileno cianol

Parte Experimental. Capilqu 2 - 67

Merck

Aldn'ch

Aldn'ch

AIdn'ch

MerckAIdrich

GlBCO BRLJ. T. BakerFlukaFlukaGlBCO BRLICN BiomedicalsMerck

AGA

Aldn'ch

Merck

GIBCO BRL

J. T. BakerJ. T. BakerJ. T. BakerAmen'can International ChemicalGIBCO BRL

GelestAIdrich

J. T. BakerPharma WaldhofAIdrich

AIdrich

FlukaAnedraGIBCO BRL

GIBCO BRLPharma Waldhof

Suma

2.1.2- Cromatografía y material para purificación.

Columna HPLC Kromasil 100 C13(5 um 25 x 0.4)

Placas de aluminiode silica gel 60qu (t.|.c.)Resina AG 50W-X2Resina Dowex 50Wx4-200

Sephadex G-50 (NlCK)y G-25 (NAP-10)

Teknokroma

MerckBio-RadBio-RadPharmacia Biotech

Sílica gel, con partícula de poro 20-45 ,um y 6-35 pm

Sílica gel 60F, grano 230-400Cartuchos de fase reversa: ABIMasterpiece OPC

2.1.3- Enzimas.

T4 polinucleótido quinasaRibonucleasa A

2.1.4- Radioisótopos.

y-32P-Adenosina trifosfato

2.1.5- Buffers.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

TBE5x

Bufferde siembra

HPLC

TEAA 10 x

Bicarbonato de amonio

Reacciones de marcación con 32Pen extremo 5'

T4 polincleótido quinasa

Buffer A 10

Parte Experimental. Capituio 2 - 68

Amicon

Merck

Applied Biosystems

MBIFennentasAmersham Phannacia Biotech

DuPont NEN

Tris-HCI 445 mM, pH 8.3Ácido bón'co 445 mM

EDTA 1o Mm

Azul de bromofenol 0.1 %Xileno cianol 0.1 %TBE 1 x

urea 7 M

Acetato de tn'etilamonio 1 M, pH 7

Bicarbonato de amonio 0.1 M, pH 7

(MBIFermentas)

Tris-HCI 500 mM, pH 7.6

MgCIz 100 mMDTT 50 mM

Spermidina1 mMEDTA1 mM

BufferB 10 x

Reacciones catalizadas por las Ribozimas

Bufferde reacción

Solución stop

Precipitación de Ribozimas

Bufferacetato de sodio

Lisado de células 293

Bufferpara tratamiento hipoosmótico

2.1.6- Cultivo de células.

Línea celular 293Medio de cultivo

D-MEM / F-12, 1:1Suero fetal bobinoBuffer fosfato salino

Placas radiográficas

Parte Experimental. Capítulo 2 - 69

ImidazoI-HCI 500 mM, pH 6.4

MgCl20.18 mMDTT 50 mM

Spennidinai mM,EDTA1 mM

ADP1 mM

Tris-HCI 50 mM, pH e

MgClz 11 mMEDTA1 mM

NaCI 100 mM

Urea 7 M

EDTA 50 mM

Acetato de sodio 3 M, pH 5.2

Tris-HCI 50 mM, pH 7.4.

DSMZ

GIBCO BRLGIBCO BRLGIBCO BRL

Kodak Scientific Imaging Film

(X-OMAT AR)

CJerte Experimental. Capítulo 2 - .70

2.2- Métodos generales y equipamiento.

° Para el estudio computacional de la ribozima se usó el programa Siby16.2 de Tn'pos.

El modelado molecular lo hizo un paquete de Amber 4.1,1 sin Ia utilización de gradientes en una

computadora Silicon Graphics. La estructura de la ribozima con la que se trabajó es la

estructura de rayos X dilucidada por Pley et al.2 que fue tomada de la base de datos PDB. La

estructura del azúcar fue modificada y la conformación del nucleósido optimizada a través de

secuencias de 100 minimizaciones.

- Las punficaciones se realizaron empleando técnicas cromatográficas, utilizando

sílica gel, con partícula de poro 20-45 pm ó 6-35 p y sílica gel 60, grano 230-400. El análisis y

seguimiento de las reacciones fueron llevados a cabo por cromatografía en capa delgada

(c.c.d.) usando placas de aluminio de silica gel 60F254.Los componentes fueron localizados por

observación de las placas bajo lámpara UV a 254 nm y los productos dimetoxitn'tilados fueron

detectados como manchas naranjas por tratamiento con H2804 / EtOH, 8 : 2, y calentamiento.

lodo se usó también como revelador en los casos que fue necesario.

- Las evaporaciones fueron llevadas a cabo usando un evaporador rotatorio Büchi

equipado con una trampa refrigerante de -100 ° C FTS Systems y una bomba de alto vacio.

- El THF fue reflujado sobre sodio metálico usando benzofenona como indicador de

anhidrez y luego destilado a presión atmosférica. La DMFfue secada por calentamiento a 100

°C con hidruro de calcio y luego destilada a presión reducida. La TEA, Ia Py y el dioxano fueron

secados por calentamiento, bajo reflujo, con hidruro de calcio y destilados a presión

atmosférica. El DCM fue de grado HPLC.

- Todos los reactivos sensibles a la humedad fueron transferidos via jeringa bajo

presión positiva de nitrógeno o atmósfera de argón. las reacciones sensibles a la humedad

fueron llevadas a cabo bajo presión positiva de argón.

1 Pearlman, R. S. NIDA Res. Monogr. 1991, 112, 62-77.2 Pley, H. W.; Flaherty, K. M: McKay. D. B. Nature 1994. 372, 68-74.


° Las estructuras fueron determinadas usando resonancia magnética nuclear de 1H,

13Cy 31Pen un equipo Brucker de 500 MHz o de 200 MHz. Los espectros fueron registrados en

CDCla o DMSO-ds usando tetrametilsilano (0.00 ppm, 1H-RMN)y CDC|3 (76.95 ppm, 13C-RMN)

como estándares internos y H3PO4 (0.00 ppm, 31P-RMN) como estándar externo. Los

desplazamientos químicos (6, ppm) citados como multipletes están referidos al centro

aproximado de la señal.

- Las constantes de acoplamiento 1H-13Cfueron medidas aplicando el experimento

sensible a fase HMBC sobre una muestra 20 mM del compuesto 8 en agua deuterada,

registrado a 400 MHzy a 25 °C en un espectrómetro Bruker Advance equipado con una sonda

de detección inversa de gradiente z-protegido. La detección de los tiempos t1y tz fueron 1.3 seg

(ancho espectral 6410 Hz, 8 K datos de puntos complejos) y 3 mseg (ancho espectral 20,100

Hz, 64 datos de puntos reales), respectivamente. EI período de relajación fue de 2 seg; fueron

acumulados 80 escaneos por incremento de t1).3

- Para el estudio confonnacional de Ia 2’-Ometiluridina se realizó primeramente una

preminimización de los 2’-C-meti|nucleósidos usando mecánica molecular (campo MM*,

programa HyperChem 5.0). Luego la 2'-C-meti|uridina se re-minimizó usando métodos

semiempíricos, con el programa MOPAC (métodos AM1 y PM3), y uno ab ¡nitiocon el programa

Gaussian 98, usando como bases 6-31 G y 6-311 G, Hartee Fock restringida, para comparar

estos resultados con los obtenidos por RMN.

- Los oligonucleótidos fueron sintetizados en un sintetizador automático ABI 392,

mediante el método de las ls-cianoetil fosforamiditas, usando tetrazol como activador y TCA

como agente detn'tilante. En el caso de oligodesoxinucleótidos las fosforamiditas fueron 5'-O

DMTr-timidin-lS-cianoetil fosforamidita; N-6-benzoíI-5‘-O-DMTr-adenosin-lS-cianoetil

fosforamidita; N-4-benzoíl-5'-O-DMTr-citidin-lS-cianoetil fosforamidita y N-2-isobutinl-5'-Q-DMTr

guanosin-ÍS-cianoetil fosforamidita y la fase sólida correspondiente (CPG) fue de poro de 500 Á.

Para los oligorribonucleótidos y los 2'-O-metiloligorribonucleótidos, las ls-cianoeti¡fosforamiditas,

estuvieron protegidas en 5' con DMTr,en 2' con TBDMS (para las ribo) y en los grupo amino de

3Cicero, 0.0., Barbate, G.. Bazzo. R. J. Magn. Reson. 2001. 148, 209-213.

Parte Experimental. Capitqu 2 - 72

las bases, adenina, citosina y guanina, con (4-tert-butiIfenoxi)-acetilo(quimica de desprotección

rápida), y la fase sólida fue también,de 500 Á con los nucleósidos convenientemente protegidos

unidos covalentemente a la misma. Los solventes utilizados para las síntesis fueron calidad

HPLC, ei ACN de bajo contenido de agua. Las soluciones empleadas fueron tetrazol 0.5 M en

ACN; 2,6-Iutidina / anhídrido acético / THF, 1 : 1 : 8 (v/v/v); N-metilimidazol / THF, 4 : 21 (v/v);

TCA 3 % (m/v) en DCM y DCA 2.5 % (mlv) en DCE, todas ellas preparadas en el laboratorio en

condiciones de estricta anhidrez. La solución de agente oxidante, ¡odo 0.02 M en THF / Py /

agua, 7 : 2 : 1 (v/v/v), también fue preparada en el laboratorio. La solución de enmascaramiento

para las sintesis de oligonucleótidos con amiditas del tipo de quimica de desprotección rápida

contenía anhídrido 4-tert-butilfenoxiacético / tetrahidrofurano.

- Las purificaciones por HPLC de fase reversa de los oligos fueron realizadas en un

cromatógrafo GILSON (módqu manométrico 805, mezclador dinámico 811B, bombas 305 y

306, detector UV modelo 116). El integrador fue Shimadzu, Chromatopac C-R6A. EI

espectrofotómetro UV / visible con el cual se cuantificaron los oligonucleótidos fue Ultrospec

2000, Pharmacia Biotech. Las evaporaciones de los oligos se llevaron a cabo en un

concentrador rotatorio SAVANTconectado a una trampa refrigerante FTS Systems de - 100 °C

y a una bomba de alto vacio.

- Una vez desprotegidos los grupos OH-2‘de los oligorribonucleótidos, se trabajó con

ellos en condiciones de esterilidad. Los buffers y soluciones fueron preparados con agua tratada

previamente con DEPC 0.1 % (v/v) y autoclavada dos veces durante 15 min. Los tips y

eppendorfs fueron autoclavados antes de usar, y las botellas y balones de vidn'o fueron

enjuagados con agua tratada con DEPC y también autoclavados.

- El contador de centelleo utilizado fue un contador de centelleo líquido modelo

Rackbeta Wallac.

- Se realizaron electroforesis en geles de poliacrilamida al 20 %, urea 7 M, para estudiar

la cinética ¡n vitro de las ribozimas y para analizar Ia estabilidad de las mismas frente a distintos

fluidos, y en geles de poliacrilamida al 10 %, urea 7 M, para purificar las ribozimas. Para preparar

20 ml de gel se mezclaron 10 g de urea, 4 ml de buffer TBE 5 x, 10 ml de una solución 40 % m/v

acrilamida / N,N’-meti|enbisacrilamida, 29 : 1, para los geles de poliacrilamida al 20 % y 5 mI para

Parte Experimental. Capitulo 2 - 73

los geles de poliacrilamida al 10 %. Se ajustó el volumen final a 20 ml con agua destilada. Se

calentó para disolver la urea y se dejó a temperatura ambiente. Para iniciar la polimen’zaciónse

agregaron 200 ul de persulfato de amonio y 60 ul de TEMED. EI buffer de corrida fue TBE 1 x. Las

muestras se sembraron disueltas en el bufferde siembra.

Las corridas se realizaron a 350 V y a 16-20 mA usando una fuente de poder de 500V/

400 mA, EMBL. Previamente a sembrar las muestras se corrió el gel 30 min y las muestras

disueltas en el buffer de siembra se incubaron 3-5 min a 95 °C, se llevaron a 0 °C, se

centrifugaron y se sembraron inmediatamente.

Los marcadores BP y XC migran como oligonucleótidos de 12 y 55 bases,

respectivamente, en geles de poliacrilamidaal 10 %; y como oligos de 8 y 28 bases en geles de

poliacrilamida al 20 %.

- Para visualizar las bandas se expusieron los geles a placas radiográficas un tiempo

adecuado que fueron posteriormente reveladas. Los cálculos cuantitativos se hicieron con un

Phosporlmager (Molecular Dinamics).

- La linea celular 293 fue establecida a partir de células de un riñón de embrión humano,

transformada por adenovirus tipo 5, su riesgo fue clasificado como clase 1. Las células se

cultivaron en medio D-MEM/ F-12, 1 : 1, suplementado con 10 % de SFB. Se cultivaron a 37 °C

en atmósfera conteniendo 5 % de C02.

o Las temperaturas de fusión de los oligonucleótidos se midieron en espectrofotómetro

Cary 3E (Varian)con controlador de temperatura.

2.3- Metodología.

2.3.1- Síntesis de los monómeros.

4 Robins. M. J.; Wilson, J.S.; Hansske, F. J. Am. Chem. Soc. 1983. 105. 4059-4065.

Parte Experimental. Capítqu 2 - 74

KK”/° N/koO

.Y \ Rf:0.40en EP/ AcOEt,1 :2

me o“ Rendimiento:90-95 %

O-—!’

Un'dina (4.880 g, 20 mmol) se evaporó dos veces a presión reducida de Py anh. y

posteriormente se disolvió en Py anh. (50 ml). A esta solución enfriada en hielo se Ie agregó

gota a gota una solución de 1,3-dicloro-1,1,3,3-tetraisopropildisiloxano (70 ml, 22.3 mmol, 1.15

eq) en DCMseco (5 ml). AIfinalizar esta adición, se llevó la mezcla a temperatura ambiente. La

reacción se siguió por c.c.d., completándose luego de 2-3 h. Se detuvo la reacción con MeOH (3

ml) y se evaporó el solvente al vacío. Se disolvió el residuo en AcOEt (0.15 I) y se Iavó la

solución con NaHCOa 1 M (2 x 0.10 l). Se secó la fase orgánica sobre Na2804 anh., se filtró y se

evaporó en vacío, obteniéndose el producto que se usó sin mayor purificación para la siguiente

reacción.

Espectro de 13C RMN (CDCIa): (6, ppm) 12.4, 12.8, 12.9, 13.3 (CHs isopropilos); 16.2, 16.3,

16.8, 17.5, 17.9 (CHas isopropilos); 60.3 (C-5'); 68.9 (C-3'); 73.2 (C-2'); 80.9 (C-4'); 90.5 (C-1');

100.9 (C-5); 139.7 (C-6); 150.1 (C-2); 162.9 (C-4).

Espectro de 1H RMN (CDCla): (6, ppm) 0.85-125 (m, 16H, CH(CH3)2);3.72 (sa, 1H, OH); 4.00

(dd, 1H, J5',5"= 12.9 Hz, Js',4-= 2.2 Hz, H-5"); 4.05-4.40 (m, 4H, H-2', H-3', H-4' y H-5'); 5.70 (d,

1H, J5_s=8.1 Hz, H-5); 5.74 (s, 1H, H-1'); 7.75 (d, 1H, J5,5= 8.1 Hz, H-6); 9.83 (sa, 1H, NH).

2’-Oxo -3’5'-O- 1 1 33-tetraiso ro ¡ldisiloxan-1 3-d¡¡lun'dina (3).5

(KH/° o Mr:484

i"

YK Rf:0.47en EP/ AcOEt,1 : 2

Yïo o Rendimiento:80%

5 Hansske, F.; Majed, D.; Robins, M. J. Tetrahedron 1984, 40. 125-135.


A- Oxidación con trióxido de cromo: Seis mililitrosde anhídrido acético y 10 mI de Py se

agregaron a una suspensión de 6 g de tn'óxidode cromo en 200 ml de DCMy la mezcla se agitó

a temperatura ambiente aproximadamente 15 min. El compuesto 2 (9.20 g, 19 mrnol) disuelto

en 60 mIde DCMseco se agregó ala suspensión del tn‘óxidode cromo previamente enfriada en

hielo. Se dejó 1 h agitándose a temperatura ambiente. Cuando Ia reacción se completó, se

volcó la mezcla de reacción sobre 1.8 I de AcOEt frío y se filtró con microfibra de vidrio poro 4.

EI filtrado se concentró (temperatura menor a 25 °C). EI compuesto 3 se puriflcó en una

columna de sílica gel (EP —>AcOEt / EP, 1 : 3).

B- Oxidación de Swem: Se agregó gota a gota una solución de cloruro de oxalilo (0,14

ml, 1.6 eq) en DCM destilado anh. (0,55 ml) a -78° C a una solución de 0,13 ml (2.5 eq) de

DMSO en 0,96 ml de DCM. Se dejó agitando cinco minutos y entonces se agregó gota a gota

una solución de 2'-cetourídina protegida con el puente disiloxano (500 mg, 1 mmol) en 2,8 ml de

DCM. Se dejó agitando quince minutos a - 78° C. Se cortó la reacción con 0,7 ml de TEA y se

agitó cinco minutos a Ia misma temperatura antes de llevar a temperatura ambiente.

Posteriormente, se extrajo con ss de NaHCOa y se lavó con agua. Se secó con Na2804 y se

obtuvo el nucleósido oxidado con 80 % de rendimiento.

Espectro de 1¿“CRMN (CDCIa): (6, ppm) 12.6, 12.8, 13.0, 13.1 (CHs isopropilos); 16.2, 16.3,

16.6, 16.9, 17.1 (CHasisopropilos); 62.03 (C-5'); 71.33 (C-3'); 80.45 (C-4'); 84.38 (C-1’); 102.40

(C-5); 144.85 (C-6); 149.99 (C-2); 163.03 (C-4); 205.43 (C-2').

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 0.85-1.25 (m, 16H, CH(CH3)2); 3.96 (m, 1H, H-4'); 4.14

(m, 2H, H-5' y H-5"); 5.00 (s, 1H, H-1’); 5.03 (d, 1H, Jaw = 3.8 Hz, H-3'); 6.75 (d, 1H, J5,6= 8.0

5 Sano, T.; Shuto, 8.; Inoue, H.; Ueda, T. Chem. Pharm. Bull. 1985, 33, 3617-3620.

Parte Experimental. Capítuio 2 - 76

ff, Mr:482l oY Rf:0.75 en EP / AcOEt, 1 : 2

\r\s_° CH: Rendimiento:69%

A una suspensión de 8.33 g (1.6 eq) de bromuro de metiltrifenilfosfonioen 240 ml de

THF anh. bajo atmósfera de argón, se le agregaron 17 ml de n-butil litio 1,6 M en hexano (1.9

eq). Se dejó una hora a temperatura ambiente bajo agitación, se obtuvo una solución

anaranjada. Entonces, fue agregada gota a gota a Ia mezcla una solución de 6.94 g de 2'

cetouridina protegida con el puente disiloxano (14 mmol) disueltos en 100 ml de THF. Se dejó

reaccionar 2 h a temperatura ambiente. Cuando la reacción finalizó se agregaron 120 ml de

NH4CI1 M y se extrajo con AcOEt (2 x 160 ml). Las fases orgánicas se juntaron, se Iavaron con

agua, se secaron con Na2804 anh. y se evaporó el solvente. El producto se obtuvo puro luego

de una columna cromatográfica (EP —>AcOEt / EP, 3 : 7).

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 12.3, 12.6, 12.8, 13.4 (CHs isopropilos); 16.6, 16.8,

17.1, 17.2, 17.3 (CHasisopropilos); 60.3 (C-5'); 70.1 (C-3'); 82.1 (C-4'); 88.5 (C-1'); 102.1 (C-5);

139.5 (C-6); 146.5 (C-2'); 150.0 (C-2); 164.2 (C-4).

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 0.86-126 (m, 16H, CH(CH3)2); 3.69 (ddd, 1H, J4'_5-=2.6

Hz, J4',5'-=2.7 Hz, J4',3'= 8.7 Hz, H-4'); 4.05 (dd, 1H, J5-_5"=13.1 Hz, J5-,4-=2.7 Hz, H-5”); 4.14 (dd,

1H, J5',5"= 13.1 Hz, J5--,4-=2.6 Hz, H-5'); 4.83 (dd, 1H, Ja',4"'=8.7 Hz, Ja',s'= 1.5 Hz, H-3'); 5.46 (dd,

1H, Jeux: 1.9 Hz, Jens": 2.8 Hz, H-6"); 5.53 (dd, 1H, Js;3'= 1.5 Hz, Jem»: 2.8 Hz, H-6'); 5.70 (d,

1H, J5,5= 8.1 Hz, H-5); 6.52 (d, 1H, JG',1'=1.9 Hz, H-1'); 7.43 (d, 1H, J5,6= 8.1 Hz, H-6); 9.23 (sa,

1H, NH).

2'R -2'-C- Hidroximetil - 3’5’-O- 1 1 3 3-tetraíso ro Íldisiloxan-1 3-díil un'dina (5).

0

5km, Mr:516l . ,

N/Ko Rf.0.34 en EP/AcOEt, 1 .2

0

0

\r u/w Rendimiento.97%\ OH—l00


El compuesto 4 (4.83 g, 100.3 mmol) se disolvió en una mezcla de THF (25 ml), tert

butanol (25 ml) y agua (7.5 ml). Óxido de N-Metilmorfolina (1.5 g; 13 mmol, 1.2 eq) y OsO4 (1 ml

de una solución 2.5 % m/v, en tert-butanol; 0.1 mmol, 0.01 eq) se agregaron a 0 °C y agitando.

La reacción se dejó 5 días a 4 °C. Luego se detuvo la reacción con una solución 1 M de

NaHSO3y la mezcla de reacción se extrajo con AcOEt (2 x 50 mI). La fase orgánica se lavó con

agua, se secó con NazSO4 anh. y se evaporó el solvente. Se obtuvo cuantitativamente el

producto 5 (5 g) como una mezcla diasteromérica en proporción 97 : 3, según se determinó por

RMN, Ia cual se usó sin posterior purificación para Ia próxima reacción.

Espectro 130 RMN del ¡sómero mayoritario (CDCls): (6, ppm) 12.1, 12.7, 12.8, 13.3 (CHs

isopropilos); 16.8. 16.9, 17.0, 17.1. 17.3 (CHas isopropilos); 59.8 (C-5'); 61.4 (-CH20H); 67.8 (C

3'); 80.1 (C-2'); 81.0 (C-4'); 90.3 (C-1'); 101.5 (C-5); 141.2 (C-6); 151.3 (C-2); 164.4 (C-4).

Espectro de 1H RMN del isómero mayoritario (CDCla): (ó, ppm) 0.80-1.20 (m, 16H, CH(CH3)2);

3.45 (d, 1H, Js'_s"= 10.1 Hz, H-6"); 3.65 (sa, 2H, OH-2’, OH-6'); 3.90 (d, 1H. Je‘,6"= 10.1 Hz, H

6'); 3.954.40 (m, 4H, H-3’, H-4', H-5' y H-5"); 5.60 (d, 1H. J5_s=7.8 Hz, H-5); 6.00 (s, 1H, H-1');

7.81 (d, 1H, J5,s= 7.8 Hz, H-B); 10.35 (sa, 1H, NH).

2'R -2'-C- 4-Metilfenilsu/foniloximetil -3' 5’-O- 1 1 3 3-tetraíso ro ildisíloxan-1 3-diil un'dina (6).

I Á Mr:° o Rf: 0.80 en EP / AcOEt, 1 : 2Sl/ N

Tio ° Rendimiento:60 %\ . OTs

A una solución del compuesto 5 (5 g. 10 mmol) en Py seca (13 ml), se le agregó cloruro

de p-tOIUensulfonilo (3.8 g, 20 mmol, 2.0 eq) y se agitó la mezcla durante Ia noche a

temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó una segunda porción de cloruro de p

toluensulfonilo (5.6 g, 30 mmol, 3 eq) y se continuó Ia agitación por 3 h más hasta que, por

c.c.d. se observó la desaparición del material de partida. EI solvente fue evaporado en vacío, el.

residuo disuelto en AcOEt, lavado con agua, secado con NaZSO4anh. y filtrado para obtener el

Parte Experimental. Capítulo 2 - 7'8

crudo de la mezcla de reacción, el cual fue posteriormente purificado por columna de sílica gel

(EP —>AcOEt / EP, 1 : 2). Se obtuvo 6 como una espuma.

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 12.6, 12.7, 12.9, 13.6 (CHs isopropilos); 16.7, 16.8,

16.9, 17.0,17.2 17.3 (CHas isopropilos); 21.6 (CH3 tosilo); 60.9 (C-5'); 66.5 (CHZO tosilo); 68.1

(C-3'); 79.3 (C-2'); 81.8 (C-4'); 89.5 (C-1'); 102.4 (C-5); 127.9 (C-2 tosilo); 129.7 (C-3 tosilo);

131.6 (C-4 tosilo); 144.8 (C-6); 145.2 (C-1 tosílo); 151.8 (C-2); 163.1 (C-4).

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 0.80-1.20 (m, 16 H, CH(CH3)2); 2.35 (s, SH, CH3 tosilo);

3.42 (s, 1H, OH); 3.82 (d, 1H, Js'_s"= 10.8 Hz, H-6'); 3.904.50 (m, 5H, H-3', H-4', H-5', H-5" y H

6"); 5.62 (d, 1H, J5,e= 8.0 Hz, H-5); 5.98 (s, 1H, H-1'); 7,20 (d, 2H, Jona: 7.4 Hz, fenilo); 7.60 (d.

1H, J5,5=8.0 Hz, H-6); 7.70 (d, 2H, Joao: 7.4 Hz, fenilo); 10.35 (s, 1H, NH).

2'-C-Met¡l-3'5'-O- 1 13 3-tetraiso ro ildisiloxan-13-diil- '-C-metilurid¡na(7).

l M,: 500‘(fs. Rf: 0.70 en EP / AcOEt, 4 : 6

ï/l Rendimiento:93%

El compuesto 6 (4 g, 60 mmol) se disolvió en 60 ml de DMF anh., entonces se agregó

NaBH4 (1.2 g, 31 mmol, 5.0 eq) y la mezcla se agitó 2 h a temperatura ambiente. Cuando por

c.c.d. se observó que el maten'al de partida había desaparecido, se detuvo Ia reacción

agregando cuidadosamente gota a gota NH4CI(ss) sobre la mezcla enfn'ada sobre hielo. La

mezcla resultante se extrajo con AcOEt (2 x 80 ml), las capas orgánicas se lavaron son NaCl

(ss) (5 x 0.14 l), se secaron con NaZSO4anh. y se evaporaron para obtener el crudo. El producto

fue pun'ficado por cromatografía flash, eluyéndose con EP —>AcOEt/ EP, 1 : 2. El compuesto 7

puro resultó ser una espuma luego de evaporar los volátiles.

Espectro de 13C RMN (CDCla): (6, ppm) 12.5, 12.8, 13.4, 13.6 (CHs isopropilos); 16.8, 16.9,

17.0, 17.2, 17.3 (CH3s isopropilos); 20.4 (CH3); 59.8 (C-5'); 72.7 (C-3'); 78.9 (C-2'); 81.6 (C-4');

90.4 (C-1'); 102.3 (C-5); 139.6 (C-6); 150.5 (C-2); 163.4 (C-4).


Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 0.80-1.20 (m, 16H, CH(CH3)2); 1.22 (s, 3H. CH3); 2.53

(s, 1H, OH-2'); 3.90415 (m, 3H. H-4', 5' y 5"); 4.21 (d, 1H, Ja'.4‘=8.1 Hz, H-3'); 5.70 (d, 1H. J5_e=

8.1Hz, H-5); 6.00 (s, 1H, H-1'); 7.73 (d. 1H, J5,e= 8.1 Hz, H-6); 8.40 (sa, 1H, NH).

2'-C-Met¡lurid¡na (8).

H0 AN O

0Mr: 258

Rf: 0.40 en DCM / MeOH, 9 : 1

H0 OH

Una solución del compuesto 7 (2.8 g, 5.6 mmol) en 900 ml de THF anh. fue tratada con

una solución de TBAF 1 M en THF (12 mI. 12 mmol, 2.2 eq) a temperatura ambiente. Después

de 5 min, la reacción fue detenida mediante eI agregado de 0.1 ml de Py / MeOH / agua, 3 : 3 :

1 (v/v/v)y la solución fue agregada a una suspensión de una resina Dowex 50Wx4-200 (5 g) en

Ia forma pin'donio en 3.4 mI de Ia misma suspensión de Py / MeOH / agua. La mezcla fue

agitada suavemente por 10 min y la resina filtrada y lavada con MeOH (3 x 6 ml). El filtrado

combinado con los lavados fueron evaporados hasta sequedad al vacío para producir el crudo

como un aceite. Una muestra analítica fue purificada por columna cromatográfica para llevar a

cabo el análisis confonnacional por RMN.

Espectro de 13CRMN (DMSO-ds): (6, ppm) 19.3 (CH3); 59.9 (C-5'); 72.7 (C-3'); 79.4 (C-2'); 82.1

(C-4'); 92.0 (C-1'); 102.6 (C-5); 141.8 (C-6); 151.0 (C-2); 166.4 (C-4).

Espectro de 1H RMN (DMSO-ds): (6, ppm) 1.00 (s, 3H. CH3); 3.79 (dd, 1H, J5',5"= 11.8 Hz,

J5-',4'=2Hz, H-5"); 3.84 (d, 1H, J'3'_4'=9.5 Hz, H-3'); 3.97 (m, 1H, H-4'); 3.98 (m, 1H, H-5'); 5.05

(sa, 2H, OH-3' y OH-2'); 5.19 (sa, 1H, OH-5'); 5.84 (d, 1H, J5,e= 8.2 Hz, H-5); 5.95 (s, 1H, H-1');

7.86 (d, 1H. J5,s= 8.2 Hz, H-6).

2‘-C-Metil-3' 5'-O-d¡acetilurídina (9).


0

NHfl Mr:Ago N 0

0

Rf: 0.40 en DCM / MeOH, 95 : 5

Rendimiento: 70 % desde 7

AcO OH

El aceite obtenido en la reacción previa fue suspendido en 28 ml de Py, y fue agregado

1 ml (10 mmol, 1.8 eq) de anhídrido acético. La mezcla fue agitada durante la noche y al día

siguiente se agregó 0.1 ml (0.2 eq) más de agente acilante. Después de una hora, la mezcla se

enfrió (0 °C), se quencheó con 2.8 mI de MeOH y se concentró en vacío. El aceite sin color

obtenido se disolvió en DCM (28 ml) y se extrajo con NaHCOa (5 x 6 ml). La fase orgánica se

secó (NazSO4).evaporó y el producto fue obtenido como una espuma después de ser purificado

por columna cromatográfica de silica gel, eluyéndose con DCM/ MeOH, 98 : 2.

Espectro de 13CRMN (CDCIa): (ó, ppm) 20.6a (CH3): 20.7a (CHas acetilos); 62.1 (C-5'); 73.9 (C

3'); 78.1b (C-2'); 78.3b (C-4'); 91.6 (C-1'); 102.7 (C-5); 139.4 (C-6); 151.0 (C-2); 163.3 (C-4);

170.1 (CO); 170.2 (CO).

abestas señales pueden intercambiarse

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (ó, ppm) 1.20 (s, 3H, CHa); 2.12 (s, 3H, CHaCO); 2.17 (s, 3H,

CHaCO); 3.25 (s, 1H, OH-2'); 4.354.45 (m, 3H, H-4', 5' y 5"); 4.92 (d, 1H, J3'_4'=6.7 Hz, H-3');

5.78 (d, 1H, J5,e= 8.2Hz, H-5); 6.01 (s, 1H, H-1'); 7.63 (d, 1H, J5_e=8.2 Hz, H-6); 9.45 (sa, 1H,

NH).

2'-O-Tetrah¡dro ¡rani/-2'-C-metiI-3' 5 '-O-diacet¡lun'dína (10).0

"” M,: 426M, fioN Rf: 0.65 en DCM / MeOH, 97 : 3

Rendimiento: 80 °/oO

AcO OTHP

Un gramo con treinta y cuarzo centésimas de compuesto 9 (4 mmol) fueron agregados

a una solución de 20 mg (0.1 mmol) de ácido p-toluensulfónico monohidrato en 13 mI de 1,4


dioxano. Posteriormente, se agregó a Ia mezcla gota a gota 3,4-dihidro-2H-pirano (5.2 ml, 57

mmol, 14.6 eq). Después de 6 h, Ia reacción se completó y se quencheó con 13 mI de TEA. La

mezcla se concentró y extrajo con Na2C0310 %. EI producto fue purificado por cromatografía

en columna de sílica gel, eluyéndose con DCM/ MeOH (98 : 2) como una mezcla epiménca.

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 16.6/17.1 (CH3); 19.2/19.3. 19.7/20.3, 20.4 (CHas

acetilos, y C-3 THP); 249/252 (C-4 THP); 31.3/31.5 (C-2 THP); 613/615 (C-5'); 620/631 (C-5

THP); 732/735 (C-3'); 76.8/77.0 (C-4'); 833/835 (C-2'); 89.7/899 (C-1'); 94.5/95.4 (C-1 THP);

102.1/102.3 (C-5); 1385/1392 (C-6); 150.1/1502 (C-2); 1629/1630 (C-4); 169.8 (CO); 169.9

(CO).

Espectro de 1H RMN (CDCI3): (6, ppm) 0.85 (rn, 1H, H-3 THP); 1.11 (m, 1H, H-3’ THP);

1.19/1.20 (s, 3H, CH3); 1.20-1.90 (m, 4H, H-4, H-4',H-2 y H-2' THP); 2.06/2.09 (s, 3H, CHaCO);

2.10/2.11 (s, 3H, CHaCO); 3204.40 (m, 5H, H-4', H-5', H-5"y, H-5 y H-5’ THP); 4.32 (m, 1H, H

3'); 4.95 (m, 1H, H-1 THP); 5.72 (m, 1H, H-5); 5.98/6.44 (s, 1H, H-1'); 7.62 (m, 1H, H-6);

9.97/10.03 (sa, 1H, NH).

2'-O-Tetrahidrogiranil-2’-C-metilufid¡na (11).

6km Mr:342Ho I Á Rf: 0.5 en DCM/ MeOH, 95 : 5N O

I o Rendimiento:=100%

Uno coma treinta y seis gramos de 3',5'-di-O-acetil-2'-O-tetrahidropiraniI-2’-Gmetilundina

(10) (4 mmol) fueron disueltos en 14 mI de solución saturada de NH; en MeOH y Ia mezcla fue

agitada durante Ia noche a temperatura ambiente. La mezcla diasteromérica resultante fue aislada

después de evaporación de los volátiles y se utilizóen el paso siguiente sin posterior purificación.

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 15.7/16.5 (CH3); 20.4/20.7 (C-3 THP); 24.8/25.3 (C-4

THP); 31.8/319 (C-2 THP); 61.9/62.1 (C-5'); 64.1/64.6 (0-5 THP); 725/731 (C-3'); 82.5/82.7 (C

4'); 85.2/84.4 (C-2'); 90.2 (C-1'); 95.1/95.5 (C-1 THP); 102.0/102.1 (C-5); 140.2 (C-6); 150.8 (C

2); 164.7 (C-4).

3arte Experimental. Capitulo- 2 - 82

Espectro de 1H RMN (CDCI3): (6, ppm) 1.28 (m, 1H, H-3 THP); 1.27/1.30 (s, 3H, CH3); 1.57 (m,

3H, H-3', H-4 y H-4' THP); 1.85 (m, 2H, H-2 y H-2' THP ); 3.374.05 (m, 5H, H-4', H-5', H-5" y,

H-5y H-5' THP); 4.07/4.15 (m, 1H, H-3'); 4.94/5.12 (m, 1H, H-1 THP); 573/574 (d, 1H, J5,s= 9.0

NH

ourro ü Mr:644N ° Rf: 0.45 en MeOH / DCM /TEA, 96 : 3 : 1

° Rendimiento: 7a %

OH OTHP

EI compuesto 11 (1.1 g, 3 mmol) seco fue disuelto en Py anh. (25 ml). TEA (0.7 ml, 4.8

mmol, 1.5 eq), 4-dimetilaminopiridina (21 mg, 0.17 mmol, 0.05 eq) y cloruro de 4,4'-dimetoxitritilo

(1.45 g, 4.3 mmol, 1.3 eq) fueron agregados con agitación y exclusión de humedad. Después de

2 h de agitación a temperatura ambiente Ia reacción no se completó y, por Io tanto, se

agregaron más cloruro de 4,4'-dimetoxitriti|o (2.43 g, 7 mmol, 2.2 eq) y TEA (1.1 mI, 8 mmol, 2.5

eq) y se continuó agitando por 5 h. Se detuvo Ia reacción con un volumen equivalente de agua y

se extrajo con EtzO (2 x 0.1 l). La fase orgánica se secó (NaZSO4)y evaporó. El producto crudo

se purificó por columna, eluyéndose la mezcla diasteromérica de 12 como una espuma, libre de

impurezas, con EP / AcOEt/ TEA, 66 : 33 : 1 —>AcOEt/TEA, 99 : 1.

Espectro de 13CRMN (CDCI3): (6, ppm) 15.9/16.9 (CH3); 20.7/21.0 (C-3 THP); 24.9/25.0 (C-4,

THP); 29.7/32.0 (C-2 THP); 55.3 (OCHa DMTr); 60.6 (C-5'); 64.4/64.8 (C-5 THP); 73.4/74.1 (C

3'); 81.4/82.1 (C-4'); 842/843 (C-2'); 87.2/878 (C-AraDMTr);90.4 (C-1'); 953/957 (C-1 THP);

102.3 (C-5);‘113.2/113.3 (Ar DMTr); 127.2, 1280/1283, 1302/1303, 135.2, 1354/1355 (Ar,

DMTr); 140.2/140.4 (C-6); 144.4/144.5 (Ar DMTr); 150.7 (C-2); 158.7 (CAFOCH3 DMTr),

1634/1635 (C-4).

Espectro de 1H RMN (CDCla): (6, ppm) 0.88 (m, 1H, H-3 THP); 1.321135 (s, 3H, CH3); 1.50

1.60 (m, 3H, H-3', H4 y H-4' THP); 170/185 (m, 2H, H-2 y H-2' THP ); 3544.02 (m, 5H, H-4',

H-5', H-5" y, H-5 y H-5' THP); 3.76 (s, 6H, -OCH3); 4.08/4.18 (d, 1H, Jaw = 7.7 Hz, H-3’);


4.96/512 (m, 1H, H-1 THP); 520/522 (d, 1H, J5,s=8.7 Hz, H-5); 6.04/6.65 (s, 1H, H-1'); 6.85 (m,

4H, DMTr);7.20145 (m, 9H, DMTr);818/8821 (d. 1H, .155:_8.7Hz, H-6).

2'-O-Tetrahidro iraní/-5’-O- 4 4'-dimetox¡tntrl - ’-C-metI/urid¡na '- 2-CIanoetil-N N-di/so ro ¡l

fosforam/dita) (13). o

DMTI‘O I N/K

o o Mr: 844

o amp Rf: 0.6 en EP l AcOEt, 3 : 4CN\/\o _ / Rendimiento:72%

p\ NY4El compuesto 12 seco (1.6 g, 2.5 mmol) fue disuelto bajo atmósfera de argón en DCM

seco (10 mI) que contenía N,N-diisopropileti|amina (2.3 ml. 13 mmol, 5.2 eq) y la solución fue

enfriada en baño de hielo. ,B-Cianoetoxi-N,N-di¡sopropilaminoclorofosfina (0.6 mI, 3 mmol, 1.1

eq) fue agregada gota a gota y la mezcla fue agitada 15 min a temperatura ambiente. Como Ia

reacción no se habia completado al cabo de este tiempo más ,B-cianoetoxi-N,N

diisopropilaminoclorofosfina (0.11 mI, 0.5 mmol, 0.2 eq) fue agregada y se continuó Ia agitación

por 30 min. Al desaparecer el material de partida, se agregaron secuencialmente MeOH (0.4

ml), AcOEt (55 ml) y TEA (3 mI). La solución resultante se lavó dos veces con NaHCO3 (10 %) y

dos veces con NaCI (ss). La capa orgánica fue secada (NaZSO4)y concentrada en vacío. EI

producto crudo fue purificado por columna cromatográfica con EP / AcOEt / TEA, 33 : 66 : 1,

para obtener 13 puro en forma de espuma.

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 17.1/17.8/18.0 (CH3); 18.8/18.9/19.7 (CHz-CN

fosforamidita); 20.1/20.2/20.3/21.0 (C-3 THP); 24.6 (CHa fosforamidita); 253/255 (C-4 THP);

29.7/31.7/31.9/32.0 (C-2 THP);434/437 (CHs fosforamidita); 552/553 (OCHaDMTr);57.9/58.0

(CHz-O fosforamidita); 60.2/60.4/60.5 (C-5'); 615/62] (C-5 THP); 75.8/75.9/76.0/76.2 (C-3');

80.6/80.7 (C-4'); 838/840 (C-2'); 87.2 (C-AraDMTr);89.2/89.3/89.5/89.6 (C-1'); 936/938/94.9

(C-1 THP); 102.1/102.3 (C-5); 1132/1133 (Ar, DMTr); 117.4 (CN fosforamidita); 1272/1273

Parte Experimental. Capítqu 2 - 8:1

128.0, 1286/1287, 1302/1305, 1352/1353 (Ar DMTr);1402/1405 (C-6); 144.3 (Ar DMTr);

150.6 (C-2); 158.8 (CArOCHs DMTr), 163.1/1632 (C-4).

