PROTOCOLO A Observación e Identificación de microalgas y cianobacterias

INTRODUCCION

Las algas son organismos muy antiguos que se encuentran presenten en casi

todos los ecosistemas terrestres, presentan una amplia gama de formas, tamaños

y estrategias ecológicas y fisiológicas. Forman un grupo muy diverso, de origen

polifilético, con representantes eucariotas y procariotas, fundamentalmente

acuáticos, autotróficos y/o heterotróficos. Presentan menor complejidad que las

plantas, pero están filogenéticamente relacionadas con las mismas. Tal es así que

presentan rutas metabólicas semejantes como la fotosíntesis oxigénica, y la síntesis

y acumulación de hidratos de carbono y lípidos (Sheehan et al., 1998; Li et al., 2008).

Hasta el momento se han reportado alrededor de 45.000 especies de algas

y se estima que existe más del doble de especies sin identificar. Las algas son uno

de los principales responsables de la producción primaria mundial y son los

productores primarios por excelencia en ambientes acuáticos. Además, participan

en diferentes ciclos biogeoquímicos globales mediante la producción de oxígeno

atmosférico, regulación del clima y la generación de combustibles (Hu et al., 2008;

Sheehan et al., 1998).

Las algas se pueden clasificar de acuerdo a varios criterios tales como su

habitat, tipo de pigmento principal, ciclo de vida, morfología y estructura celular

(Brennan y Owende, 2010). El término microalga hace referencia a un grupo muy

heterogéneo de organismos eucariotas unicelulares cuyo tamaño varía de 2-200µm,

sin embargo, usualmente algunos autores también incluyen dentro de este grupo a

las cianobacterias, organismos procariotas fotosintéticos (Greenwell et al., 2009).

Los principales grupos de microalgas (en términos de abundancia) son:

Cryptophyta, Dinophyta, Euglenophyta, Bacillarophyta y Chlorophyta (Bellinger y

Sigee, 2011; Mutanda et al., 2010, Sheehan et al., 1998).

OBJETIVO Conocer las principales características para la clasificación de microalgas y

cianobacterias y observar las diferentes morfologías y estructuras presentes en las

mismas.

PROCEDIMIENTO

1) En un portaobjetos agregar una gota (10 µL) de cultivo y colocar un

cubreobjetos. Observar la preparación al microscopio, si la imagen no es muy clara

agregar una gota de aceite de inmersión y observar a 50X.

2) Observar morfología y características generales (plastos, pirenoides,

presencia de espinas o espículas, flagelos, estructuras de resistencia, acinetos,

heterocistos, etc.)

Recuento celular de microalgas INTRODUCCION

A pesar del enorme desarrollo tecnológico que ha tenido lugar en los

laboratorios científicos, el conteo visual con hematocitómetro sigue siendo el

método de conteo más utilizado. La cámara Neubauer consiste en una placa gruesa

con forma de porta, cuya porción central está dividida en tres bandas longitudinales

perpendiculares a su eje longitudinal. De ellas, las dos laterales se encuentran sobre

elevadas con respecto de la central en 0.1 mm, y en la central hay grabado un

retículo cuadrangular.

Típicamente, el rango de concentraciones que permite contar el

hematocitómetro está entre 2,5x105 células y 2,5 x106 células por ml. Intentaremos

que la muestra tenga una concentración en torno a 106 (1 millón) aplicando las

diluciones correspondientes.

Por encima de 2,5 millones (2,5 * 106) la probabilidad de cometer errores de

conteo crece demasiado, y también el tiempo y esfuerzo necesario para realizar un

recuento con fiabilidad. Por encima de esta concentración es conveniente diluir la

muestra para acercar la concentración al rango óptimo.

PROCEDIMIENTO

Se toman 10 uL de la muestra de microalgas.

1) Se coloca un cubreobjetos sobre la cámara de Neubauer,

2) Se coloca la punta de la pipeta en el borde del cubreobjetos, en el extremo

de la cámara de Neubauer. Se trata de dejar que el líquido penetre entre la cámara

y el cubreobjetos desde el lateral, por capilaridad.

3) En caso de que aparezcan burbujas, el cubreobjetos se haya movido o

algo no haya salido bien, repetir la operación

4) Observar bajo microscopio óptico a un aumento de 50X

MATERIALES Microscopio óptico

Aceite de inmersión

Cubreobjetos

Portaobjetos

Pipetas

Cámara de Neubauer BIBLIOGRAFIA 1. Bellinger, E. G., & Sigee, D. C. (2011). Freshwater algae: identification and use as

bioindicators. John Wiley & Sons.

2. Brennan, L., & Owende, P. (2010). Biofuels from microalgae—a review of technologies for

production, processing, and extractions of biofuels and co-products. Renewable and

Sustainable Energy Reviews, 14(2), 557-577.

3. Greenwell, H. C., Laurens, L. M. L., Shields, R. J., Lovitt, R. W., & Flynn, K. J. (2010). Placing

microalgae on the biofuels priority list: a review of the technological challenges. Journal of the

Royal Society Interface, 7 (46), 703-726.