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 1.10 (m, 1H, H-3 THP); 1.18 (m, 12 H, CHas

fosforamidita) 126 (s, 3H, CH3); 1.50-1.65 (m, 3H, H-3', H-4 y H-4’ THP); 228/234 (m, 2H, H-2

y H-2’ THP ); 2.66 (m, 2H, CH2CN); 3.41-4.42 (m, 10H, H-3', H-4', H-5', H-5", H-5 y H-5’ THP,

CHs y CH20 fosforamidita); 3.83 (s, 6H, -OCH3);502/506 (d, 1H, sz = 8.9 Hz, H-5); 520/532

(m, 1H, H-1 THP); 605/652; (s, 1H, H-1'); 6.85 (m, 4H, DMTr); 720-740 (m, 9H, DMTr);

8.17/8.821 (d, 1H, J5,s= 8.9 Hz, H-6).

Espectro de 31PNMR (CDCIJ):(6, ppm) 151.09/151.13l151.18/15122.

O-Trímeti/silil-3' ’-O- 1 13 3-tetraiso ro ÍIdisi/oxan-1 3-dii/ un'dina (14).

¡ Mr:558(Sl/o N ° Rf: 0.6 en IPrOH / CH2CI2, 5 : 95

Yi x? ° ïl Rendimiento:100%

EI compuesto 2 seco (1.96 g, 4 mmol) se disolvió en 20 ml de CH2CI2seco y se

agregaron con exclusión de humedad 4 mI de TEA ( 29 mmol, 7 eq) y 1 mI de cloruro de

trimetilsililo(9 mmol, 2 eq) a 0 °C. Se dejó reaccionar 30 min. Cuando desapareció la mancha

del reactivo se agregaron 40 mI de NaHCOa y 20 mI de CHzClz.La fase orgánica se secó con

NazSO4. Se fiitró y se evaporaron los volátiles en vacio.

M,;607° Rf: 0.5 en EP / AcOEt, 1 : 1\n

I Rendimiento: 45 % desde 14—</o ¿se

Parte Experimental. Capilqu 2 - 85

El compuesto 14, (1.1 g, 2 mmol) , sin mayor purificación se evaporó dos veces de

tolueno y el residuo se disolvió en 10 mI de CH2C|2seco y se agregó TEA (1.4 ml, 10 mmol, 5

eq), cloruro de p-toluensulfonilo (0.65 g, 3 mmol, 1.5 eq) y DMAP (60 mg, 0.5 mmol, 0.25 eq)

con exclusión de humedad. Se formó una solución rojo profundo que se dejó agitando 30 min,

hasta que reaccionó completamente según se observó por c.c.d. (Rfdel producto mesitilado: 0.8

versus Rf : 0.6 para el material de partida en EP / AcOEt, 2 : 1). Entonces se agregaron 44 mg

de DABCO (0.4 mmol, 0.2 eq) y 550 mg p-nitrofenol (4 mmol, 2 eq), y se dejó agitando 1 h. Se

diluyó con 10 ml de CH20I2 y se extrajo con 20 ml NaHCOa 1 M. La fase acuosa se lavó dos

veces con 5 ml de CH2CI2,se seco y se evaporó. EI residuo se disolvió en 6 ml de CHzclz y se

agregó una solución de 750 mg de ácido p-toluensulfónico monohidrato en 6 ml de dioxano. Se

agitó por dos minutos y se detuvo la reacción con 0.6 ml de TEA.

\ o M,:630

_</ l to Rf:0.55enEP/AcOEt,1:1Ï’I ° Rendimiento:41 %desde 14

Se repitió el mismo procedimiento que para el compuesto 15. Pero se agregó 2,6

diclorofenol (650 mg, 4 mmol) en vez del 2-nitrofenol y se dejó agitando en este paso 2 h.

NG-Benzoiladenosina (17):

NHBz

Ho ¿N ¡ j M,:371N/ Rf:0.5enMeOH/DCM,7:93

O

HO OH

Se suspendieron 200 mg (0.75 mmol) de adenosina en 8 mI de Py anh. bajo atmósfera

de nitrógeno. Se enfrió a 0 °C, se agregaron gota a gota 0.67 mIde clorotrimetilsilano y se dejó


agitando en frío por 30 min. Entonces, se agregaron 0.67 ml de cloruro de benzoílo y se agitó la

mezcla a temperatura ambiente durante 3 h. Al cabo de este tiempo se enfrió y se agregaron

1.62 mI de agua fria. Se esperó 15 min y se agregaron 1.6 ml de amoniaco concentrado. La

mezcla resultante se agitó por 30 min más y se evaporó. El aceite que se obtuvo se extrajo con

18 ml de EtzO y agua. La fase acuosa se concentró hasta que precipitó el producto como un

sólido blanco.

Espectro de 13CRMN (CDCIa): (ó, ppm) 61.3 (C-S'); 70.3 (C-3'); 73.7 (C-2’); 85.7 (C-4'); 87.6 (C

1'); 125.8 (C-5); 128.4 (C-3 Bz); 129.2 (C-2 Bz); 132.4 (C-4 Bz); 133.4 (C-1 Bz); 146.1 (C-8);

150.4 (C-4); 151.2 (C-2); 152.2 (C-6); 165.7 (CO).

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (ó, ppm) 3.59 (dd, 1H, J5;5"= 11.9 Hz, J5',4-=4.0 Hz, H-5"); 3.69

(dd, 1H, J5',5'-=11.9 Hz, J5-',4-=4.0 Hz, H-5'); 3.99 (m, 1H, H-4'); 4.25 (dd, 1H, Ja',2'= 4.3 Hz, Ja',4'=

4.3 Hz, H-3'); 4.65 (dd, 1H. J3',2'=4.3 Hz, J1-_2'=5.8 Hz, H-2'); 5.15, 5.26, 5.57 (s, 3H, 0H-2', -3’ y

-5'); 6.04 (d, 1H, J1',2'= 5.8 Hz, H-1'); 7.55 (dd, 2H, J2,a= 7.3 Hz, J4,3= 7.3 Hz, Hs-3 Bz); 7.64 (t,

1H, J4_3=7.3 Hz, H-4 Bz); 8.05 (d, 2H, Ju: 7.3 Hz, Hs-2 Bz); 8.72 (s, 1H, H-2); 8.75 (s, 1H, H-8);

11.18 (sa, 1H, NH).

N \ N

4 o </ | u Mr:614S./ N/

\¡' l' o Rf:0.8 en MeOH/DCM, 7 : 93o

YSÍ—0 OH Rendimiento:75 % desde adenosina

Uno coma un gramo (3.0 mmol)de adenosina benzoilada se evaporaron en vacio de Py

seca y entonces se disolvieron en 8.1 ml de Py seca, se enfrió todo en baño de hielo y se

agregaron gota a gota 1.6 ml de 1,3-dicloro-1,1,3,3 tetraisopropildisiloxano (1.2 equivalentes). Al

finalizar esta adición se llevó a temperatura ambiente y se dejó con agitación. La reacción se

siguió por c.c.d. hasta mostrar que se había completado luego de 2 - 3 h. Se detuvo Ia reacción

con MeOH (2 ml) y se evaporó el solvente en vacio. Se disolvió el residuo en AcOEt (15 ml) y se

Iavó Ia solución con NaHCOa acuoso 1 M (2 x 10 mI). La fase orgánica se secó sobre Na2804

Parte Experimental. Capitulo 2 - 87 —

anh., se filtró y se evaporó en vacio. El producto se purificó por columna (DCM —) MeOH /

DCM, 3 : 97).

Espectro de 13C RMN (CDCI3): (6, ppm) 12.6, 12.8, 13.1, 13.3 (CHs isopropilos); 16.9, 17.0.

17.1, 17.3, 17.4 (CHas isopropilos), 61.7 (C-5'); 70.8 (C-3’); 71.5 (C-2’); 82.3 (C-4'); 89.9 (C-1');

123.6 (0-5); 127.9 (C-3 Bz); 128.8 (C-2 Bz); 132.7 (C-4 Bz); 133.7 (C-1 Bz); 141.9 (C-B); 149.7

(C-4); 151.0 (C-2); 152.7 (C-6); 164.6 (CO).

Espectro de 1H RMN (CDCIa): (6, ppm) 1.00-1.15 (m, 16H, CH(CH3)2); 3.36 (s. 1H, OH); 4.06

(dd, 1H, J5',5"=13.8 Hz, J5',4'= 4.6 Hz, H-5"); 4.14 (m, 2H, H-4’ y H-5'); 4.64 (d, 1H, J3',2'= 5.1 Hz,

H-2'); 5.11 (dd, 1H, J3-_4'=7.4 Hz, J3',2'= 5.1 Hz, H-3'); 6.04 (s, 1H, H-1'); 7.51 (dd, 2H, J2_3=7.4

Hz. J4,3= 7.8 Hz Hs-3 Bz); 7.60 (t, 1H, J4,3= 7.4 Hz, H-4 Bz); 8.03 (d, 2H, J2,3= 7.8 Hz, H-2 Bz);

8.16 (s, 1H, Hs-2); 8.75 (s, 1H, H-8); 9.22 (sa, 1H, NH).

N5-Benzoil-2’41eoxi-2'-oxo-3’5'-O- tetraiso ro ildisi/oxan-1 3-diil adenosina (19):NHBz

x” \” M'6124/0 < ' 2 'ÏS‘i o N Rf: 0.45, metanol l diclorometano, 97 : 3

°\ . o Rendimiento: 40 %

Doscientos cincuenta microlitros de anhídrido acético y 0.4 ml de Py se agregaron a

una suspensión de 0.25 g de trióxido de cromo en 17 ml de DCM y la mezcla se agitó a

temperatura ambiente aproximadamente durante 15 min. Se agregaron, entonces, 0.5 g (0.89

mmol) del nucleósido protegido 18 disueltos en 2.6 ml de DCMseco a la suspensión del trióxido

de cromo previamente enfriada en hielo. Se dejó 1 h con agitación a temperatura ambiente.

Cuando la reacción se complet, según se observó por c.c.d., se volcó la mezcla de reacción

sobre 110 ml de AcOEt frio y se filtró con microfibra de vidn’oporo 4. El filtrado se concentró

(temperatura menor a 25 ° C). Y se purificó en una columna de sílica (EP / AcOEt —>AcOEt).

Espectro de 13C RMN (CDCIs): (6, ppm) 12.7, 12.9, 13.0, 13.2 (CHs isopropilos); 16.7, 16.8,

16.9, 17.0, 17.3 (CHss isopropilos), 61.1 (C-5’); 72.6 (C-3'); 79.0 (C-4'); 80.5 (C-1'); 123.0 (C-5);

Parte Experimental, Capituio 2 - 88

127.0 (C-3 Bz); 128.5 (C-2 Bz); 132.7 (C-4 Bz); 133.4 (C-1 Bz); 142.6 (0-8); 149.6 (C4); 151.0

(C-2); 152.5 (C-6); 164.0 (CO); 205.2 (C-2').

Espectro de 1H RMN (CDCI3): (ó, ppm) 0.80-1.20 (m, 16H, CH(CH3)2);4.044,25 (m, 3H, H-4’,

H-5' y H-5"); 5.58 (d, 1H, J4-,3'=9.5 Hz, H-3'); 5.79 (s, 1H. H-1'); 7.42-7.59 (m, 3H, Hs-3 y H-4

Bz); 8.03-8.13 (rn, 3H, Hs-2 Bz y H-2); 8.61 (s, 1H, H-B);9.25 (sa, 1H, NH).

N6-BenzoiI-2’-deox¡-2’-metilen-3' 5’-O- tetraiso ro IIdISIloxan-13-d/i/ adenosrna (20):NHBz

/N \” M 6 o4/0 < I N) r. 1jr»? o Rfï 0.6, MeOH / DCM, 97 Z3

°\ . Rendimiento: 40 %

A una suspensión de 0.16 g de bromuro de metil trifenilfosfonio en 3 ml de THF anh.

bajo atmósfera de argón, se le agregaron 0.58 mI de butil litio 1,6 M en hexano. Se dejó una

hora a temperatura ambiente bajo agitación, se obtuvo una solución anaranjada. Entonces, se

agregó gota a gota una solución de 0.18 g (0.29 mmol) de 19 disueltos en 2 ml de THF anh. Se

dejó reaccionar 2 h a temperatura ambiente. Cuando Ia reacción finalizó se agregaron 2.4 ml de

NH4CI1 M y se extrajo con AcOEt (2 x 3.5 ml). Las fases orgánicas se juntaron, se Iavaron con

agua, se secaron con Na2804 anh. y se evaporó el solvente. EI producto se obtiene puro luego

de una columna cromatográfica (DCM —>MeOH / DCM, 3 : 97).

Espectro de 130 RMN (CDCIa): (ó, ppm) 12.7, 12.8, 12.9 (CHs isopropilos); 16.7, 16.8, 16.9,

17.0, 17.1, 17.2, 12.3 (CHss isopropilos), 61.3 (C-5'); 71.3 (C-3'); 77.7 (04'); 83.5 (C-1’); 112.1

(C-2'); 123.2 (C-5); 127.9 (C-3 Bz); 128.7 (C-2 Bz); 130.8 (C-4 Bz); 131.8 (C-1 Bz); 142.6 (C-8);

147.2 (C-4); 150.0 (C-2); 153.1 (C-6); 164.6 (CO).

Espectro de 1H RMN (CDCI3): (6, ppm) 0.85-1.20 (rn, 16H, CH(CH3)2);3.904,40 (m. 4H, H-3',

H-4', H-5’ y H-5"); 5.45 (m, 2H, CHz); 6.80 (d, 1H, J1_2=2 Hz, H-1'); 7.60-7.70 (m, 3H, Hs-3 y H-4

Bz); 7.88 (d, 2H, J2.3= 7.8 Hz, Hs-2 Bz); 8.20 (s, 1H, H-2); 8.81 (s, 1H, H-8); 8.44 (sa, 1H, NH).

2.3.2- Síntesis y purificación de oligonucleótidos.


2.3.1.1-Síntesis en fase sólida automatizada de oligonucleótidos.

Las síntesis en fase sólida de todos los oligonucleótidos se llevaron a cabo según el

método de las B-cianoetilfosforam¡ditasen un sintetizador automático. Se usó como fase sólida

un soporte de vidriode poro controlado de 500 Á al cual se encuentra unido covalentemente el

monómero correspondiente al extremo 3'. La fase sólida, contenida en una columna con un filtro

en cada extremo, se selló y se conectó a la máquina. Las fosforamiditas se disolvieron en ACN

anh. hasta una concentración de 0.1 M ó 0.12 M en el caso de fosforamiditas de nucleósidos

modificados.

Durante cada ciclo de adición de un nuevo monómero se usaron como agentes

detritilantes, una solución de TCA 3 % en DCM, o DCA 2 % en DCE para oligonucleótidos que

contenían la 2'-C-met¡|uridina. Tetrazol fue usado como agente activante de las fosforamiditas

en la reacción de acoplamiento, se mezclaron en línea el tetrazol y Ia fosforamidita entrante

antes de pasar por la columna. Se usó ACN anh. como solvente y todos los reactivos se

mantuvieron en estado de anhidrez por continua presurización de las botellas con argón. Para el

enmascaramiento de los oligonucleótidos que no reaccionaron se administró igual volumen de

dos reactivos, N-metilimidazol (Cap A) y anhídrido acético (o bien, anhídrido t-butilfeonxiacético

para fosforamiditas de quimica de desprotección rápida) (Cap B). La solución de iodo en THF se

usó para oxidar el fósforo (lll)del enlace fosfito tn'éster recién formado al más estable enlace de

fósforo pentavalente. Se realizó posteriormente un lavado para eliminar los restos de reactivos y

de subproductos. El ciclo fue repetido hasta que se finalizó Ia elongación de Ia cadena (ver ciclo

completo para preparación de ADNy ARN en escala 0.2 pmol en el apéndice Il).

2.3.1.2- Ensayo del catión DMTr.

Para cuantificar el tritiloliberado en cada paso de detritilación, el efluente de la

columna después del tratamiento con TCA y el subsecuente lavado con ACN fue colectado.

Como las soluciones de tritilose encontraban muy cóncentradas se diluyeron convenientemente


en ácido p-toluensulfónico monohidrato 0.1 M en ACN para que las lecturas de absorbancia se

encontraran dentro del rango de validez de la ley de Lambert-Beer. Las fracciones de tritilose

colectaron en tubos graduados de 15 mI y se llevaron a 10 ml con la solución de ácido p

toluensulfónico. Luego de agitar enérgicamente cada fracción se diluyó más, 20 ó 50 veces, con

la misma solución de ácido p-toluensulfónico. Se mezcló y se leyó Ia absorbancia del catión

naranja DMTr a 498 nm en una cubeta de 1 cm de paso óptico. La absorbancia leida debía

encontrarse en el rango de 0.1 a 0.8 para que los cálculos sean confiables.

2.3.1.3-Análisis y purificación de oligonucléotidos por HPLC.

Se utilizó HPLC para analizar o purificar los oligonucleótidos sintetizados. Se usó una

columna de fase reversa C13y la longitud de onda del detector UV se fijó a 260 nm, el flujo fue de

0.8 mI/miny los solventes del gradiente fueron ACN y TEAA 0.1 M pH 7.

Para oligonucleótidos DMT-Onel programa utilizado se detalla en la tabla 2.I.

En el caso de HPLC preparativo se colectó el pico principal correspondiente al oligo que

se eluye a los 20-23 min, y luego se IiofilizóIa solución.

Para purificar y/o analizar los oligodesoxinucleótidos DMT-Offpor HPLC se usó

el gradiente de ACN / TEAA 0.1 M pH 7 que se muestra en la tabla 2.Il. Nuevamente,

en el caso de HPLC preparativo se colectó el pico principal a 16-30 min.

Para purificar los oligorribonucleótidos y 2'-O-metiloligorribonucleótidos DMT-Ofl’

se usó el gradiente de ACN / NH4HC030.1 M p H 7 que se muestra en la tabla 2.III, con

los oligos saliendo a 20-25 min.


60 38

16 50

Tabla 2.l. Gradiente ACN/ TEAAusado para purificaroligonucleófidos DMTr-Onpor HPLC de fase reversa.

Tabla 2.II. Gradiente ACNl TEAAusado para purificaroligodesoxinucleótidos DMTr-Ofipor HPLCde fase reversa.

Tabla 2.I|l. Gradiente ACN / NH4HC03usado para purificaroligorribonucleótidos y 2'-O—metiloligorribonucleótidos

DMTr-Ofipor HPLC de fase reversa.

2.3.1.4-Síntesis y purificación de oligodesoxi y oligorribonucléotidos.

o En el caso de oligodesoxinucleótidos las síntesis fueron realizadas en escala 0.2

pmol ó 1 pmol, DMTr-On.Se verificó que los acoplamientos para la adición de cada monómero


resultaran satisfactorios (de acuerdo a la coloración naranja del catión dimetoxitn'tiloliberado). AI

finalizar las sintesis se trataron las columnas con amoniaco concentrado para liberar el

oligonucleótido del soporte sólido, y la solución conteniendo el producto se recogió en un vial.

Las bases y los grupos fosfato fueron desprotegidos por digestión durante 12-16 h en NH3(c) a

55 °C. Se evaporaron los volátiles, se disolvieron los oligos en agua y se purificaron por HPLC.

El extremo 5' fue desprotegido por tratamiento con AcOH 80 %, 20 min a temperatura ambiente

(0.5 mI por umol). Se detuvo la reacción agregando EtOH (0.5 ml) y se evaporaron los volátiles,

repitiéndose Ia operación hasta eliminar los restos de ácido acético. Se disolvió el residuo en 0.5

ml de agua y se extrajo con 0.5 ml de EtzO. El producto obtenido se cuantificó antes y después

de la purificación por HPLC midiendo su absorbancia a 260nm.

o El mismo procedimiento se siguió en el caso de oligodesoxinucleótidos

conteniendo (2’S)-2’-metil-2'-C-desoxiuridina, excepto que durante la sintesis se prolongó el

periodo de acoplamiento a 600 seg para este monómero.

o Para oligodesoxinucleótidos conteniendo Ia 2’-C-metiluridina el periodo de

acoplamiento fue extendido a 900 seg y se constató también que la eficiencia fuera > 98 % en

todos los acoplamientos. Un tratamiento adicional en HCI 0.01 N (pH z 2-2.5), estéril por si

acaso la modificación no fuese resistente a nucleasas, 7 h a temperatura ambiente (0.5 mi) fue

realizado eliminar el THP de 2'. Esta reacción de desprotección se detuvo por neutralización con

NH4HCOs (s). se evaporaron los volátiles, se redisolvieron los oligos en agua estéril y se

purificaron los oligos DMTr-Offuna segunda vez por HPLC.

o Los oligorribonucleótidos fueron sintetizados en escala 0.2 ó 1 pmol, con un ciclo

que difiere al usado para los desoxi en que el periodo de acoplamiento fue extendido a 10 min

para asegurar un acoplamiento eficaz, debido al impedimento estérico producido por la

presencia del voluminoso grupo protector TBDMSéter en 2'. Primero, se realizó un protocolo de

desprotección y purificación que no resultó exitoso (protocolo 1). que fue optimizado como se

describe en el protocolo 2.

Protocolo 1: Se realizaron las sintesis DMT-Off.Una vez que terminó la sintesis se liberaron los

oligonucleótidos de las columnas en forma automática con un procedimiento similar pero más

prolongado que para oligodesoxinucleótidos debido al impedimento estérico del grupo 2'-O


TBDMS. Fueron tratados 12-16 h en NH3(c) - EtOH (3 : 1) a 55 °C para desproteger las bases y

los ganos fosfatos. Se liofilizó,se cuantificó el bruto según su absorbancia a 260 nm y los

oligos se trataron 36 h con TBAF a temperatura ambiente (15 pl por OD). Se detuvo la reacción

agregando igual volumen de TEAA 0.1 M. Se evaporaron los volátiles, obteniéndose un

precipitado viscoso que se desaló con un cartucho de fase reversa (C13).EIcartucho fue lavado

primero con 5 ml de ACN, después con 5 ml de TEAA 2 M. Los oligos se disolvieron en 1 ml de

TEAA 0.1 M. Se pasaron dos veces por el cartucho a una velocidad de 1-2 gotas por minuto.

Después se pasaron 5 ml de TEAA 0.1 M y 10 ml de agua. Los oligos se eluyeron con 1 ml de

ACN - agua (50 : 50) y se evaporaron los volátiles en un evaporador rotatorio. Finalmente, los

oligos se purificaron en un gel de poliacrilamida 20 %, urea 7 M. Se removieron las placas de

vidrio una vez que se terminó la electroforesis, se colocó el gel sobre un filmde polietileno sobre

una placa de c.c.d. con indicador fluorescente y se expuso a radiación UVde longitud de onda

corta. Los oligonucleótidos que absorben al UVenmascaran Ia emisión de la fluoresceína de la

placa y se observan como una sombra. Se identificaron las bandas, se cortó la banda

correspondiente al oligonucleótido deseado y se colocó en uno o más eppendorfs. Se

desgarraron los trozos de gel en fracciones lo más pequeñas posible con un tip estéril. Se

cubrieron con agua estéril y se agitaron bien. Luego se dejaron los eppendorfs con agitación a

37 °C durante la noche. AI día siguiente, se tomaron los sobrenadantes cuidadosamente con

una pipeta estéril y se filtraron con lana de vidrio. Se cubrieron nuevamente los fragmentos de

gel con agua estéril, se vortexearon y ahora se incubaron a 5 °C durante 8 h. Se extrajeron y

filtraron nuevamente los sobrenadantes y se repitió el procedimiento dejando los fragmentos de

gel embebidos en agua a 5 °C durante 8 h más. Se redujo el volumen de las fracciones

combinadas y se volvieron a desalar siguiendo el procedimiento arriba mencionado del cartucho

de fase reversa para eliminar Ia urea y restos de sales.

Protocolo 2: Los oligorribonucleótidos fueron sintetizados DMTr-On.También en este caso se

verificó que los acoplamientos para la adición de cada monómero resultaran satisfactorios. Una

vez que la sintesis acabó las columnas fueron desconectadas del sintetizador. Los

oligonucleótidos unidos al soporte sólido fueron transferidos a viales de vidrio y se agregó

metilamina acuosa (41 %, 0.4 mI / 0.2 umol). Se cerraron los viales y se mantuvieron a 65 °C

por 10 min. Posteriormente, las soluciones fueron enfn'adas en baño de hielo durante 10 min, se

filtraron las respectivas fases sólidas y se lavaron con 50 % EtOH acuoso (0.2 ml). Se

combinaron los filtrados de cada síntesis y se concentraron en vacío. Los ARN se desililaron

usando una solución de N-metilpírrolidinona / TEA / tn'hidrofluoruro de trietilamonio, 6 : 3 : 4,

(v/v/v) (0.2 ml) en tubos eppendorfs calentando por 1 h 30 min a 65 °C. Se destruyó el exceso

de fluoruro por tratamiento con isopropil trimetilsililéter (0.4 mI)7agitando suavemente por 10

mín. Se precipitaron los ARN crudos por adición de Et20 (0.8 mI) y se aislaron por

centrifugación, el precipitado se lavó dos veces con Et20 (0.4 mI).

Los ARN crudos se disolvieron en agua estéril y se purificaron por HPLC de fase

reversa sobre una columna C13 usando un gradiente de buffer estéril de TEAA en ACN. Se

colectaron los picos correspondientes al oligonucleótido y se evaporó el solvente.

Los oligos se detn'tilaron usando ácido acético diluido pH 4 (0.5 mI) a temperatura

ambiente por 20 min. Se neutralizaron con NH4HC03 (s) y se redujo el volumen de las

soluciones en un evaporador rotatorio. Se purificaron una vez más por HPLC de fase reversa

usando un gradiente de NH4HC03 0.1 M estéril en ACN y se Iiofilizaron las fracciones

adecuadas. Eventualmente, si después del segundo HPLC los oligos se encontraban todavía

impurificados (oligos largos sobre todo), entonces se realizó también una purificación por gel. O

bien, se suprimió el segundo HPLC de los oligos Off y se realizó directamente una purificación

por gel..I 'L I’ L'J

Üo Los conteniendo uridina, se sintetizaron modificando el

ciclo del sintetizador para los oligodesoxinucleótidos de forma de extender el período de

acoplamiento a 600 seg para la uridina solamente. Se liberaron automáticamente del soporte y

se trataron con NHa (c) 12 h a 55 °C. Se evaporaron los volátiles y a partir de aquí se trataron

como se describe en la síntesis de ARN.

o Los 2’-O-metiloligorribonucleótidos se sintetizaron siguiendo el protocolo 2 para la

síntesis de ARN con las siguientes modificaciones: se eliminó el paso que involucra la

desprotección del OH-2', el tratamiento con ácido acético se detuvo por el agregado de EtOH

7Song. 0.; Jones R. A. Tetrahedron Letters 1999. 40, 4653-4654.


(0.5 pl) y, luego de evaporar los volátiles, se disolvieron los oligos en agua y se realizó una

extracción con éter etilico, como se explica en la preparación de los oligodesoxinucleótidos.

o Las secuencias mixtasque contenían 2’-0-meti|ribonucleót¡dos y ribonucleótidos

se sintetizaron, desprotegieron y purificaron en forma análoga a la descn'pta para

oligornbonucleótidos. Para las ribozimas, que contenían, además, la 2'-C-metiluridina, una

incubación en HCI 0.01 N pH 2-2.5 (0.5 ml, para una síntesis 0.2 pmol) durante 7 h a

temperatura ambiente fue realizada, en lugar del tratamiento con AcOH. Se neutralizaron las

soluciones con NH4HC03 (s), se pasaron las ribozimas por HPLC, pero posteriormente una

purificación adicional por gel resultó ser necesaria.

Finalmente, para los estudios de las ribozimas se convirtieron los oligonucleótidos a su

forma sódica a través de un pasaje por una resina de intercambio catióníco (AG 50W-X2). En

una jeringa se colocaron aproximadamente 0.5 ml de suspensión de resina y se llevó Ia misma

a su forma sódica con NaOH 0.1 M hasta pH > 9, se Iavó posteriormente con varios volúmenes

de agua estéril (3 - 6 mi) hasta pH 7 y se agregó entonces Ia muestra correspondiente disuelta

en 0.2 mIde agua, y se eluyó con tres volúmenes de agua.

2.3.3- Marcado de los oligonucleótidos con 32Pen 5'.

- Se mezclaron en un eppendorf 2 pl de buffer A 10 x, Ia solución de oligonucleótido

(hasta 500 ng) en agua destilada, 2 pl de ATP-732? (10 pCi l pl) y se agregó agua destilada

para completar un volumen final de reacción de 20 pl y, finalmente, 2 pl de la enzima T4

polinucleótido quinasa 10 u / ul a 0 °C. Se incubó Ia mezcla por 45 - 60 min a 37 °C.

- Marcadores de PM: se mezclaron en un eppendorf 1 pl de buffer B 10 x, 2 ul de Ia

solución comercial de los marcadores de ADN diluida 1 : 10 (0.1 pg / pl), 1 pl de ATP-y32-P(10

pCi / pl) y la enzima a 0 °C (10 u / pl), 1p.|. Se mezcló y se dejó 10 min a 37 °C y 5 min a 55 °C.

Al cabo de este tiempo, se agitaron los tubos y las reacciones se detuvieron llevando Ia

temperatura a 0 °C. Se agregó agua destilada hasta completar 100 pl y se mezcló nuevamente.


De la reacción del sustrato se tomó 1 pl y se agregan 20 pl de agua y se midió la radiactividad

total en un contador de centelleo para poder cuantificar después la solución de oligo marcado.

Se lavó con 100 pl de CHCIa y los oligonucleótidos marcados se purificaron por

sephadex, de acuerdo a su PM:

a)OIigos de menos de 20 bases y escalera: Se usó sephadex G-25

(columna NAP-10), para ello se sembró la mezcla de reacción, después de

extraerla, en la columna previamente lavada con 3 ml de agua estén'l. Una vez

que la muestra entró íntegramente en la columna, se agregó agua destilada estéril

y se tomaron tres fracciones de 400 pl (W, E1, E2sucesivamente). Posteriormente

se tomó 1 pl de cada fracción y se agregaron 8 pl de buffer de siembra y se

cargaron las muestras en un gel analítico de poliacrilamida al 20 % en condiciones

desnaturalizantes (urea 7 M).Los oligos se encontraban generalmente puros en la

fracción E2.

La concentración de sustrato para el estudio in vitro de la actividad de la

n'bozima se estimó comparando la radioactividad total introducida en la mezcla de

reacción de marcado con la radioactividad de la fracción de sustrato purificado por

sephadex (siendo el volumen de esa fracción de 400 pl).

b)Ribozimas: Se usó sephadex G-50 (columna NICK), para ello se

sembró la mezcla de reacción después de ser extraída y diluida con 390 pl de

agua en la columna previamente equilibrada con 15 ml de agua estéril. Se

permitió que la muestra entre totalmente en la columna y se agregó agua

destilada, tomándose fracciones de 1m| primero (W) y dos fracciones de 1.5 ml

después (E1 y E2, respectivamente). Se tomaron 7 pl de cada fracción y se

agregaron 8 pl de buffer de siembra y se cargaron las muestras en un gel de

poliacrilamida al 20 % en condiciones desnaturalizantes (urea 7M). Las ribozimas

marcadas radioactivamente y purificadas se solían encontrar en la fracción E2.

2.3.4- Ensayo RNasa A.

Parte Experimental, Capítulo 2 —97

Se marcaron con 32P los oligonucleótidos de 12 bases (el control de ADN, UMe1y rU1) y.

en vez de purificariospor sephadex, se precipitaron con EtOH. Previo a la precipitación de

agregaron 200 pl de agua y se extrajo con 200 pl de una solución de alcohol isoamílico :

clorofonno ( 1:24) equilibrada a pH 7. A la fase acuosa se le agregaron 5 pl de acrilamida lineal,

20 pl de NaAcO 3 M, y 2.5 vol. de EtOH absoluto. Se incubó a - 70 °C durante 2 h y se centrifugó

20 min a 4 °C a 13 000 g. EI precipitado se lavó con 100 pl de EtOH 70 % y se centrifugó a 4 °C

nuevamente durante 15 min a 13 000 g.

Para las reacciones se suspendieron los oiigos en 20 pl de NaCI 100 mM se partió Ia

mezcla en dos partes iguales y a una de ellas se le agregó RNasa A hasta una concentración de

10 pg/ml. Se incubaron las reacciones durante 3h a 37 °C; se paró Ia reacción con la solución de

stop (15 pl) y los productos se analizaron en un gel de poliacrilamida al 20 %, urea 7 M.

2.3.5- Purificación de las ribozimas por gel.

Las ribozimas marcadas radioactivamente se purificaron por gel de poliacrilamida 10 %,

urea 7 M. Las bandas correspondientes se ubicaron por superposición del gel a un film para

radiografia, el cual se había expuesto un tiempo adecuado para poder identificar nitidamente las

bandas que fueron cortadas y colocadas luego cada una en un eppendorf. Se desgarraron con

una punta de pipeta automática los trozos de gel conteniendo las bandas correspondientes a las

ribozimas en fracciones Io más pequeñas posible, se cubrieron con 200 ul de agua estéril y se

agitaron. Se sumergieron 3 min en N2 (I) y luego se llevaron a 37 °C hasta que se fundió el

sólido y se agitó nuevamente. Este procedimiento se repitió tres veces. Luego se dejaron los

eppendrofs con agitación a 37 °C durante la noche. AI día siguiente, se tomó el sobrenadante

cuidadosamente con una pipeta estéril y se filtrócon lana de vidrio y se conservó a - 80 °C. Se

agregaron 200 ul más de agua a los eppendorfs que contenían los pedazos de gel y se dejó

durante Ia noche a 4 °C. Transcurrido ese tiempo, se tomó nuevamente el sobrenadante, se

Parte Experimenta Capítuio 2 - 98

fiitró, se combinó con la fracción anterior, teniéndose aproximadamente 350 ul de volumen final

en cada caso.

Entonces se procedió a precipitar el ARN. Se agregaron 35 ul de acetato de sodio 3 M

pH 5.2, 1 ul de glicógeno y 2.5 volúmenes de EtOH a - 20°C. Se agitó y se dejó durante Ia

noche a - 80 °C. AIdía siguiente se centrifugaron las muestras una hora a 4 °C, se descartó el

sobrenadante. se enjuagó cuidadosamente el precipitado con 100 ul de EtOH (a - 20 °C) + 30 ul

de agua (a 4 °C). Se volvióa centrifugar 30 min a 4 °C yse descartó el sobrenadante.

Para estimar el rendimiento en cada paso se midió la radiactividad de las fracciones en

cada paso de purificaciónen el contador de centelleo.

2.3.6- Estudios de temperatura de fusión de los oligonucleótidos

modificados.

Las muestras fueron preparadas agregando Ia hebras "antisentido" (ADNo ARN) en la

cubeta que contenía Ia hebra “sentido”. Antes de los experimentos de fusión, se registraron los

espectros entre 210 - 500 nrn a 25 °C de todas hebras “sentido”en presencia y en ausencia de

la hebra antisentido.

Los experimentos de fusión se realizaron en una cubeta de 1 ml y 1 cm de paso óptico en

una solución conteniendo: buffer fosfato pH 7 10 mM, EDTA 0.1 mM, y se agregó NaCI hasta una

concentración de sodio total igual a 100 mM, siendo 3 mM Ia concentración de cada hebra. Las

mediciones se llevaron a cabo como sigue: pn’mero, se midió Ia linea de base registrando el

espectro de Ia solución sin los oligos; se agregó, entonces Ia pn'mera hebra (sentido) y se adquirió

el espectro a 25 °C. Luego, se agregó el oligo complementario (antisentido) y se registró el

espectro de la muestra a 25 °C. La temperatura de la muestra fue incrementada a 80 °C y

después de 5 min, lentamente disminuida a 25 °C (en aproximadamente 20 min). Una capa de

parafina se agregó en eI tope del a muestra. Se descendió aún más la temperatura a 3 °C (en más

o menos 20 min); previamente, la cámara que contenía ia cubeta fue secada con una corriente de

N2.Los perfiles de fusión fueron adquiridos desde 3 - 5 hasta 80 -90 °C, con una rampa de 0.5 °C


/ min, midiendo Ia absorbancia a 258 nm. Las temperaturas de fusión fueron obtenidas a partir del

máximo de la primera derivada de las curvas de absorbancia vs temperatura.

2.3.7- Estudio de la actividad in vitro de las ribozimas.

Los estudios se llevaron a cabo en condiciones de recambio simple (exceso de ribozima

sobre sustrato). Primero, se realizó un paso previo de preapareamiento donde se incubaron las

mezclas de reacción 2 min a 95 °C, y se dejó alcanzar la temperatura ambiente lentamente en

un baño de agua de forma que toda Ia ribozima esté apareada al sustrato al empezar el estudio

cinético. De este modo, se puede analizar selectivamente la velocidad del paso quimico (khid).

Las reacciones se llevaron a cabo a 25 °C en buffer Tris-HCI 50 mM pH 8, NaCI 100 mM, EDTA

1 mM, con sustrato marcado con 32P en 5' (0.5 - 2 nM) y ribozima (40 - 200 nM). Después del

paso de preapareamíento, una vez alcanzada Ia temperatura de Ia reacción, se tomaron 2 ul de

la mezcla y se diluyeron en 15 ul de solución stop a 0 °C, alícuota to. Se iniciaron las reacciones

agregando 2 ul de MgCIz100 mM, el volumen final fue de 20 ul en todos los casos. Se tomaron

alícuotas (2 ul) a distintos tiempos y se trataron con 15 ul de Ia solución stop a 0 °C, como se

hizo con to. Se analizaron las fracciones en un gel de poliacrilamida en condiciones

desnaturalizantes (poliacrilamida 20 %, urea 7 M). Las bandas se cuantificaron usando un

"phosphorimagef'. Y se calcularon las constantes según el método del tiempo de vida medio

sobre la porción rápida de la curva, que representaba el 70 - 90% de la reacción (suponiendo

pseudo-primer orden).

2.3.8- Cultivo y Iisado de células.

Células 293 fueron Iisadas mediante un tratamiento hipoosmótico con buffer Tris-HCI50

mM pH 7.4. Se procedió como sigue para lograr el Iisado. Se estableció el cultivo de células a

partir de un stock de células 293 en glicerol mantenido en N2 (l), agregando 15 ml de medio

(DMEM/ F12, 1:1, suplementado con 10 % de SFB). Luego de repicar el cultivo dos veces se

Parte Experimental. Capitqu 2 - 100

procedió a preparar el lisado a partir de células en 70 - 80 % de confluencia (aproximadamente

10 - 20 10‘5células). Las células se Iavaron con 2 x 5 ml de PBS y luego se suspendieron en 10

ml de PBS. Se pasaron a un tubo falcon y se centnfugaron 4 min a 1000 rpm. Se descartó el

sobrenadante. Se resuspendieron las células en 1 mI de PBS, se pasaron a un eppendorf y se

centnfugaron a 500 g durante 3 min. Se descartó el sobrenadante y las células se suspendieron

nuevamente, esta vez en 1 mI de buffer Tris-HCIpH 7.6 durante 5 min. Entonces la suspensión

se sumergieron en N2(I) por 30 seg y después se incubó a 30 °C con agitación hasta que se

fundió el sólido. Este procedimiento se repitió tres veces. Finalmente, para obtener el lisado se

centrifugo a 20000 g durante 10 min y se tomó el sobrenadante.

2.3.9-Estudio de la estabilidad de las ribozimas en distintos fluidos.

Se suspendieron las ribozimas marcadas radioactivamente, después de la precipitación

con EtOH, en agua estéril ajustando la concentración a 0.3 uM. Entonces se tomaron 5 ul de Ia

solución de ribozima y se agregaron 15 ul de una de las siguientes suspensiones:

- medio de cultivo de células 293T (DMEM/ F12 (1:1), 10 % SFB),

- lisado de células 293,

- directamente en SFB.

De esta forma el volumen final de cada experimento fue de 20 ul. Las mezclas se

incubaron a 37 °C en condiciones controladas de humedad (94.5 %) y de C02 (5 %) para

mantener el pH y la concentración de muestra constantes. Se tomaron alícuotas (2 pl) a

distintos tiempos que fueron mezcladas con 20 pl de solución stop (Ia misma que se usó para

las reacciones de las ribozimas) y almacenadas a - 80 °C hasta que se sembraron en el gel. Se

analizaron, entonces, las muestras por gel (poliacrilamida 20 %, urea 7M), se cuantificaron las

bandas usando phosphorimager y se calcularon los tiempos de vida medio.

Parte C

Resultados y discusión

Resultados. Estudio Computacional. Capitulo 3 - 103

Capítulo 3

Estudio computacional

3.1- Objetivos.

En este capítulo se muestra el estudio computacional que se realizó en forma

preliminarpara analizar si la introducción de 2’-C-metilnucleótidos en las posiciones de la

ribozima cabeza de martillo en las cuales se habían detectado interacciones que

involucraban al OH-2' afectaba la estructura global de la ribozima.’

3.2- Motivos del análisis computacional.

En este trabajo se propone una nueva clase de nucleótidos modificados en el

azúcar, los 2’-C-metilnucleótidos, útiles para el desarrollo de análogos de ARNestables en

fluidos biológicos. Se espera que estos monómeros provean, cuando sustituyan un

n'bonucleótido particular, un grupo OH-2’, disponible para reproducir las interacciones

necesarias para el correcto plegado de las moléculas de ARN. Paralelamente, Ia presencia

del metiloen 2', proporcionaría resistencia frente a Ia degradación mediada por nucleasas.

Esta hipótesis está condicionada a que la conformación del azúcar en el nucleótido

modificado sea Ia misma que en el ARN, esto es C3'-endo o norte. Un estudio realizado

“a nu. “Mg/u. ...:..' .‘I 4HGadlïc-CUSEstudió computacnar. CaprtUro 3 - .04

anteriormente en nuestro grupo sobre una modificación relacionada, los (2'S)-2’-alquil-C-2'

desoxinucleósidos, demostró que, en solución, el azúcar de dichos monómeros adoptaba la

misma conformación que aquella preferida por los nbonucleósidos, C3'-endo.2 Es de

esperar que en los 2'-C-meti|nucleósídos la presencia adicional del OH-2' sirva para fijar aún

más la conformación del azúcar, ya que el metilo adoptaría una orientación ecuatorial y el

OH-2' una orientación axial. Se ha demostrado que los sustituyentes 2'-C-a|qui|o tienden a

conservar una orientación pseudo-ecuatorial por razones estéricas, mientras que los

sustituyentes oxigenados tienden a ocupar una situación pseudo-axial debido al efecto

gauche estabilizante O4'l02’,3 y ambos factores favorecen que el azúcar de los 2'-C

metilnucleósidos adopte la conformación norte. Adicionalmente, un estudio de rayos X

mostró que el azúcar de la 2’-C-meti|uridinacristalizada adoptaba la conformación norte.4

Primeramente, se encaró el trabajo realizando un estudio computacional, de forma

de intentar determinar si el plegamiento del azúcar de los 2'-C-metilnucleót¡dos era

efectivamente del tipo norte. Posteriormente se intentó predecir cómo afectaría Ia

incorporación de estos monómeros a la conformación terciaria de una molécula de ARN, Ia

ribozima cabeza de martillo,que es el modelo en el que se pensaba ensayar la aplicabilidad

de la nueva modificación. En el caso que los cambios producidos debido a Ia introducción

de los 2'-C—meti|nuc|eótidosno fueran significativos, se tendria un punto de partida más

firme que justifique el desarrollo de los monómeros para Ia sintesis en fase sólida de estos

nuevos análogos de ARN.

3.3- Resultados.

‘ Este trabajo se hizo gracias a la colaboración y ayuda de Ia Dra. Elisabeth Jares.2 Cicero, D. 0.; Iribarren, A. M.; Bazzo, R. Appl. Magn. Reson. 1994, 7, 95-105.3 Koole. L. H.; Wu, J.; Neidle, S.; Chattopadhyaya, J. J. Am. Chem. Soc. 1992. 114, 2687-2696.4 Beigelman, L. N.; Ermolinsky, B. S.; Gurskaya, G. V.; Tsapkina. E. N.; Karpeisky, M. Y.; Mikhailov, S. N.Carbohydrate Res. 1987. 166, 219-232.

Resultados. Estudio Computacional. Capitqu 3 - 105

Se minimizó Ia energía de los 2’-C-meti|nucleótidos por mecánica molecular. La

conformación de menor energía resultó ser, como se había predicho, C3'-endo. Con el fin de

realizar un estudio confonnacional más detallado se optimizó la conformación de Ia 2'-C

metiluridina,usando métodos semiempín'cos y ab ¡nifio Para una discusión más detallada de

la conformación de este nucleósido dirigirse al capítulo 5, donde se discute el estudio

confonnacional realizado.

Por otra parte, como ya mencionado anteriormente, se tomó como molécula modelo

para analizar la factibilidad de nuestra hipótesis la ribozima cabeza de martillo. Pley y

colaboradores reportaron Ia elucidación estructural de un complejo de una ribozima cabeza de

martillo con un inhibidor (hebra de ADN) por cristalografía de rayos X (figura 3.1).5 A partir de

este estudio, ellos construyeron un modelo tridimensional de Ia ribozima, que fue confirmado

posteriormente en otro estudio realizado por Scott y colaboradores.6 La semejanza entre la

estructura terciaria de los dos complejos es notable a pesar de que, en el caso del trabajo de

Scott, el inhibidor consistía, en vez de ADN, en una cadena de ARN, en la cual solamente la

citidina en el sitio de hidrólisis se reemplazó por una 2’-O-metilcitidina para prevenir Ia

reacción, y de que las condiciones salinas para obtener los cristales eran mucho más suaves.

Se partió, por consiguiente, de Ia estructura publicada por Pley, disponible en una

base de datos y se reemplazaron por 2'-C-meti|nucleótidos, cuya conformación había sido

optimizada por mecánica molecular, los nucleótidos de cada una de las posiciones de Ia

ribozima cabeza de martillo en las cuales los OHs-2’ demostraron estar involucrados en

interacciones de orden terciario, de acuerdo a Io observado por Pley. Estas posiciones son: U4

(cuyo OH-2‘ interactúa con el N7 de As), G5 (su OH-2' interactúa con el 02' de C152), U7(cuyo

OH-2' hace puente de hidrógeno con el N1 de A14),G3 (su OH-2' tiene puente de hidrógeno

con la base de G12) y G12 (cuyo OH-2' interacciona con el amino exociclico de A9). Se

individualizaron las interacciones de orden estérico que se originaban, ya que distancias

menores de 2 Á se supone generan interacciones desestabilizantes.

5 Pley, H. W.; Flaherty, K. M.; McKay, D. B. Nalure1994. 372, 68-74.

5 Scott, W. G.; Finch, J. T.; Klug, A. Cell 1995. 81, 991-1002.

AAAResultados Estudio Computacional. Capitulo 3 - :uo

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Brazo III C...dG

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H . .Bmo U7 A‘ RJbOZIma

Figura 3.1. Secuencia del complejo ARN-ADNusado por Pley ycolaboradores en sus estudios cristalográficosde la

ribozima cabeza de martillo.

Luego, se realizó una minimizaciónenergética de la ribozima tomando esta estructura

como base7 y se compararon las distancias entre los átomos cercanos al metilo introducido y

al OH-2’, antes y después de la minimización. Se verificó si las interacciones estéricas

identificadas se relajaban como consecuencia de Ia minimización, y si este reordenamiento

producía una alteración drástica en la estructura de Ia ribozima.

Este procedimiento se llevó a cabo reemplazando, uno a uno, los siguientes

nucleótidos por los respectivos 2’-C-metilnuc|eótidos: U4, Gs, U7, Ga, y G12. Los resultados

obtenidos en cada una de estas posiciones se muestran en la tabla 3.l.

En el caso de U4 (ver figura 3.2), al introducir el metilo en 2’ se midieron distancias

menores que 2 Á, entre el metilo con el H3' de G5 y con el H8 de As. Las distancias con el

resto de los átomos era mayor a 2 Á, con Iocual, se supone, no se generaban perturbaciones

de tipo estérico adicionales. AI realizar Ia minimización, la disposición de los átomos en Ia

zona donde se generaba el conflicto van'aba un poco, de forma de alejar esos átomos tan

cercanos y minimizar esos disturbios. Pero Ia conformación global de Ia ribozima y, en

particular, el núcleo catalitico no parecian sufrir cambios perceptibles.


Posición donde Átomos con los cuales Distancia antes Distancia

se introdujoel el metilogenera de Ia después deta2'-C- interacciones minimización (Á) minimización (Á)

metilnucleótido desestabilizantes

(distancia < 2 Á antesde minimizar)

U4 H3', G5 1.27 2.14H8. As 1.34 2.15

C8, As 1.92 2.49Gs H8. As 1.96 2.65

04. A6 1.50 2.27

U7 08, Ga 1.88 2.64H8, Ga 1.70 2.71

05'. Ga 1.32 2.37Ga H8, Ga 1.55, 1.32 2.28. 2.39

CB, Ga 1.87 2.74

H8, A13 1.70 2.24

G12 N2, Ga 1.92, 1.48 2.56, 2.83NH21. G3 1.68, 1.42 2.31, 2.79NH22, Ga 1.65, 1.82, 1.45 2.59, 3.23. 2.74

Tabla 3.I. Interacciones de orden estérico (< 2 Á)observadas cuando se introdujeron2'-C-meti|nucleótidosen cada una de las posiciones indicadas. Se muestran las distancias antes y después dela

minimización energética.

7 Peanman. R. s. NIDARes. Monogr. 1991, 112. 62-77.

Resultados. Estudio Computacional. Capítulo 3 - 108 —

Figura 3. 2. Detalle de la estructura de Ia ribozima en Ia zona de U4con una2’-Gmetiluridina en esa posición antes (derecha) y después (izquierda) de la minimización.

Figura 3.3. Detalle de la estructura de la ribozima en la zona de G12con una2'-C--metilguanosina en esa posición antes (derecha) y después (izquierda)

de la minimización.

Resultados Estudio Computacional. Capitulo 3 - 109

Al introducir el metilo en G12(ver figura 3.3), éste resultó estar demasiado cerca del

grupo amino exocíclico de A13,pero luego de la minimización, los grupos se reacomodaron de

forma de evitar estas interacciones sin producir grandes cambios.

Figura 3.4. Detalle de la estructura de la ribozima en la zona de U7con una2'-Gmetiluridina en esa posición antes (derecha) y después (izquierda)

de la minimización.

Lo mismo ocurre con U7y G5(ver figuras 3.4 y 3.5, respectivamente). La

incorporación del metilo origina interacciones de orden estérico con la base de Gey A6,

respectivamente. Nuevamente, la minimizaciónlleva estas distancias a valores que no

implicandesestabilización en la ribozima, sin perturbar mayormente su estructura global.

Diferente es el caso de Ga (ver figura 3.6), en el que al introducir el metilo-2’ se

originan interacciones de tipo estérico, pero dentro del nucleótido en sí, ya que el metilo se

encontró demasiado cercano al N8 de la guanina y del 05’ del azúcar. Luego de la

minimización se produce un cambio en la estructura del azúcar que adopta una conformación

tipo bote, se aleja el metilo y se altera dramáticamente la estructura de la ribozima (datos no

mostrados).

Resultados. Estudio Computacional. Capítqu 3 - 110

Figura 3.5. Detalle de Ia estructura de Ia ribozima en Ia zona de G5con una2’-C-metilguanosina en esa posición antes (derecha) y después (izquierda) dela minimización.

Figura 3.6. Detalle dela estructura de Ia ribozima en la zona de Ga con una2’—C-metl|guanosinaen esa posición antes (derecha) y después (izquierda) de

Ia minimización.

Figura3.7.EstructuradeIaribozimacon2’-C-meti|nuc|eótidosenlasposicionesU4,G5,vaG12

antes(derecha)ydespués(izquierda)delaminimización‘

Resultados. Estudio Computacional. Capítqu 3 - 111


Exceptuando el caso de Ga, los resultados fueron positivos, es decir, Ia introducción

del metiloen cuestión en cada una de estas posiciones generó leves interacciones estéricas

que estéricas que desaparecieron luego de la minimización,con un casi imperceptible cambio

en la conformación global de Ia ribozima.

Finalmente, se introdujeron simultáneamente en las posiciones U4, Gs. U7 y G12 los

respectivos nucleótidos con la modificación aquí propuesta, se realizó la minimización y se

verificó que Ia estructura global de la ribozima virtualmente se mantenía (ver figura 3.7).

3.4- Discusión.

Los resultados obtenidos en este estudio preliminar indican que la introducción de 2'

C-metilnucleótidos en las posiciones del núcleo catalitico de la n'bozima cabeza de martillo,

cuyos OHs-2' demostraron estar involucrados en puentes de hidrógeno en la estructura de

Pley, no afecta a la conformación global de Ia misma. Una excepción es el caso de G3, en el

cual el reemplazo por la 2'-C-metilguanosina, produce una alteración sustancial del núcleo

catalitico. Este resultado no es sorprendente debido a que la conformación del azúcar de esta

guanosina Ga es C2'-endo,3 que le permite a su OH-2' interactuar con el amino exocíclico y

con el N1 de G12,y paralelamente a su 04' enlazarse con el amino exocíclico de A13.Además,

Ga presenta la base sustancialmente torcida. respecto de una interacción planar base-base

con A13. Estas interacciones terciarias de Ga parecen ser cruciales para estabilizar la

estructura global del dominio 2 del núcleo catalitico de la nbozima.9 La conformación del

azúcar no se modificó luego de Ia minimización en ninguno de los otros cuatro casos y era Ia

misma que en la ribozima natural, es decir CS'-endo.

El azúcar de los 2'-C-meti|nucleósidos, debido a la presencia del gmpo metilo en Ia

cara B del azúcar, que tiende a ubicarse en posición pseudo-ecuatorial para minimizar las

9 Scott. W. G.; Finch, J. T.; Klug, A. Cel/1995, 81, 991-1002.9 Mc Kay. D. B. en Nucleíc Acids and Molecular Biology, Vol. 10 ed. por Eckstein, F y Lilley, D. M. J. 1996. 166167.


repulsiones estéricas con la base y con el metileno 5' (repulsión 1,3-diaxial),1° adopta Ia

misma conformación que el azúcar de sus contrapartes naturales, pero es mucho menos

flexible.11Debido a esta falta de flexibilidad, la 2'-C>metilguanosina no es capaz de cambiar su

conformación a C2'-endo para satisfacer los requerimientos estructurales de la ribozíma, como

Io hace la guanosina natural, la cual puede desplazar más fácilmente el equilibrio de la

conformación de su azúcar de norte a sur. La presencia del metilo genera interacciones que,

aparentemente, no pueden relajarse fácilmente si el azúcar adopta la conformación sur.

Adicionalmente, Ia presencia del metilo interfiere con el torcimiento de la base de este

monómero como fue observado en la estructura de rayos X de la ribozíma.

Cabe recordar, que todos estos resultados se derivan de Ia estructura cristalina de la

ribozíma con su inhibidor. La conformación del complejo en su estado cristalino y en un medio

de concentración salina elevada puede ser muy diferente a la que adopta en solución y a

concentración fisiológica, donde la ribozíma es activa. Además, como hemos mencionado

anteriormente, Ia estructura de la ribozíma cristalizada es la del estado basal, mientras que en

el estado de transición, la conformación puede ser sustancialmente diferente. No obstante,

también podria argumentarse, de acuerdo a trabajos posteriores de crio-cristalografía que

permitieron visualizar un intermediario temprano y uno tardío del complejo de la ribozíma y su

sustrato, que la conformación de la ribozíma activa en estas condiciones es muy similar a la

de la ribozíma en el estado basal.12 Una limitación adicional proviene del hecho que las

minimizaciones realizadas luego de introducir los 2'-C-metilnucleótidos son en vacío y no en

solución, por Io tanto no consideran las interacciones con el solvente.

3.5- Conclusión.

1°Koole, L. H.; Wu, J.; Neidle, S.; Chattopadhyaya, J. J. Am. Chem. Soc. 1992, 114, 2687-2696.1‘ limori, T.; Murai, Y.; Ohuchi, 8.; Kodama, Y.; Ohtsuka, Y.; Oishi, T. Tetrahedmn Left. 1989. 32, 7273-7276.

1?Murray, J. B., Terwey, D. P.; Maloney. L.; Karpeisky. A.; Usman, N.; Beigelman, L. Scott, W. G. Cell 1998, 92,665-673.

Resultados. Estudió Computacional. Capitulo 3 - ll"

Este estudio computacional tenía como objetivo aportar datos preliminares que

avalaran la hipótesis que esta nueva modificación, que incluye el OH-2', permitiría la

construcción de ribozimas modificadas activas. Si bien este estudio computacional constituyó

una primera aproximación cuyos resultados fueron un impulso para seguir adelante con el

proyecto, las limitaciones del método son tales que no permiten extraer conclusiones

definitivas y estas predicciones debieron ser contrastadas con resultados experimentales. Por

este motivo fue necesario preparar los monómeros correspondientes a los 2'-C

metilnucleótidos para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos y probarla actividad de las

ribozimas modificadas resultantes.

Resultados. Sintesis de los monómeros. Capítulo 4 - 115

Capítqu 4

Síntesis de los monómeros

4.1- Objetivos.

EI objetivo de este capítulo es mostrar Ia estrategia sintética empleada para la

preparación de los 2'-C—metilnucleótidos,asi como también, describir Ia obtención de las

fosforamiditas necesarias para la síntesis automatizada de oligonucleótidos, incluyendo la

protección regioselectiva del grupo 0H-2'. Se comenzó por las pirimidinas debido a la menor

complejidad de los caminos sintéticos involucrados. En primer lugar, se diseñó una ruta sintética

que se creyó conveniente, la cual incluye Ia síntesis estereoselectiva de Ia 2'-Gmeti|uridina, su

adecuada protección y Ia formación del derivado de fósforo. Se empezó con la un'dina porque

en el núcleo catalitico de la n'bozima cabeza de martillo, que es el modelo en el cual se planeó

ensayar Ia hipótesis de la aplicabilidad de nuestra modificación, existen dos OHs-2' de uridinas

que son importantes para la actividad y ninguno de citidina. Se presentan, además, los

adelantos alcanzados en la preparación del derivado correspondiente a Ia adenosina.

4.2- Síntesis de la 2’-C-meti|uridina.

El esquema 4.| muestra la ruta que se siguió para la preparación de Ia 2'-C

metilun'dina. La uridina fue transformada en la 3',5'-O(tetraisopropiIdisiloxan-1,3diil)-uridina (2)

Resultados. Síntesis delos monómeros. Capítulo 4 - 1-15

usando el reactivo disiloxano de Markíewicz1y piridina como solvente.2 Este grupo protector es

ideal porque permite proteger regioselectivamente las posiciones 3’ y 5' y, por lo tanto, trabajar

sobre la posición 2'. Es sumamente estable frente a ácidos, bases, condiciones oxidantes y

reductoras y las reacciones para su introducción y remoción son muy sencillas y de alto

rendimiento.3

La oxidación del OH-2' con trióxido de cromo / Py / anhídrido acético se llevó a cabo

según estaba reportado en la literatura con 80 % de rendimiento.4 Se realizó alguna variación

en la purificación respecto a Io informado por Hansske y colaboradores, debido a la dificultad

para eliminar el trióxidode cromo. En ese trabajo se indicaba la percolación con acetato de etilo

del aceite obtenido luego de concentrar Ia mezcla de reacción. Sin embargo, después de este

procedimiento se aislaba el producto carbonílico altamente contaminado con el trióxido, lo cual

exigía purificaciones adicionales posteriores. Por lo tanto, en lugar de la percolación, se decidió

realizar directamente una columna cromatográfica de sílica gel, después de filtrarel crudo de la

reacción sobre lecho de celite para eliminar los productos de cromo insolubles. Este

procedimiento permitió eliminar las trazas de cromo restantes y la obtención de la 2'-cetouridina

(3) pura.

Esta técnica de oxidación, a pesar de ser eficaz, presenta dificultades en la eliminación

del trióxido de cromo, es por eso que se pensó como alternativa en recurrir a otras técnicas,

como aquellas que involucran dimetilsulfóxido, más algún activante electrofílico para Ia

oxidación. Se probó con dimetilsulfóxido y anhídrido acético5 y con el método propuesto por

Swem (dimetilsulfóxido y cloruro de oxalilo),‘5-7ambos métodos anteriormente reportados para la

oxidación de azúcares. Los rendimientos obtenidos con estas técnicas fueron, sin embargo,

similares al de la reacción de oxidación con trióxido de cromo, no introduciendo ninguna mejora

1 Markíewicz, W. T.; Vtfiewiorowski, M. en Nuc/eic Acids Chemistry, Towsend, L. B., Tipson R.S. Wiley, New York1986, 229.2 Robins, M. J.; Wilson, J. S.; Hansske, F. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 4059-4065.

3 Hagen, M. D.; Happ, C. S. J. Org. Chem. 1988, 53, 5040-5045.4 Hansske, F.; Majed, D.; Robins, M. J. Tetrahedron1984, 40, 125-135.5Albright, J. D.; Goldman, L. J. Am. Chem. Soc. 1964, 89, 2416-2423.5 Mancuso, A. J,; Swem, D. J. Org. Chem. 1918, 43, 2480-2482.7 Marx, M.; Tidwell, T. J. Org. Chem. 1984, 49, 788-793.


adicional.

La reacción de Wittigsobre el compuesto 3 con bromuro de metiltrifenilfosfonioen THF,

usando n-butil litiocomo base dio el metilenpirimidin-nbósido (4) con 69 % de rendimiento.8

El alqueno fue, entonces, oxidado cuantitativamente con óxido de N-metilmorfolina y

Os04 como catalizador.9 Esta reacción es sumamente limpia, y altamente estereoselectiva.

Cuando se realizó en pequeña escala, se obtuvo un único producto conforme se observó por

RMN. Sin embargo, al repetirla aumentando Ia escala. se vio una pequeña contaminación del

producto mayoritario con el otro diasterómero (97 : 3). Este producto secundario se detectó

tanto por c.c.d. como en el espectro de 1¿iC-RMN.En este punto, Ia configuración del 02' del

diasterómero mayoritariose asignó tentativamente como en el compuesto 5. sobre la base que

es más probable que el ataque del 0504 ocurra por el lado menos impedido, o sea, la cara o del

anillo del azúcar. Esta hipótesis fue confirmada en eI último paso de Ia sintesis del 2'-C

metilnucleósido, como se discutirá más adelante.

El subsecuente tratamiento con cloruro de p-toluensulfonilo. permitió Ia tosilación

selectiva sobre el alcohol primario que pudo ser aislado por columna cromatográfica para

obtener el compuesto 6 con un 60 % de rendimiento. EI fin de este paso de sintesis es

reemplazar el hidroxilo primario por un grupo que sea un buen grupo saliente para el

desplazamiento posterior con borohidruro de sodio. EI cloruro de tosilo ataca al hidroxilo

priman'ocon preferencia al terciario debido al impedimento estén'co. No se observó reacción de

este últimogrupo, incluso con grandes excesos de agente tosilante y luego de largo tiempo de

reacción. Además, luego de esta reacción se produce una mejor separación cromatográfica de

ambos diasterómeros, lo cual facilita Ia purificación del producto mayoritario.

La reacción de 6 con borohidruro de sodio10 dio la 2'-C-metiluridina protegida con el

puente dísiloxano (7).

3 Sano, T.; Shuto. S.; Inoue, H.; Ueda. T. Chem. Pharm. Bull. 1985. 33, 3617-3620.

9 Van Rheenen, V.; Kelly, C. R.; Cha, D. Y. Tetrahedron Lett. 1973, 1976-1979.

Resultados. Sintesis de los monomeros. Capítulo 4 - 11.8

H0

NH

_i_> Ys/ o —’ l o(|3\ . °\ OH

o

NH I NH

íu\/ko . ‘í/o NÁ° — Ho I N/KOl

Esquema 4. I. Preparación de Ia 2'-C-meti|uridina.i: a- TIPDSCI2, Py; b- MeOH; ii: a- Cr03, Py, A020. CH2CI2; b- AcOEt; iii:a- Ph3P=CH2, THF; b- Et20, NH4CI; iv:a- 0504, MNO. t-BuOH, THF; b- NaHSOS 1 M. AcOEt; v: TsCI. Py; vi: a- NaBH4, DMF; b- NH4CI; vii: TBAF, THF.

El compuesto 7 fue desililado con TBAF para dar el nucleósido libre 8, el cual se purificó

para llevar a cabo un análisis por RMN con el fin de asignar certeramente la configuración del

C2' y realizar el estudio conformacional que se detalla en el capítulo 5. Con ese fin, se midieron

todas las constantes que son sensibles a ambas, a Ia configuración de ese carbono y a la

1°Hutchins, R. 0.; Kandasamy, D.; Dux Ill, F.; Maryanoff, C. A.; Rotstein, D.; Goldsmith, B.; Burgoyne. W.; Cistone,

Resultados. Sintesis de los mcnómeros, Capítqu 4 - 119

conformación del azúcar. Éstas incluyen las constantes de acoplamiento entre H3' y H4', y un

número de constantes heteronucleares 1H-13C.En particular, el valor de 0.5 Hz obtenido para

J(H3',CH3) permite establecer Ia configuración del C2', ya que este pequeño número es sólo

compatible con una orientación cis del grupo CH3 respecto aI H3'. Una constante relativamente

grande (n 4 Hz) hubiera sido esperada en el caso que estos grupos estuvieran orientados en

forma trans-diaxial.

4.3- Preparación de la fosforamidita de la 2’-C-metiluridina.

El próximo paso en el camino sintético planeado era la protección adecuada del

monómero para Ia síntesis de oligonucleótidos. Las protecciones del hidroxilo 5’ y el

acoplamiento con ,B-cianoetoxi-N,N-diisopropilaminoclorofosfina para obtener la fosforamidita

correspondiente constituyen técnicas de rutina en la síntesis de oligonucleótidos. No obstante,

Ia protección del hidroxilo2' es un punto que requiere particular atención, ya que constituye una

complicación adicional respecto a Ia síntesis normal de oligodesoxinucleótidos. EI grupo

protector elegido para esa función debe cumplir con requisitos generales como ser estable

durante Ia elongación de Ia cadena, esto implica, estabilidad frente a ácidos (el DMTr, grupo

protector del hidroxilo 5', se elimina mediante tratamiento con TCA), a agentes oxidantes (se

oxidan las fosforamiditas para obtener los fosfatos con l2 / Py / agua), y a las condiciones

alcalinas de desprotección de las bases y de los grupos fosfato. Por otra parte, debe ser

cuantitativamente removido en condiciones suaves al final de Ia síntesis sin interactuar con el

enlace fosfodiéster -3’,5' vecino. Además, Ia protección selectiva de este hidroxiloterciario se ve

complicada por la presencia de otros dos grupos hidroxilos, uno pn'man'oy otro secundario; con

Io cual, los hidroxilos 3' y 5' deben ser previamente bloqueados y, por consiguiente, el grupo

protector de 2' elegido debe ser estable a las condiciones requeridas para desproteger las

posiciones 3' y 5’.

EI TBDMS éter es el grupo protector usado en Ia sintesis de rutina de ARN,11-12por lo

F.; Dalessandro, J.; Puglis, J. J. Org. Chem. 1978, 43, 2259-2267.1‘ Prakash, C.; Blair, A. I. Tetrahedmn Lett. 1989, 30, 19-22.

Resultados. Sintesis de los monómeros. Capítulo-4 - 120

tanto, fue el primer grupo que intentamos usar; pero, dado que es un grupo muy voluminoso, la

introducción en el hidroxilo terciario de 2' era un punto dudoso. Inicialmente, tratamos de

introducir el grupo TBDMS directamente en el nucleósído modificado protegido con el puente

disiloxano (7) (ver esquema 4.II). La idea era desproteger luego selectivamente 3' y 5’, en

presencia del TBDMS éter en la posición 2’,13aprovechando que un alcohol terciario está

estéticamente más impedido que uno pn'man'oy uno secundario y que eI puente disiloxano es

levemente menos estable que el TBDMS.14 No obstante, intentos para obtener el

correspondiente derivado de 7 usando condiciones estándar (TBDMSCI / TEA) resultaron

infructuosos. No se detectó, incluso, producto con el uso de un agente sililante poderoso como

el tn'flato de TBDMS / hidruro de potasio l éter corona (dibenzo-18-corona-6),15 técnica

especialmente descripta para alcoholes muy impedidos estéricamente, después de cinco días,

ni aún a 60 °C. Con el fin de ensayar la influencia del voluminoso 3',5’-disiloxano, se pensó en

proteger transientemente 3' y 5' con acetilos. El 3',5'-di-O-aceti| den'vado 9 fue preparado por

acetilación con anhídrido acético / Py (70 % desde 7) del crudo de la reacción con TBAF para

obtener el nucléosido libre 8. Sorprendentemente, tuvieron que ser agregados no más de 2

equivalentes del agente acetilante al medio de reacción para evitar la peracetilación. En este

caso, la 2'-ten‘-butildimetilsililaciónde 9 tampoco funcionó incluso luego de largos tiempos de

reacción a altas temperaturas y usando exceso de agente sililante (3.5 equivalentes).

Otro grupo protector apropiado para 2’, debido a sus propiedades químicas y a su

tamaño es el tetrahidropiranil éter.1GEste grupo, además, ya fue usado en la síntesis de ARN,

permitiendo la sintesis de oligorribonucleótidosde hasta 20 bases eliminándose en condiciones

relativamente suaves, sin Ia concomitante migración del enlace fosfodiéster. Sin embargo, tiene

la desventaja que puede reaccionar sobre y bajo el plano del doble enlace carbono-carbono,

dando mezclas de diasterómeros que dificultan su purificación y la interpretación de espectros.

Y, más importante, es relativamente lábil a las condiciones ácidas (ácido tn'cloroacético en

12Chaix, C.; Dupka, A. M. Nucl. Acíds Res. 1989, 17, 7381-7386.

13Nelson, T. D.; Crouch, R. D. Synthesis 1996, 1031-1069.1‘ Bruzik, K. S. ; Tsai, M. D. J. Am. Chem. Soc. 1992,114, 6361-6374.

‘5 Braish, T. F.; Fuchs, P. L. Synth. Commun. 1986, 16, 111-115.1°Gait, M. J. en Olígonucleotide Synthesis, a practical approach, IRLPress 1985, p.156-158.

Resuitados. Sintesis delos monómeros. Capitulo 4 - iZi

diclorometano) requeridas para Ia eliminación del grupo dimetoxitritilo que protege el OH-5'

durante Ia sintesis en fase sólida,17-18con lo cual su uso está limitado a la preparación de

otigonucleótidos de no gran longitud.19Por estos motivos, fue desplazado por el TBDMS en la

sintesis de oligorribonucleótidos normales.

I NH , NH

Á/o off/Ko _\_> í/o I N/Ko—\—> i,\s¡—o OH

rr , es; mi Q3 ° , °

NW 6:1 w ACCfNJ:FL0o wACO OH AcO OTBDMS

9

Esquema 4.Il. Intentos infrucutosos de introducir el grupo portector TBDMSen 2'.i: TBDMSCI, TEA, 60°C, 5 días; ii: TBDMS Tf, KH, crown éter, 60°C, 5 dias; iii:TBAF, THF; iv: Ac20, Py.

No obstante, preliminannente el objetivo era introducir los 2'-C-metiinucieótidos

solamente en determinadas posiciones de moléculas análogas de ARN en donde la presencia

del OH-2‘ es esencial para Ia actividad, y no en todas las posiciones, con el fin de probar Ia

aplicabilidad de Ia modificación. Por lo tanto, el hecho que el THP fuera relativamente lábil en

medio ácido no resultaba, en principio, mayor problema porque los riesgos debidos a su

labilidad al ácido estaban minimizados en primera instancia, ya que el monómero protegido con

tetrahidropiranilo seria introducido en unas pocas posiciones del oligorn'bonucleótido, Ia

17Christodoulou, C.; Agrawal, S.; Gait, M. J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 1521-1522."3Reese, C.B.; Skone, P. A. Nucl. Acids Res. 1985, 13, 5215-5231.

Resultados. Síntesis de los monómeros. Capitulo :1- 122

ribozima cabeza de martillo,y esas posiciones eran relativamente cercanas al extremo 5', con lo

cual el THP no estaria expuesto a muchos ciclos de desprotección del DMTr.Por consiguiente,

probamos con este grupo como una primera aproximación para ensayar la aplicabilidad de

nuestra modificación.

En el esquema 4.Il| se muestra la preparación del monómero para Ia sintesis en fase

sólida de oligonucleótidos de la 2'-C-meti|uridina. La reacción de 7 con 3,4-dihidro-2H-pirano /

ácido p-toluensulfónico monohidrato20no dio el producto esperado, aún cuando se empleó un

gran exceso de reactivos y altas temperaturas. Finalmente, el producto deseado 10, se obtuvo

cuando el compuesto diacetilado 9 se usó como material de partida (80 %). Se observó que la

reacción no se completaba y degradación del material de partida era visible por c.c.d. El

catalizador, ácido p-toluensulfónico monohidratado, era aparentemente un factor crítico porque

con poca cantidad del mismo no se detectaba el producto dentro de las 48 horas, mientras que

con exceso, el material de partida se descomponia rapidamente. Después de agregar un gran

exceso de dihidropirano, se vio Ia mancha correspondiente al producto por c.c.d. y, aunque no

se logró desplazar totalmente el equilibrio (el tiempo de reacción fue una solución de

compromiso, tal que se optimizó la proporción de los productos frente a Ia descomposición del

reactivo), se obtuvo la mezcla de diasterómeros 10 con un rendimiento del 80 %

aproximadamente, pudiéndose reciclar el compuesto 9 sin reaccionar, luego de aislado por

columna cromatográfica. El rendimiento para la introducción del THP en 9 es más bajo y la

reacción es más lenta que los reportados para la 3',5'-di-O-acetilun'dina,21en las mismas

condiciones seguramente debido al impedimento estérico del alcohol terciario.

El compuesto 11 fue obtenido por tratamiento de 10 con amoniaco metanólico (100 %).

La protección del OH-5' con dimetoxitn'tilopara obtener 12 se realizó en Py con cloruro

de 4,4'-dimetoxitriti|o y TEA, usando 4dimeti|aminopiridina como catalizador (78 %). Es

importante destacar que, a partir de aqui, para minimizar Ia pérdida del grupo protector que es

muy Iábil a ácido, las purificaciones se realizaron agregando 1 % de TEA a los solventes de

19Kierzek, R.; Caruthers, M. H.; Longfellow, C. E.; Swinton, D.; Turner, D. H.; Freier, S. Biochemistry1986, 25,7480-7846.

2°Griffin, B. E.; Jannan, M.; Reese, C. B. Telrahedron 1968, 24, 639-662.

Resultados. Sintesis de los monómeros. Capitqu 4 - 123

elusión y de annado de las columnas cromatográficas, debido a las propiedades ácidas de la

silica.

0° o

NH

I NH NH

Acc l lN 0 I A II

__> co N ° Ho N o-—>° o

A00 OH 9AGO OTHP OH OTHP

11O

NH

° IDMTrO

N

I NH oDMTI'O Iv o—> N 0 )

CN 0 OTHP

0 — 9OH OTHP

12

Esquema 4.III.Preparación de la fosforamidita dela 2'-C-metilun'dinapara la sintesis en fase sólida de oligonucleótidos.

i: DHP. p-TsOH. dioxano; ii: NH3, MeOH; iii: a- DMTrCl. DMAP, TEA, Py; b- H20;iv: a- iPr2NEt, CH2CI2, iPr2NP(CI)OCHZCH2CN; b- MeOH.

El revelado de estos derivados dimetoxitritilados se realizó con ácido sulfúrico en

etanol, ya que el catión dimetoxitritilo revela naranja en estas condiciones. El producto es

visible, por Io tanto, al UV y con el ácido, mientras que el material de panida solamente se

observa al UVy el exceso de dimetoxitritilo,sólo con el ácido.

El último paso en la secuencia sintética consistió en la preparación del derivado de

fósforo ||I en el OH-3’. La reacción es muy rápida y se purificó el monómero para la síntesis en

fase sólida de oligonucleótidos de la 2'-C-meti|uridina (13) por columna con 72 % de

2‘ Griffin, B. E.; Jarman, M.; Reese, C. B. Tetrahedron 1968. 24, 639-662.


rendimiento. La principal impureza era el fosfonato del reactivo que no revela ni al UV, ni con

ácido ni con yodo, pero que posee un olor muy característico. La estructura y pureza de 13

fueron confirmadas por RMN de 1H, 13Cy 31P.

El rendimiento total desde la uridina fue del 9%, para 12 pasos de síntesis, siendo la

reacción de Wittig y Ia tosilación los cuellos de botella en cuanto al rendimiento de toda Ia

secuencia.

4.4- Avances en la preparación de otros 2’-Cmetilnucleósidos.

Se comenzó la preparación de los 2'-C-metilnuc|eósidos de Ia citidina y de Ia

adenosina. Para Ia citidina existían dos posibilidades, o bien repetir la ruta sintética probada

para Ia uridina, previa protección del amino exociclico de Ia base, como Ia correspondiente

benzamida, o bien obtener ambas, uridina y citidina, a partir de algún derivado S-Ofenilo de la

uridina. Para esto último se sintetizaron a partir de 2 los compuestos correspondientes o

nitrofenil (15) y 2,641iclorofeniluridina (16),22 mediante protección transiente del OH-2' con TMS

(compuesto 14), con 45 y 41 % de rendimiento, respectivamente (esquema 4.IV).

Se decidió, sin embargo, continuar con la secuencia ya probada para Ia uridina, debido

a que estos últimos rendimientos no resultaron ser muy satisfactorios y a que Ia N-bezoílación

de la citidina se logró llevar a cabo casi cuantitativamente, obteniéndose el producto puro sin

necesidad de purificaciones adicionales.

En el caso de las purinas, Ia adenosina y, eventualmente, la inosina pueden obtenerse

a partir del 6-O-fenilpurin-ribósido, el cual usualmente se sintetiza a partir del 6-cloropun'n

ribósido. Para obtener el derivado de Ia guanosina, el producto de partida correspondiente sería

el 2-amino-6-cloropurin-ribósido.Como estos compuestos son muy caros, se consideró como

otra vía posible, la síntesis directa de los derivados fenólicos de la purina a partir de Ia inosina.

22Sproat, B. B.; Beijer, B.; Iribarren, A. M. Nucl. Acids Res. 1990, 18, 41-49,

Resultados. Sintesis de los monómeros. Capitqu 4 - 125

Ïl/ —>°\Sl——o on °\sl—o cms o\si—o omsY» 2 Y; u Y»

I¡lo _> Iloe É: wis'__° om: Si-O OH

Y R2-nitroferiio_ n 1aR-2mmMmmm 1aRZS-Gdorofem'lo

o ;/ \« nü (iÉ: N o ¿í N oYF, 0.. YF 0..

Esquema 4.!V.Ruta altemaüva para Ia preparación de las pirimidinasmodificadas.i:TMSCl, TEA, CHZCIZ; ii: MsCI, DMAP. CHZCIZ; iii: 2,6-diclorofenol o 2-nitrofenol,

TEA, DABCO, iv: p-TsOH. dioxano, CH2CI2; v: o-nitrobenzaldoxima. metilguanidina; vi: NH3(g).

Intentos preliminares repitiendo los pasos llevados a cabo para Ia un'dina no produjeron

prácticamente nada del producto final, con ambos fenoles arrojando 3 - 5 % de rendimiento

desde inosina.

Resultados. Sintesis de los mcnómercs. Capítulo 4 - 126

Entonces, se decidió comenzar por la adenosina siguiendo Ia misma ruta de Ia uridina,

previa N-benzoilación para proteger el grupo amino exociclíco de la base (ver esquema 4.V).

Se realizó la protección con el puente disiloxano de Ia adenosina benzoilada, dando el

compuesto 18 (75 % desde adenosina). La oxidación con el trióxidode cromo sobre 18 para dar

la 3',5'-O-(tetraisopropi|disiloxan-1,3-diiI)-6-N-benzoiI-2'-oxoadenosina (19) arrojó un 40 % de

rendimiento de una mezcla del hidrato y el cetósido en el producto de reacción, siendo la

purificación más compleja que en el caso de la uridina, probablemente debido al

complejamiento del cromo con el grupo amino de la adenosina, incluso estando éste protegido.4

Para mejorar este paso de reacción se probaron la oxidación de Swem y Ia reacción con DMSO

/ AC2O,con la intención de evitar la compleja purificación del producto carbonílico, pero los

rendimientos finalmente obtenidos no fueron mejores. La reacción de Wittig sobre el producto

de reacción de Ia reacción con trióxido de cromo permitió obtener el den'vado olefínico 20 con

un 40 % de rendimiento.

NH2 NHBz NHBzN \ N \

N \N </fN / frv/ I _ \/ < |

HO < I N/J Ho N) S./O N)o i o ¡i W“ ¡' oi l O

Ho OH HO OH \I/\SÍ—O OH17 )\ 1aNHBz NHBz

N \ N«f <1“4 o a 4 o 2S¡/ N . ./ N

III Y | o IV S‘I o—> o\ o —> O\W n v: za

Esquema 4. V. Avances en la obtención de Ia 2'-C-meti|adenosina .i: a- TMSCI, Py; b- BzCl; c- NH3 ii: a-TIPSDCI2, Py; b- MeOH; iii:a- Cr03. Py. A020, CH2CI2; b- AcOEt; iv: a

Ph3P=CH2, THF; b- Et20. NH4CI.