4. Hu, Q., Sommerfeld, M., Jarvis, E., Ghirardi, M., Posewitz, M., Seibert, M., & Darzins, A.

(2008). Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production: perspectives and

advances. The Plant Journal, 54(4), 621-639.

5. Li, Q., Du, W., & Liu, D. (2008). Perspectives of microbial oils for biodiesel production. Applied

Microbiology and Biotechnology, 80(5), 749-756.

6. Mutanda, T., Ramesh, D., Karthikeyan, S., Kumari, S., Anandraj, A., & Bux, F. (2011).

Bioprospecting for hyper-lipid producing microalgal strains for sustainable biofuel

production. Bioresource Technology, 102(1), 57-70.

7. Sheehan, J., Dunahay, T., Benemman, J., Roessler, P.G. 1998. US Department of Energy.s

Office of Fuels development, July 1998. A Look back at the US Department of energy´s

Aquartic Species Program - Biodiesel from Algae, Close out report TP-580-24190. Golden,

CO: National renewable Energy Laboratory.

Anexo Protocolo A

CLAVES DICOTÓMICAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ALGAS

1. Pigmentos dispersos en el citoplasma, sin plástidos ni núcleo definidos, raramente de color verde intenso….CYANOPHYTA

1’. Pigmentos reunidos en uno o varios plástidos, con núcleo….2

2. Plástidos verde intenso….3 2’. Plástidos verde-amarillento, marrones o amarillos….4

3. Reserva de almidón en los plástidos, coloreable con yodo, unicelulares, coloniales o filamentosas….CHLOROPHYTA

3’. Reserva de paramilon fuera de los plástidos, no coloreable con yodo, mayormente unicelulares….EUGLENOPHYTA

4. Sin reservas de almidón….CHRYSOPHYTA 5 4’. Con reservas de almidón….6

5. Con 1 o 2 flagelos….CHRYSOPHYCEAE 5’. Sin flagelos, con cubierta silícea formada por dos valvas que poseen diversas

ornamentaciones….BACILLARIOPHYCEAE

6. Células provistas de 2 flagelos desiguales y de diferente orientación ubicados en un surco ecuatorial y otro longitudinal….PYRROPHYTA

6’. Células comprimidas provistas de 2 flagelos ligeramente desiguales ubicados en una foseta subapical….CRYPTOPHYTA

CYANOPHYTA

1. Células solitarias o reunidas en cenobios o colonias....2 1’. Células formando filamentos (tricomas)....5

2. Células irregularmente dispuestas....3 2’. Células regularmente dispuestas....4

3. Células envueltas en vainas gelatinosas estratificadas....Chroococcus 3’. Células rodeadas por vaina gelatinosa difluente, no estratificada....Microcystis

4. Células dispuestas en cenobios planos, rectangulares....Merismopedia 4’. Células dispuestas en la periferia de cenobios

esféricos u ovoides....Coelosphaerium

5. Filamentos con heterocistos y/o acinetos....6 5’. Filamentos sin heterocistos ni acinetos, multiplicación sólo por hormogonios....11 6. Heterocistos y acinetos escasos, células terminales generalmente incoloras y alargadas....Aphanizomenon

6’. Heterocistos y acinetos frecuentes, filamentos solitarios o agrupados....7

7. Filamentos enrollados y entrelazados dentro de una vaina gelatinosa formando un conjunto globoso consistente....Nostoc

7’. Filamentos solitarios o en conjuntos no consistentes....8

8. Filamentos únicamente con acinetos, cortos y con extremos aguzados….Raphidiopsis

8’. Filamentos con heterocistos y acinetos….9

9. Heterocistos generalmente en los extremos del filamento,....Anabaenopsis 9’. Heterocistos generalmente intercalares….10

10. Generalmente células más anchas que largas, filamentos con vaina individual….Nodularia

10’. Generalmente células esféricas o en forma de barril, sin vaina individual....Anabaena

11. Filamentos provistos de una vaina individual firme....Lyngbya 11’. Filamentos sin vaina....12

12. Filamentos espiralados....Spirulina 12’. Filamentos rectos o curvados....13

13. Células separadas por un puente gelatinoso....Pseudoanabaena 13’. Células adyacentes unidas ....Oscillatoria

CHLOROPHYTA

1. Organismos flagelados, unicelulares o coloniales....Volvocales 2 1’. Organismos no flagelados, unicelulares, cenobiales o filamentosos....5

Volvocales

2. Unicelulares, pared celular gruesa, plástido en forma de copa....Chlamydomonas 2’. Coloniales, de forma esférica o elipsoidal....3