Resultados. Sintesis de los monómeros, Capítulo 4 - 127

El rendimiento de reacciones sobre las pun'nas suele ser menor que sobre las

pin'midinas, pues Ia unión glicosídica de las pun'nas es más Iábil. Dado que este efecto se ve

acentuado estando Ia base protegida, se probó proteger Ia base después de la reacción de

Wittig. En el paso posterior; es decir, la reacción con tetróxido de osmio; Ia base debe ser

inevitablemente protegida, ya que el amino exocíclico puede reaccionar también con este

reactivo. Sin embargo, la purificación después de Ia oxidación resultó todavía más compleja

debido al grupo amino libre de la base, no pudiéndose eliminar los subproductos de cromo,

incluso después de dos columnas cromatográficas y, a su vez, la reacción con DMSO / A020

tampoco introdujo mejoras.

En el caso de Ia guanosina, no se detectó el producto metilénico después de Ia reacción

de Wittigsobre la guanosina protegida con el isobutirilo.

Para Ia obtención de las purinas modificadas, se consideró también como alternativa

una estrategia bioorgánica, con el uso de enzimas especlficas o células enteras.23 Se intentó

producir la transglicosidación mediante el uso de enzimas purificadas. Esta reacción consiste en

partir de un nucleósido pin'midínico y, mediante la acción conjunta de pirimidin- y pun'n

fosfon'lasas en presencia de una base purínica, obtener el correspondiente purin-nucleósido.

Estas enzimas, comercialmente disponibles, han sido probadas sobre nucleótidos modificados;

sin embargo, hasta el momento no fueron exitosas en Ia reacción de Ia 2’-Gmeti|un‘dina con Ia

adenina, con Ia hipoxantina o con Ia guanina para la obtención de los correspondientes 2'—G

metilnucleósidos. Tampoco fue efectiva Ia transglicosidación de Ia 2'-C-metenuridina, obtenida

por tratamiento del compuesto 4 con TBAF. Sería interesante obtener el den'vado metilénico de

la guanosina, dado que este derivado no se pudo obtener a través de Ia reacción de Wittig

sobre el 2'-oxo análogo. Resta probar la reacción de transglicosidación con células enteras,

para lo cual se dispone de diversas cepas y se espera que alguna de ellas resulte activa."

23Gilsen, M. J.; Qiao L. Chem. Rev. 1996, 96, 443-467.

Resultados. Sintesis de los monómeros. Capitulo 4 - 128

4.5- Conclusión.

La síntesis estereoselectiva de la 2'-C-metiluridina fue llevada a cabo. La preparación

de la fosforamidita correspondiente para la síntesis en fase sólida de oligonucleótidos,

incluyendo la protección regioselectiva del hydroxilo-2’, fue también realizada. Asimismo, se

presentan los adelantos en la sintesis de otros 2'-C-meti|nucleósidos, fundamentalmente, del

derivado de la adenosina.

2‘ El trabajo relacionado oon las biotransfonnaciones se realiza en colaboración con la Dra. Elisabeth Leukowicz.

Resultados, Estudio conformacional. Capítulo 5 - 129

Capítulo 5

Estudio conformacional

5.1- Objetivos.

Sobre Ia base de mediciones de RMN,de NOE y de constantes de acoplamiento homo

y heteronucleares, se establecieron la configuración del C2' y Ia conformación preferida por la

2’-C-metiluridina (compuesto 8). Se realizó una comparación de los parámetros

confonnacionales obtenidos experimentalmente por RMNcon aquellos surgidos de cálculos de

quimica computacional usando métodos semiempín'cos y ab inr'tioy con una estructura del

nucleósido obtenida cn’stalografiade rayos X, realizada previamente por otro grupo.

5.2- Análisis conformacional por RMN.

5.2.1-Constantes de acoplamiento.

Tradicionalmente, el análisis conformacional del azúcar de nucleósidos en solución por

espectroscopía de RMN es llevado a cabo midiendo 3JHH.La metodología fue desarrollada por

Altona1 combinando el concepto de pseudorrotación2 para una conveniente descripción del

1Haasnooot, C. A. G.; de Leeuw, F. A. A. M.. Altona C. Org. Magn. Reson. 1981, 15, 43-52.2Altona, C.; Sundaralingam. M. J. Am. Chem. Soc. 1972, 94, 8205-8212.

Resultados. Estudi-oconformacional. Capitqu 5- 130

azúcar, con la conocida ecuación de Karplus.3Esta ecuación permite traducir las constantes de

acoplamiento Spin-spin a tres enlaces, al ángulo diedro formado por los átomos involucrados1 y,

mediante un modelo de dos estados, se analiza la conformación preferencial del anillo de la

furanosa. Se asume, por lo tanto, que el azúcar en solución adopta solamente dos modos de

plegamiento bien definidos en mutuo y rápido equilibrio (norte, P N 0°; sur, P -v 180°).4 Este

modelo es apoyado experimentalmente por determinaciones estructurales basadas en

difracción de rayos X, que muestran que ribonucleósidos en estado cristalino prefieren una de

estas dos conformaciones,5 y por cálculos de energía potencial, los cuales muestran que estos

dos dominios son los más estables del ciclo pseudorrotacional.6

Existen numerosos estudios sobre la conformación de nucleósidos naturales y

modificados. Estos estudios probaron que la geometría de los dos confónneros en solución está

poco influenciada por los sustituyentes en 2' y 3', pero lo que sí puede ser fuertemente

modificado por Ia orientación y naturaleza de los sustituyentes es el equilibrio entre los dos

confónneros predominantes.

Se sabe, además, que la configuración de los carbonos del azúcar, determinada por

mediciones de RMN, está altamente correlacionada con la conformación y ambos aspectos

deben ser resueltos simultáneamente.7 En el caso de la 2'-C-meti|un'dina es de interés no

solamente la determinación de la conformación del azúcar, sino también, Ia determinación de Ia

configuración absoluta del 02’. Si bien la configuración de este carbono habia sido

tentativamente asignada como R, en base a que el ataque del 0504 es más probable que

ocurra por el lado menos impedido estéricamente, era necesario confirmar esta suposición.

La carencia de un hidrógeno unido a este carbono reduce las constantes de

acoplamiento 1H-1Hdisponibles para analizar Ia conformación a sólo una (JH3'_H4');por Io tanto,

se decidió medir también las constantes de acoplamiento 3J (1H-13C).El uso de las constantes

de acoplamiento heteronucleares y de J (13C-13C)para la determinación de Ia conformación de

3 Karplus J. Chem. Phys. 1959. 30, 11-15.4 Para las definiciones de los parámetros cantonnacionales consultar el apéndice I de esta tesis.5 De Leeuw. H. P. M.; Haasnoot, C. A. G.; Altona. C. Isr. J. Chem1980, 20, 108-126.5 Olson, W. K. J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 278-286.

Resultados. Estudio conformacional, Capitulo 5 - 131

azúcares en solución fue propuesto con anterioridad, debido, sobre todo, a la bien conocida

flexibilidad conforrnacional de la furanosa. Los JHHsuministrarían una mínima infonnación para

evaluar el amplio rango de opciones conformacionales disponibles de estas moléculas y el uso

de un mayor número de constantes se supone que podría asistir al análisis confonnacional de

furanosas y furanósidos al proveer más parámetros para contrastar modelos confonnacionalesB.

Con este propósito, se usó una secuencia de pulsos recientemente desarrollada,9 la cual

muestra alta sensibilidad y es adecuada especialmente para mediciones en abundancia natural.

Se midieron todas las constantes que eran sensibles a ambas, a la conformación de la

molécula y a la configuración del C2'. Éstas involucran la constante de acoplamiento entre H3' y

H4' y un número de constantes de acoplamiento heteronucleares 1H-‘ïlC.

La tabla 5.| muestra las constantes de acoplamiento a tres enlaces (en Hz)

determinadas para la 2'-C-meti|un'dina en D20, y para la un'dina según Kline y Serianni.1°

Primeramente, los valores relativamente altos obtenidos para JH3',H4'= 9.5 Hz, y para

JH1',C3'= 3.8 Hz, así como también el pequeño valor obtenido para JH4',C2'< 0.5 Hz, para JH4',C2'<

0.5 Hz son claras indicaciones que 8 adopta en solución principalmente la conformación C3’

endoo norte (ver figura 5.1). El valor de JH3',H4'es consistente con un ángulo diedro de - 180° y

el de JH1’,CS',con uno de -140° y los valores pequeños de JH4',C2'y de JH4',C1'están de acuerdo

con los ángulos de - 90°-100°,“n12adoptados en Ia conformación norte. Para nucleósidos en

conformación sur, el ángqu diedro entre H3’ y H4’ es menor, con lo cual se espera un valor

menor para esa JHH,mientras que para H4' y C2’, y para H4’ y C1', los ángulos adoptados son

mayores (>140°) que en Ia conformación norte con lo cual los valores esperados de JH4',C2'y de

JH4-,c1-serían aproximadamente 2.5 y 5.0 Hz, respectivamente.11

7 Neuhaus, D.; Williamson, M. en The Structural Overhauser Effect in Structural and Confonnafional Analysis; VCHPublishers Inc. 1989; p. 354-355.5 Serianni, A. S.; Baker, R. J. Org. Chem. 1984, 49. 3292-3300.9 Cicero, D.O.; Barbato, G.; Bazzo, R. J. Magn. Reson. 2001, 148, 209-213.1°Kline, P. C.; Serianni, A. S. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 7373-7381.

Resultados. Estudio conformacional. Capitulo 5 - 132

H fN2»HOH2C Ho

CH3 H

OH

Figura 1. Conformación norte del azúcar de un 2'-C-metilnucleótido.

C1’ 02' 03’ C4' CH; H4’(L=92.0 ppm) (L=79.4 ppm) (L=72.7 ppm) (L=82.1 ppm) (L=82.1 ppm) (L=3.97 ppm)

H1' 3.8 1.0 <0.5

(L=5.95 ppm)

H3’ 0.5 9.5

(L=3.84 ppm) 5_5

H4' <0.5 <0.5

(L=3-97ppm) 0.7 1.3

Tabla 5.I. Constantes de acoplamiento 3JHHy 3Jucmedidas para la 2'-Gmeliluridina(en negro) y valores informados por Kline y Serianni para la uridinaa (en rojo).

En segundo lugar, el pequeño valor de 0.5 Hz obtenido para JHJ',CH3,(con un ángulo

diedro correspondiente cercano a 90°)12es únicamente compatible con una orientación cis del

grupo CH; respecto al H3'. desde que un valor comparativamente alto (-«4 Hz) sería esperable

en el caso que estos grupos se encuentren en posición trans-diaxial. De este modo. puede

establecerse como R la configuracióndel 02'.

” Schwarcz. A. J.; Perlin, A. S. Can. J. Chem. 1972. 50, 3667-3676.

Resultados. Estudio conformacional. Capitulo 5- 133

La población relativa de confónneros norte y sur en nucleósidos naturales suele ser

estimada a partir de ia ecuación derivada por Davies y Danyiuk:13

K :Xs "flN

°" X” J3._4.

En nuestro caso, no se dispone de JH1'_H2',con lo cual esta ecuación es, en principio,

inaplicable. Sin embargo. es posible tener una idea muy aproximada de las poblaciones de

ambos confónneros en solución usando Ia ecuación de Davies de una forma poco rigurosa,

pero que permite hacer una estimación grosera de la constante de equilibrioconfonnacional. A

partir de JH1',CHa,es permisible evaluar el valor del ángulo diedro involucrado. Con ese ángulo, y

el uso de Ia ecuación de Karplus, que permite estipular el valor que tomaría Ia 3J en el caso de

haber un H en vez de un metilo en esa posición es entonces factible aplicar Ia ecuación de

Davies. Así, JH1'.CHatiene un valor menor a 0.5 Hz, Io cual está en consonancia con un ángulo de

torsión de N 90 - 120°11 (el error en el ángqu de torsión es grande debido a que la curva que

relaciona la constante 3qu con el ángulo diedro involucrado pasa para valores de 3JCH<0.5 Hz,

por un mínimo bastante "aplastado" con el consiguiente error en Ia interpolación del ángulo).

Estos valores se corresponden con 3JHHde valores de N 1.0 - 3.0 Hz,1 y el valor de la constante

de equilibrioestaría en el rango de 0.10-0.30, indicando una mayor abundancia del confónnero

norte respecto del sur. En comparación, para Ia uridina Jm'm- vale 4.5 Hz y JH3',H4'5.5 Hz, de

donde Xs/XNz 0.72. Este resultado indica que. si bien en ambos nucleósidos predomina el

confónnero norte, en Ia 2'-C—meti|uridinaIa proporción de este confónnero es todavia mayor.

Esto se debe a que el metilo en 2' tiende a orientarse ecuatorialmente y este factor adicional

implica que Ia posición del equilibrio confonnacional se vea desplazada aún más hacia la

conformación norte (ver más adelante). Los resultados obtenidos están de acuerdo con la

tendencia esperable teniendo en cuenta interacciones de orden estérico. La ecuación de Davies

fue derivada para nucleósidos naturales en los cuales se asume que JH3',H4' z 9.3 XN.

Considerando que XNtiene un valor cercano a uno, estos datos concuerdan, dentro de los

12Schwarcz, A. J.; Perlin, A. S. Can. J. of. Chem. 1972, 50, 3667-3676.

13Davies, D. V.; Danyluk. S. S. Biochemístry 1974, 13, 4417-4434.


errores experimentales y de aproximación, con el valor de JH3',H4'observado. El valor atípico de

esta constante de acoplamiento puede deberse a que el metilo induce un plegamiento del

azúcar tal que Tmresulta más grande que en nucleósidos naturales, o bien que el valor de PN

para este nucleósido es mayor que el valor que adoptan usualmente los n'bonucleósidos, o a

ambos factores combinados.

La mayor población del confónnero norte y mayor rigidez confonnacional para Ia 2'-C

metiluridina van en línea con eI valor menor de JH3'_H4'= 5.5 Hz y los valores mayores de JH4',C2'=

1.3 Hz y JH4'_C2'= 0.7 Hz, determinados para Ia un'dina. Estos valores sugieren una mayor

proporción relativa de confónneros sur y, por lo tanto, una mayor libertad confonnacional del

nucleósido natural, que debido a la ausencia del metilo, demuestra una mayor flexibilidad del

anillo furanósico.14

De acuerdo a lo anteriormente dicho, podemos concluir que la conformación preferida

adoptada por Ia 2'-C-metilun'dina es Ia norte, y a partir de esta afirmación, usando los valores de

JH3',H4',y de las constantes heteronucleares ch'm' y Jc1',H4'es posible determinar un valor de

Ppromedioz 30°, y de Tmpromedio:40° (conformación del azúcar 3T4).Si bien los valores obtenidos

son un promedio confonnacional, dada Ia rigidez de este nucleósido, según los resultados

obtenidos más arriba, que indican que XN es cercana a la unidad; los valores de P y ‘Cm

promedio obtenidos no deberían diferir mucho de PNy de TmN,respectivamente. En un estudio

por RMN previo llevado a cabo sobre Ia (2’S)-2'-desoxi-2'-C-metiluridina se había demostrado

que Ia fracción molar del confónnero norte para este nucleósido era de 0.90 a 1, según el

solvente.15Los resultados aquí obtenidos para la (2’R)-2'-C-metiluridinaconcuerdan en que para

esta molécula el equilibrio confonnacional debería estar aún más desplazado hacia la

conformación norte que en el caso del derivado desoxi, dada la presencia adicional del OH-2',

como se discute más adelante.

5.2.2- NOE.

1‘ Iimori, T.; Mural, Y.; Ohuchi, 8.; Kodama, Y.; Ohtsuka, Y.; Oishi, T. Tetrahedron Left. 1989, 32, 7273-7276.

‘5 Cicero, D. 0.; Iribarren, A. M.; Bazzo, R. Appl. Magn. Reson. 1994, 7, 95-105.

Resultados. Estudio conformacional, Capitulo 5 - 135

Adicionalmente, la distancia entre determinados átomos puede ser estimada a partir de

experimentos de NOE, los cuales aprovechan la doble resonancia entre átomos cercanos en el

espacio. Experimentos ZD NOESY sobre el nucleósido 8, corroboran los resultados

confonnacionales obtenidos a partir de las constantes de acoplamiento. En la tabla 5.|l se

muestran las distancias estimadas entre los átomos mencionados y el H6 de la base, tal cual

surgen de los datos de NOE obtenidos.

H5 H1' H5" H3' H5'

Distancia en A 2.42 3.21 3.25 2.20 3.08

respecto a H6

Tabla 5.ll. Distancias al H6 (en Á), de acuerdo a mediciones de NOE.

EI fuerte NOE observado entre H6 y H3' indica ambas cosas, una conformación del

azúcar C3'-endo y una orientación anti para la base. La orientación de la base se ve

corroborada por el NOE observado entre H6 y H5'. Estos resultados están de acuerdo con la

observación usual que los nucleósidos pirimidinicos prefieren una orientación anti de Ia base.16

En el caso de Ia 2'-C-meti|uridina, al encontrarse el metilo orientado hacia arriba y, por

consiguiente, tener una relación cis con la base, se generaría una fuerte interacción con el C2

en el caso de adoptar la base una orientación sin, Io que aumentaría su energia. Por este

motivo, la tendencia de la 2'-C-metiluridinaa adoptar la orientación anti se encuentra acentuada

respecto de los nucleósidos naturales.

Por otra parte, se observó un efecto NOE más fuerte entre el CHa y el H3', que entre

aquél y el H1', una clara indicación de una relación cis entre el grupo 2’-C-metilo y el H3'. Este

15Saenger, W. en Principles of Nucleic Acid Structure, New York: Springer 1988, 69-73.


resultado corrobora la configuración asignada teniendo en cuenta las consideraciones químicas

de reactividad de la molécula y a partir dela constante de acoplamiento Jna'ma.

5.2.3- Discusión.

Los resultados aqui obtenidos pueden ser razonados en términos de factores

estereoelectrónicos y estéricos que contribuyen a la estabilidad de los distintos confórmeros del

azúcar

a- el efecto anomérico, de acuerdo al cual glicósidos sustituidos en el Ct' con un

grupo atractor de electrones son usualmente más estables cuando el sustituyente se encuentra

en orientación axial en vez de ecuatorial. Debido a una interacción entre un par libre de

electrones en un orbital p del átomo electronegativo, con el orbital o’ del enlace C-X que

permite una deslocalización de los electrones cuando el sustituyente se encuentra con

orientación axial.17

b- el efecto gauche, que dirige los ángulos de torsión de grupos X-C-C-Y, con X, Y =

átomo electronegativo, a adoptar confomiaciones gauche (iso) y tiende a evitar la conformación

ap. Esto es también debido a interacciones estabilizantes entre el par de electrones y el enlace

polar, que se ven favorecidas en la orientación gauche. En la ribosa, los enlaces afectados por

este efecto son: O4'-C1'-C2’-02', O4'-C4'-03’-03' y N'-C1'-C2’-02’.

c- preferida orientación cuasi ecuatorial de las cadenas laterales, debido a que este

ordenamiento minimiza repulsiones estéricas desfavorables del tipo 1,3-diaxiales.

d- Orientación altemada de los sustituyentes

e- Preferencia por ángulos tetraédricos de los carbonos del anillo

En nucleósidos y nucleótidos, el resultado de estas interacciones combinadas restringe

la geometria de los posibles confórmeros a norte y sur, y la posición del equilibrio está

determinada mayormente por la relativa des/estabilización alcanzada por estos dos

17Carey, C.A.; Sundberg. R.J. en Advanced Organic Chemistry. Part A. Structure and Mechanísms, Plenum Press1990, p. 147-149.

Resultados. Estudio conformacional. Capítulo 5 - 137

confónneros. El efecto anómerico es débil en los N-glicósidos y son los factores b y c los que

determinan que la orientación de sustituyentes en los C2' y C3’siga dos principios generales:

sustituyentes no atractores de electrones en C2’ y en C3’ prefieren

ubicarse posición pseudo-ecuatorial

sustituyentes atractores de electrones en esas posiciones prefieren

ubicarse en posición pseudo-axial debido a interacciones gauche estabilizantes con el 04'

endocíclico.

Son estos dos factores los que tienen un efecto más pronunciado sobre la conformación

de los anillos furanósicos, sobre todo, si trabajan en Ia misma dirección, como es el caso de los

2’-C-metilnucleósidos.

El compuesto 8 en la conformación norte exhibe el ordenamiento espacial más

favorable para todos los sustituyentes del anillodel azúcar,

- el voluminoso grupo CH3está posicionado pseudo-ecuatorialmente

- el grupo OH-2' muestra un efecto gauche positivo con el 04’

- la cadena lateral del C5’es pseudo-ecuatorial

- Ia base se encuentra con orientación pseudo-axial, satisfaciendo el débil efecto

anomén'co,

excepto para el 0H-3' que se encuentra ecuatorial, por lo cual no presenta efecto

gauche estabilizante con el 04’, sino que uno repulsivo con el metilo.

Mientras que en Ia conformación sur el metilo y el C5' se encontrarían en posición 1,3

diaxial, Ia base con orientación pseudo-ecuatorial, y habría un efecto gauche repulsivo entre el

metilo y el C4' y entre el metilo y el 04', constituyendo la única interacción estabilizante el efecto

gauche entre el OH-3' axial con el 04'. La conformación C3'-endo, o conformación tipo ARN,

adoptada por el 2’-C-metilnucleósido confirma que el posicionamiento del grupo metilo-2' en una

orientación pseudo-ecuatorial es la principal fuerza impulsora para definir la conformación

preferida de este tipo de nucleósidos,13 así como fue también demostrado para los 2'-C-alquiI-2'

desoxi análogos,14 habiendo en el caso aqui estudiado una razón más para favorecer la

conformación norte que es el efecto gauche positivo entre el OH-2' y el 04'.


La estimación de la conformación a partir de estudios de RMN, está afectada por las

siguientes inevitables fuentes de error:

el error experimental asociado con las mediciones de los J,

Ia calibración de la ecuación de Karplus,

Ia relación entre un dado ángulo de torsión y los parámetros

confonnacionales, que no está establecida exactamente,

la posible presencia de un significativopromedio confonnacional.

A pesar de esto, el análisis confonnacional puede ser llevado a cabo y puede producir

resultados significativos porque todos los parámetros medibies son usados en conjunto para

ajustar unas pocas variables confonnacionales. En nuestro caso, los resultados obtenidos

coinciden ampliamente con los resultados esperados teóricamente.

5.3-Comparación con estudio computacional y estrucutra derayos X.

5.3.1-Métodos semiempíricos.

Antes de realizar la preparación del monómero de Ia 2'-C-metiluridina para la síntesis en

fase sólida de oligonucleótidos se realizó el estudio computacional que se describe en el

capítulo tres de esta tesis. Para ello se realizó una minimización energética por mecánica

molecular para obtener Ia geometría molecular de los nucleótidos que posteriormente se

introdujeron en la ribozima cabeza de martillo. De acuerdo a estos resultados, la conformación

de los 2'-C-meti|nuc|eotidos es C3'-endo. Se consideró interesante comparar resultados

obtenidos a partir de los datos de constantes de RMN y de NOE para la 2'-C-meti|uridina, con

resultados obtenidos mediante cálculos computacionales más rigurosos (usando metodologías

semiempríricas y ab initio)y con resultados previos obtenidos de Ia estructura cristalina de la 2'

C-metiluridina.13

13Beigelman. L. N.; Ennolinsky, B. S.; Gurskaya, G. V.; Tsapkina, E. N.; Karpeisky, M. Y.; Mikhailov. S. N.Carbohydrate Res. 1987. 166, 219-232.


Considerando factores estéricos, la orientación de Ia base en la 2'-C-metilun'dinadebe

ser anti. Esta predicción se vio confirmada por las mediciones de NOE de la molécula en

solución y por la estructura de rayos X del nucleósido publicada por Beigelman y

colaboradores.17 Teniendo en cuenta estos, datos se realizó la minimización de la energía

confonnacional de la 2’-C-metiluridina usando los métodos semiempíricos AM1 y PM3 con esa

orientación de Ia base. Con ambos métodos se probaron distintas orientaciones para el enlace

C4’-C5’,ya que este factor no había sido analizado por RMN. Los resultados se muestran en las

tablas 5.III y 5IV.

AM1 +sc AM1 -sc PM3 +sc PM3 -sc PM3 ap RMN Rayos X

P 10.29 -23.10 -2.20 11.86 -26.37 30 24

rm 23.27 16.71 17.32 21.447 15.14 40 33.4

Conformación 3T2 2T1 gT 3T2 2T1 3T4 3T4delazúcar

X -114.495 -113.87 -111.87 -121.54 -117.35 anti - 145.5

y 72.34 -84.176 78.99 -76.08 478.859 n.d. 60.8

Tabla 5.lll. Parámetros conformacionales de la 2'-C-metiluridinaobtenidos usando métodos computacionalessemiempíricos AM1y PM3 para diferentes orientaciones del enlace C4'-05.'

(Para AM1no fue posible encontrar un minimo para y con orientación ap.)Con fines comparativos se muestran los datos extrapolados de las mediciones de RMNen azul y de rayos Xen

roio.

La conformación del azúcar obtenida en todos los casos es la conformación norte,

confirmando los datos experimentales. Los valores de P varían entre 12° y - 26°,

aproximadamente, y son menores que el valor promedio estimado a partir de RMN, P z 30°,


que se encuentra más cercano al de rayos X (en el trabajo de Beigelman P vale 24°, siendo 3T4

el plegamiento del azúcar). El valor más alto obtenido por RMN puede ser reflejo del promedio

confonnacional de PNy Ps. Aunque XN= 1, de acuerdo a Io discutido más arriba, el alto valor de

Ps ( N 180 °), bien podría resultar en un valor de Ppromedio,según las constantes de

acoplamiento, un poco mayor que el PNreal en solución. Es también probable que los métodos

semiempíricos usados no den resultados cuantitativos confiables con este nucleósido en

particular.

Distancia enal H6

H5 2.542 2.544 2.541 2.492 2.495 2.42

H5' 3.655 2.058 3.513 1.750 1.727 3.08

H5" 4.023 3.184 4.009 3.080 3.339 3.25

H3' 2.339 2.565 2.536 2.436 2.671 3.21

H1’ 3.713 3.718 3.733 3.744 3.741 2.20

Tabla 5.IV. Distancias al H6 (en Á) para las oonfonnaciones de la 2'-Gmetiiuridinaobtenidas usando métodos computacionales semiempíricos.

Con respecto a las distancias, se puede observar que, en general, las distancias

obtenidas a partir de datos semiempíricos son mayores que las determinadas por NOE para

todas las orientaciones del enlace C4'-C5'. Teniendo en cuenta Ia orientación respecto a este

enlace, se observa que, para los rotámeros —scy ap, hay una diferencia notable entre las

distancias al H6 de H5' y H5". En cambio para el rotámero +sc, ambos hidrógenos cinco se

Resultados. Estudio conformacíonal. Capítulo 5 - 141

encuentran a distancias semejantes del H6. En las mediciones de NOE se observa que las

distancias de estos hidrógenos al H6 son parecidas y concuerdan mejor con las distancias

obtenidas por los métodos semiempíricos para el rotámero +sc. Por Io tanto, es razonable

concluir que el valor de y se encuentra dentro del rango +sc para la 2‘-C-metiluridina en

solución.

Una vez más, si bien los valores obtenidos a partir de datos de RMNson el resultado de

un promedio entre todos los confónneros que están en equilibrio en solución, estudios previos

realizados teniendo en cuenta las constantes de acoplamiento de los hidrógenos exocíclicos de

nucleósidos y nucleótidos habían mostrado que el grupo exocíclico se convierte rápidamente en

la escala tiempo de RMNentre los tres confónneros +sc, -sc y ap, y que el rotámero +sc es

preferido respecto de los otros dos, sobre todo en pirimidinas.12Esta orientación fue observada

para Ia 2'-C-metilun'dina en Ia estructura cristalina de Beigelman (y = 60.8°).

A partir de cálculos con ambos métodos semiempíricos, concluimos, entonces, que Ia

conformación preferida del azúcar será norte y +sc el valor de y, resultados consistentes con los

obtenidos por RMNy con consideraciones teóricas.

5.3.2-Método ab ínitio.

Con el fin de tener datos más confiables para realizar comparaciones cuantitativas, se

realizó la minimización de Ia energía de la 2'-C—metilun’dinacon un método ab ¡nitio usando el

programa Gaussian y las bases 6-31 G y 6-311 G. Para Ia estructura de partida se tuvo en

cuenta el plegamiento, Ia orientación de Ia base y el ángulo diedro C4'-C5' obtenidos por

métodos semiempíricos. Las confonnaciones obtenidas con cada una de las bases son casi

idénticas (ver tabla 5.V). Se muestra en Ia figura 5.2 Ia conformación del nucleósido obtenida

con la base 6-311 G.

Resultados. Estudio conformacional Capitulo 5 - 142

Figura 5.2. Conformación obtenida para Ia 2’-Ometi|urídlna a través de Ia minimizaciónde la energía por un método ab ¡nit/o(programa Gaussian y base 6-31t G).

a- Resultados conformacionales: plegamiento del azúcar, orientación de Ia base y del

enlace C4’-CS’.La conformación del azúcar, de acuerdo a los datos obtenidos usando ambas

bases, son muy parecidos y concuerdan mejor con los datos extrapolados a partir de las

constantes de acoplamiento por RMNy por cristalografía de rayos X, que cuando se usaron

métodos semiempr’ricos. La concordancia es mejor con los datos derivados de la estructura de

rayos X que con los datos de RMN, Esto último no es sorprendente porque los datos de RMN

corresponden a un promedio de las conformaciones que existen en equilibrio en solución,

mientras que generalmente por rayos X y por métodos computacionales se obtiene solamente Ia

conformación más estable. El plegamiento del azúcar obtenido, sin embargo, en todos los casos

fue 3T4. Los valores de x y de y usando un método ab ¡nit/o también se acercan más al

resultado de rayos X que los obtenidos usando métodos semiempr’ricos. Estos resultados

comprueban Ia mejor eficiencia del empleo de métodos ab ¡nit/o para obtener resultados

cuantitativos; no obstante, los resultados globales (conformación norte del azúcar, orientación

anti de la base y orientación +sc del enlace C4’-C5’)fueron los mismos usando todas las

metodologías computacionales y concuerdan con los resultados obtenidos a partir de


cristalografía de rayos X y de las constantes de acoplamiento homonucleares H-H y

heteronucleares C-H.

Ángulo Método ab initio Método ab initio RMN Rayos X(Gaussian, base (Gaussian, base

6-31 G) 6-311 G)

P 19.14 18.21 30 24

rm 32.97 33.04 40 33.4

Conformación del 3T4 3T4 3T4 3T4azúcar

X - 150.139 - 149.928 anti - 145.5

y 52.876 53.094 n.d. 60.8

Tabla 5.V. Parámetros oonfonnacionales obtenidos por cálculosab initio,usando las bases 6-31 G y 6-3116).

Con tines comparativos se muestran los datos extrapolados delas mediciones de RMN en azul y de rayos x en rojo.

b- Comparación de los ángulos obtenidos usando cálculos ab ¡nitiocon los calculados a

través de las constantes de acoplamiento. Se midieron los ángulos vinculados a las constantes

de acoplamiento 1ï’C-1Hy 1H-‘Hobtenidas experimentalmente y se compararon con los ángulos

esperados a partir de los valores de las constantes.11 En Ia tabla 5.VIse pueden ver los ángulos

resultantes de la minimización con la base 6-311 G y con la base 6-31 G y los derivados de las

constantes de acoplamiento. Los resultados obtenidos con las dos bases son muy similares,

variando los ángulos no más de 0,6°. Como era de esperar, a partir del valor pequeño de la

Resultados. Esíudio conformacional Capitulo 5 - 144

constante de acoplamiento, el valor del ángulo diedro entre el H1' y el metilo es de alrededor de

90°. La misma concordancia ocurre con H3' y H4’para los cuales el ángulo obtenido es cercano

a 180°, número que se refleja en el valor grande de la constante de acoplamiento JH-3',H-4'de 9.5

Hz. Un ángulo de alrededor de 140° entre el C3’ y el H1' puede ser predicho del valor de la

constante de acoplamiento y, orientaciones cercanas a la normal pueden adjudicarse a los

ángulos entre el H4’y los C1' y C2'. a partir de las pequeñas constantes de acoplamiento. Esto

es, efectivamente, lo que resulta de Ia minimización computacional. EI ángulo obtenido para el

H1' y el C4’ de 118° es también consistente con el valor de 1 Hz de Ia constante de

acoplamiento. Finalmente, un ángulo un poco más grande entre el metilo y el H3' se esperaría

de la constante de acoplamiento. Sin embargo, esta discordancia no es del todo inesperada

debido a que una gran dispersión de valores de constantes de acoplamiento ha sido observada

para ángulos del rango entre 40° y 60° para diferentes carbohidratos.

c1' C2' c3' c4' CH3 H4'

H1' 438.761 118.657 94.337438.209 118.251 94.814

440 42o «90-120

H3' 42.309 457.57942.162 457.493

‘90 N180

H4' -96.597 84.550-96.444 84.506

ego-100 —90—100

Tabla 5.VI. Se muestran en negro los ángulos en grados resultantes de Ia minimizacióncon la base 6-311 G y enrojo los resultados de Ia minimización 6-31 G y en azul los derivados de las constantes de acoplamiento.


Esta dispersión ha sido atribuida a que el acoplamiento vecinal 13C-1Hes muy sensible

en esa región de ángulos diedros, y a este efecto se suma el efecto producido por Ia orientación

de los sustituyentes oxigenados, siendo el valor de Ia constante de acoplamiento más pequeño

si existe algún oxígeno trans respecto aI C.12 En nuestro caso eI 04’ se encuentra trans

respecto al metilo y esta podría ser la razón por la cual la constante de acoplamiento es menor

a Ioesperado para un ángqu de alrededor de 40°.

Se puede concluir que la correspondencia entre los valores de los ángulos resultantes

de la minimización computacional y los valores deducidos a partir de los valores experimentales

de las constantes de acoplamiento usando Ia ecuación de Karplus es en general muy buena.b

Comparación de las distancias entre átomos de acuerdo a los resultados computacionales con

aquellos derivados de mediciones de NOE. En la tabla '5.Vll, se indican las distancias aI H6

obtenidas con cálculos ab initio,usando ambas bases.

Distancia en A H-5 H-1' H-5" H-3’ H-5'

respecto a H6

Método ab 2.472 3.549 3.981 2.776 3.418initio 2.476 3.550 3.985 2.789 3.414

NOE 2.42 3.21 3.25 2.20 3.08

Tabla 5. VII.Se muestran en negro las distancias al H6 resultantes de Ia minimizacióncon la base 6-311 G, en rojo los resultados dela minimización 6-31 G

y en azul las distancias medidas a partir de experimentos de NOE.

Por un lado, se puede observar que las distancias obtenidas a partir de cálculos

computacionales usando métodos ab initioconcuerdan mejor con las calculadas a partir de las

mediciones de NOE que aquellas obtenidas usando métodos semiempíricos como AM1o PM3

(excepto para Ia distancia entre el H6 y el H3'). Por otro lado, puede observarse que, en también

Resultados. Estudio confonnacional. Capitulo 5 - 146

este caso, los resultados de las distancias emanados de cálculos computacionales concuerdan,

en rasgos generales, bastante bien con los deducidos a partir de mediciones de NOE.

En general, puede entonces concluirse de la comparación de datos computacionales,

que los cálculos ab initioconcuerdan bastante bien con los datos experimentales de RMN y de

rayos X. Estos resultados son más confiables que los dos métodos semiempiricos ensayados

para obtener datos cuantitativos.

5.3.3- Discusión.

Las diferencias entre los cálculos computacionales, los obtenidos experimentalmente a

partir de cálculos de RMN (J y mediciones de NOE) y por cn'stalografía de rayos X, pueden

deberse a razones inherentes a los tres métodos. Los errores correspondientes a conclusiones

confonnacionales extraídas de datos RMNfueron discutidos más arriba. Los datos extraídos de

cálculos computacionales, deben ser contrastados con alguna medición experimental para que

tengan confiabilidad, ya que son realizados en el vacio y no tienen en cuenta ni la dinámica en

solución ni Ia influencia del solvente.

Por otra parte, diferencias entre conclusiones extraídas a partir de la molécula en

solución y en el estado sólido pueden deberse a que Ia estructura cristalina, que representa

solamente Ia conformación más estable, teniendo en cuenta la suma de los componentes

intramoieculares e intennoleculares en el cn'stal, puede ser diferente a ia estructura en solución,

donde los componentes intennoleculares, en este caso interacciones con el solvente, pueden

ser muy distintos a los del estado sólido. Con lo cual, Ia conformación de más baja energia en el

cristal puede no ser idéntica a la conformación de más baja energia en solución. Además, en el

estado cristalino suele observarse una sola conformación o a lo sumo dos, mientras que en

solución existe flexibilidad confonnacional y, por Io tanto, los datos de RMNrepresentan valores

promediados según sea el equilibriodinámico entre las diferentes poblaciones de confórrneros

posibles en solución.

Resultados. Estudio conformacional. Capítqu 5 - 147

5.4-Conclusión general.

Los resultados obtenidos por los distintos métodos concuerdan a grandes rasgos en

que Ia conformación preferida del azúcar es la conformación norte, que la base se encuentra

con orientación anti, y que y está mayoritariamente dentro del rango +sc, como sucede en la

un'dina natural. Sin embargo, la 2'-C-met¡lun'dina, presenta mayor rigidez, debido al metilo que

fija Ia conformación del azúcar en norte y en anti Ia orientación de Ia base, aumentando aún

más Ia población de estos confónneros respecto del ribonucleósido natural.

La expectativa es que este nucleósido provea, cuando es introducido en análogos de

ARN, un grupo OH-2’ disponible capaz de reproducir las interacciones observadas en las

estructuras de ARN natural. Los resultados obtenidos en este capítulo, el análisis por RMNy los

estudios de química computacional, avalan esta hipótesis, ya que indican que Ia conformación

preferida por la 2'-C—meti|un'dinaes similar a Ia de Ia uridina, sugiriendo que ambas estructuras

posicionan el OH-2' en una orientación equivalente, siendo además equivalente la orientación

de Ia base. Ésta es, además, la conformación predicha teóricamente, teniendo en cuenta las

interacciones entre los diferentes sustituyentes del anillodel azúcar.

Resultados. Sintesis de tos oligonucleótidos. Capitulo 6 - 149

Capitqu 6

Síntesis de los oligonucleótidos

6.1- Objetivos.

El objetivo de este capítulo es mostrar cómo se realizaron las síntesis de los

oligodesoxinucleótidos, de los oligorribonucleótidos y de los oligonucleótidos modificados usados

para los experimentos de temperaturas de fusión; su desprotección y purificación y cómo se

prepararon las n'bozimas cabeza de martillonatural y las modificadas con las cuales se probó Ia

aplicabilidad de Ia nueva modificación y el sustrato sobre el cual se ensayó la actividad de las

n'bozimas.

6.2- Síntesis automática de los oligonucleótidos por elmétodo de las fosforamiditas.

La metodología para la sintesis química de ADNy ARN es similar; se utilizó en todos los

casos la técnica de las fosforamiditas. que son los nucleósidos químicamente modificados

usados como monómeros para sintetizar ácidos nucleicos. La síntesis en el sintetizador

automático es en fase sólida y el oligo se sintetiza del extremo 3' al 5'; el ciclo básico de síntesis

para ADNse muestra en la figura 1.5 de ia introducción y en Ia figura 1.12 para ARN.

A ..‘¿ ' 1...“; -I 'i ‘:' A .f‘ fé l C "Resmtacos. Sunshi- de lCSorganucleciidos. capituc '3- 1:0

Se usa un soporte de vidrio de poro controlado (CPG) de 500 A (este tamaño de poro

fue adecuado para los oligonucleótidos sintetizados durante este trabajo), el cual se encuentra

derivatizado con el nucleósido inicial convenientemente protegido para evitar reacciones

laterales. Los grupos aminos exocíclicos de las bases se bloquean con un grupo acilo adecuado

(ver más adelante), el OH-5' con el grupo dimetoxitritilo y, en el caso de ribonucleósidos, el

grupo OH-2' se protege con TBDMS. El OH-3' está unido covalentemente a través de un

espaciador succinilaminopropilo a la fase sólida; este enlace succinato es Iábil a condiciones

básicas y permite la remoción del oligo del soporte, con amoniaco después que la sintesis se

completó dejando el OH-3' libre.

La fase sólida, contenida en una columna con un filtro en cada extremo, se selló y se

conectó a Ia máquina. Las fosforamiditas se disolvieron en ACN anh. hasta una concentración

de 0.1 M, ó 0.12 M en el caso de fosforamiditas de nucleósidos modificados para favorecer la

reacción de acoplamiento. En el sintetizador automático los reactivos y solventes son

bombeados a través de la columna a través de una presión positiva de argón. Cada ciclo

involucra van'os pasos que incluyen la detritilación, el acoplamiento, el enmascaramiento y la

oxidación (en el apéndice ll se muestran los ciclos que usa el sintetizador automático para

síntesis de ADN y ARN en escala 0.2 pmol y en la introducción se detalla cada uno de los

pasos). Pasos de lavado con ACNremueven el exceso de reactivos y los productos secundarios

de las reacciones. Después que la elongación de la cadena se completa, el oligómero debe ser

removido del soporte y completamente desprotegido, este paso puede hacerse en forma

manual o automática.

En el primer paso del ciclo de sintesis el grupo DMTrIábil a ácido se remueve del OH-5’

del monómero unido al soporte, tradicionalmente con una solución de TCA en diclorometano

para dejar un grupo OH-5' reactivo. el cual puede acoplarse con la fosforamidita entrante

durante el siguiente paso de reacción. Este paso se realiza a través de varias administraciones

de TCA y un flujo final de Ar desde el fondo al tope de la columna que empuja el liquido al

puerto de colección de tritilo. Eventuales residuos de TCA se eliminan con un lavado de ACN

para prevenir la eventual detritilación de la próxima fosforamidita y eliminar cualquier otro

Resultados. Sintesis de los oligonucleótidos. Capitulo 6 - 151

nucleófiloque pueda haber quedado en la columna de reacción, seguido de un flujo de Ar para

eliminar restos de solvente.

El siguiente paso es el acoplamiento de la nueva fosforamidita al oligonucleótido

creciente unido al soporte. EI mecanismo de acoplamiento es un ataque nucleofilico del OH-5'

libre al fósforo del monómero entrante, por lo tanto, es muy importante un medio libre de OHs

en la columna. Por eso, se usa ACN anh. como solvente y todos los reactivos se mantienen en

un estado anh. por continua presurización de las botellas con argón. La columna es entonces

secada por un flujo reverso de Ar para remover el ACN residual. Entonces, el tetrazol y la

siguiente fosforamidita son administrados a la columna de reacción. EI tetrazol se usa para

activar la fosforamidita y se mezclan en linea los dos reactivos antes de pasar por la columna.

De acuerdo a Ia escala de sintesis, alternativos agregados de tetrazol y base más tetrazol son

repetidos hasta tres veces.

Como no todos los OH-5' sufren Ia reacción de acoplamiento, se bloquean los OHs-5'

que no reaccionaron acetilándose para prevenir Ia posterior elongación de la cadena que no

reaccionó que permanece unida al soporte (enmascaramiento). Este paso se realiza al

suministrar igual volumen de las soluciones de anhídrido acético y de N-metilimidazol a la

columna. Estos reactivos reaccionan entre si para formar un agente acetilante poderoso y la

reacción es muy rápida. EIexceso de reactivos se elimina con un flujo de Ar reverso.

Una solución de iodo en THF, con agua como donora de oxigenos, se usa para oxidar

el fósforo (lll) del enlace fosfito triéster recién formado. Se realizan posteriormente varios

lavados de ACN seguidos por flujos reversos de Ar para eliminar los restos de reactivos y de

subproductos. Con la oxidación, un ciclo de adición de un nucleótido es completado. El oligo

unido a la fase sólida tiene el extremo 5’ protegido con DMTr.

El ciclo es repetido hasta que se finaliza la elongación de la cadena. Cuando la sintesis

se acaba, el material de la columna se seca por corriente de argón. De acuerdo al sistema

usado para purificar el oligo deseado de la mezcla de reacción, existe la opción de dejar un

grupo DMTr unido al oligonucleótido sintetizado para facilitar la purificación en fase reversa del

producto de la mezcla de reacción (síntesis DMTr-On)o puede eliminarse (sintesis DMTr-Off).

Un tratamiento básico en necesario para liberar el oligonucleótidode la fase sólida, desproteger

Resultados. Síntesis de las oligonucleótidos. Capitulo 5 - 152

los grupos fosfato y las bases. También el grupo acetilo de las secuencias fallidas se elimina

con este tratamiento.

6.3- Determinación de la eficiencia de acoplamiento.

El catión DMTrliberado en cada paso de Ia desprotección del OH-5' es una medida de

la cantidad de monómero incorporado en el último paso de acoplamiento, siempre que el

procedimiento de enmascaramiento haya permitido el bloqueo de las cadenas que no

reaccionaron durante el ciclo de síntesis. Su cuantificación permite, entonces, estimar eficiencia

de acoplamiento en cada paso de adición de forma rápida y sencilla. Esta determinación del

rendimiento de las reacciones de acoplamiento es una indicación preliminar confiable de la

calidad del producto obtenido.

En solución ácida el catión DMTres relativamente estable y produce un color naranja

brillante que tiene un máximo de absorbancia a 498 nm y un coeficiente de extinción de 70 000

en solventes como ACN o DCM. Es fácilmente detectado y cuando se diluye puede ser

cuantificado espectrofotométricamente. El ácido estabiliza los cationes tritilo que permanecen

fuertemente coloreados.

Las fracciones de tritilose determinaron, por lo tanto, eSpectrofotométricamente, como

se indica en la sección experimental.

El rendimiento de Ia reacción de acoplamiento en cada paso es:

Rendimiento del paso x = Ax/ Ax-1x 100,

donde Ax= lectura de absorbancia del paso x

Ax-1= lectura de absorbancia del paso anterior a x.

La diferencia entre estos dos valores indica la cantidad de oligonucleótido que disponía

del OH-5’ libre y que falló en acoplarse a la fosforamidita entrante en el paso correspondiente.

Para que una síntesis se considerara aceptable la eficiencia de cada paso debió ser mayor al 98

%. Un porcentaje menor indica o bien que los flujos no fueron los correctos o que el ACN, el

tetrazol o alguna/s de las fosforamiditas se encontraban húmedas.

Resultados. Sintesis de los oiigonucleótidos. Capitulo 6 - 153

Por otro lado, eI ensayo del DMTr no asegura Ia calidad del producto, es sólo una

medida indirecta de la eficiencia de síntesis. Hay factores que pueden ocasionalmente resultar

en un bajo rendimiento en el producto deseado y, sin embargo, los rendimientos de cada paso

según el DMTr son altos; por ejemplo, una incompleta detn'tilación o un enmascaramiento

ineficiente. La única forma de evaluar Ia calidad del producto de la síntesis es a través de

electroforesis en geles de poliacn'lamida o por HPLC. Ambas técnicas se utilizaron en este

trabajo

El rendimiento total se calcula como:

Rendimiento total = An/ A2 x 100,

donde An = la última lectura

A2= Ia segunda lectura.

El pn'mer tn'tilo no es informativo porque durante el almacenamiento de la fase son

removidos algunos DMTrde la fase y éstos se eliminan con el primer lavado de ACN.

La eficiencia promedio se determina por:

Eficiencia promedio = (Rendimiento total)1/lN-1l,

donde N = longitud del oligonucieótido.

6.4-Síntesis y purificación de oligodesoxinucleótidos.

Para la síntesis de ADN, las fosforamiditas que se usaron fueron las convencionales,

con el OH-5' protegido con DMTr, los aminos exocíclicos de las bases adenina y citosina con

benzoílo, ¡so-butin'lose usó para la guanina y B-cianoetanilo para Ia protección del fosfato (ver

figura 6.1), estas fosforamiditas requieren un tratamiento finalde 12 h con amoniaco

concentrado a 55° C para desproteger completamente los grupos amino de las bases.

Los oligodesoxinucleótidos se sintetizaron DMTr-On, para facilitar su purificación por

HPLC de fase reversa. Las escalas usadas fueron de 0.2 pmol o 1 pmol (ver en el apéndice Il

el ciclo para síntesis en escala 0.2 pmol). La eficiencia de acoplamiento de cada monómero fue

determinada según Ia absorbancia del catión DMTreliminado y se ven'ficó que fuera en todas

Resultados. Síntesis de los oligonucleotidos. Capítulo 6 - 154

las síntesis mayor al 98 %, con un rendimiento totaI promedio de más o menos 85 - 90 % para

oligos de 12 bases de longitud, según las absorbancias del DMTr. Los oligos se liberaron

automáticamente del soporte, se desprotegieron las bases con amoniaco.

OCH3

OCH3

Ü o ¿ENCW ¡YO (ko-JN»

o —N’4 A O OWLNÁ B°“a o’ \—N CH3l YNC //\\//0NC

o

00H3 oOCH3 N HO Oill] IEÍ;ÏÍ{ÁL' c IÍ!EH o/ -N/<L D

(J \Y_ Nó/NÍ// \Y

Figura 6.1. Sintones desoxinucleósido B-cianoetil-N,N-diisopropilfosforamiditas.A: 5'-O-DMTr-N2-isobutiriI-2'-desoxiguanosin-3'-O-B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.B: 5'-O—DMTr-N6-benzoiI-2'-desoxiadenosin-3'-0-t3-cianoetiI-N.N-diisopropil fosforamidita.

C: 5'-O-DMTr-N4-benzoiI-2'-desoxicitidin-3'-O—B-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita.

D: 5'-O—DMTr-timidin-3'-O-iS-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

CH3

NC


hlhvv

¡vu-v

STHRT

Figura 6.2. HPLC del crudo de una síntesis DMTr-Onde un oligodesoxinucleótido de 12 bases.

Posteriormente, se evaporaron los volátiles en un evaporador rotatorio, se cuantificaron

los productos brutos obtenidos y se purificaron por HPLC de fase reversa. Teóricamente, si la

síntesis fue eficiente, el único compuesto en la mezcla de reacción que posee el DMTren eI

extremo 5' es el producto esperado. Todas las otras especies en la mezcla cruda de reacción

habrán sido acetiladas en 5' durante el enmascaramiento y las cadenas truncas tendrán los OH

5’ libres después de la amoniólisis. Con un gradiente adecuado de solventes (típicamente, ACN

y TEAA0.1 M pH 7) se pueden separar en una columna de fase reversa por HPLC los dos tipos

de oligonucleótidos (DMTr-On y -Off) de acuerdo a su diferencia de hidrofobicidad. Los

productos tritilados, más hidrofóbicos, serán retenidos más tiempo en la columna que las

secuencias truncadas y otras especies en Ia mezcla de reacción.

En Ia figura 6.2 se muestra un cromatograma típico. El primer pico, a - 2 - 3 min, que

corresponde al volumen muerto de la columna, incluye todos los oligonucleótidos DMTr-Off.

Éstos constituyen una pequeña porción del oligo deseado que eventualmente ha perdido el

DMTr; más los oligos truncos y los productos de escisión que se producen durante la

amoniólisis en sitios apúrinicos en algunas moléculas de producto cuyas purinas fueron

hidrolizadas durante las condiciones de remoción del DMTr.A los 7 min de tiempo de retención

Resultados Síntesis delos oligonucleótidos. Capitulo 5 - 156

sale la benzamida, subproducto de la desprotección de los grupos amino exocíclicos de las

bases. Y, porfin, el principal pico - 20-23 min es el producto tritilado. Existen algunos picos

minoritarios a tiempos de retención levemente mayores correspondientes a especies tn'tiladas

no deseadas resultantes de Ia escisión de Ia cadena en los sitios apurínicos y a oligonucleótidos

n-1 debidos a una incompleta detn'tilacióno a un ineficiente enmascaramiento.

Se evaporó el solvente y los oligonucleótidos correspondientes se detritilaron por

tratamiento con AcOH 80 %, se evaporaron van'as veces de etanol para eliminar los restos de

ácido, se realizó una extracción con EÍ20 para eliminar los restos de tn'tiloy se cuantificaron

nuevamente, según su absorbancia a 260 nm. Los rendimientos usuales obtenidos para síntesis

de oligonucleótidos de 12 bases se muestran en la tabla 6.I.

Escala 0.2 pmol Escala 1 pmol

Oligonucleótido crudo 16 - 23 ODs 60 - 85 ODs

Oligonucleótido 9 - 14 ODs 30 - 50 ODspunficado por HPLC

Tabla 6.l. rendimientos tipicos para sintesisde oligodesoxinucleótidos de 12 bases.

6.5- Preparación de oligodesoxinucleótidos conteniendo la(2’S)-2’-desoxi-2’-C-metiluridina.

Se sintetizaron en escala 0.2 pmol oligodesoxinucleótidos conteniendo en una o tres

posiciones la (2’S)-2'-desoxi-2'-C-metilundina,1 con el fin de ensayar los efectos de esta

modificación sobre las temperaturas de fusión de estos oligos y compararlas con aquellas de

1 Cicero, D. 0.; Gallo. M.; Neuner. P. J.; Iribarren, A. M. Tetrahedron 2001, 57. 7613-21.


oligos de la misma secuencia que contenían Ia nueva modificación o la uridina natural en la

misma posición. Las secuencias que se sintetizaron para estos estudios fueron:

dUMe1: 5'- GCG TTT U'TT CGC -3’

dUMe3:5'- GCG TU‘T U'TU' CGC -3',

donde U' representa (2'S)-2’-desoxi-2'-C-metiluridina.

La fosforamidita correspondiente es la que se muestra en la figura 6.3, las restantes

fueron las mismas que se usaron para los oligodesoxinucleótidos naturales.

3 (El;0

Oo CH,L4

NW 6 YFigura 6.3. Monómero para la sintesis en fase sólida

de Ia (2‘S)-2'-desoxi-2'-C-metiluridina.

La concentración fue de "uiZ Les véï warm i/Ilpara favorecer el acoplamiento y el

ciclo de síntesis fue modificado con respecto al usado para preparar oligodesoxinucleótidos

naturales, extendiéndose el período de acoplamiento para esta fosforamidita a SUDseg. Se

determinó la eficiencia del acoplamiento según la absorbancia del catión Di/IlTr,resultando ser

igual que para las desoxifosforamiditas naturales. Las síntesis fueron realizadas Di/IlTr-On,los

pasos para Ia desprotección y purificación fueron los mismos que para los

oligodesoxinucleótidos descriptos en la sección anterior y los rendimientos obtenidos fueron del

mismo orden. Se desprotegió el OH-5' y, finalmente, se verificó que los oligonucléotidos Di/IlTr

Offse encontraran puros realizando una corrida analítica de HPLC, observándose un único pico

al tiempo de retención esperado (comparado con el oligodesoxinucleótido sin modificar de Ia

misma secuencia, el tiempo de retención similar de 19 - 2”Umin).

6.6- Síntesis de oligorribonucleótidos.


Comparada con la síntesis quimica de ADN, Ia síntesis de ARN es mucho más

dificultosa. La dificultad surge debido a la presencia del adicional OH-2', que debe ser protegido

convenientemente, y que provoca, además, una más lenta velocidad de acoplamiento a causa

del impedimento estérico en 2', que desactiva el acoplamiento de los monómeros entrantes

sobre la cadena creciente. Por otra parte, el ARN es mucho más inestable que el ADN,

degradándose químicamente en medio básico y enzimáticamente por las ubicuas RNasas.

Estos factores traen aparejados tiempos más largos de síntesis, desprotección y purificación

que el ADN y menores rendimientos. Es necesaria, además, una mucho más cuidadosa

manipulación de los compuestos.

El gano protector de OH-2' que se usa actualmente en la síntesis de rutina de ARN,

después de haberse ensayado numerosas altemativas durante las dos últimas décadas, es el

tert-butildimetilsililo,que se remueve en un paso final de desprotección con el anión básico

fluoruro. Dado que es un grupo muy voluminoso, la formación del enlace fosfito tn'éster se

demora durante el ciclo de sintesis; por eso, el período para el acoplamiento debe ser extendido

de 15 seg para ADN a 10 min para ARN, de forma que las eficiencias de acoplamiento sean

razonables (> 98 %). EI resto del ciclo de sintesis, salvo el último paso para remover el oligo

recién sintetizado del soporte sólido, es similar al empleado para ADN (ver el apéndice II). Se

probaron dos diferentes protocolos para la obtención de ARN en escalas de 0.2 y 1.0 pmol. EI

primero de los protocolos ensayados2 utilizaba como sintones las ribofosforamiditas análogas a

las utilizadas para ADN (figura 6.1), con los mismos gmpos protectores usados para las bases

y los grupos fosfato, y con el adicional OH-2' protegido con el TBDMS. Los oligornbonucleótidos

se sintetizaron DMTr-Offy la liberación del soporte sólido se realizó automáticamente; el

procedimiento es similar al utilizado para el ADN, excepto en que el tiempo requerido es mayor

debido a la presencia del sustituyente voluminoso en 2’ (2 h vs. 1 h). La desprotección de las

bases y los grupos fosfato se llevó a cabo mediante amoniólisis, esta vez con amoniaco (c) :

EtOH (3 : 1) a 55 °C con el tin de aumentar la solubilidad de los oligos protegidos con el TBDMS

2 Gait, M. J. ; Pn'tchard, C.; Slim, G. en Olígonucleotide and Analogues. A practical approach. IRLpress 1991 , 32-45.

Resultados. Sintesis de los oligonucleótidos. Capítulo 6 - 159

y, debido a observaciones experimentales, que indicaban que, en ausencia de EtOH. el

amoniaco removía una porción significativa de los gmpos sililo dejando los OHs-2' expuestos.

EI ARN desprotegido en 2' se degrada químicamente en condiciones básicas; se produce un

ataque del OH-2' al enlace fosfotriéster vecino, con el consiguiente fraccionamiento del oligo.

Esta degradación es minimizada usando NHa : EtOH (3:1),3 en vez de únicamente amoniaco.

Los grupos TBDMS se eliminaron con TBAF 1 Men THF, a temperatura ambiente durante 36 h.

La reacción se detuvo con TEAA0.1 M, obteniéndose un precipitado viscoso, que fue desalado

usando un cartucho de fase reversa C13.EI uso de columnitas de sephadex G 25 no resultó

efectivo, se obtuvo el oligo diluido en varias fracciones y el desalado no fue eficiente. Posterior

al desalado, se aisló Ia secuencia deseada en un gel de poliacrilamida,se extrajo el oligo del gel

y se desaló nuevamente con cartucho C18;sin embargo aún se encontraba contaminada con

restos de sales.

Problemas de esta metodología nos impulsaron a buscar alternativas para obtener

oligorribonucléotidoscon un rendimiento aceptable y en condiciones adecuadas de pureza.

Primeramente, se observaba en el gel de purificación una parcial degradación del

oligonucleótido. Esta degradación es probable que ocurriera por el prolongado

tratamiento en medio básico, aún usando Ia mezcla amoníaco : EtOH,4 necesario

para eliminar los grupos protectores de los aminos de las bases, especialmente el

isobutirilode la guanosina.

Por eso, se decidió usar otros sintones que no requirieran un tratamiento tan drástico en

condiciones alcalinas, de forma de minimizar el tiempo de desprotección. por un lado, y la

eventual degradación, por otro. Se usaron, por consiguiente fosforamiditas de quimica de

desprotección rápida, en las cuales los grupos exocíclicos de las bases se encuentran

protegidos con el más Iábilgnrpo fenoxiacetilo5'6(figura 4), y pueden ser desprotegidos por un

3 Scarlnge, S. A.; Francklyn, C.; Usman, N. NucI. Acids Res. 1990, 18, 5433-5441.4 Wu, T.; Ogilvie. K. K.; Pon, T. R. Nucl. Acids Res. 1989. 17, 3501-3517.5 Wu, T.; Ogilvie. K. K.; Pon, T. R. NucI. Acids Res. 1989. 17, 3501-3517.5 Gasparutto. D.; Livache, T.; Bazin, H.; Duplaá, A. M.; Guy, A.; Khorlin, A.; Molko, D.; Roget, A.; Téoule. R. NucI.Acids Res. 1992, 20. 5159-5166.

tratamiento más suave con metilamina acuosa durante sólo 10 min a 65 °C7. Para evitar

transamidación entre el acetilo usado para el enmascaramiento y el grupo fenoxiacetilo de las

guaninas, anhrídido fenoxiacético fue usado como agente bloqueante en lugar de anhídn’do

acético.B

w o ¡NHO ' k NkoN ° Oo OO o H3

0 T“: o CH3C _ __o o O—SÍ—I—CH3 o S' I CH3

Figura 6. 4. Sintones desoxinibonucleósido B-cianoetiI-N,N-diisopropilfosforamidítas.A: 5'-O-DMTr-N2-fenoxiacetiI-2'-O-TBDMS-guanosin-3'-O—B-cianoetil-N,N-d¡isopropi| fosforamidíta.B: 5'-O-DMTr-N6-fenoxiacetil-2'-0-TBDMS-adenosin-3'-O—IS-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidíta.

C: 5'-0-DMTr-N4-fenoxiacetil-2'-0-TBDMS-citidin-3'-O-B4:ianoefiI-N,N-diisopropil fosforamidíta.D: 5'-O—DMTr-2'-O—TBDMS—uridin-3'-O-B-cianoetiI-N.N-diisopropilfosforamidíta.

Por otra parte, Ia desprotección con TBAF,es larga y engorrosa, y es muy sensible

a Ia presencia de humedad en la solución de TBAF, resultando muchas veces

7\Mncott, F.; DiRenzo. A.; Shaffer, C.; Grimm, S.; Tracz, D.; Workman, C.; Sweedler. D.; Gonzalez, C.;

Scarincge,S.Usman, N. NucI. Acids Res. 1995. 23. 2677-2684.3 Chaix, C.; Duplaá, A. M.; Teoule. R. NucI. Acids Res. 1989. 17, 7381-7393.


incompleta para los ribosil pun'n-nucleósidos, sobre todo en oligonucleótidos largos.9

Este hecho se hizo visible en bandas que corrían más lento en los geles de

poliacn’lamida.

Finalmente, la eliminación de las sales de fluoruro es muy dificil10y no se lograron

eliminar los restos de fluoruro, aún después del gel y de un segundo cartucho de

fase reversa.

Por estos dos motivos, se recurrió a trietilamina trihidrofluoruro como reactivo para

eliminar el TBDMS de 2', con la cual la reacción de desprotección ocurre más rápidamente, sin

que tenga lugar migración de los enlaces fosfodiéster y, además, tiene la ventaja de ser mucho

menos sensible a la presencia de humedad.11 Con una mezcla de TEA / TEA.3HF / N

metilpirrolidinonalos oligos se desprotegen en 1.5 h solamente a 65 °C y no se detectan restos

de sales de fluoruro luego de precipitar los oligos de la mezcla de reacción.7

Los oligorribonucleótidos se sintetizaron, entonces, DMTr-On. Cuando las sintesis

terminaron se sacaron los oligos de la columna en forma manual y, todavía ligados al soporte,

se trataron con Ia solución metilamina, 10 min a 65 °C con el fin de terminar de desproteger los

grupos fosfato, desproteger los grupos amino de las bases y escindir el producto de la fase

sólida. Este procedimiento es mucho más breve y, por lo tanto, más inocuo para los

oligonucleótidos que las 12 h a 55 °C necesarias de amoniólisis, más las 2 h a temperatura

ambiente requeridas para liberar al oligo del soporte. La reacción de desprotección se detuvo

por agregado de EtOH y se filtró para separar la solución conteniendo el oligo del soporte

sólido. Se evaporaron los volátiles y el siguiente paso constituye la desprotección de 2', para lo

cual se trataron los oligos con la solución conteniendo TEA.3HF. Para destruir el exceso de

fluoruro se agregó isopropil trimetilsilil éter.12 Los oligos muy polares precipitan y los otros

compuestos (fluoruro de TBDMS, exceso del éter de silicio, fluroruro de trimetilsililo,

pirrolidinona, TEA) quedan en solución. Como último paso se agregó EtzO para asegurar una

9 Hogrefe, R. l.; McCaflrey, A. P.; Borozdina, L.; McCampbell, E. S.; Vaghefi, M. M. Nucl. Acids Res. 1993, 21.4739-4741.

1°Sproat, B.; Colonna, F.; Mullah, B.; Tsou, D.; Andrus, A.; Hampel, A.; Vinayak, R. Nucleosides &Nucleotides1995. 14. 255-273.

1‘Westman. E.; Strómberg. R. Nucl. Acids Res. 1994, 22. 2430-2431.

JU <1) rn L. LG (L() (n U) c5 (n U1 C ._(D '3 (n r) (a O :3 c: Q (D Q: ñ." Oy) O 1‘) '9. .6. (J)I

_—l 0) N I

completa precipitación. Luego de desproteger los OH-2', los oligorribonucleótidos son

susceptibles al ataque por nucleasas, con lo cual a partir de este momento los buffers y las

soluciones utilizados fueron esterilizados y también el material que estuviera en contacto con los

oligos. Los oligonucleótidos DMTr-On se purificaron por HPLC de fase reversa C13con un

gradiente de buffer TEAA 0.1 M pH 7 en ACN.

Se recogieron los picos correspondientes a los oligos. En este caso los cromatogramas

obtenidos (figura 6.5) fueron similares a los obtenidos para los oligodesoxinucleótidos, sólo que

los oligorribonucleótidos quedan levemente más retenidos en la columna de HPLC que los

oligodesoxinucleótidos de igual número de bases ( -23 min vs. - 21 min para oligos de 12

bases y de secuencia similar)y que contenían una cantidad algo mayor de picos espurios.

Figura 6.5. HPLC del crudo de una sintesis DMTr-Onde un oligon'ibonucleótidode 12 bases.

Se eliminó el DMTrcon AcOH pH 4 que se neutralizó con NH4HC03 (s) y se realizó una

segunda purificación por HPLC de fase reversa de los oligonucleótidos DMTr-Off,esta vez con

ACN - NH4HC03 0.1 M pH 7. Se muestran en la figura 6.6 un cromatograma típico de un

oligorribonucleótido DMTr-Offde 12 bases. En el caso de la cromatografía tritiI-Offno existe una

relación tan clara entre el tiempo de retención y la longitud del oligonucleótido. El tiempo de

retención depende de la hidrofobicidaddel oligonucleótidoque está influenciada. además de por

la longitud, por Ia composición de bases.

12Song, 0.; Jones, R. A. Tetrahedron Letl. 1999, 40, 4653-4654.


Adicionalmente, la formación de estructuras secundarias puede disminuir la resolución

del cromatograma al salir los picos ensanchados o, incluso, puede enmascarar la diferencia de

hidrofobicidadde compuestos químicamente similares. Esta tendencia a plegarse en estructuras

secundarias es más evidente en HPLC DMTr-Ofi‘porque las condiciones de corrida contienen

mayor proporción de buffer y menor de solvente, con Io cual, son condiciones menos

desnaturalizantes que las empeladas en Ia cromatografía tritiI-On;y es, además, más acentuada

para oligorribonucleótidos que para oligodesoxinucléotidos debido a Ia presencia del OH-2'.

E:'

Figura 6.6. HPLC de un oligorn'bonucleótidoDMTr-Oilrde 12 bases.

Aitemativamente, después del tratamiento con AcOH se purificaron los oligonucleótidos

por gel de poliacrilamidaseguido por un desalado con sephadex.

Finalmente, se pasaron los oligos por una resina de intercambio iónico para

transformados a su forma sodio, para evitar eventuales interferencias en los estudios de

actividad de las ribozimas de los iones amonio o tn'etilamonio que actúan como contraiones

después de las purificaciones por HPLC.

Con respecto a los dos métodos de purificación, gel o HPLC; HPLC es una técnica

mucho más rápida y si la síntesis funcionó bien no presenta inconvenientes, la desventaja es

que no permite identificar claramente productos de degradación, de incompleta desprotección y

secuencias truncas. Por otro lado, Ia electroforesis por gel tiene la ventaja de proveer

información sobre la longitud de las secuencias existentes en la mezcla de reacción, siendo

posible en teoría separar las bandas de Ia longitud deseada de las cadenas con una o dos

bases menos, correspondientes a las secuencias truncas y eventuales productos de

“AA. 5'- .l “fangú' ,,. I - ' A . ' ':' ’\ ' l f" P/i1::Uhapcs. ¿mms d: los ¿Ilignuclecudos LEDIÍUIOo -1c-.

degradación. Sin embargo, el uso de Ia absorción al UV como método de detección para

visualizar las bandas, es poco sensible y tiene poca resolución, con Io cual, disminuye la

eficiencia de la purificación. Además, la electroforesis por gel es un método considerablemente

más largo y tedioso que HPLC y los rendimientos en la recuperación de los oligos no son

siempre reproducibles, sobre todo si las mezclas de reacción son complejas. Por lo tanto, una

primera purificación por HPLC es conveniente, para separar, los oligos DMTr-On de las

secuencias Off.

Un segundo paso de purificación es requerido para obtener los oligos en óptimas

condiciones de pureza después de Ia desprotección del extremo OH-5’ y terminar de eliminar

los posibles fragmentos productos de alguna eventual degradación y / o incompleta

desprotección. Entonces, finalmente, para el segundo paso de purificación se prefirió, en los

casos de oligonucleótidos cortos (< de 15-20 monómeros), los cuales son más fáciles de

manipular y cuyas sintesis son eficientes, usar HPLC.

Sin embargo, para la obtención de secuencias más largas y complejas en donde los

rendimientos de síntesis son más bajos (ribozimas naturales y modificadas), las mezclas de

reacción son más heterogéneas, la tendencia a degradarse más alta y más alta también la

propensión a formar estructuras secundarias que dificultan Ia interpretación de los

cromatogramas; se concluye, que, según nuestra experiencia, es preferible utilizarelectroforesis

en gel de poliacrilamida para el segundo paso de purificacióndebido a que esta técnica permite

visualizar el oligo deseado identificado según su PM, comparado con un oligodesoxinucleótido

de la misma longitud y secuencia (ambos corren a velocidad similar, aunque el oligo de ARN

puede verse un poco retrasado) o usando marcadores de PM comerciales.

Los rendimientos aproximados típicos (referidos a las ODs medidas inicialmente) que se

obtuvieron después de cada paso de la sintesis, desprotección y purificación se observan en Ia

tabla 6.ll. Las síntesis fueron realizadas en escala 0.2 pmol usando HPLC para los dos pasos

requeridos de purificación, independientemente de la longitud del oligonucleótido:

En el caso de usar gel de poliacrilamida como segundo paso de desprotección Ia

recuperación fue variable.

Resultados. Síntesis delos oligonucleótidos. Capítulo 8 - 165

Como se observa el rendimiento es mucho más bajo que para oligodesoxinucléotidos.

Esto es fundamentalmente debido al paso extra de desprotección del OH-2', y a la necesidad de

dos pasos de purificación para tener el oligo en condiciones razonables de pureza, sobre todo,

para las n'bozimas (36 monómeros) que son oligorribonucleótidos relativamente largos. Sumada

la degradación que ocurre en alguna proporción a pesar de las precauciones tomadas con el

uso de soluciones y material estén'l posteriormente a la desprotección en 2'.

Longitud del oligorribonucléotido sintetizado

12 monómeros 15 monómeros 36 monómeros

Crudo (ODs obtenidas) 15-25 20-30 80-100

Rendimiento después de Ia precipitación con 50 % 40 % 30 %isopropil trimetilsililéter

Rendimiento después de la primera corrida 25 % 15 % 10 %por HPLC (ACN ITEAA 0.1 M)

Rendimiento después de la segunda corrida 6 % 4 % 3 %por HPLC (ACN / NH4HC03 0.1 M)

ODs obtenidas finalmente 1-2 1-1.5 2.5-3

Tabla 6.ll. Rendimientos promedio obtenidos en las síntesis de oligorribonucleótidos.

6.7-Síntesis de oligodesoxinucleótidos conteniendo uridina.

Se sintetizaron en escala 0.2 pmol oligodesoxinucleótidos conteniendo en una o tres

posiciones la uridina natural para los experimentos de temperatura de fusión:

rU1: 5’- GCG TTT UTT CGC -3'

rU3: 5'- GCG TUT UTU CGC -3'.

La síntesis se llevó a cabo con el mismo ciclo que se usó para los oligonucleótidos que

contenían la (2’S)-2'-desoxi-2’-C-metiluridina. EI rendimiento del crudo y la eficiencia de

acoplamiento resultó similar que para los oligodesoxinucleótidos. Después de Ia síntesis, se

liberaron los oligos automáticamente de la fase sólida y se desprotegieron los gmpos amino de

las bases con NH3(c) : EtOH, 3 : 1, como se hace tradicionalmente: 12 h a 55 °C (no se usó

directamente amoniaco concentrado, para minimizar Ia degradación que pudiera ocurrir en las

posiciones de la uridina). A partir de aqui se siguió el protocolo optimizado para ARN. Los

tiempos de retención observados por HPLC fueron en todos las casos similares a aquellos del

oligodesoxinucleótido de Ia misma secuencia.

Después de Ia segunda corrida de HPLC se obtuvieron 8 ODs del oligonucleótido con Ia

uridina en una sola posición y 4 ODs del oligo con Ia uridina en tres posiciones, para escala de

síntesis 0.2 pmol.

6.8- Síntesis de 2’-O-meti|o|¡gorribonucléotidos.

La síntesis de los 2'-O-meti|o|igorribonucléotidos se llevó a cabo usando fosforamiditas

de desprotección rápida (figura 6.7).

Antes de probarla síntesis de las ribozimas modificadas sintetizamos algunos oligos de

12 bases para verificar Ia eficiencia en Ia preparación de esta clase de oligonucleótidos

modificados.13Se extendió el paso de acoplamiento a 600 seg debido al impedimento estérico

causado por Ia presencia del metilo unido al oxígeno de la posición 2'. La eficiencia de

acoplamiento resultó óptima. La desprotección de las bases se realizó con metilamina acuosa

como se describió para los oligorribonucleótidos. se purificaron los oligonucleótidos DMTr-On

13Sproat, B. S.; Lamond, A. I. en Oligonucleolide and Analogues. A practical approach, IRL press 1991, 78.

Resultados. Simesis delos oligonucleótidos. Capitulo 6 - 167

por HPLC, eluyéndose éstos a un tiempo de retención levemente superior que

oligorríbonucleótidos y que oligodesoxínucleótidos de Ia misma secuencia (- 25 min, - 23 min y

e 21 min, respectivamente). EI OH-5' se desprotegió con AcOH pH 4 a temperatura ambiente.

Se realizó una extracción final con EtzO para eliminar los restos de tiitilo y se chequeó la

calidad de los mismos con una corrida de HPLC analítica.

oca, o Ï/OÜ,N NH °°“*‘ NH

OO (NINJ‘NHE/OÜo

Ü 1ogoiocrg Q odoC Ü o CHa

CCI-13 N

OD Ü SO NO OO

o oCl-bFL-NÁ CHJLN'4

r C C/\/Ó Y

Ob-Z>=0

“Ócz)

8J O

Figura 6.7. Sintones desoxirn'bonucleósido B-cianoetiI-NN-diisopropilfosforamiditas.A: 5'-O-DMTr-N2-fenoxiacetiI-2'-0-metiI-guanosin-3'-0—B-cianoeüI-N,N-diisopropil fosforamidita.B: 5'-O-DMTr-N6-fenoxiacetiI-2'-O-metiI-adenosin-3'-O-B-cianoetiI-N,N-diisopropil fosforamidita.

C: 5'-0-DMTr-N4-fenoxiacetiI-2'-O-metiI-citidin-3'-0—B-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita.D: 5'-0-DMTr-2'-O-meti|-uridin-3'-0-B-cianoetil-N,N-diisopropil fosforamidita.

6.9- Síntesis de oligonucleótidos conteniendo la 2’-Cmetiluridina.

Como primera medida, antes de incorporar la 2'-C-meti|un'dina en oligonucleótidos,

realizamos algunos ensayos de estabilidad del nucleósido para testear su estabilidad frente a

las condiciones de desprotección de los oligonucleótidos. Por consiguiente, Ia 2'-C-metiluridina

se incubó en amoniaco (c) y no se detectaron trazas de degradación c.c.d. luego del

tratamiento durante 24 h a temperatura ambiente ni tampoco a 55 °C por Como Ia 2'-C

metilun'dina contiene una función alcohol terciaria era critico constatar que resistiera las

condiciones ácidas requeridas para eliminar el THP sin sufn'r eliminación o isomen'zación.

Luego de tratamiento con HCI pH 2 durante 24 h a temperatura ambiente y a 55 °C. se obtuvo

un Rf idéntico al del material de partida. Finalmente, el nucleósido modificado fue también

resistente a Ia digestión con Ia solución desililante 20 h a 65 °C. Todas estas condiciones son

muy drásticas en comparación con las empleados en Ia síntesis de oligonucleótidos y estos

resultados proveen una primera indicación que la 2'-C-metiluridina podría ser efectivamente

incorporada en oligonucleótidos.

El siguiente paso fue ensayar las condiciones de remoción del THP del OH-2' en las

condiciones de desprotección usadas en la síntesis de ARN. La 3’,5'-di-O-aceti|-2’-O

tetrahidropiraniI-2'-C-metiluridina (compuesto 10) fue tratada con HCI 0.01 N (pH = 2) a

temperatura ambiente. Éstas son las condiciones que se usaban para desproteger el OH-2' de

oligorribonucleótidos sintéticos protegidos con THP. EI tiempo medio observado de la reacción

de desprotección fue de 1 h aproximadamente, según se monitoreo por c.c.d.; recuperándose la

3’,5’di-O-acetiI-2'-C-meti|uridina luego del tratamiento sin mostrar trazas de degradación. EI

tiempo medio de desprotección de la 2'-O-tetrahidropiraniluridina fue informado por dos grupos,

el grupo de Griffin informa 69 min,14mientras Yamakaye y colaboradores determinaron un t1/2

de 32 min.15 En el trabajo de Griffin, los autores también verificaron que eI tiempo requerido

para Ia desprotección del THP en un dinucleótido es la mitad que el del derivado nucleosídico.

Atn'buyen la diferencia ala posible participación del enlace fosfodiéster en la hidrólisis del THP

en el dímero. El tiempo medio observado para Ia desprotección del compuesto 10, por Io tanto,

14Griffin, B. E.; Jannan, M.; Reese, C. B. Tetrahedron 1968, 24, 639-662.

Resultados. Síntesis de los oligonucleótidos. Capitqu 8 - 169

se encuentra dentro del orden de lo esperado, comparado con la 2'-O-tetrahidropiraniluridinay

asumiendo que no será muy diferente para el compuesto 10 que para Ia 2'-O-tetrahidropiranil

2'-C-meti|uridina. Si el tiempo medio para la desprotección del OH-2' en el oligo fuera similar al

tiempo involucrado para Ia desprotección del compuesto 10 a las 5 h de tratamiento con HCI

más del 97 % del oligo se encontraría desprotegido. Aunque probablemente por lo arriba

mencionado sea más corto.

Todos estos datos preliminares señalaban que no debía haber mayores inconvenientes

para la incorporación de la 2'-C-metiluridina en oligonucleótidos usando la 2'-O-tetrahidropiranil

5'-O-(4,4'-dimetoxitritiI)-2’-C-metiluridína3'-(2-cianoeti|-N,N-diisopropiIfosforamidita) (compuesto

13) como sintón para la síntesis en fase sólida.

En un primer intento, se probó Ia síntesis de oligodesoxinucleótidos que contenían la

nueva modificación en una posición con el fin de poner a punto las condiciones de sintesis y

desprotección. dada Ia mayor simplicidad y mayor eficiencia de las síntesis de

oligodesoxinucleótidos que de oligorribonucleótidos. Antes de intentarlo, dado que el enlace N

incosídico es menos estable en condiciones ácidas para la serie desoxi que para la serie n'bo,

se probó la estabilidad de un oligodesoxinucléotido a las condiciones de desprotección del THP.

Por Io tanto, se sintetizó un oligodesoxinucléotido control de 12 bases DMTr-On,se purificó por

HPLC y se tomaron 5 ODs que se trataron en HCI 0.01 N pH a 2 durante 24 h a temperatura

ambiente. Luego de neutralizado con NH4HC03(s) se realizó una corrida analítica en el HPLC y

el cromatograma observado fue idéntico al obtenido luego de tratar al oligo con AcOH pH 4

durante 20 min a temperatura ambiente, condiciones requeridas para detritilar el oligo,

observándose en ambos casos un único pico de tiempo de retención de - 19 min (datos no

mostrados).

Se sintetizaron, por consiguiente, en primera instancia dos oligodesoxinucleótidos de

doce bases con la misma secuencia. un oligo control y el otro que contenía en una posición la

2'-C-metiluridina (son estos oligos los que posteriormente se usaron para determinar las

temperaturas de fusión de híbridos con hebras complementarias de ARN, ver capítulo 8):

15Yamakage, S.; Sakatsume, 0.; Furuyama, E.; Takaku, H. Tetrahedron Let. 1989, 30. 6361-6364.

Resultados. Sintesis de los oligonucleótidos. Capitulo 6 - 1.76

ODNc: 5'- GCG TTT TTT CGC -3'

UMe1: 5'- GCG TTT U'TT CGC -3'

donde U*corresponde a la 2'-Gmetiluridina.

Los oligos se sintetizaron DMTr-On, en escala 0.2 pmol, usando concentración 0.1 M

de todas las fosforamiditas (se usaron las fosforamiditas convencionales mostradas en la figura

6.1). excepto para la fosforamidita modificada. cuya concentración fue de 0.12 M. El tiempo de

acoplamiento también se extendió en este caso para la uridina modificada a 900 seg, debido al

alto impedimento estérico en la posición 2'; el OH-2' es un alcohol terciario que además se

encuentra protegido con un grupo THP. Durante la síntesis la eficiencia del acoplamiento fue

siempre > 98 % para todas las bases. no notándose diferencia entre las desoxifosforamiditas

convencionales y la nueva fosfarmidita. Los crudos se trataron con amoniaco para desproteger

las bases, se evaporaron los volátiles y obtuvieron los rendimientos que se muestran en la

tabla 6.I|l.