3. Células apretadas unas contra otras....Pandorina 3’. Células más distantes unas de otras....4

4. Células dispuestas en capas más o menos paralelas....Eudorina 4’. Células irregularmente dispuestas....Volvox

5. Unicelulares o cenobiales….Chlorococcales 6 5’. La mayoría filamentosos….16

Chlorococcales

6. Unicelulares....7 6’. Cenobiales....9

7. Células fusiformes....Monoraphidium 7’. Células isodiamétricas....8

8. Células esféricas....Chlorella 8’. Células tetraédricas....Tetraedron

9. Células fusiformes....10 9’. Células más isodiamétricas....12

10. Rectas o con forma de media luna poco marcada....Ankistrodesmus 10’. Con forma de media luna bien redondeada....11

11. Células adheridas unas a otras....Selenastrum 11’. Células dispersas....Kirchneriella

12. Células dispersas en una matriz gelatinosa esférica....13 12’. Células adheridas unas a otras....14

13. Células ovoides....Oocystis 13’. Células esféricas....Sphaerocystis

14. Cenobio en forma de empalizada....Scenedesmus 14’. Cenobio con simetría radial....15

15. Cenobio plano....Pediastrum 15’. Cenobio esférico....Coelastrum

16. Filamentos no ramificados, algunas también pueden ser unicelulares….17 16’. Filamentos ramificados….28

17. Zonas de elongación celular en forma de anillo….Oedogonium (Oedogoniales) 17’. Sin zonas de elongación celular diferenciadas….18

18. Conjugación sexual de gametas ameboides no flageladas….Zygnematales 19

18’. Gametas flageladas….Ulothrichales 26

Zygnematales

19. Membrana de la célula formando 2 hemicélulas, con poros, en su mayoría unicelulares….Desmidiaceae 20

19’. No forman hemicélulas, todas filamentosas….Zygnemataceae 24

Desmidiaceae

20. Filamentosas….Spondylosium 20’. Unicelulares….21

21. Células sin istmo (constricción que separa las hemicélulas), con forma de media luna más o menos marcada....Closterium

21’’. Células con istmo....22

22. Células con brazos (proyecciones apicales que sobresalen notablemente del cuerpo de la célula)....Staurastrum

22’. Células sin brazos....23

23. Células que presentan numerosos lóbulos profundamente marcados....Euastrum 23’. Células con pocos lóbulos, superficialmente marcados....Cosmarium

Zygnemataceae

24. Plástidos estrellados con un solo pirenoide ….Zygnema 24’. Plástidos con numerosos pirenoides….25

a 1 o 2 plástidos axiales en forma de placa….Mougeotia 25’. 1 a 16 plástidos parietales espiralados….Spirogyra

Ulothrichales

25. Las células quedan unidas de a pares después de la división celular y contenidas dentro de la membrana original....Binnuclearia

26’. Las células no quedan de esa forma....27

26. Células redondeadas en los extremos dispuestas dentro de una vaina general, en los extremos de cada célula se observa un gránulo refringente....Planctonema 27’. Células rectas, con un cloroplasto parietal en forma de anillo incompleto, raramente completo....Ulothrix

27. Monocarióticas, cloroplasto parietal cilíndrico, talo heterotrico (constituido por una parte postrada y filamentos erectos)….Chaetophora (Chaetophorales)

28’. Policarióticas, cloroplasto parietal reticulado con numerosos pirenoides…Cladophora (Cladophorales)

EUGLENOPHYTA

1. Formas sin flagelo, fijas formando colonias....Colacium 1’. Formas flageladas, solitarias, libremente nadadoras....2

2. Células con teca o lórica....3 2’. Células sin teca o lórica....4

3. Lóricas aguzadas en ambos extremos....Strombomonas 3’. Lóricas esféricas o elipsoidales....Trachelomonas

4. Células de sección transversal circular, generalmente alargadas....Euglena 4’. Células de sección transversal comprimida, generalmente

más redondeadas....Phacus

PYRROPHYTA

1. Células sin teca celulósica....Gymnodinium 1’. Células con teca....2

2. Con 1 cuerno largo en la epiteca y 2 o 3 en la hipoteca....Ceratium 2’. Sin cuernos o con cuernos reducidos...3

3. Con 1 placa antiapical (acompañada de 1 suplementaria)....Gonyaulax 3’. Con 2 placas antiapicales más o menos del mismo tamaño....4

4. Con 2 o 3 placas intercalares anteriores y 5 placas postcingulares....Peridinium 4’. Sin placas intercalares anteriores o con 1 sola....Glenodinium

CRYPTOPHYTA

1. Citofaringe conspicua, cromatóforos desde verde-oliva hasta marrones....Cryptomonas 1’. Citofaringe inconspicua o ausente....2

2. Cromatóforo desde verde-oliva hasta marrón o rojo con 1 pirenoide....Rhodomonas 2’. Cromatóforo laminado parietal azul o azul-verdoso....Chroomonas

CHRYSOPHYTA

CHRYSOPHYCEAE

1. Células cubiertas por una lóriga en forma de vaso alargado, solitarias o formando colonias arborescentes....Dinobryon

1’. Células cubiertas por escamas silíceas....2

2. Formas solitarias....Mallomonas 2’. Formas coloniales globulosas....Synura

8.