Olignucleótido i ODs

ODNc 20.0

U‘de‘

Tabla 6.l|l. Rendimiento crudo de Ia sintesis del oligo Um.

Se corrieron los oligos por HPLC observándose el siguiente cromatograma (figura 6.8):

Aparentemente, el THP no fue lo suficientemente estable frente al TCA, eliminándose

parcialmente en cada ciclo de detritilación, disminuyendo la calidad del producto obtenido. Se

colectaron juntos todos los picos que salían entre 21 - 23 min en una corrida preparativa

obteniéndose 8 ODs. Se tomaron dos porciones de esa mezcla de reacción de 1 y 3 ODs,

respectivamente. Una OD fue tratada con AcOH pH 4 preparado con solución estéril. por si

acaso la modificación no acrecentara la estabilidad frente a RNasas. Se tomó una alícuota a los

Resultados. Síntesis de los oligonucleótidos. Capitulo 6 - 171

8 min que se evaporó de EtOH para detener la reacción (correspondería este experimento a

una parcial detritilación).

8.58

Figura 6.8. HPLC del crudo dela sintesis DMTr-Onde UMe1(00n TCA).

EIresto se dejó reaccionar hasta los 20 min para completar la desprotección de 5'. Las

3 ODs restantes se incubaron en HCIpH 2-2.5 también estén'l y fueron tomándose alícuotas a

diferentes tiempos entre 1 y 20 h. La reacción se detuvo por neutralización con NH4HC03 (s).

Se realizaron HPLCs analíticos de todas las alícuotas observándose que todos los

cromatogramas fueron iguales. salvo para Ia fracción tratada 12 min con AcOH. Estos

cromatogramas son como el que se muestra a continuación (figura 6.9).

Contienen principalmente cuatro picos. O bien, todo el THP fue eliminado con AcOH y

en corto tiempo con HCl, o bien ya se había eliminado durante la síntesis o, por último, el oligo

de 12 bases con THP corre igual que el mismo oligo sin THP. Se considera que Ia última

posibilidad era la más probable. El cromatograma de la fracción tratada 12 min con AcOH es

igual al de la figura 9 pero muestra un conjunto adicional de picos alrededor de los 40 - 45 min,

que es el tiempo de retención de los oligos DMTr-Oncom'dos en condiciones Off (datos no

mostrados).

Resultados. Síntesis delos oligonucleóiidos. Capitulo 8 - 172

Figura 6.9. Cromatograma del oligo Um DMTr-On purificadopor HPLCe incubado después a temperatura ambiente oon

HCI pH 2-2.5 10 h o con AcOH pH 4 20 min.

Se decidió analizar por gel la mezcla de los cuatro picos principales observados en los

cromatogramas. Por Io tanto, se marcó con 32P la posición 5’ de las fracciones tratadas con

AcOH 20 min y con HCI 10 h. Se corrió un gel de poliacn'lamida con las fracciones y el oligo

control marcados (figura 6.10).

Lo que se vio es que ambas fracciones contenían el mismo perfilde cuatro bandas, dos

mayoritarias, respecto de la radioactividad total. Una de ellas tenía la misma movilidad que el

oligo control (12 bases), que corresponde al producto deseado y la otra parecia ser un oligo de

5 bases, que es coherente con el producto 3' de la hidrólisisdel oligo de longitud completa en el

enlace intemucleótídico 3’ a la posición en donde se introdujo la modificación, probablemente

por ataque del 0H-2' libre al fosfato inmediato. Las otras dos bandas minoritarias correspondían

a oligos n-1, o sea 11 bases, tal vez productos de incompleta detn’tilación,y a 7 bases, que

correspondería al fragmento 5' del oligo de 12 bases escíndido en la posición que contenía la

2'-C-metilun'dina.

OOOOOOOOOOOOOOOOOOO...OÓOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO<

Resultados, Síntesis de los olígonuoleótídos. Capítulo 6 —773

AcOH HCI Control

Figura 6.10. Gel de poliacrilamida de los picos DMTr-Onproductos dela síntesis de oligo UMe1purificados juntos por HPLC e incubados 20 min en AcOH pH 4 ó 10 h en HCl pH 2-2.5.

El control es un oligodesoxinucleótido de la misma secuencia.

Finalmente, era probable que el oligo de 12 bases fuera el más retenido, con un tiempo

de retención que correspondía al del oligo control DMTr-Off(19 min). Para corroborarlo, las 4

ODs restantes de los picos DMTr-On, aisladas por HPLC fueron tratadas con HCl 0.01 N.

7 durante 7 h que era un tiempo que se suponía suficiente para que se hidrolizara el THP, de

acuerdo con los estudios preliminares. Se neutralizaron con NH4HC03(s) las soluciones ácidas

y se purificaron los cuatro picos. Se marcaron con 32P y luego se corrieron por gel,

corroborándose que el primer pico consistía principalmente en el oligo de 5 bases, las otras dos

fracciones eran una mezcla del oligo de 7 y el de 11 bases con una proporción menor del oligo

de 12 bases, que se encontraba puro en la fracción correspondiente al pico de 19 min de

tiempo de retención. V x

Está informado que el uso del THP como grupo protector de OH-2’ en la síntesis de

oligorribonucieótidos está limitado a oligos relativamente cortoslím18 debido a que es

16Tanimura, H.; Fukasawa, T.; Sekine, M.; Hata, T.; Efcavitch, J. W.; Zon, G. Tetrahedron'Lett. 1988, 29, 577-578.

17Kierzek, R.; Caruthers, M. H.; Longfellow, C. E.; Swinton, D.; Turner, D. H.; Freier, S. M. Biochemistry1986, 25,7840-7846. ’

insuficientemente estable a ácido, con Io cual, se hidroliza parcialmente en las condiciones

ácidas utilizadas para desproteger el OH-5' en cada ciclo.1‘3-20En este caso, aparentemente, el

THP protegiendo el OH-2' terciario es todavia más Iábil a la hidrólisis ácida, tanto que resulta

incompatible con las condiciones de desprotección del DMTr.

Figura 6.11. Cromatograma del crudo de Ia sintesis DMTr-Onde UMe1usando DCA como agente detn'tilante.

Están reportadas sintesis de oligonucleótidos que usan DCA 2 % en DCE en vez de

TCA 3 % en DCM,21la solución es un poco más diluida y el DCA es un ácido más débil que el

TCA (pKaTCA= 0.65 vs. pKaDCA= 1.29). Por lo tanto, se probó la sintesis en estas condiciones

más suaves, suponiendo que tal vez, si Ia sintesis funcionara bien, podria disminuirse Ia

hidrólisis del THP en cada ciclo al desproteger el OH-5'. Esto mejoraría Ia calidad de Ia sintesis

y, además, permitiría confirmar que era ésta la causa el bajo rendimiento obtenido. Se chequeó

durante Ia síntesis del oligo control que la eficiencia de acoplamiento y los rendimientos

obtenidos fueran similares a los obtenidos con TCA y se realizó luego la sintesis del oligo UMe1.

El HPLC Io que mostró fue que la sintesis de UMe1fue notoriamente más eficiente (en Ia figura

6.11 se muestra el cromatograma del crudo de la reacción y en figura 6.12 el cromatograma

1°Tanimura, H.; Imada. T. Chem. Lett. 1990. 2081-2084.

‘9 Reese, C. B.; Skone P. A. Nucl. Acids Res. 1895. 13, 5215-5231. .2°Christodolou. 0.; Agrawal, S.; Gait, M. J. Tetrahedron Lett. 1986, 27, 1521-1523.21Ellington. A.; PoIIard, J. D. en Current Protocols ¡n Molecular Biology. Supplement 42 1998 editado por JohnVlfilleyand Sons. Inc. Unidad 2.11. 6.

Resultados. Sintesis de los oligonucleóiidos. Capiiulo 6 - 175

del pico del oligo DMTr-On purificado por HPLC. después del tratamiento con ácido); lo cual

indica que efectivamente el monómero protegido con THP es mucho más sensible a ácido de lo

que se había predicho en base a los resultados preliminares. A partir de aqui las síntesis

conteniendo la 2’-C-metiluridina se realizaron con DCA 2 % en DCE en lugar de TCA 3 % en

DCM.

Figura 6.12. Cromatograma de UMei sintetizado con DCA DMTr-Onypurificado por HPLC, después del tratamiento con HCI.

Finalmente, se repitieron las sintesis con DCAy además se sintetizó

UMe3: 5'- GCG TU*T U'TU' CGC -3’

donde U*representa la 2’-C-metiluridina.

En Ia figura 6.13 se muestra el cromatograma del crudo. En Ia síntesis se observan

tres picos DMTr-On. Se purificaron los picos correspondientes al conjunto de oligos DMTr-On,

se trató la mezcla 7 h con HCI 0.01 N estéril y se neutralizó con NH4HC03. Se cromatografió

luego nuevamente por HPLC la muestra (figura 6.14) y se colectó el pico correspondiente al

oligo de 12 bases de acuerdo a lo observado mediante marcación isotópica y análisis por gel de

policarilamida. EI pico correspondiente al oligo sale de la columna a un tiempo de retención de

19 min; correspondiendo los otros picos de menor tiempo de retención a oligos de menor peso

molecular.

Resultados. Síntesis de ios oligonucleotidos. Capitqu 6 - 176

(0

ÜJ

a:iCE

C¡CFl

Cl

l á,'11e:

Figura 6.13. Cromatograma del crudo de Figura 6.14. Cromatograma de UmaUma. sintesis DMTr-On después del tratamiento con HCI (se

señala el pioocorrespondienteal producto deseado).

Los rendimientos obtenidos se muestran en Ia tabla 6.lV.

A partir de este resultado se puede concluir que es necesario utilizarun grupo protector

de 2' alternativo, ya que el THP es demasiado Iábila las condiciones ácidas requeridas para Ia

eliminación del tn'tilo de 5' durante la elongación del otigo. Cuando se introduce la nueva

fosforamidita en una sola posición de un oligodesoxinucleótido de 12 bases se obtiene el

producto deseado con un rendimiento razonable. Sin embargo al introducida en tres posiciones


el rendimiento obtenido es muy bajo, obteniéndose mezclas de oligonucleótidos más cortos

productos de Ia degradación en esas posiciones, incluso, usando DCAcomo agente detritilante.

Oligonucleótido ODs (crudo) ODs (purificado)

ODNC 20.0 10

UMei 19.3 5

UMea 18.0 0.4

Tabla 6.lV. Rendimientos de las sintesis de oligodesoxinucleótidos de 12 bases conteniendo la 2'-Cmetiluridina en una o en tres posiciones y del

oligodesoxinucleótido control.

Si ocurrieran eventuales migraciones del fosfato, el oligo 3' —>5' estaria impurificado en

alguna proporción con uniones 2' —> 5'. Este evento no ocurre en los oligos naturales

sintetizados con fosforamiditas cuyos OH-2’ estaban protegidos con THP,14.16desde que la

remoción del THP se efectúa sin Ia generación de iones alcóxido. los cuales son los que

pueden subsecuentemente atacar los enlaces internucleotidicos vecinos conduciendo a Ia

isomerización. Cuando el THP se hidroliza parcialmente durante la detritilación en los sucesivos

ciclos de elongación del oligo. lo que se observa es la escisión del oligo en esa posición durante

el tratamiento en medio básico pero no se detectan migraciones de los enlaces fosfato.24 Sin

embargo, con el fin de verificar que Ia migración efectivamente no había ocurrido se trató el

oligo UMe1purificado con la enzima ribonucleasa A que cataliza la hidrólisis del enlace entre el

fosfato 3' de un pirimidin-ribonucleótido y el OH-5' adyacente. La reacción genera un fosfato

2',3' cíclico. el cual es entonces hidrolizado al correspondiente nucleósido fosfato-3’.22Siempre

22Struhl. K. en Current Prolocols Supplement81989, editado por John WiIIeyand Sons, lnc. Unidad 3.13, 1-2.


que Ia enzima reconociera Ia 2'-C-metiluridina, si se producía degradación del oligo en Ia

posición correspondiente a este nucleótido habría sido una confirmación que el oligo estaba

desprotegido y que no habrian ocurrido migraciones. En caso contrario no‘es posible extraer

conclusión alguna al respecto.

Para realizar el experimento se marcaron los siguientes oligonucleótidos en 5’ con 32P:

GCG WT “HT GCG

GCG TTT rUTT GCG

GCG TTT UMe'lTGCG

Los oligos se precipitaron de EtOH y se suspendieron en NaCI 100 mM y se incubaron

con la enzima ribonucleasa A durante 3 1/zh a 37 °C. Se analizaron por gel los productos y Io

que se observó fue que el control de ADN no fue cortado por la enzima, el oligo con Ia uridina

fue cortado en Ia posición correspondiente a Ia uridina cuando fue tratado con Ia enzima en

gran proporción y no se observó hidrólisis al ser incubado en NaCl 100 mM sin la enzima.

Finalmente, el oligo que contenía Ia 2'-C-meti|uridina no fue hidrolizado en ninguno de los dos

casos. Con lo cual, de este experimento se puede concluir que o bien la modificación es

resistente a la acción de esta enzima en las condiciones en las cuales fue llevado a cabo este

experimento, o bien se produjo migración o incompleta desprotección del oligo y, debido a

alguna de estas razones enzima no actuó.

Como se verá posteriormente los resultados obtenidos con las ribozimas que incluían

esta modificación indicaron que en estas condiciones el oligo deberia estar desprotegido, sin

producirse considerable migración del fosfato.

6.10-Síntesis de las ribozimas modificadas.

Beigelman y colaboradores23 publicaron un trabajo en donde estudiaban una ribozima

cabeza de martillo genéricamente activa y resistente a nucleasas y probaban diferentes

23Beigelman, L.; McSwiggen, J. A.; Draper, K. G.; González, C.; Jensen. K.; Karpeisky, A. M.; Modak, A. S.;Matulic-Adamic. J.; DiRenzo, A. B.; Haeberli, P.; Sweedle. D.; Tracz, 0.; Grimm. S.; ancott. F. E.; Thackray, V. G.;Usman. N. J. Biol..Chem. 1995, 270, 25702-25708.

Resultados. Síntesis de los oligonucleótidos. Capitulo 6 - 179

modificaciones en las posiciones U4y U7de la ribozima, que son las posiciones de la uridina en

el núcleo catalítico. Se eligióeste modelo para probarla efectividad de la nueva modificación.

En este trabajo, todas las posiciones para las cuales, de acuerdo a resultados previos

de actividad de ribozimas con desoxinucleótidos y nucleótidos modificados en diferentes

posicionesZ4-25n26el OH-2' no era importante para mantenerla actividad, se reemplazaron con 2’

O-metilribonucleótidos. Las posiciones del núcleo, en las que según estos trabajos era

necesaria la presencia del OH-2’.se dejaron como ribonucleótidos (ver figura 6.15).

NN sustratoNN

ribozima c

ZIOH AU A/ZOHC

N A NNNNN NGNCGIZ NNNNN

NNCNGA CGx U4

U

//7AG5 \ l20HTOH ZZOH TOH

2'OH

Figura 6.15. Ribozimagenéricamente activa y resistente a nucleasas. Se señalan las posiciones en las cuales lapresencia del OH-2' es importante para Ia actividad. Las posiciones 4 y 7 deben ser modificadas para incrementar

la estabilidad a nucleasas respecto dela ribozimanatural.

Esta ribozima es tan activa como la ribozima natural y sin embargo, es también, a pesar

de las modificaciones introducidas, tan lábil a nucleasas como la ribozima natural (es decir su

tiempo de vida medio en fluidos biológicos es el mismo que para la ribozima ARN). Esto es

porque las pirimidinas son mucho más susceptibles al ataque de endonucleasas que las

purinas y son las primeras en ser atacadas. Por eso es que para obtener ribozimas resistentes

2‘ Paolella, G.; Sproat, B. S.; Lamond, A. I. EMBO J 1992, 11, 1913-1919.25Pieken, W. A.; Olsen, D. 8.; Benseler, F.; Aurup. H.; Eckstein, F. Science 1991,254, 314-317.26Yang, J.; Usman, N.; Chartrand, P.; Cedergren, R. Biochemistry 1992, 31, 5005-5009.

Resultados. Sintesis de los oligonucleotidos. Capitqu 6 - 180

es indispensable modificar las uridinas del core catalitico.27-23Se introdujo, por consiguiente, Ia

2’-C-metiluridina en aquellas posiciones del core catalitico de ribozimas cabeza de martillo.

genéricamente activas y resistentes a nucleasas, donde el OH-2' de la uridina demostró ser

importante para Ia actividad. El resto de la secuencia fue sintetizado conteniendo 2'-O

metilribonucleótidos28con excepción de cuatro posiciones especificas en donde ribonucleótidos

naturales fueron conservados con el fin de mantenerla actividad catalitica (ver figura 6.16). Se

sintetizaron cuatro ribozimas modificadas, tal que se introdujo Ia urldina modificada:

a- en ninguna posición (ribozima control)

b- en Ia posición 4 (ribozima UMe4)

c- en la posición 7 (ribozima UMe7)

d- en ambas posiciones 4 y 7 (ribozima UMe47).

Además, se sintetizaron una ribozima toda ARN, como control positivo, y el sustrato de

ARN para realizar los estudios de actividad ¡n vitro.

‘Lasecuencia de los brazos laterales de Ia ribozima es complementaria a la región 5'

Iider/gag del genoma del HIV-1y Ia secuencia del sustrato sintético es Ia correspondiente a Ia

región de reconocimiento de Ia ribozima.—3'.5'

U A sustratoC G

ribozima C G\ GCA U

r ' hidrólisis NH

A A A u A/v I ÁA Gi: A ,1 . ‘. N oG 00cc GACAAAL-J fl

c ccoo , -o-rl=—oU A CUGUUUA-S o- CH,

G“ l t 9 °“

A“ CH" W 2'-C-Metr|uridina

Figura 6.16. Ribozimas modificadas. Azul: 2'-O-metilribonucleótidos, rojo: ribonucleótidos, verde: 2'-Gmeti|uridina ouridina. según el caso, se señalan, además, las posiciones en donde el OH-2es importante.

27Heidenreich, 0.; Benseler, F.; Fahrenholz, A.; Eckstein. F. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2131-2138.


Estas síntesis son complejas debido a que involucran tres clases diferentes de

nucleótidos, es una secuencia larga y Ia experiencia con sintesis de secuencias más cortas de

ADN con la nueva modificación demostraron tener inconvenientes. Su usaron, por Io tanto,

fosforamidtas de desprotección rápida y DCAcomo agente detritilante, con el fin de mejorar los

rendimientos. Las síntesis se llevaron a cabo de acuerdo al siguiente procedimiento, en dos

pasos. Se hizo una síntesis DMTr-Onen escala 1 pmol de la secuencia que se muestra a

continuación (que es la parte 3’-terminal, común para las cuatro ribozimas):

5' —rGAG GCC UCG AGG CCrG AArA CAG CCU - 3'

En rojo se muestran los ribonucleótidos, en negro los ?'-O-metilribonucleótidos y en

verde Ia 2'-C-meti|uridina. Se extendió el tiempo de acoplamiento a 900 seg para la 2'-C—

metiluridinay 600 seg para los otros monómeros y se programó el sintetizador para terminar el

oligo manualmente. La eficiencia de acoplamiento promedio obtenida fue del 98.5 % y el

rendimiento total fue de 71.7 %. Se pesó la fase conteniendo el oligo sintetizado y se dividiópor

cuatro. Entonces se realizaron 4 síntesis en escala 0.2 pmol de la fracción 5'-termina| de la

ribozima, que es diferente en las cuatro las ribozimas, con terminación manual y concentración

de UMe0.12 M (Ver tabla 6.V).

Se determinaron en esta caso las eficiencias de acoplamiento de cada paso (tabla 6.VI). Las

sintesis fueron llevadas a cabo exitosamente, y la eficiencia de acoplamiento de la nueva

modificación no difirió de la eficiencia de acoplamiento observada para las ribo y las 2'-O

metilfosforamiditas. Todas las fosforamiditas, que eran del tipo de química de desprotección

rápida, se desprotegieron con metilamina acuosa y, posteriormente, los OHs-2' de los

ribonucleótidos se deprotegieron con TEA.3HF, como se describió anteriormente. Los oligos

DMTr-Ondesprotegidos se pasaron por HPLC, observándose en todos los casos un pico

mayoritario.

29 Iribarren. A. M.; Sproat, B. S.; Neuner, P. J.; Sulston, I.; Ryder. U.; Lamond, A. l. Proc. Nail. Acad. Sci. U. S.A.


C. 5' - AUU UGU CCrU rGrArU (rG) - 3'

UMe4 5' - AUU UGU CCUMe rGrA rU (rG) —3‘

Ufifie7 5' - AUU UGU CCrU rGrAUMe (rG) —3'

UMe4? 5’ - AUU UGU CCUme rGrAUMe(rG) —3'

Tabla 6.V. Secuencias de las sintesis en escala 0.2 pmol de las partes5'-termina|es de las ribozimas. '

Después se trataron con ácido para eliminar el grupo DMTrdel extremo 5' y el grupo

THP. EI oligo control (a) que no contenía Ia nueva modificación se incubó en AcOH pH 3.5 - 4

durante 20 min y los restantes que contenían Ia 2'-C-meti|uridina se trataron con HCl pH 2.2

2.5, 8 h para eliminar además del _DMTrde 5', el THP del OH-2’ de la uridina modificada. Las

reacciones de detuvieron por neutralización con NH4HC03 (s) y los oligos se repurificaron por

HPLC, siendo el pico mayoritario el pico correspondiente a las ribozimas. Los rendimientos

obtenidos se muestran en Ia tabla 6.Vl. Después de las síntesis se marcaron las ribozimas con

32Py se corrió un gel para analizar su pureza. Y se observaron algunas bandas de menor PM al

correspondiente de las ribozimas, producto de secuencias truncas o de degradación, con lo

cual se confirmó que el HPLC no es una buena técnica para purificar oligorribonucleótidos o 2'

O-metiloligorribonucleótidosde un número de bases considerable.

Se hizo un ensayo preliminar de actividad de las ribozimas (descrito en capítulo 8) y,

como dio positivo para todas las ribozimas sintetizadas. se procedió a la purificación por gel de

las mismas. Con el fin de purificar las ribozimas por gel, para hacer los ensayos de actividad y

resistencia, y con el objeto seguir Ia purificación, detectando Ia radioactividad de las diferentes

fracciones, se marcó radioisotópicamente una porción de cada ribozima (del orden de 0.5 ODs).

1990, 87. 7747-7751.

Resultados. Sintesis de ios oiigonuoleótidos. Capitqu 5 - 183

Las ribozimas se marcaron, además, porque Ia visualización de las bandas radioactivas es

mucho más sensible que Ia exposición del gel a radiación UV.

Se corrieron los geles de poliacn'lamida,se cortaron las fracciones de gel que contenían

las bandas correspondientes a las ribozimas y se eluyeron como se detalla en Ia sección

experimental y luego se precipitaron con EtOH.

Los rendimientos de los diferentes pasos de Ia purificación, de acuerdo a la

radioactividad medida se muestran en Ia tabla 6.Vl|. (Se consideró como 100 % la

radioactividad del fragmento de gel que contenía Ia banda correspondiente a las respectivas

ribozimas.)

No fue realizado el lavado con EtOH en el caso de las ribozimas modificadas, porque

se consideró Ia purificación aportada por este paso no era significativa y disminuía en forma

relativamente importante el rendimiento de la purificación.


Eficiencia de C - UMe4 UMe7 UMe47

acoplamiento en cada 'paso

rG - - -

rU/UMe 100 100 100 100rA 98.0 93.6 97.0 96.7rG 98.2 90.6 97.3 97.8

rU/Ume 97.0 91 98.0 97.0C 97.6 92.2 97.3 97.6C n.d. n.d. n.d. n.d.U n.d. n.d. n.d. n.d.

G 98.0 94.7 98.0 98.0U 98.6 95.3 98.2 98.2U 100 95.8 98.4 100U 98.9 96.1 98.5 100A - - - _

Promedio de las 98.5 94.4 98.1 98.4eficiencias de

acoplamiento de lospasos medidos

Rendimiento dela 84.5 % 53.1 °/o 81.0 % 83.7 %

síntesis 0.2 pmol29

Rendimiento global de Ia 60.6 % 38.1 % 58.1 % 60.0 %ribozima3°

Tabla 6.VI.Eficiencias de acoplamiento y rendimiento de lassíntesis 0.2 pJTlOIy totales de las ribozimas.

29Rendimiento de las sintesis 0.2 pmol, solamente, osea del fragmento a partirdel cual las secuencias de lascuatro ribozimas difieren. (eficiencia promedioi. i = 11, número de pasos).

3°Rendimiento de las sintesis de las ribozimas desde el comienzo (rendimiento sintesis 1pmol ' rendimientosíntesis 0.2 pmol).

Resultados. Sintesis de los oiigonucieótidos. Capitulo 8 - 185

Ribozima Oligo bruto (ODs) Después primer DespuésHPLC (ODs) segundo HPLC

(ODs)

C 32.00 19.7 7.4

UMe4 24.7 11.1 10.0

UMe7 30.1 4.4 1.2

UMe47 22.7 5.5 1.5

Tabla 6.V|. Rendimientos finales de las sintesis ypurificaciones de las ribozimas.

RibozimasPaso de

purificaciónNatural C UMe4 UMe7 UMe47

Elución del gel 75 % 78 % 83 % 80 % 80 %

Precipitado con 75 % 78 % 81 % 80 % 80 %EtOH

Lavado 68 % 65 % no se realizó no se realizó no se realizó

Tabla 6.VII. Purificación de las ribozimas por gel de poiiacrilamida.

Resultados. Sintesis de los oligonucleótidos, Capitulo 8 » 186

En Ia figura 6.17 se muestra un gel analítico de las ribozimas purificadas que se usaron

para realizar los ensayos de actividad y de estabilidad de las ribozimas.

Escalera Natural control UMe4 UMe? UMe47

Figura 6.17. Gel de poliacrilamida 10 % 8 M urea de las ribozimas purificadas.

6.11- Conclusión.

Se realizaron exitosamente síntesis y purificaciones de oligos naturales y modificados.

Se optimizó en el laboratorio Ia sintesis de ARN usando química de desprotección rápida,

usando metilamína acuosa para desproteger las bases y TEA.3HFpara desproteger los OHs-2’.

Se prepararon y purificaron oligorribonucleótidos cortos, de 12 y 15 bases, y más largos hasta

de 36 nucleótidos (ribozima natural). Se sintetizaron secuencias mixtas conteniendo

desoxinucleótidos y ribonucleótidos; desoxinucléotidos y (2’S)-2’-C-metil-2’-C-desoxiuridlna,

para realizar los estudios de temperatura de fusión, y también se prepararon secuencias cortas

de 2’-O-metilribonucléotidos.

La nueva modificación fue introducida en oligonucleótidos. No se observó disminución

en la eficiencia de acoplamiento, respecto a las fosforamlditas convencionales, indicando Ia


estabilidad del nucleósido frente a las condiciones de síntesis. Sin embargo, la desprotección

de los oligonucleótidos conteniendo Ia modificación tuvo inconvenientes. EI grupo THP resultó

no ser lo suficientemente estable a las condiciones ácidas de hidrólisisdel grupo DMTr,a pesar

que los ensayos preliminares no permitían predecir esta acentuada Iabilidad. Se observó una

parcial degradación de los oligos, proporcional al número de posiciones que contenían la nueva

modificación, con bajo rendimiento en Ia síntesis. No obstante estas dificultades, fue posible

sintetizar y purificar oligonucleótidos de ADN con la modificación en una y tres posiciones.

Por otra parte, se sintetizaron las secuencias complejas y relativamente largas (36

bases) de n'bozimas modificadas y naturales. Estos oligos requieren series de van'os pasos de

desprotección y purificación. Logro introducirse la nueva modificación en estas secuencias y

obtener una cantidad suficiente de n'bozimasen condiciones adecuadas de pureza para realizar

los ensayos de actividad in vitroy estabilidad.

BASE

F

Y M90n bR:ENFigura 6.18. a. 2'-TOM-fosforamiditab. 2'-thp- fosforamidita

Para solucionar los problemas observados, una alternativa es cambiar el grupo

protector del OH-2’, por ejemplo, por TOM (triisopropilsililoximetilo)31(figura 6.18 a) que es un

grupo protector desarrollado recientemente, poco impedido estéricamente y que demostró ser

útil para proteger 2'. Este grupo se eliminaría en el mismo tratamiento con TEA.3HF que se usa

3‘ Pitsch, S.; Weiss, P: A.; Jenny, L.; Stutz, A.; Wu, X. HeI. Chim. Acta 2001, 84, 3773-3795.

Resultados. Síntesis de los olígonucleótidos. Capitulo 8 - 188

para desproteger los 2’-OH de los ribonucleótidos protegidos con TBDMS, con lo cual se

evitarían los inconvenientes relacionados con el tratamiento con el tratamiento ácido y se

ahorraría un paso de desprotección. O bien, otra posibilidad sería el uso de thp (1-(2

fluorofeniI)-4-metoxipiperidin-4-ilo)32para la protección del OH-2', en el caso que pueda ser

introducido en esa posición (figura 6.18 b). Bajo las condiciones fuertemente ácidas requeridas

para la remoción del DMTr,este grupo se encuentra protonado sobre el N1 y es estable a la

hidrólisis. Sin embargo, el nitrógeno permanece desprotonado a pH 2 - 2.5, y en estas

condiciones el thp puede ser hidrolizadoa Ia misma velocidad que el THP.

3?Beijer, B.; Sproat. B.S.; Rider, P.; Lamond, A. l. Neuner, P. NucI. Acíds Res. 1990. 18, 5143-5151.

Resuitados. Estudios de hibridización de los ciígonucleóidos modificados. Capitqu 7 - 189 —

Capítqu 7

Estudios de hibridización deoligonucléotidos modificados

7.1- Objetivos.

Un parámetro importante en el diseño de oligonucleótidos antisentido es Ia afinidad

por el ARN blanco. Se ha atribuido Ia mayor estabilidad de híbridos formados por ARN y

oligonucleótidos que contenían monómeros modificados en 2', como los derivados 2'-O-alqui|

o 2'-desoxi-2’F, respecto de los híbridos ADN/ARN,a Ia conformación C3‘-endo del azúcar de

estos análogos. Se supone que la hebra modificada se encuentra preorganizada en una

conformación consistente con la geometría de la hélice A adoptada por el ARN doble cadena.

Sin embargo, oligodesoxinucleótidos conteniendo (2’S)-2'-desoxi-2'-C-alquilnucleótidos,

demostraron tener una reducida afinidad por ARN,1-2a pesar de que estos nucleósidos

adoptan preferencialmente la conformación norte. Con el fin de estudiar Ia influencia sobre la

afinidad por hebras complementarias de ARN de la presencia de un átomo electronegativo en

2' en la cara o y de un grupo alquilo en 2' en la cara Bdel azúcar dexnucleótidos modificados,

se sintetizaron oligodesoxinucleótidos conteniendo un'dina, 2'-C-metiluridina y Ia (2’S)-2'

1Schmidt, C.; Bévierre M. 0.; De Mesmaeker. A.; Altmann, K. H. Bioorg. Med. Chem. Left. 1994, 4, 1969-1974.2 Cicero, D. 0.; Gallo, M.; Neuner, P. J.; Iribarren A. M. Tetrahedron 2001, 57, 7613-7621.

Resufïados. Estudios de hibridizacion de los Ciigonucieóidos modificados. Capitulo 7 - 1GB!

desoxi-2'-C-metiluridina y se analiza la afinidad por hebras complementarias de ADN y de

ARN de estos oligos.

7.2- Resultados.

Se sintetizaron los siguientes oligonucleótidos, como se describe en el capítulo seis

de esta tesis:

l- d(CGC AAA AAACGC) As ADN

II- r(CGC AAA AAACGC) AS ARN

III- d(GCG rrT TiTCGC) s ADN

lV- d(GCG) m dUMeTT(CGC) dUMe1

v- d(CGC) TdUMeTduMeruMe d(GCG) dUMea

VI- d(CGC)Trr urr d(GCG) rui

vu- d(CGC) TUTuru d(GCG) ru;

vm— d(GCG) rrr uMeTT(CGC) una

IX- d(CGC) TuMeT uMeTuMed(GCG) uma

(Lamentablemente del oIigo lX no se obtuvo cantidad suficiente para realizar los

experimentos de temperaturas de fusión.)

Se realizaron experimentos de estabilidad térmica de los híbridos formados por las

hebras lII a VIll (hebras "sentido") con las hebras complementarias de ADN y ARN, I y II,

respectivamente (hebras “antisentido"). Antes de realizar los experimentos de las

temperaturas de fusión, se midieron los espectros de las hebras IIIa VIIIen ausencia y en

presencia de las hebras lo II,para una más exacta determinación de Ia estequiometría. El tipo

de espectros obtenido se muestra en la figura 7.1.

Resultados. Estudios de hibridización de los oligonucleóidos modificados. Capitulo 7 - 191 —

M, oa

oi: " u

0.2 o A

or o:

oo 0.o

zoo ¡su sin sin .50 «¿o 539 ¡no 230 noo :sLo «¿o a? 55°

longituddc onda (nm) longlud do onda (nm)

a. Hebra III. b. Hebras I + III.

Figura 7.1. Espectro de absorción UV(201 -500 nm).

Los experimentos de temperaturas de fusión se realizaron usando una rampa de 0.5

°C / min, no observándose diferencias significativas si la rampa usada era de 1 °C / min (datos

no mostrados). La cámara que contenía la cubeta fue secada con una corriente de N2 para

evitar Ia condensación de vapor de agua a baja temperatura y a las muestras se les agregó

una capa de parafina en la superficie para prevenir la formación de burbujas y Ia evaporación

de agua. La parafina no cambió los resultados de las temperaturas de fusión, pero mejoró Ia

adquisición de datos a altas temperaturas.

Todas las hebras sentido hibn'dizaroncon sus hebras complementarias. tanto de ADN

como de ARN, mostrando una transición cooperativa, evidenciada por las derivadas de las

curvas de fusión obtenidas. La diferencia de absorbancia observada fue en todos los casos

similar (de e 0.87 - 0.93 a '- 1.06 - 1.09 para los híbridos con la hebra “antisentido” de ADN y

de - 0.84 - 0.86 a - 1.03 —1.10 para los híbridos con la hebra “antisentido” de ARN). Un perfil

de temperatura de fusión tipico se observa en Ia figura 7.2. Las temperaturas de fusión

informadas (tabla 7.I) constituyen los puntos de inflexión de las curvas obtenidas y se

obtuvieron a partir de los máximos de Ia primera derivada de las curvas de absorbancia vs

temperatura (en la figura 7.3 se pueden ver algunas de las derivadas obtenidas).

Resultados. Estudios de hibridización de los oligonucleóidos modificados. Capitqu 7 - 192 —

1.10 _

1.05 _

Abs.

1.00 _

0.95 _

0.90 l l l l lzo 4o so eo 100

temperatura (°C)

Figura 7.2. Curva típica de desnaturalizacíón térmica de híbridos doble cadena.(Hebras l + III).

h. c d.

w,: 9 9‘ o0|)

2 9 9' .

v 9 9k 05 a. L y 9 Y Y

h; Nn :9 f'ïo Í E.‘ 111° TIIu .

i 9 a oN1 o '

i ' 9 lM a o o o _Jm a É 3 3.0 o II) I‘W o a) o o o ¡mUnam Wed mua-amm '

Figura 7.3. Derivadas de la curvas abs. vs temperatura. El máximo de la curva corresponde a Iatemperatura de fusión. a. I+ III.b. Il+ III.c. II+ IV. d. II+ VIII.

Resultados, Estudios de hibridización de los oligonucleóidos modificados. Capitqu 7 - 193 —

emperatura emperaturaOligo de fusión con ATt(ADN)a de fusión con AT1(ARN)b

ADN ARN

(N + l) (N + II)

Tabla 7.l. Tc Temperaturas de fusión de los oIigonucIeótidos Illa Vlll y la hebra complementaria deADNo ARN. aMimi): diferencia de temperaturas entre el dúplex formado por ADNrmdficado/ADNy el

ADNnatural/ADN(ATKADN)= Tl - Tlfllld». h ATuARN):diferencia de temperaturas entre el dúplex formado por

ADNn'Iodifraih/ARN y el ADNnau-ai/ARN (ATr(ADN)= Tr - Ti(IIM|)).

En todos los casos las afinidades de los oIigonucIeótidos modificados por

hebras de ADN o ARN complementarias fueron menores que las de los

oligodesoxinucleótidos naturales, considerando, incluso, que la dU suele presentar

una desestabilización de - 0.5 °C por sustitución con relación a la timidina.3 En el

caso de Ia desoxiuridina con el metilo en B (dUMe),se observa que Ia disminución de

Ia temperatura de fusión es de alrededor de 10 °C / modificación para Ia afinidad por

ADN y de 8 °C / modificación para la afinidad por ARN respecto del oligonucleótido

sin modificar, manteniéndose esta proporción, ya sea que se hayan introducido una o

tres modificaciones. La más acentuada disminución en las estabilidades de los

híbridos fue observada, sorprendemente, en el caso de la introducción de la uridina

en una sola posición en el oligodesoxinucleótido, reduciéndose la temperatura de

fusión de los híbridos formados con ARN y con ADN en 18 - 19 °C. Mientras que al

.,:. A r: . ‘A ' ‘-;,';_ :' ' H ; ¿A I“ "r, -. 'x‘estudias oe hlbaidmachi’ioe loso wn. Óa.tuamtdb/ - iuLrE1 (o _) L EL m g) (2L C) cn É (7 D. :1 r3 {U L'|

ser introducida en tres posiciones, la temperatura de fusión cayó solamente en 15.8

°C respecto del híbrido ADN doble cadena y nada más que 5.7 °C respecto del

heterodímero ADN/ARN, indicando que el efecto en la disminución de las

temperaturas de fusión no es en este caso acumulativo. Concemiente a la 2'-C

metiluridina, la temperatura fue en ambos casos del orden de 12 —13°C menor

respecto a los híbridos sin modificar.

7.3- Discusión.

La alta afinidad y especificidad del apareamiento de bases tipo Watson y Críck

hizo de los oligonucleótidos atractivos compuestos para su aplicación en diagnóstico

y como agentes terapéuticos. Se han desarrollado diversas modificaciones con el fin

de mejorar la bioestabilidad de los oligonucleótidos y con el fin de mejorar la

penetración celular y la distribución celular y en tejidos. Las modificaciones deben ser

tales que mantengan o mejoren las características de hibridización del ADN natural,

ya que el mecanismo de acción de los oligonucleótidos antisentido requiere Ia

hibridización especifica del oligonucleótido con su sitio complementario en el ARNm

blanco. La importancia de la hibridización puede demostrarse por la correlación

observada entre Ia actividad antisentido en ensayos en cultivos de células“:5 y en

estudios in vivoficon Ia afinidad por hebras complementarias y con las temperaturas

de fusión de los oligonucléotidos con hebras de ARN complementarias. Asi, Ia

estabilidad del dúplex es un rasgo importante a tener en cuenta en el diseño de

oligonucléotidos antisentido.

Rigurosamente, el AG°37es el parámetro apropiado para evaluarla afinidad de

3 Freier, S. M.; Altmann, K. H. Nucl. Acids Res. 1997, 25, 44294443.

4 Baker, B.F.; Lot, S. S.; Condon, T. P., Cheng-Floumoy, 8.; Lesnik, E. A.; Sasmor, H. M.; Bennet, C. F. J. Biol.Chem. 1997, 272, 11994-12000.

5 Wagner, R. W.; Matteuci, M. D.; Lewis, J. G.; Gutierrez, A. J.; Moulds, C.; Froeler, B. C. Science 1993, 260, 15101513.

Resultados. Estudios de hibridización de los oligonucleóidos modificados. Capitulo 7 - 195

Ia hibridización, ya que representa Ia diferencia de energía libre entre el híbrido y la

hebra simple. Se ha demostrado, sin embargo, a partir de consideraciones

tennodinámicas, que existe una correlación entre AAG°37 y la diferencia de

temperaturas de fusión (ATi),en el caso que esta diferencia sea menor que 25 °C y

que los cambios en AH sean menores que el 25 %. Esta correlación ha sido

observada experimentalmente.7 Dado que las determinaciones de AG°37 son más

complejas y bastante sensibles al método de analisis y como las Trs pueden ser

precisamente medidas, las TrSy ATrs han sido usadas para evaluar el efecto de las

modificaciones sobre la estabilidad de híbridos.

Dobles hélices ADN/ADN se sabe que existen en varias familias de

conforrnaciones, adoptando generalmente la forma B bajo condiciones fisiológicas

donde el azúcar es C2'-endo. En contraste, Ia conformación de los duplexes

ARN/ARN se encuentra restringida a Ia forma A, la cual está caracterizada por un

plegamiento del azúcar C3’-endo. Con los híbridos ADN/ARN,hay alguna flexibilidad

inherente a las hebras de ADN, según las condiciones o Ia secuencia, la hebra de

ADNpuede adoptar una forma A, o intermedia ente A y B, para adaptarse a la hebra

de ARN. En general, los híbridos de ARN (forma A) son más estables que los de ADN

(forma B). La conformación del azúcar aparece como un principal determinante en la

forma A de los duplexes de ARN. Estudios previos atribuian la mayor afinidad por

hebras complementarias de ARNde oligonucleótidos conteniendo, por ejemplo, 2'-O

alquil o 2'-desoxi-2'-fluor derivados, a que el equilibrioconfonnacional del azúcar de

estos monómeros se encuentra desplazado hacia Ia conformación norte, consistente

con la geometria A de los duplexes de ARN.“ En contraste al incremento de Ia

estabilidad de los híbridos observados con sustituyentes electronegativos en 2’,

5 Monia, B. P.; Sasmor, H.; Johnston J. F.; Freier, S. M.; Lesnik, E. A.; Muller, M.; Geiger, T.; Altmann, K. H.;Moser, H.; Farbbro, D. Proc. Nafl. Acad. Sci. U. S. A. 1996, 93, 15481-15484.7 Cummins, L. L.; Owens, S. R.; Risen, L. M.; Lesnik. E. A.; Freier, S. M.; Mc Gee, D.; Guinosso, C. J.; Cook, P. D.

Nucl. Acids. Res. 1995, 23, 2019-2024. ,9 Lesnik, E. A.; Guinosso, C. J.; Kawasaki, A. M; Sasmor, H.; Zounes, M.; Cummins, L. L.; Ecker, D. J.; Cook, P. D.

Freier, S. M. Biochemisfry 1993, 32, 7832-7838.

. i‘ "m. ,4: ,1 H1, ':' _:' lPH": r‘" ,—.‘‘I .Ap Q fly .r|r.|*’, r' HFRe.) 2'4qu -504Luk4.) ¿te tu..."m:.¿'1;.,.C:I ‘Cl “me A . ¡”"1”. . 'r'; l A ha '.¡ 7 ,I‘U";uïflulïq’ichCVD mociïscaccs. capitulo .. - lar. «

modificaciones con azufre en 2' o con 2’-a alquil sustituyentes resultaron ser muy

desestabilizantes.7 La desestabilización en estos casos fue explicada por la tendencia

de estos sustituyentes de desplazar el equilibrioconfonnacional hacia el plegamiento

C2’-endo no compatible con la conformación encontrada en las dobles hélices de

ARN.

EI razonamiento es que las modificaciones con conformación norte en un

oligonucleótido, podrian resultar, al hibridizarse con el ARNm blanco, en doble hélices

con “mayor pureza confonnacional". Estas modificaciones preorganizarían la hebra

antisentido para unirse al ARN y formar una doble hélice A, en oposición a los

híbridos ARN/ADN que adoptan posibles variantes de formas A/B, mejorando Ia

afinidad por el ARN.

En ese sentido, es interesante el caso de los 2'-(>anuil-2'-desoxinucleótidos.

Oligonucléotidos conteniendo (2’S)-2'-C-metil-2’-desoxinucleótidos hibridizan mejor

que Oligonucléotidos conteniendo. los (2’R)-2’-C-metiI-2'-desoxiderivados}2 debido

seguramente a Ia conformación del azúcar. (2'R)-2'-GAlquiI-2’-desoxinuc|eótidos

adoptan, como ya se mencionó, la conformación sur; mientras que en los isómeros

2’S es observada la conformación norte, consistente con el ARN. La conformación del

azúcar fuerza a que el híbrido adopte Ia forma B; no obstante, esta estructura es

incompatible con Ia presencia de un grupo voluminoso en posición 2' de la cara a del

azúcarEI caso es que, aunque éstos últimos adopten la conformación norte, Ia

afinidad que demuestran por ARN. es o más baja o levemente más alta que las

secuencias complementarias de ADN,dependiendo de Ia secuencia y el número de

modificaciones introducidas. Se ha atribuido esta relativamente baja afinidad a

interacciones estéricas desfavorables entre el metilo y las bases del nucleótido

adyacente en 3' (H6 de pirimidinas y H8 de purinas) dentro de la estructura del dúplex

del tipo A.

Por otra parte. la mayor estabilidad de híbridos de ARN ha sido atribuida a Ia

9 Egli, M. Angew. Chem. Int. Ed. 1996, 35, 1895-1909.

Resultados. Estudios de hibridización de los oligonucleóidos modificados. Capitulo 7 - 197 —

presencia del OH-2', debido, más allá de fijar Ia conformación del azúcar, a que media

en puentes de hidrógeno intracadena 3’—>5', 02'-----04', y fundamentalmente a su rol

en la hidratación de la doble hélice. La hidratación se ha sugerido que es el principal

factor de la mayor estabilidad entálpica de los híbn’dos de ARN, respecto a los de

ADN. El OH-2’ articula la red de moléculas de agua en la gruta menor y también él

mismo se hidrata extensivamente.10 Tal vez, sea tanto o más importante que Ia

conformación del azúcar, la presencia de un átomo electronegativo en 2', capaz de

formar puentes de hidrógeno.

A pesar de que la aplicabilidad de los 2'-C-meti|nuc|eótidos no estaba centrada

en su potencial actividad antisentldo, sino como ya se dijo, en su uso en análogos de

ARN en posiciones específicas donde fuera necesaria Ia presencia del OH-2', se

consideró era interesante estudiar sus propiedades de hibridización.EIfin era analizar

si la influencia de la presencia del OH-2' introducia una estabilidad adicional respecto

del análogo 2'- desoxi. Con eso en mente, se sintetizaron secuencias de

oligodesoxinucleótidos, conteniendo en una o en tres posiciones, uridina, (2’S)-2'-C

metil-2'-desoxiuridina y 2'-C-metilun'dina. Lamentablemente, Ia 2'-C—metilun'dina,no

pudo ser introducida en tres posiciones, debido a los bajos rendimientos de síntesis y

a problemas con el sintetizador automático. Sin embargo, se ha sugerido que, en

general, propiedades de hibridización de oligonucleótídos que contenían una sola

modificación fueron predictivos de las propiedades hibndización de oligonucléotidos

uniformemente modificados.3 Por Io tanto, fue determinada Ia estabilidad de híbridos

formados por estos oligos y hebras complementarias de ADNy ARN.

Los resultados obtenidos muestran que la estabilidad de híbridos formados por

los oligonucleótídos modificados y hebras complementarias fue más baja que la de

oligodesoxinucleótidos de la misma secuencia. En la serie de una modificación, rU1

fue el oligo que demostró peor afinidad por sus hebras complementarias. Sin

embargo, al introducir tres un'dinas; si bien el AT: siguió siendo negativo, el ATr/

1°Egli, M.; Portmann, S.; Usman. N. Biochemísfry1996. 35, 8489-8494.

- . '¿ I-a. .,.." i ' "_ 'Á í " v ‘ " ' 'ÍÏ > A .'-.. _ 4a.?.1" I F. c . .. i n 'j‘ I- .rrrt' ,nfi- ,- r.:, me ¡agfifi" nn». rn 1A?! .Ir‘crvn l ,q l _ e ,lhub-.1 ¿430.2 EtLuvrob u: : luliqlLuqu x“. .L.Qu .‘4\,!,.!u!LuIC-JS n.L;u'xI\/..<'..uo. l.'_.s. r ¡JC.4

modificación fue mucho menor. Este hecho contradiría lo señalado previamente que

una sola modificación en un oligo es representativa de las propiedades de oligos más

extensivamente modificados, dado por hecho, además, en el otro extremo, que los

híbridos ARN lARN son los más estables. Distinto es el caso de dUMepara quien el

ATl/ modificación fue constante. Esto sería una indicación de alguna perturbación

(2’S)-2'-C-metil-2’-desoxinucleótidos en la doble hélice que se mantiene

independientemente del número de modificaciones. Con todo, un estudio previo

realizado por nuestro grupo con un oligo (dUMe)11mostró ATfSpositivos.2 En el caso

de UMe,no se puede saber si el efecto se mantiene proporcionalmente o no, es decir,

si el AT1/ modificación es o no constante, dado que sólo pudimos analizar UMet.Los

resultados obtenidos indican que la ausencia del grupo OH-2' en este caso no parece

ser Ia causa de Ia baja afinidad demostrada por los (2'S)-2'-C-metiI-2‘

desoxinucleótidos, sino más bien Ia presencia del metilo que debe perturbar en

alguna medida Ia formación de la doble cadena, dado que UMe1hibridiza peor que

dUMe1.Sin embargo, en vista de las Tis observadas con rU1y rUa, sería importante

analizar lo que sucede al introducir 2'-C-meti|un’dina en más posiciones de un

oligonucleótido.

De todas formas, modificaciones que concluyentemente muestran un

incremento en las afinidades por los híbridos, como los 2'-O-a|quil o 2'-fluor

derivados, muestran ATf que son siempre positivos, independientemente de la

secuencia y el número de modificaciones introducidas. Dado Io cual, podríamos decir

que estas modificaciones, interfieren en la estabilidad de la doble hélice A de alguna

forma, y en principio estos 2'-alquil desoxi y nbonucleótidos no muestran

extraordinarias propiedades de hibridización. Sin embargo, un hecho notable es la

gran estabilidad frente a nucleasas de los (2'S)-2’-desoxi-2'-C-metilnucleótidos11con

Io cual no habría que desestimar su potencial aplicabilidad en el campo antisentido.

Uno o más de los siguientes factores podrían ser los causantes de la baja estabilidad

1‘ Iribarren, A. M.; Cicero, D. 0.; Neuner P. J. Antisense Res. &Dev. 1994, 4, 95-98.

Resultados. Estudios de hibridización de los oligonucleoio‘os modificados. Capitulo 7 - 199

de los híbridos, tanto de los 2'-alqui| desoxi y ribonucleótidos:

La presencia del metilo que interfiere en el apilamiento de las bases,

como ya se ha sugerido.1

Ambos monómeros son muy rígidos y esto podría interferir en la

formación de los híbridos. Una cierta flexibilidad de los nucleótidos

podría estabilizar Ia doble hélice.12

EI metilo hidrofóbico también podría perturbar la red de hidratación de

la doble hélice.

7.4- Conclusión.

Los resultados obtenidos indican que las secuencias modificadas no

introdujeron un incremento en las afinidades por hebras complementarias en relación

con los oligodesoxinucleótidos de Ia misma secuencia. La presencia del OH-2' no

introdujouna gran mejora respecto a la afinidad con relación ala (2'S)-2'-desoxi-2'-C

metiluridina.Con lo cual, aparentemente el metilo desorganizaria en alguna medida la

doble hélice. Sin embargo, para poder obtener resultados concluyentes sería de

importancia estudiar oligonucleótidos más extensivamente modificados.

Contrariamente al hecho argumentado que la introducción de una sola modificación

en oligodesoxinucleótidos sería representativa de los efectos generales que

produciría esa modificaciónsobre la afinidad por hebras complementarias,7 en base a

lo observado con rU1 y rU3, sugeriría que el entorno en el cual las modificaciones

fueron introducidas es determinante en la estabilidad del híbrido. Ya ha sido

propuesto previamente, que no es lo mismo introducir una modificación en un entorno

de desoxinucleótidos que en un entorno de nucleótidos modificados, en cuanto a Ia

afinidad por la secuencia de ARN complementaria.B

A pesar de Ia importancia que se le ha dado a la estabilidad de los híbridos

Resultados. Esudcs de hibrïdizaceonde ¡cs :lígonxclecidcs moditicados. Capitulo ./ - 20';

para el diseño de oligonucleótidos antisentido, cabe señalar que la primera

generación de esta clase de drogas consiste en los fosforotioatos cuyas TlS son

menores que la de los híbridos ADN / ARN. Su difundido uso reside, además de

activar la Rnasa H, en la importancia de la bioestabilidad de estos análogos. Sin

embargo, han sido desplazados, principalmente debido a que muestran interacciones

inespecificas con proteinas por Ia presencia del azufre. En este sentido la gran

estabilidad de los (2’S)-2'-desoxi-2'-C-metiloligonucleótidos es un punto a tener en

cuentas para su potencial uso corno agente antisentido, a pesar de Ia reducida

afinidad por hebras complementarias.

1?Tereshko. V.; Portmann, 8.; Tay. E. C.; Martin. PzNatt, F.. Altmann, K. H.; Egli, M. Biochemístry 1998, 37, 1062610634.

Resulta-dos. Actividad y estabilidad de las ribozimas modificadas. Capítulo 3 - 201

Capítulo 8

Actividad y estabilidad de lasribozimas cabeza de martillo

modificadas.

8.1- Objetivos.

En este capítqu se muestra el estudio de la actividad ¡n vitro de las ribozimas

modificadas cuya preparación se describió en el capitqu seis y los estudios de estabilidad de

las mismas en diferentes fluidos biológicos.

8.2- Diseño de las ribozimas modificadas.

El objetivo de esta tesis consiste en el desarrollo de un nuevo análogo de ARN

modificado en el azúcar y que conserva el OH-2', los 2'-C-meti|nucleótidos. La hipótesis es que

el OH-2’ muestra en estos monómeros Ia misma orientación que en los ribonucleótidos

naturales y. por lo tanto, puede reproducir las interacciones tercian'as del ARN mientras que Ia

presencia del metilo brindaría estabilidad frente a nucleasas. Para contrastar estas hipótesis en

un sistema biológico concreto, se eligió como modelo de estudio la ribozima cabeza de martillo,

por ser una molécula de ARN para la cual el correcto plegamiento es esencial para la actividad

,J t rm" 'l '. mpg: ',..' l ,.,_ ; A n.” A“atados. nothlüílÜ y esas! Cai. ce .c: nbozmas mccmc. das.

y porque resulta una molécula atractiva para su aplicación en terapia génica. Con ese fin, se

sintetizaron las ribozimas cabeza de martillo modificadas que contenían la 2'-C-metiluridina en

las posiciones de la un'dina del núcleo catalitico en donde la presencia del OH-2’es importante.

Las ribozimas fueron diseñadas tal que los brazos laterales, que son las secuencias de

reconocimiento del sustrato, tuvieran siete nucleótidos de longitud cada uno, de forma que la

longitud total de la región de apareamiento con el sustrato fuera de 14 nucleótidos. Esta longitud

es lo suficientemente larga como para brindar especificidad a la ribozima. que hidrolizará una

sola especie de ARNm, y lo suficientemente corta como para permitir una rápida disociación de

los productos y que la nbozima pueda actuar catalíticamente. In vitro, la extensión de la región

de reconocimiento más allá de 17 pb implica una dramática disminución de la actividad,

posiblemente debido a que la disociación del producto se vuelve el paso determinante.1 Por otra

parte, el uso de largas secuencias de reconocimiento resulta en una fuerte unión del sustrato, lo

cual implica una mayor tolerancia de errores en la complementariedad del complejo ribozima

sustrato, y reduciendo la especificidad de la ribozima. Además, al aumentar la longitud de la

nbozima aumenta la probabilidad de formación de estructuras secundarias alternativas de la

nbozima que dificultan la unión al sustrato, y disminuye el rendimiento obtenido en la síntesis en

fase sólida.

La secuencia fue complementaria a la región 5'-Iider/gag del virus HIV-1.Se eligió esta

secuencia porque ribozimas dirigidas contra este blanco han probado ser efectivos inhibidores

de la replicación del HIV-1.2Es más, una n'bozima de cabeza de martillo ya se encuentra en

ensayos de fase 2 para ser aprobada como droga contra el HIV-1.3

Un análisis de la literatura indica que el patrón principal de degradación de las

ribozimas en suero es consistente con la hidrólisisde los enlaces fosfodiéster en las posiciones

pin'midínicas,debido a la acción de enzimas endonucleasas. Por lo tanto, estos sitios deben ser

modificados para lograr un incremento en la estabilidad.

1 Berttrand, E. L.; Rossi, J. J.; EMBO J. 1994. 13. 2904-2912.2 Honnes, R.; Homann, M.; Oelze, l.; Maschall, P.; Tabler, M; Eckstein, F.; Sczakiel. G. NucIAcids Res. 1997. 25.769-775.

3 Usman, N.; Blatt, L. M. J. Clin. Inv. 2000,106, 1197-1202.

Resultados. Actividad y estabilidad de las ribozimas modificadas. Capitulo 3 - 203

Estudios previos llevados a cabo con ribozimas modificadas4-5-5-7sugerían que una

estrategia de modificar las ribozimas uniformemente no era aplicable, en principio porque era

necesario preservar un nivel razonable de actividad, y para ello era necesario dejar unos

residuos del núcleo sin modificar.

La aproximación aquí usada para la modificación de Ia ribozima está basada en un

trabajo de Beigelman y colaboradoresa, que resolvieron el problema del balance entre la

resistencia a nucleasas y la actividad catalítica. Los autores diseñaron una ribozima que es

genéricamente activa y genéricamente resistente a nucleasas. EI modelo comprende una

secuencia quimera compuesta principalmente por 2’-O-alqui|ribonuc|eótidos y que contiene un

conjunto mínimo de pum-ribonucleótidos, er, rAs, er, an y rA15.1.La optimización del

balance resistencia / actividad en este diseño requiere la modificaciónselectiva de las un'dinas 4

y 7. Si las posiciones de estas uridinas se mantienen como ribonucleótidos, Ia actividad y

resistencia a nucleasas son las mismas que para la ribozima natural. Por ello, este diseño

permite evaluar los efectos sobre la estabilidad y Ia actividad de la nueva modificación

específicamente en estas posiciones críticas de Ia ribozimacabeza de martillo.

Se usaron 2'-O—metilribonucleótidosen todas las posiciones, excepto las siete

posiciones en que dicha sustitución afectaba en forma considerable la actividad, con el fin de

incrementar la resistencia a nucleasas de las ribozimas. Esta modificación es químicamente

estable, los 2'-0anulloligorribonucleótidos son fáciles de sintetizar, exhiben mínimas

interacciones no específicas, se unen fuerte y específicamente a hebras de ARN

complementarias y, por último, Ia conformación del azúcar es como la de los ribonucleótidos,

C3'-endo, con lo cual podrían reemplazarse selectivamente varias de las posiciones del núcleo

donde esta conformación es requerida, sin disminución de la actividad.

4Yang, J.; Usman, N.; Chartrand. P.; Cedergren, R. Bíochemistry 1992, 31, 5005-5009.5 Paolella. G.; Sproat, B. S.; Lamond, A. l. EMBO J. 1992, 11, 1913-1919.5 Pieken, W. A.; Olsen, D. B.; Benseler. F.; Aurup, H.; Eckstein, F. Science 1991, 253, 314-317.7Shiyama, T.; Nishikawa, F.; Nishikawa, S.. Taira. K. Nucl. Acids Res. 1993. 21, 2605-2611.3 Beigelman, L.; McSwiggen, J. A.; Draper, K. G.; González. C.; Jensen, K.; Karpeisky, A. M.; Modak, A. S.; MatulicAdamic, J.; DiRenzo. A. 8.; Haeberli, P.; Sweedle, D.; Tracz, D.; Grimm, S.; Vlfincott,F. E.; Thackray, V. G.; Usman,N. J. Biol. Chem. 1995, 270, 25702-25708.

3 Iribarren, A. M.; Sproat, B. 8.; Neuner. P. J.; Sulston, I.; Ryder, U.; Lamond, A. l. Proc. Nati. Acad. Sci. U. S.A.1990, 87, 7747-7751.

EI mínimo requerimiento encontrado usando 2'-O-meti|ribonucleótidos, mantiene a las

adenosinas de las posiciones 6 y 15.1 sin modificar, además de las otras posiciones

(guanosinas 5, 8 y 12 y las uridinas 4 y 7) para las cuales se habian identificado en el estudio de

rayos X interacciones particulares que involucraban sus OHs-2' (ver capitulo 3).9 Esta

inconsistencia aparente, puede deberse a que la cristalografia de rayos X bn'nda información

sobre la estructura del estado basal de complejos ribozima-sustrato, mientras que estudios

cinéticos usando ribozimas con nucleótidos modificados permiten obtener información sobre la

estructura del estado de transición. El pasaje del estado basal al estado de transición puede

involucrar la formación de puentes de hidrógeno especificos.

8.3- Estudios de actividad in vitro de las ribozimasmodificadas.

Primeramente, se realizó en un ensayo preliminar, con el fin de analizar si las ribozimas

modificadas eran o no activas. Se incubaron en el buffer de reacción cada una de las ribozimas,

obtenidas después de la segunda purificación por HPLC, con el sustrato sintético de ARN

marcado radioactivamente con 32Pen el extremo 5'. Los resultados se observan en la figura

8.1, donde puede se ver el producto obtenido luego de incubar el sustrato con las ribozimas

sintetizadas durante 30 min en el buffer de reacción (ver figura 6.16). Como se puede observar,

todas las ribozimas preparadas presentaron actividad hidrolítica, indicando que Ia modificación

introducida permitía mantener eI plegamiento y, por consiguiente, la actividad de las mismas.

Con Io cual, tenia sentido purificar por gel las ribozimas y llevar a cabo estudios cinéticos más

detallados de actividad.

9 Pley, H. W.; Flaherty, K. M.; McKay, D. B. Nature 1994, 372, 68-74.

Resuitados. Actividad y estabilidad de ias ribozimas modificadas. Capitulo 3 4205

P1

control UMe4 UMe7 UMe47

Figura 8.1. Actividad in vitrodelas ribozimas.Se observan las bandas correspondientes al sustrato (S) y al producto (P1)marcados. to:antes del agregado de

Mg”, tn: resultado de incubar la mezcla de reacción durante 30 min a 37 °C. (M:marcador de peso molecular (unabanda cada 10 bases).

Se muestra en el siguiente esquema una descripción cinética mínima de la catálisis

intennolecular de las ribozimas:

s+EÏ >SE - P1P2E

3 P1E+P2' E+P2+ P1X-3

K1

*__—.. ' ke

XP2É+P1—LE+P1+P2

S = sustrato, E = ribozima, P1 = producto-5’, P2 = producto-3’.

k1, k3 y k.s, k4; y k4 son las constantes de asociación del sustrato, dei P2 y del P1

respectivamente. Estas constantes están bien descritas por el comportamiento del ARN doble

cadena.

"pm Ring hdr. :4, A ; 'Zv ,' 1.. ¡No ,;' ' .. :t'n .4 a fi n. ¡y.hacabados. null/mdd y :s-ecid c.15:5: “COZilT‘xaat‘fiïjdnlcauab.capulo c - wc- u)

k-1,k3y ke, k5 y k4 representan las constantes de disociación del sustrato, del P2 y del

P1 respectivamente. Y también son similares a las constantes de apertura de hélices

determinadas para cortos ARN.

k2 es la constante del paso químico que refleja la velocidad de hidrólisis del enlace

fosfodiéster catalizada por la n'bozima y es independiente de la longitud de los brazos laterales

de unión al sustrato. Suele adoptar valores de 0.5-1.5 min-1 bajo condiciones estándar de

reacción (25 °C, MgClz10 mM, pH 7.5). Es sobre esta constante que nuestra modificación tiene

influencia en las ribozimas sintetizadas y es la magnitud de este efecto lo que se quiere

cuanüflcar

k.2es la constante de ligamiento, o sea de la reacción inversa. Su valor suele ser 0.008

min-1, indicando que la ribozima cabeza de martillo favorece fuertemente la hidrólisis. En los

experimentos despreciaremos la velocidad inversa. con respecto a la directa que es mucho más

rápida.

Para hacer el estudio cinético ¡n vitro de las ribozimas se usó el sustrato marcado

radioactivamente. Se trabajó en condiciones de recambio simple, esto es con exceso de

ribozima respecto a sustrato, tal que cada molécula de sustrato es degradada por una molécula

diferente de n'bozima y la velocidad de hidrólisis es independiente de la liberación de producto.

En estas circunstancias es posible calcular la constante cinética del paso quimico de la reacción

de hidrólisis (k2).Como la modificación se encuentra en el núcleo de la ribozima, es de esperar

que no afecte los procesos relacionados con Ia hibridación y disociación de la n'bozima al

sustrato y/o los productos, sino que tenga influencia solamente sobre la catálisis. Para que lo

que se observara fuera exclusivamente este proceso (k2),se realizó previamente un paso de

preapareamiento, el cual consiste en desnaturalizar juntos la ribozima y el sustrato elevando la

temperatura a 95 °C y dejar que la mezcla llegue a temperatura ambiente lentamente. De esta

forma se analiza la reacción con el complejo ribozima-sustrato ya formado (es decir k1,no forma

parte del análisis), y como hay exceso de ribozima, se supone que todo el sustrato se encuentra

unido a la ribozima y, al monitorearse la reacción de hidrólisis del enlace fosfodiéster en geles

desnaturalizantes, la disociación de los complejos ribozima-sustrato y ribozima-producto no

interfiere en el análisis cinético y lo único que se cuantifica es la velocidad del paso quimico.


Bajo condiciones de recambio simple la velocidad de hidrólisis observada deberia aproximarse

a una constante de velocidad de pseudo-primer orden para la conversión del complejo ribozima

sustrato en producto.

La reacción se comenzó por agregado de MgClzhasta una concentración 10 mM;el ion

Mg" es un cofactor necesario para la actividad de Ia ribozima y 10 mM es Ia concentración

óptima de magnesio para Ia actividad de la ribozima. Estando ya la ribozima y el sustrato

apareados, Io único que se analiza es Ia hidrólisis del sustrato catalizada por Ia ribozima (Ia

unión de Mg" al complejo ribozima-sustrato es mucho más rápida que el paso químico y puede

suponerse que ocurre casi instantáneamente en comparación con el proceso químico que se

quiere estudiar). El buffer de reacción contenía, además,

Tris-HCI para controlar el pH = 8,

NaCI 100 mM para imitar las condiciones de fuerza iónica existentes en las células,

EDTA 1 mM, porque se observó que se producía algo de reacción en el paso de

preapareamiento debido a las trazas de Mg“ existentes en el agua y fue necesario

agregar 1 mM de este agente complejante para evitar que la reacción ocurra antes del

agregado de magnesio.

La temperatura fue de 25 °C porque a 37 °C, que es la temperatura fisiológica, la

reacción de los controles era demasiado rápida para ser posible la realización de los

experimentos.

Se tomaron alicuotas a diferentes tiempos y las reacciones se detuvieron con una

solución desnaturalizante (8 M en urea) y se dejaron en el freezer hasta que se analizaron las

mezclas de reacción mediante geles de poliacrilamida.Se muestra un esquema de la reacción y

del procedimiento seguido para llevar a cabo los cálculos cinéticos:

R + 32P-S ——__ R32P —s —> R + 32P-P1 + P2

preapareamiento+ Mg2Cl

Alícuotas a

distintos tiempos

Resultados, Actividad y estabilidad de las ribozimas modificadas. Capítulo 3 - 208

En la figura 8.2 se puede observar un gel típico de estos experimentos.

to 15seg 305eg 1min 4min 8min 20min 2h 3h

Figura 8.2. Gel tipico del cálcqu de la actividad ¡n vitro de las ribozimas. Es un gel de poliacrilamida 20 % encondiciones desnaturalizantes (urea 7 M).M:marcadores de PM (una banda cada 10 bases). Sustrato: banda

superior (15 bases), P1: banda inferior(8 bases) [P2no se observa porque no está marcado radiactivamente]. tocorresponde a la alícuota antes del agregado de Mg”, por lo tanto antes del iniciodela reacción y los tr

corresponden a las respectivas alícuotas tomadas a diferentes tiempos.

Las reacciones fueron llevadas a cabo con diferentes concentraciones de ribozima

respecto a Ia concentración de sustrato para verificar que las condiciones fueran efectivamente

de saturación, obteniéndose en todos los casos el mismo valor de la constante, dentro del error

experimental. Para los cálculos de la constante se supuso que la reacción era de pseudo-primer

orden, respecto a la concentración de sustrato y se utilizóel método del tiempo de vida medio,

para obtener el valor de las constantes a partir del decaimiento exponencial de la concentración

de sustrato, debido a la formación del producto. Como las reacciones de las ribozimas no

proceden hasta completarse, o sea, lhasta la desaparición completa del sustrato, sino que queda

un remanente entre 30 y 10 % que reacciona mucho más lentamente, se normalizaron todos los

valores a un tiempo considerado infinito (esto es más o menos 2 h). Se tomó la radioactividad \

inicial del sustrato como 100 % (antes del agregado de Mg“) y 0 % la final, a tiempo infinito, se

calculó el tiempo que tardaba en caer Ia radioactividad de Ia banda del sustrato al 50 % y este

es el tiempo de vida medio informado. La razón por Ia cualel 10-30 % de la concentración

original del sustrato se hidroliza más lentamente, puede ser la existencia de una población de

Resultados. Actividad y estabilidad de las ribozimas modificadas, Capitqu 3 - 209

complejos n'bozima-sustrato en confonnaciones alternativas (inactivas), que complican los

cálculos cinéticos.1°

Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8.1 (cada valor es el promedio de al

menos cinco experimentos).

Ribozima ' k2 (min-1)

natural 0.7

control 0.7

UMe4 0.4

UMe7 0.1

UMe4? 0.1

Tabla 8.I. Constantes cinéticas del paso químicode las ribozimas.

8.4- Estabilidad de las ribozimas modificadas.

Para que el uso de la nueva modificación tenga sentido, además de tener el OH-2'

disponible para reproducir las interacciones terciarias del ARN; es necesario que la modificación

bn'nde a los oligonucleótidos que la contienen una incrementada resistencia a las ubicuas

nucleasas. respecto de los oligonucleótidos naturales. La resistencia sería otorgada a los 2'-C

metilnucleótidos por Ia presencia del grupo metilo en Ia cara B del azúcar. Para ensayar esta

hipótesis se marcaron las ribozimas radioisotópicamente con 32P en el extremo 5’ y se

suspendieron en cada uno de los siguientes medios:

1°Burgin, A. B.; Gonzalez, C.; MatuI-Adamic. J.; Karpeixky, A. M.; Usman. N.; Mc Swiggen, J. A.; Beigelman, L.;Biochemistry 1996. 35, 14090-14095.

Resuitados. Actividad y estabilidad de ias ribozimas modificadas. Capitulo 3 - 210

el medio de cultivo de células 293T (DMEM : F12 (1:1), 10% suero fetal

bovino), con estas células se piensan realizar estudios de inhibiciónde la producción del virus

HIV-1

Iisado de esas células (llevado a cabo por tratamiento hipo-osmótico)

directamente en suero fetal bovino (SFB)

Las mezclas se incubaron a 37 °C en condiciones controladas de humedad y de dióxido

de carbono para mantener el pH y la concentración de muestra constantes. Se tomaron

alícuotas a distintos tiempos que fueron mezcladas con la misma solución stop usada en el

experimento anterior y almacenadas a - 80 °C hasta que se sembraron en el gel. Se analizaron

entonces las muestras por gel (20 % poliacn'lamida, 7 M urea) y se cuantificaron las bandas

usando phosphorimager. Los tiempos de vida medio obtenidos para las ribozimas en las

distintas condiciones se muestran en la tabla 8.||.

En las figuras 7.3, 7.4 y 7.5 pueden observarse algunos de los geles obtenidos.

Ribozimas SFB Lisado de Medio de cultivocélulas

Natural <1 min 2 min 4 min

Control <1 min 10 min 4 min

UMe4 1 min 15 min 5 min

UMe7 10 min 1 h 1 h

UMe47 10 min 1 h 1 h

Tabal B.Il.Tiempos de vida medio de las ribozimas en distintos fluidos biológicos.

y

Resultados. Actividad y estabilidad de las ríbozimas modificadas. Capítqu 3 - 211

Rzp. 1min 5mín 10min 30m'n 1h M Rzp.‘ 1min 5m'n 10min30min

M Rzp.10m'n 30m'n 1h 2h 3h

Figura 8.3. Estabilidad de las ríbozimas modificadas en lísado de células. a. Ribozima natural.b. Ribozimas control (UMe4 muestra un patrón similar). c. Ribozima UMe7 o UMe47.

Rz p.: Ribozima purificada. M:marcador de PM (una banda cada 10 bases).

Resuitadas‘ Actividad y estabilidad de ias ribozimas modificadas. Capituio 3 - 212

Rzp.1min5min M Rzp.1min5min10min M Rzp.10min30min 1h 2h 3h

a. b. c.

Figura 8.4. Estabilidad de las ribozimas modificadas en suero fetal bovino. a. Ribozima natural. b. Ribozima control(ia ribozima UMe4 muestra el mismo patrón). c. Ribozima UMe7 (para la ribozima UMe4? es similar). Rz p. :

Ribozima purificada. M:marcador de PM (una banda cada 10 bases).

M 1min5min10min30min 1h 1.5h M 1min5min10min30min 1h 1.5hb x

Figura 8.5. Estabilidad de las ribozimas modificadas en el medio de cultivo de células 293T.a. Ribozima control. b. Ribozima UMe47. M:marcador de PM (una banda cada 10 bases).


8.5- Discusión.

Según se puede observar, todas las ribozimas modificadas fueron activas y catalizaron

la hidrólisis del sustrato en el enlace fosfodiéster esperado, pero Ia actividad de las ribozimas

con la modificación es menor que la actividad de aquellas que carecen de Ia modificación (Ia

ribozima natural y Ia “2-O-metilribozima" con n'bonucleótidos en las posiciones en donde el OH

2' es importante). La ribozima control (“2-O-metilribozima") tiene la misma actividad que la

ribozima natural como estaba infonnado.Elpor Io tanto, cualquier disminución en Ia actividad de

ribozimas cabeza de martillogenéricamente activas y resistentes a nucleasas puede atribuirse a

la presencia de Ia 2'-C-meti|un'dina en los casos UMe4, UMe7 y UMe47.

La uridína conteniendo Ia modificación propuesta introducida en Ia posición 4 no afecta

en forma considerable Ia actividad; la constante cinética cae solamente a la mitad respecto de

los controles.

En cambio, en Ia posición 7, Ia actividad disminuye en un factor de siete. La posición 7

es la posición de Ia ribozima cabeza de martillo más pobremente comprendida. La inspección

de Ia arquitectura del complejo ribozima-inhibidor enfatiza la localización central de Ia posición

7, que podría ser vista como un Iinkerentre los dos dominios del núcleo catalítico de Ia ribozima.

La conformación del azúcar cambia Ia distancia entre Ia base y el esqueleto fosfodiéster,

pudiendo, en 7. cambiar el posicionamiento del dominio catalítico 1 respecto al dominio 2 y el

sitio de hidrólisis en el estado de transición. Es también posible que sea requerida cierta

flexibilidad del nucleósido, y la presencia del metilo que fija Ia conformación en norte, podria

interferirdesestabilizando el estado de transición. Otro factor, que es razonable pensar pueda

influirsobre Ia actividad en esta posición, es la presencia del metilo que podria interferir en el

apilamiento de la un'dina 7 sobre el uracilo en 16.1.

La misma disminución de la actividad se observa en la ribozima que contiene Ia

modificación en las posiciones 4 y 7 en donde la disminución de Ia actividad se debería

principalmente a Ia presencia de Ia 2’-C—meti|un'dinaen 7.

El principal problema para la administración exógena de ribozimas en las células es que

las moléculas de ARN son muy propensas a Ia degradación por nucleasas presentes en

ambientes intra y extra celulares. Las dos principales clases de nucleasas son las endo- y

exonucleasas. La nueva modificación introducida en el núcleo de las ribozimas tendria, debido a

su ubicación. eventualmente efecto sobre la estabilidad frente a endonucleasas. Estas enzimas

hidrolizan ARN simple cadena 3' a los residuos de pirimidinas y Ia degradación puede ser

inhibida en ribozimas químicamente sintetizadas por la incorporación de ribonucieótidos 2'

modiflcados. Es crucial modificar las uridinas del núcleo para obtener un aumento en la

estabilidad respecto a Ia ribozima natural. Como puede observarse, la ribozima control y la

natural son degradadas con la misma velocidad en todos los fluidos analizados, excepto en el

lisado de células en donde el Í1/2de la ribozimas control es un poco mayor que el de Ia

ribozimas naturales. Lo que cambia en ambos casos en los distintos fluidos analizados es que,

en el caso de la ribozima natural. Ia ribozima desaparece casi inmediatamente para dar lugar a

oligos de muy bajo peso molecular; en cambio, en la ribozima control aparecen bandas de PM

intermedio correspondientes a 9 y 12 bases de longitud. que son las posiciones pirimidinicas

que permanecen sin modificar de Ia ribozima 2'-O-metilada. Con el tiempo estos fragmentos

fueron hidrolizados en sus extremos terminales —5'y -3' para generar fragmentos más

pequeños. El efecto 5'-exonuc|easa se observa como una disminución de la radioactividad total

de las bandas, no observándose los fragmentos menores en los autorradiogramas debido a que

las ribozimas están marcadas en 5'; los productos de degradación resultado de la actividad 3'

exonucleasa si pueden verse como fragmentos de menor peso molecular. Los resultados de la

resistencia a nucleasas de las ribozimas modificadas muestran que Ia modificación aumenta la

estabilidad de las ribozimas en suero, medio de cultivo y lisado de células T293 siempre que Ia

uridina en la posición 7 esté modificada. Ya se había observado en trabajos anteriores que esta

posición es la más sensible a Ia degradación enzimática, siendo indispensable su modificación

para alargar el tiempo de vida medio de ribozimas cabeza de martillo,probablemente debido a

su expuesta posición en la estructura de Ia ribozimas-7

Con respecto a los diferentes fluidos analizados, el suero fetal bóvino es el que

presenta mayor actividad de RNasas. La ribozima natural es completamente degradada en

Resultados. Actividad y estabilidad de las ribozimas modificadas. Capítulo 3 - 215

menos de un minuto a mononucleótidos, la ribozima control también es degradada

completamente en ese lapso de tiempo pero aparecen una banda tenue de 12 bases (producto

de la degradación en 7) y una importante de 9 bases (producto doble de Ia degradación en 4 y

de Ia degradación del fragmento de 12 bases en Ia misma posición) en el primer minuto. A los 5

minutos la banda de 12 bases ha desaparecido y aparecen bandas de 8, 7 y bases

correspondientes a actividad 3'-exouncleasa. Se observa el mismo patrón para UMe4que para

Ia ribozima control; en cambio con UMe7, a las 3 h, todavía hay una cantidad detectable de

n'bozima íntegra; la principal banda de degradación corresponde a 9 bases a los 10 min y luego

va desapareciendo y crecen las bandas de menor PM. En el lisado de células y medio de cultivo

(que está suplementado con un 10 % de SFB) los tiempos de vida medio, no inesperadamente,

se extienden en todos los casos, pero los patrones son similares a los del SFB puro.

Está informado que Ia introducción de fosforotioatos en algunas posiciones de los

extremos -3' y -5' de Ia ribozima inhibe considerablemente Ia acción de las exonucleasas y su

presencia no afecta la actividad.11Esta modificación protege más eficientemente las ribozimas

frente a la acción de las exonucleasas que los 2'-O-alquiloligonucleótidos. así es que la

combinación de ambos tipos de modificaciones puede dar lugar a un incremento mayor en la

estabilidad de ribozimas en fluidos biológicos.

8.6- Conclusión.

La posición 7 Ia ribozima fue siete veces menos activa pero del orden de quince veces

más estable. Esto último también se observa con la ribozima conteniendo la 2'-C-meti|uridina en

las posiciones 4 y 7. En cambio, en el caso de Ia n'bozima UMe4, la disminución en Ia actividad

catalitica, si bien no es tan pronunciada como en los casos anteriores, no se ve compensada

con un aumento comparable de la resistencia a nucleasas, debido a la posición 7 que

permanece sin modificar. Los resultados aquí obtenidos sugieren que n'bozimas conteniendo la

11Heidenreich, 0.; Benseler, F.; Fahrenholz, A.; Eckstein, F. J. Biol. Chem. 1994, 269, 2131-2138.

, .:l r. .¡AL‘WH- u.Resbtado .rd.CÉlvl-'JEGy esaslcad de ¡aU7 '1 L) (3Li ‘J EJ m "3 O (1 3

C) [1) C). m U) (3 h) É E-L O (A)l

rx) ._L O).

2'-C-meti|uridina podrían ser útiles en la inhibición de la producción del HIV-1 in vivo. Estudios

en cultivode células de las n'bozimas, se encuentran pendientes.

Estos resultados aportan una indicación que Ia presencia de nuestra modificación en

determinadas posiciones de análogos de ARN, brindará resistencia a nucleasas y aportará un

OH-2' capaz de reproducir las interacciones del ARN, siempre y cuando, la presencia del metilo

no perturbe la estructura terciara de la molécula, o su interacción con cationes metálicos

necesarios para la actividad o no sea necesaria cierta flexibilidaden el monómero en cuestión.

Pan‘e D

Conclusiones y perspectivas

Conclusiones generales y perspectivas. Capitulo 9 - 217

Capítqu 9

Conclusiones generales yperspectivas

9.1-Conclusiones generales.

A continuación se muestran los resultados y las principales conclusiones obtenidas en

este trabajo de tesis. Una discusión más detallada puede encontrarse en los capítulos

precedentes.

En este trabajo se propone una nueva clase de nucleótidos modificados

potencialmente útiles para el desarrollo de análogos de ARN resistentes a nucleasas. Para las

aplicaciones in vivo de oligonucleótidos es necesario modificarlos químicamente para tener

compuestos con tiempos de vida medio adecuados. Entre las diversas modificaciones las que

involucran la posición 2', demostraron ser de utilidad, sin embargo, ninguna de las probadas

hasta el momento conservan el OH-2'. Este grupo funcional demostró ser esencial en algunas

posiciones de moléculas de ARN para su correcto plegamiento y, por lo tanto, para la actividad

o función particular de las mismas. Aquí se presenta la generación de una nueva claSe de

nra An.r‘r A." n53 __\ u mcg-An A?" H |¿: H".-!-_-.l'::¿5-: Cra V.- ,' ¡1-:3z‘iculc8. 'Vztrjmlm

análogos modificados en la posición 2' que conservan el OH-2', los 2’-C-metilnucleótidos. La

hipótesis que dio origen a este trabajo es que estos monómeros brindarán un OH-2' disponible

para reproducir las interacciones terciarias del ARN y que demostrarán una incrementada

resistencia a nucleasas, debido a la presencia del metilo. Para verificarla, se desarrolló el

monómero de la 2'—C-metilun'dinapara la sintesis en fase sólida de oligonucleótidos y se eligió

como modelo biológico para ensayar la aplicabilidad de la nueva modificación la ribozima

cabeza de martillo.

En un estudio computacional preliminar por mecánica molecular, se introdujo la nueva

modificación (cuya conformación fue previamente minimizada) en una estructura de la

ribozima cabeza de martillo producto de cn'stalografía de rayos X, en las posiciones

en donde el OH-2’ demostró tener interacciones de orden terciario (U4. G5. U7, Ga y

G12) y se analizó cómo afectaba esta incorporación al plegamiento terciario de la

ribozima cabeza de martillo. Los resultados mostraron que la conformación preferida

adoptada por los 2’-C-metilnucleótidos es la misma de los n'bonucleótidos naturales.

Se observó que su introducción en la ribozima cabeza de martillono produjo cambios

apreciables en la conformación global de la misma, excepto en la posición Ga. Este es

el único residuo de la ribozima que adopta una conformación que no es la típica del

ARN. La introducción simultánea de U4. G5. U7 y G12tampoco produjo cambios en el

plegamiento de la ribozima y, en particular, tampoco en el núcleo catalítico de la

misma. Los resultados de esta primera aproximación constituyeron el punto de partida

Conclusiones generales y perspectivas. Capítqu 9 - 219 —

para el desarrollo químico de los 2'-C-meti|nuc|eótidos, monómeros para Ia síntesis en

fase 'sólida de oligonucleótidos.

Se comenzó por la preparación de los monómeros de las pirimidinas debido a la

menor complejidad de los caminos sintéticos involucrados. Se eligió la un'dina porque

en dos posiciones de Ia n'bozima cabeza de martillo los OHs-2' de un'dinas

demostraron ser importantes para la actividad, mientras que ninguna citidina estaba

involucrada. Se preparó, entonces, la 2’-C-meti|un'dinapor una estrategia sintética

esteresoselectiva novedosa. Además, se preparó la fosforamidita convenientemente

protegida necesaria para Ia síntesis en fase sólida de oligonucléotidos, incluyendo la

regioselectiva protección del OH-2'. Se muestran también los resultados preliminares

para Ia obtención del den'vado de la adenosina.

La hipótesis de la aplicabilidad de la nueva modificación se basa en que la

conformación de los 2'-C-metilnucleósidos sea la misma que la de los n'bonucleósidos

naturales, con lo cual, ambas moléculas posicionarían el OH-2' con la misma

orientación y podrían generar el mismo tipo de interacciones. Esta conjetura estaba

apoyada por estudios previos realizados en nuestro grupo con compuestos

relacionados, los (2'S)-2'-desoxi-2'-C-a|quilnucleósidos que demostraron tener Ia

conformación norte, que es Ia misma que adopta el ARN. Por consiguiente, era de

esperar que los 2'-C-meti|nucleósidos adoptaran la misma conformación, debido a la

presencia adicional del OH-2', que tendería a ubicarse axialmente, a favor de un

efecto gauche positivo con el 04'. Por otra parte, el estudio preliminar usando

mecánica molecular había mostrado también que los 2’-C-metilnuc|eótidosadoptaban

la conformación norte. Finalmente, un estudio de rayos X de Ia 2'-C-metilur¡dina

también había mostrado que el azúcar de este nucleósido se plegaba en esa

conformación. Para confirmar esta suposición experimentalmente, y corroborar Ia

configuración del 02', se realizó un estudio confonnacional de la 2'-C-met¡|uridina en

solución por RMN. El estudio confonnacional en nucleósidos se realiza generalmente

a partir de constantes de acoplamiento a tres enlaces. En el presente caso, la falta de

un hidrógeno unido al 02' reduce el número de constantes de acoplamiento 1H-‘H

disponibles a solo una JH3',H4'.por lo tanto se decidió medir también constantes de

acoplamiento 3J1H.rsc.Con ese fin se decidió usar una secuencia de pulsos nueva, que

muestra ser útil para medir estas constantes en abundancia natural y tiene alta

sensibilidad. También, se realizaron experimentos de NOE para confirmar los datos

obtenidos a partir de las constantes de acoplamiento y deducir Ia orientación de Ia

base. Se realizó, además, una comparación cuantitativa de los parámetros

confonnacionales obtenidos en solución con resultados obtenidos a partir de cálculos

computacionales semiempríricos y ab initio y con los resultados publicados de

cristalografía de rayos X, obteniéndose mejor correlación entre los resultados de

cálculos ab ¡nitro con los de RMN y los de rayos X. Todos los resultados fueron

consistentes con Io esperado, Ia conformación preferida adoptada por el azúcar de Ia

2'-C-metiluridina es norte (específicamente, 3T4),anti la orientación de la base y +sc el

rotámero mayoritario del enlace C4'-C5’, lo mismo que la uridina natural. La diferencia

es que el azúcar de la 2’-C-metiluridina es menos flexible, estando el equilibrio

conformacional casi totalmente desplazado hacia la conformación norte, debido a Ia

presencia del metilo que fija el plegamiento del azúcar y la orientación de la base en

esa conformación.

Dados los resultados obtenidos del estudio conformacional, se puso a punto Ia

síntesis en el laboratorio de oligonucléotidos conteniendo Ia 2'-C-metiluridina. Los

resultados mostraron que el tetrahidropiranilo es un grupo excesivamente Iábil a

ácido para ser usado en la síntesis de oligonucleótidos, hidrolizándose parcialmente

durante el tratamiento ácido para la remoción del DMTr en cada ciclo. La 2'-G

metilun'dinapudo ser introducida en una o tres posiciones de oligodesoxinucleótidos

de doce bases, obteniéndose un rendimiento razonable al incorporarla en una sola

posición. pero al ser introducida en tres el rendimiento resultante fue muy bajo.

También se sintetizaron oligodesoxinucleótidos conteniendo uridina y (2'S)-2'

Conclusiones generales y perspectivas. Capitulo 9 - 221

desoxi-2’-C-meti|urid¡na para realizar estudios de hibridización con hebras

complementarias de ADN y de ARN. Se puso también a punto en el laboratorio un

protocolo para la síntesis en ARN, que es más compleja que la de ADN y se

sintetizaron secuencias de ARN para los estudios de temperaturas de fusión y para

los estudios ¡n vitrode las ribozimas. Asimismo se prepararon las ribozimas cabeza

de martillo modificadas, conteniendo 2'-O-metilribinucleótidos, ribonucleótidos y la

2'-C-meti|un'dina, en una o dos posiciones.

Con el fin de estudiar la influencia sobre Ia afinidad por hebras complementarias de

ARN de Ia presencia de un átomo electronegativo en 2' en la cara a y de un grupo

alquilo en 2' en Ia cara B del azúcar de nucleótidos modificados, se sintetizaron

oligodesoxinucleótidos conteniendo un'dina, 2'-C-metilun'dina y la (2’S)-2'-desoxi-2'

C-metiluridina y se analizó Ia afinidad por hebras complementarias de ADN y de

ARN de estos oligos. Los resultados obtenidos indicaron que las secuencias

modificadas produjeron una disminución en las afinidades por hebras

complementarias en relación con los oligodesoxinucleótidos de Ia misma secuencia.

La presencia del OH-2' en una posición no introdujo una gran mejora respecto ala

afinidad con relación a Ia (2’S)-2’-desoxi-2'-C-metiluridina. Con lo cual,

aparentemente el metilo interferiria de alguna forma en la conformación de la doble

hélice. Sin embargo, para poder obtener resultados concluyentes sería de

importancia estudiar oligonucleótidos más extensivamente modificados, dado que

los resultados ponen en relevancia Ia importancia del contexto en el cual las

modificaciones son introducidas para poder evaluar su influencia sobre Ia

estabilidad de híbridos.

Finalmente, se realizaron los estudios de actividad ¡n vitro y estabilidad en fluidos

biológicos (medio de cultivo de células, suero fetal bobino y en Iisado de células) con

las ribozimas modificadas. El diseño de las ribozimas se basó en un trabajo de

Beigelman y colaboradores que prepararon una clase de ribozimas sintéticas

genéricamente activas y resistentes a nucleasas. Las n'bozimas contienen 2'-O

metiln'binucleótidos principalmente y un conjunto minimo de n'bonucleótidos para

mantener la actividad. La optimización entre la actividad y Ia resistencia a nucleasas

se logra con la modificación selectiva de las uridinas del núcleo catalítico de la

n'bozima. En estas posiciones fue introducida la nueva modificación. Las ribozimas

demostraron ser activas, y tener una incrementada resistencia a nucleasas. La

introducción en Ia posición 4 mostró una caída de solamente Ia mitad en la actividad,

pero no mostró un incremento significativo en la resistencia a nucleasas. En cambio,

en la posición 7 la ribozima fue siete veces menos activa pero del orden de quince

veces más estable. Esto últimotambién se observa con la n'bozima conteniendo Ia 2'

C-metilun'dina en las posiciones 4 y 7. Los resultados aqui obtenidos aportan una

indicación que Ia presencia de nuestra modificación en determinadas posiciones de

análogos de RNA, brindará resistencia a nucleasas y aportará un 2'-OH capaz de

reproducir las interacciones del RNA. Es importante señalar que, la utilidad de esta

modificación estará restringida a situaciones en las cuales Ia presencia del metilo no

perturbe Ia estructura terciara de la molécula, o su interacción con cationes metálicos

necesarios para Ia actividad y en las que no sea necesaria cierta flexibilidad en el

monómero en cuestión.

9.2- Perspectivas.

A partir de los resultados obtenidos en este trabajo, se han derivado una serie de

proyectos o de estudios futuros que creemos son de interés para continuar con la línea de

investigación. A continuación se enumeran algunos de los puntos que creemos pueden dar

lugar a futuras investigaciones, algunos de los cuales ya están siendo llevados a cabo en el

laboratorio:

Conclusiones generales y perspectivas. Capítulo 9 - 223

o Primero, sería importante desarrollar los monómeros de las otras bases. En el

laboratorio, ya se _ha sintetizado la 2'-C-metiladenosina y se preparando la

preparación de Ia 2'-C-metilcitidina.

o En segundo lugar, dado que el tetrahidropiranilo, no resultó ser suficientemente

estable, habría que ensayar otro grupo protector para 2'. Una alternativa que se

piensa probar consiste en el uso del TOM (triisopropilsililoximetilo),1este nuevo grupo

protector se encuentra poco impedido estéricamente, con lo cual es probable que

pueda ser introducido, sino en el derivado protegido con el puente disilixano, en el

nucleósido diacetilado. Además. se elimina en las mismas condiciones que el

TBDMS,dado Io cual se evitaría un paso extra de desprotección.

o Por otra parte, sería de interés para sacar algún resultado concluyente. acerca de la

influencia de un grupo electronegativo en 2' y sobre la posible interferencia del metilo

en B del azúcar en nucleótidos modificados sobre la afinidad por hebras

complementarias, sintetizar oligonucleótidos más extensivamente modificados y que

incluyan monómeros de otras bases. La afinidad por hebras complementarias de

oligonucleótidos modificados se ha sugerido depende del entorno en el que la

modificación ha sido introducida, si en un entomo de desoxinucleótidos o de

nucleótidos modificados. La síntesis de estos oligos se llevará a cabo en cuanto se

optimice la protección del OH-2'.

o En este sentido también seria importante realizar estudios estructurales sobre los

híbridos para analizar Ia interferencia del metilo sobre el apilamiento de las bases y

analizar el rol del metilo en el patrón de hidratación del dúplex. Estos resultados

permitirían extraer tal vez conclusiones más generales acerca de los factores que

estabilizan los híbridos y podrían ser de utilidad para el diseño de nuevas drogas

antisentido.

1 Pitsch, S.; Weiss. P: A.; Jenny, L.; Stutz. A.; Wu, X. Helvefica Chimica Acta 2001, 84. 3773-3795.

Finalmente, para probar la aplicabilidad de la nueva modificación es fundamental

realizar ensayos en condiciones que se aproximen más a las condiciones fisiológicas

que serían las condiciones de acción de estas drogas. Un paso más cercano a esas

condiciones sería el estudio de la capacidad de las ribozimas para inhibirel HIV-1en

cultivos de células. Ribozimas dirigidas contra la región 5'- lider/gag y tet/rev han

probado ser efectivos inhibidores se Ia replicación del HlV-t.2 Se propone un ensayo

usando células humanas T293. Un plásmido CMVque contiene el genoma defectivo

del HIV-1y las ribozimas correspondientes serán cotransfectados en células 293T. Se

analizará la producción viral mediante un análisis ELISA específico para la proteína

gag de la cápside viralen el sobrenadante de las células.

2 Hormes, R.; Homann. M.; Oelze, I.; Maschall. P.; Tabler. M.; Eckstein, F.. Sczakiel, G. Nucl. Acíds Res. 1997, 25,769-775.

Apéndice i. Conformación de nucleósidos y nucieóïidos - 225

Apéndice l

Conformación de nucleósidos ynucleótidos

AI.1-Ángulos de torsión y sus rangos - Definición de ángulosde torsión en (oligo)nuc|eótidos.

La estructura tridimensional de una molécula está caracterizada por longitudes de

enlace, ángulos de enlace y por rotaciones de átomos alrededor de enlaces. Estas rotaciones

son descritas por ángulos de torsión o ángulos diedros, que involucran cuatro átomos en

secuencia: A-B-C-D. El ángulo de torsión G, está definido como el ángqu entre los enlaces

proyectados A-B y C-D, cuando se observa a través del enlace central. Se define como 0° si A

B y C-D están eclipsados (cis o coplanares) y el signo es positivo si el enlace más lejano es

rotado en el sentido de las agujas del reloj con respecto al más cercano. EI ángulo diedro es

estrictamente el complemento del ángulo de torsión (o sea, el ángulo formado por las normales

de los planos determinados por A-B-C y B-C-D).Sin embargo, habitualmente ángulos diedros y

ángulos de torsión se usan como sinónimos, y asi se hará en esta tesis, salvo que se señale lo

contran'o. Los rangos son descritos comúnmente en quimica orgánica de acuerdo a la

nomenclatura propuesta por Klyne y Prelog, sin o sinpen'planar (-0°), anti o antíperiplanar

(-180°), isinclina/ (-:60°) y ¿antic/¡nal("i120°) (figura AI.1).

t ¡“t if‘ . ,. K: ,2 :¡J , tanga "meApaizoice conformamos de cuaeastaos y ï‘síÉCieïxiuQ-‘se ¿.¿c

Figura AI.1. Nomenclatura de los rangos del ángulo de torsión usada por los espectroscopistas(cis, trans, +gauche, -gauche) y aquella definida por Kliney Prelog

(syn o sinperiplanar, anti o antipen'planar, +sinclinal, -s¡ncl¡nal, +antic/ínal, -anticlinal).

En moléculas con libertad rotacional alrededor de enlaces simples, usualmente ciertas

conformaciones estéricamente permitidas sonvpreferidas; por lo tanto, suele ser conveniente

describir una estructura de acuerdo a los rangos a que adoptan sus ángulos de torsión.

En nucleótidos, la conformación del esqueleto azúcar fosfato siguiendo la numeración

secuencial de átomos P—>05’—>C5’—>C4’——>C3’—>O3’es definida por los ángulos de torsión oc,

[3, y, 6, s y t; en orden alfabético, con d describiendo la rotación alrededor de P—>O5’,y así

sucesivamente a lo largo del (oligo)nucleótido. Los ángulos endociclicos de torsión del azúcar

Apéndice i. Conformación de nucleosidos y nucieótidos - 227

son denotados por vo a v4 y la orientación relativa de Ia base es descrita por x. En Ia tabla ALI

se muestran las definiciones de los ángulos de torsión ¡enoligonucleótidos.

Ángqu de torsión Átomos involucrados

0. (n.1)03'-P-05'-C5'

B P-OS'-C5'-C4I

y O5'-C5'-C4'-C3'

5 C5'-C4'-C3'-O3l

8 C4'-C3'-O3'-P

C C3'-O3'-P-05'(n+1)

x O4'-C1‘-N1-C2 (piridinas)

O4’-C1'—N9-C4(purinas)

vo C4'-O4'-C1'-C2'

v1 O4'-C1'-CZ'-C3'

V2 C1 '-C2'-C3'-C4'

V3 02'-c3'-c4'-04'

v4 C3'-C4'-O4'-C1'

Tabla ALI. Definición de ángulos de torsión en oligonucleótidos.

AANm!“ ,1_‘ A A5,: ., .1 .ln CAMA- _.i up . decidido: y “lia-avg.»

AI.2-Tecnologías utilizadas para elucidación estructural delos ácidos nucleicos y sus componentes.

Las metodologías que permiten la elucidación y el análisis de la estructura y

conformación de ácidos nucleicos, nucleósidos y nucleótidos incluyen cristalografía de rayos X.

métodos espectroscópicos, particularmente RMN y dicroísmo circular, y métodos

computacionales. La cristalografía está limitada al estado sólido, por eso, la información

obtenida por esta técnica es complementaria a la obtenida por RMN, que brinda información

sobre la estructura dinámica de la molécula en solución. Los cálculos computacionales permiten

derivar un cuadro general de la flexibilidad de una molécula. EI intercambio y complementación

de datos espectroscópicos y cristalográficos, combinado con consideraciones de tipo teórico y

cálculos computacionales da lugar a una comprensión amplia de las propiedades y estructuras

moleculares.

Al.3-Plegamiento del azúcar.

La furanosa planar es energéticamente desfavorable porque en este ordenamiento

todos los ángulos son de 0° y todos los sustituyentes se encuentran eclipsados. El sistema

disminuye su energia plegándose, el azúcar puede encontrarse como sobre o enve/op (E), con

cuatro átomos en el plano y el quinto desplazado del plano 0.5 Á, o como conformación

retorcida o twist (T). con dos átomos adyacentes desplazados sobre lados opuestos respecto al

plano formado por los otros tres átomos. Si los átomos desplazados están del mismo lado que

el C5' Ia conformación es endo, si se encuentran del lado opuesto, la conformación es exo.

Usualmente, debido a que Ia transición entre E y T es factible, los cuatro átomos no son

perfectamente coplanares en E. y desplazamientos del plano formado por tres átomos son

raramente simétricos. A Ia mayor desviación de la planaridad se Ia llama plegamiento principal o

mayor, y a la menor. plegamiento menor o secundario. El plegamiento mayor se indica a la

izquierda de Ia letra mayúscula T o E, como superíndice si es endo o como subíndice si es exo;

FJ“.l/fi _.’—.’_\z

Apéndice l. Conformación de nucleósidos y nucleótidos - 229

y el plegamiento menor se señala a la derecha. (Por ejemplo, 3E, indica que Ia conformación es

tipo sobre C3'-endo; 3T2,es un twist asimétrico con plegamientos C3'-endo mayor y C2’-exo

menor).

Los cambios confonnacionales, que no preceden via un intermediario planar, sino que

el máximo plegamiento va rotando alrededor del anillo, son descriptos mediante el ciclo

pseudorrotacional. Este ciclo, primeramente aplicado al ciclopentano y luego a furanosas,

describe un itinerario continuo para representar la interconversión de los confórmeros (ver

figura AI.2).1 En el ciclopentano los cambios confonnacionales ocurren virtualmente sin

barreras de energía potencial, dando lugar a un infinitonúmero de confonnaciones. las cuales

pueden ser definidas en términos de dos ángulos: ‘tm,amplitud de plegamiento máxima, que

describe el grado de plegamiento de la conformación, o sea, los desplazamientos fuera del

plano, y P, ángqu de fase de pseudorrotación. Los ángulos P y tm se vinculan con los ángulos

de torsión endociclicos del azúcar mediante la siguientes fórmulas,

tan P = [(V4+V1)-(V3+Vo)]/ [2 V2(sen 36°+ sen 72°)]

tm = V2/COSP

Y complementariamente,

Vi=TmCOS(P+(i—2) 144°) i=0,....,4

Nótese, además, que los w no son independientes, XM :0.

Para 3T, P = 0, mientras que la imagen simétrica 3T corresponde a P = 180°. En el

itinerariorotacional las confonnaciones E y T se alternan cada 18°, correspondiendo E a valores

de P múltiplos impares de 18° y T a múltiplos pares.

Debido a que el anillo se encuentra asimétricamente sustituido en los nucleósidos,

surgen barreras de energía potencial que dan lugar a ciertas conforrnaciones preferidas.

‘Altona. C.; Sundaralingam, M J. Am. Chem. Soc. 1973, 94. 8205-8212.

ápéndíce Ccníormacáón de nucleésée’oe y :mcáeóáíács m23€}«

oeste

Figura AI.2. Ciclo pseudorotaclonal del anillo de Ia furanosa en nucleósidos.Valores del ángulo de fase (P) están dados en múltiplos de 36 °.

Las formas E y T, se alternan cada 18 °.Después de rotar 180 °, Ia imagen especular de la posición on'ginales encontrada.

S

Cz-endo C3.-exo C2--endo-Cg.-exo sumaCs. C - C . C5 N 5 5‘

N N N ¿No,

05 N' c5. N c5, ’V (45' NN \1>T/\z¿\7/w

Cz-exo ‘ C3--endo Cy-exo-Cy -endo suma

Figura AI.3. Respresentación esquemática de los modos de plegamíentosmás frecuentemente observados en las fuanosas de nucleósidos.


Los valores de P, calculados para estructuras de nucleósidos determinadas por

cristalografía no se encuentran uniformemente dispersados en el ciclo pseudorrotacíonal, sino

que están agrupados en dos rangos centrados en la conformación C2'-endo (137° s P s 194°),

dominio sur, y en Ia conformación C3’-endo (-1° s P s 34°), familia de confonnaciones norte.2

La familia norte comprende los modos de plegamiento C2'-exo, C3'-endo y C2’-exo-C3'-endo,

mientras que Ia familia sur incluye los modos C2'-endo, C3'-exo y C2'-endo-C3'-exo (figura

AI.3).3

Estas confonnaciones son predominantes porque, como las barreras de rotación

alrededor de C-O son menores que para C-C, el anillo adopta confonnaciones con los enlaces

C-O, vo y V4. cercanamente eclipsados y C-C-C, V1. vz y vs. máximamente altemados,

resultando los dominios norte y sur, con C2'-endo, o -exo, para V4= 0 y C3'-endo o -exo para vo

= 0. Por otra parte, los ángulos C-O-C son menos flexibles que ángulos con C en el vértice y

debido a que ángulos endocíclicos de los átomos plegados son menores que los ángulos en el

plano, esta es una razón adicional en contra del desplazamiento de 04’ del plano y la mayor

población de los confónneros norte y sur en el ciclo pseudorrotacíonal.

Los cambios confonnacionales a Io largo de un mismo dominio, norte o sur, son

equivalentes a un desplazamiento alrededor de un limitado rango de recorn'do

pseudorrotacíonal. La falta de una barrera de energía potencial sustancial entre E y T hace

estas conversiones relativamente continuas. Por el contrario, la inversión del plegamiento N 4-»

S implica un intercambio en el ciclo pseudorrotacíonal, en el cual diferentes orientaciones de los

sustituyentes, axial 4-»ecuatorial, son observadas; Io cual requiere una cantidad considerable

de energia. La distribución de datos cn’stalográficos sugiere que las dos posibles rutas para Ia

transición N 4-»S no son equivalentes. El pasaje a través de Ia conformación O4’-endo es más

corto y de menor energia que la vía a través de O4'-exo que es energéticamente

2 De Leeuw, H. P. M.; Haasnoot, C. A. G.; Altona, C. lsr. J. Chem. 1980. 20, 108-126.3Si bien los dominios norte sur abarcan un rango de confonnaciones, es de uso común (y asl se hará enesta tesis) referirse a las confonnaciones norte y sur, y muchas veces se usan como sinónimos,respectivamente, los términos C3'-endo y norte, y CZ'-endoy sur.

desfavorablez“.5 Desde un punto de vista geométrico, en O4'-exo la base y el 05' se

encuentran ambos con orientación axial, por lo tanto, se genera un conflicto estérico, debido a

interacciones del tipo 1,3-diaxial. Mientras que en O4'-endo están ambos sustituyentes

orientados ecuatorialmente y, consecuentemente, más separados. Los resultados de RMN

muestran que las confonnaciones 02'-endo 4-»C3’-endo se encuentran en equilibriorápido.

Un análisis detallado del plegamiento del azúcar en un gran número de nucleósidos

mostró que la amplitud de plegamiento. Trn,muestra distribución unimodal, tal que <tm > = 386°

i 3°.6 Esto sugiere que tm es una propiedad intrínseca de la estructura del anillo

carbonooxigenado, independiente del tipo de azúcar, dela base, de Ia fase pseudorrotacional y

de los ángulos de torsión x y y.

Para ribonucleósidos, Ia población de confónneros norte y sur está más distribuida, en

cambio, para desoxirribonucleósidos se encuentra una preferencia por Ia conformación sur. Se

observa que la conformación sur permite una mayor libertad conformacional para los ángulos de

torsión x yy; en cambio en Ia norte, x adopta preferentemente una orientación ap y y raramente

se encuentra -sc.

Al.4-Orientación de la base.

La rotación alrededor de la base relativa al azúcar se encuentra estéricamente

restringida y dos orientaciones principales son observadas: sin (con x adoptando valores en el

rango de sc). con el O2 de las pirimidinas y el C4 de las purinas sobre el azúcar, y anti (con x

ap), tal que estos átomos se dirigen hacia fuera del anillo azucarado. En anti no existe particular

impedimento estérico entre la base y el azúcar. En sin la parte voluminosa de Ia base se localiza

sobre el azúcar dando lugar a cercanos contactos interatómicos que pueden ser aliviados si el

azúcar adopta la conformación C2'-endo, de forma que el C5' y Ia base estén ecuatoriales, más

4 Levitt, M.; Warshel, A. J. Am. Chem. Soc. 1978, 100. 2607-2613.5 Olson, W. K.; Sussman. J. L: J. Am. Chem. Soc. 1982, 104, 278-286.

5 Saenger. W. en Principles of Nucleic Acid Structure. New York: Springer 1988. 55.


separados. En general, se observa una correlación entre conformación del azúcar C2‘-endo y

orientación sin de la base.

En pirimidinas, sólo raramente se observa orientación sin, y el rango de x está

finamente sintonizado por el azúcar: -180° s x s -138° se corresponden con C3'-endo, mientras

que -144° s x s -115° se observa con C2'-endo. En C3’-endo el H3' axial interactúa con H6,

por lo tanto, x, adopta valores cercanos a - 180°; en C2'-endo el H3' se on'enta ecuatorialmente,

entonces la base puede rotar hasta el rango -ac, hasta que su 02 contacte el H1'. En las

purinas las interacciones entre Ia base y el azúcar son menos severas, el anillo imidazol coloca

el H8 y el N-3 lejos del azúcar, así la orientación -sc se vuelve accesible.

Al.5-Orientación alrededor del enlace C4’-C5’.

La rotación alrededor del enlace exociclico C4'-C5' permite al 05' asumir diferentes

posiciones relativas al azúcar. Existen tres conformaciones posibles para las cuales todos los

sustituyentes se encuentran altemados; +sc, -sc y ap. En principio las tres orientaciones son

posibles pero no se encuentran uniformemente pobladas debido que su distribucióndepende de

Ia conformación del azúcar y de la base. Por efecto gauche,7 las orientaciónes +sc y ap son

favorecidas respecto a -sc.

En pun'nas, +sc y ap, se encuentran igualmente pobladas, en cambio en pirimidinas,

+sc es la orientación en general observada. La orientación -sc es raramente observada en

ambos casos.

7 Este efecto dirige los ángulos de torsión de grupos X-C-C-Y,con X e Y electronegativos a orientación ¿sc ogauche, y tiende a evitar la conformación ap. que es aquella en la cual los sustituyentes se encuentran másapartados entres si.

Apéndices

Apéndice Il

Apéndice !I.Ciclos del sintetizador auzomético-ZS,.¡\_v

Ciclos del sintetizador automático

Tabla AII.1. Ciclo de síntesis de ADNen escala 0.2 umol.

Table AI-17.

Name: .2 um CESteps: 77Ste FunctionMim

U‘O

33‘33!383888388EBBBÉGSSRGKSSESonqausuN...

1% Begin64 l8 to Waste

lll BbckVan53m toWasIe33una toColumn3411:: lo Column

141 Column l OH142 Column 2 On64 18 toWasu:l Bleeka

111Bbckth58Tettoan

w33 34-13 to Column34 Tb! to Column

733 B+Te1 lo Column43 Push to Column

143 Column 2 01!103 Wait102

64 18 to Waste2 Reverse Flushl Bloc.ka

103 Wan42 18 to Column

Step

.2 um CEmelo (two-columnfive-bm Monument)9:55:13P,

Step Active for BasesLQCIEYesYsYesYsYesYesYsYesYsYesYGYCSYCSYGSYGS

YsYesYesYesYes

YesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYes

Y'GYe'sYesYesYesYesYesYesYesYes

YesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYesYes

Yes Yes Yes Yes Ya

Yes Ys Yes Yes YesYes Ya Yes Yes YesYu Yes Y: Yes YesYes Yes Y: Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YaYes Yes Yes Yes YesYes Yes Ya Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Y: YesYes Yes Ys Yes Yes

Safe

én-zice IllC'cïcs de}sinteïï. ¡Loratico

Table Al-17. .2 um CE Cycle (two-column "vo-buon lnetrurnent)

Name: .2 um CE 9:55:13P. l/ 4/92Steps: 77Step Function Step Step Active for Bases SafeEmula. if. Ham: Jim: A. Q Q I 5 5.2.2

l 106 Begin Yes2 64 18 to Waste 3.0 Yes3 42 18 to Column 10.0 YesYesYesYesYes Yes4 2 Reverse Flush 8.0 YesYesYesYesYes Yes5 l Block Flush 4.0 YesYesYesYesYes Yes6 101Phos qu 3.0 Yes7 140 Column l On Yes8 lll Block Vent 2.0 YesYesYesYesYes Yes9 58 Tet to Waste 1.7 Yes

10 33 B+Tet to Column 2.0 YesYsYesYesYes Yesl l 34 Tet to Column l .0 YaYesYesYesYes Yes12 33 B+Tet to Column 1.5 - YesYesYesYesYes Yes13 43 Push ¡o Column Yes14 141 Column l OE Yes15 142 Column 2 On Yes16 64 ¡8 toWaste 4.0 Yes17 l Block Flush 3.0 YesYesYesYesYes Yes18 ll 1 Block Van 2.0 YesYesYesYesYes Yes19 58 Te: to Waste 1.7 Yes20 --33 B+Tet lo Column 2.0 YesYesYesYesYes Yes21 34 Te! to Column 1.0 YBYCSYCSYCSYCS Yes22 '33 B+Tet to Column 1.5 YesYesYesYesYes Yes23 43 Push lo Column Yes2.4 143 Column 2 Ofl' Yes25 103 Wait 25.0 Yes Yes Yes Yes Yes Yes2.6 1m Cap Ptep 3.0 Yes27 64 18 to Wase 4.0 Yes28 2 Reverse Flush 5.0 Yes Yes Yes Yes Yes Yes29 l Block Flush 3.0 Yes Y: Yes Yes Yes Yes30 39 Cap to Column 10.0 Yes Yes Yi: Ya Y: Yes31 103 Wan 5.0 Yes Yes Yes Yes Yes Yes32 64 18 toWaste 4.0 Yes33 2 Reverse Flash 5.0 Yes Yes Yes Yes Yes Yes34 l Block Bush 3.0 Yes Ya Yes Yes Yes Yes35 41 15 toColumn 8.0 Yes Yu Yes Yes Yes Yes36 64 18 toWaste 4.0 Yes Yes Yes Ya Yes Yes37 1 Block Flush 3.0 Yes Yu Yes Yes Yes Yes38 103 Wait 15.0 Yes Yes Yes Y: Yes Yes39 42 18 to Column 10.0 Yes Yes Yes Yes Yes Yes

Tabla AII.2.Ciclo de síntesis de ARN en escala 0.2 Emol.

Apéndice II.Ciclos del sintetizador automático-237

.2 um FINAWel- (two-eolurnnfive-bno lnssrurnsnt)

143 Cohnnn 2 Ofl'

leb AI-a.Name: .2 nm RNA

' Steps: 77Step WonNumb. í. Ham:

l 1062 64 18 toWaste3 42 18 to Column4 2 Revene RushS l Block Flush6 101 Phos ¡frep7 140 Column 1 On8 111Block Van9 58 'na to Waste

10 33 B+Tet to Columnll 34'1‘etnoColumn12 33 B+Tu to Column13 43 Push lo Column14 141 Column l 0C15 142 Column 2 On16 64 18 lo Waste17 l Block Flash18 111Bbck Van19 58 Tb! (o Waste20 33¡mu toColumn21 341M lo Column22 33 B+Tet to Column23 43 Push to Column24B2627282930313233343536

StepJim:

3.010.0

9:58:28P, 1/ 4/92

Step Active for BasesLQQIE

Ya Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes Yes

Ya Ya Yes Yes YesYa Yu Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Ya Ys Yes Yes YesYes Yes Yes Ya Yes

Yes Yu Yes Yes YesYu: Yes Yes Yes YesYes Ya Yes Yes Yes

Ya Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes


«ÁL''- 'j ' h: l , "4¿"—r" m + .A.noemce II.CEC2CSdel Summa-or a males

mn. ¡1.23.(cent)

Step Function

4041424344454647484950

5l525354555657SB

59606162636465666768697071727374757677

4 Flush lo Waste42 18 to Column2 Reverse Flushl Block Flash

105 Start Detrltyl64 18 to Waste42 18 to Column2 Reverse Flush1 Block Flush

167 IfMonitoríng44 19 lo Column

40 14 to Colmnn

135 Monimr uityls40 14 to Column

136 Monitor Noise40 14 to Column

l37 Stop Monitor42 18 to Colmnn2 Reverse Flash

168 If not Montring40 14 to Column

3 Trityl Flash40 14 to Column

103 Wait

3 TrixylFlush40 14 to Column

103 Wait

3 Trityl Flusn40 14 to Column

103 Wait

Stepmsnm: Slim:4.0

10.05.03 .0

4.010.05.03.0

25.0

3.0

35.0

10.0

4.0

Step Active for Bases¿3.5915Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes Yes

Ya Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Ya Yes Y:

Yes Yes Yu Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YeS‘Yes Yes Ya Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

No No Yes Yes YesNo No Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes


Yes Yes Yu Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Ya Ya YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYs Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes Yes

Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Safe

me¿5:

Apéndice Il.Cicios dei sinteïizador automático-239

Tabla AII.3. Procedimiento automático para Ia finalización de la síntesis de unoligodesoxinucleótido.

Table"-23. (cent)

Step Function StepEmula.fi. Ham: Jim:40 4 Rush toWaste 4.041 42 ¡a to Column 10.042 2 ReverseRush 5.043 l Bbck Rush 3.044 105 Stan Detrltyl45 64 18 to Waste 4.046 42 18 to Column 10.047 2 Rev-esseBush 5.048 l Block Flash 3.049 167 IfMonltm-lng50 44 19 to Column 25.051 40 14 to Column 3.052 135 Monitor uityls53 40 14 to Column 35.054 136 Monitor Noise55 40 14 to Column 10.056 137 Stop Monitor57 42 18 to Collnnn 10.058 2 Reverse Flush 8 059 168 Ifnot Menu-ing60 40 14 to Column 6 061 3 'Ih'tyl Flash 5 062 40 14 to Column 6 063 103 Wait 5 064 3 Trityl Rush 5.065 40 14 to Column 6 O66 103 Walt 5 067 3 Trityl Flash s o68 40 14 (o Column 6.069 103 Walt 5.070 3 ’IHIylHash 5.071 42 18 to Column 10.072 3 Triryl Bush 8.073 169 End Mmitnring74 42 18 to Column 8.075 2 Reverse Flush 5.076 l BlockBush 4.0'77 107 End

Step Active for Bases¡3.95215Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes


Yes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YerYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Ya Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesNo No Yes Yes YesNo No Yes Ya YesYes Yes Ya Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Ya Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes YesYes Yes Yes Yes Yes

Safe

Tabla Al|.4. Procedimiento automático para la finalización de Ia sintesis de unoiigorribonucieótido.

Table me. 394End Procodun Llnlng (EndRNA)

Name: End RNA 6:50:42P, 1/ 4/92Steps: 34

Step Function Step SafeNumh. L Name Iim Descriptlon 51:2

l 106 Begin Yu2 2 Revela: Rush 60.0 Husha column: and columnblocb Yes

inmese.3 115 Prep 10 15.0 Ptqnms ammonlum hydrmide for Yes

delivery.4 3610 to Conca 11.0 F1111mlnmn with ammonhnn Yes

hydroxide.5 64 ¡8 toWaste 5.0 Rm ¡agent block withaaetnniu-ueXes6 1 Block Flush 5.0 flashes tengan blocks. Yes7 103Walt 900.0 Amodlm hydroxideclaves Yes

ollgoinn suppm8 103 Wan 9MB Ammonimn hydroxjde deaves oligo Yes

kmemm9 3610 to Count: 11.0 Amman. hydrox delivery lo col. Yes

a anuncian vial.10 6418 ton 5.0 2ndrinsewithaccioniu'ile. Y:11 l Block Flush 5.0 2nd block flush. Yes12 103 Wan 900.0 Yu13 103wm 900.0 Ya14 36 10 lo Conan 11.0 Yes15 64 18 lo Waste 5.0 Yes

16 l Block Finch 5.0 Yes17 103 Wen 900.0 Yes18 103 Wa! 900.0 Yes19 36 10 lo Cullen 11.0 Yes20 64 18 to Waste 5.0 Yes21 1 Block Flash 5.0 Yet22 103 Wai! 900.0 Ya73 103 Wan 900 0 Yes24 5 Flash to Cullen 9.0 Flash: ammonlum hydroxjdeinto Yes

collect. vial¡Li 36 10 to Conca 9.0 Y:26 5 Flash tn Cullen 9.0 Yes21 2 Rm Bush 600 Yes28 1 Block Rush 4.0 Yes29 64 18 to Wan: 5.0 Yes

30 42 ¡B to Column x 30.0 Yu31 Revene Final: 60.0 Y“32 l BlockFlash 10.0 Y:

Apéndice II.Ciclos de! sintetizador automático-241

35

373839

414243

ll HushtoólZFlushto713HushtoB15FlushtoTetlóFlushlo 1017Flushto 11+12lBFlushlo 144-15l9Flushlo 1820Hushto 19l BbckFlush

107m

60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Yes60.0 Ya15.0 Yes

Yes

Apéndice i: Cicios cei sintetizador autcmáiico - 243

Apéndice llI

Espectros de RMN

AIII.1-2’-C-Meti|uridina (compuesto 8).

AIII.1.2- Espectro de 13CRMN (DMSO-ds).

W T . l . . . , . l . .160 14o 120 100 ao 60 4o 20

PPM

-‘- - . r“ Hz ‘AIA'W ,A A “,‘¡ï "J,HCvLCÍVS !:. Vidas J=¡s:::\;1._aJur :1 ÏCthlza-ÓC- ¿—4

Alll.1.3- Espectro de 1HRMN (DMSO-ds).

AIII.2- 2'-0-Tetrahidropiranil-5'-0-(4,4’-dimetoxitritil)-2’-Cmetiluridina 3'-(2-cianoetiI-N,N-diisopropi| fosforamidita) (compuesto13)

AIII.2.1-Espectro de 13cRMN(cock).

Apéndice II,Ciclos de! sintetizador automáiíco - 255

I I I ' I I ' - I I I

150 14o 120 100 ao so 4o 20PPM

AIII.2.2- Espectro de 1HRMN (CDCIa).

.- L. l 1' A: I \ r ' A Á U IA. . > I A 'FN.-'4nc.‘-A ‘." -i':-.r. rr'...,. I HLIVÍLÁKA. l. \_'¡\.:.CL‘V6! CIFECLIQQL/r HUÍC‘. ctm.) ¿"3

Alll.2.3- Espectro de 31PRMN (CDCIa).

¿A

“Life’s but a walking shadow; a poor player,That struts and frets his hour upon the stage,And then is heard no more: it is a tale

Told by an idiot, full of sound and fury,Signifying nothing.”

MacbethWilliam Shakespeare

Desarrollo de oligonucleótidos modificados químicamente...

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