UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

Cultivo de microalgas Reporte de servicio social

Dirigido por: Dra. Marieke Koopmans

Balderas Hernández Diana Cecilia;Cruz Calixto Jhosafat

25/07/2014

Contenido

I. Introducción ................................................................................................................ 2

II. Antecedentes .............................................................................................................. 2

III. Objetivo ................................................................................................................... 5

IV. Metodología ............................................................................................................. 5

a) Microalgas ............................................................................................................... 5

b) Preparación del medio e inoculación ....................................................................... 5

i. Medio de 1L .......................................................................................................... 5

ii. Medio de 10 y 20L ................................................................................................ 6

c) Densidad óptica (técnica turbidimétrica) .................................................................. 6

d) Medida del peso seco .............................................................................................. 7

e) Conteo al microscopio ............................................................................................. 8

f) Cosecha ................................................................................................................ 10

V. Resultados y discusiones .......................................................................................... 11

a) Observaciones ....................................................................................................... 11

b) Conteo al microscopio ........................................................................................... 12

c) Peso seco .............................................................................................................. 13

d) Cultivo en volumen de 1L ...................................................................................... 14

e) Cultivo en volumen de 10 y 20 ............................................................................... 16

f) Comparación entre los volúmenes de cultivo ........................................................ 18

VI. Conclusiones ......................................................................................................... 19

VII. Recomendaciones ................................................................................................. 20

VIII. Bibliografía ............................................................................................................. 21

I. Introducción

La energía es la fuerza que dirige el crecimiento económico y el desarrollo mundial. En

años recientes, el rápido desarrollo de la economía mundial ha agotado las fuentes de

combustibles fósiles trayendo consigo problemas ambientales importantes, por lo tanto, el

desarrollo y la utilización de nuevas fuentes de energía se ha convertido en una práctica

común en todo mundo. (Marcilla et al, 2012).

El estudio de diferentes aspectos relacionados al comportamiento de las microalgas ha

recibido un interés importante debido al amplio campo de aplicación de estos organismos.

Generalmente, las microalgas contienen cantidades importantes de lípidos, carbohidratos,

proteínas y pigmentos, entre otros componentes. Los cultivos de microalgas han sido

principalmente desarrollados como una importante fuente de productos de nutrición

acuícola, suplementos alimenticios y farmacéuticos; pero también se han sugerido como

buenos candidatos para la producción de combustible. Varios estudios publicados

muestran la posibilidad de obtener biodiesel de alta calidad mediante esterificación y

transesterificación convencionales a partir de los lípidos acumulados en las células de las

microalgas (Valdés et al, 2012).

II. Antecedentes

El incremento en el consumo de energía ha causado varias preocupaciones acerca de la

seguridad energética y la degradación del medio ambiente, más y más atención de parte

de las comunidades académicas e industriales se ha dirigido a producir energía renovable

a partir de biomasa, principalmente biodiesel (Wu et al, 2012) a partir de oleaginosas. Sin

embargo, el cultivo de estas plantas no es sustentable debido al requerimiento de grandes

superficies cultivables, consumo de agua y desplazamiento de otros cultivos destinados

al consumo como alimentos para los seres humanos (Halim et al, 2012).

Las microalgas han sido reconocidas como una prometedora fuente alternativa de lípidos

para la producción de biodiesel. Estas son un grupo de diversos organismos fotosintéticos

que pueden acumular grandes cantidades de lípidos, hasta el 50% del peso seco total en

algunas especies (Halim et al, 2012). El crecimiento de las microalgas se puede generar

en sistemas abiertos como estanques y canales artificiales o sistemas cerrados como

fotobioreactores tubulares o laminares. Siendo las microalgas una forma de vida vegetal

requiere para su crecimiento fuentes de luz, carbono y nutrientes, dichos nutrientes

pueden obtenerse de aguas de desecho mientras que el carbono lo obtienen de la

atmosfera (Demirbas y Demirbas, 2011, Chun-Yen et al, 2011).

Los recipientes de cultivo comúnmente usados son de materiales no tóxicos como las

cajas de Petri, matraces Erlenmeyer, matraces Ferenback, o garrafas, adecuados para

cultivos de laboratorio. Para cultivos a gran escala los recipientes de plástico, madera y

concreto son los más recomendables. En cultivos masivos la aireación es un factor

importante para la homogenización de los nutrientes y para evitar la sedimentación de las

microalgas. Algunas especies suelen acumularse en lugares donde el agua no se mezcla,

éstas también depende de la forma del recipiente de cultivo que cuando no es adecuado

retarda el crecimiento (Torrentera et al, 1989). El crecimiento y la división celular son

afectados por la temperatura y por la penetración de la luz en el cultivo. En los cultivos a

gran escala la profundidad es tan grande que la intensidad de la luz incidente no es

suficiente para la fotosíntesis, hasta el fondo del tanque. La adición de CO2 amortigua el

agua contra los cambios de pH, es recomendable la inyección de CO2 (0.5%) para

contribuir al proceso fotosintético (Catalá-Esteve L, 2013).

Aunque muchas variedades de microalgas tiene un alto contenido lipídico natural, como

se muestra en el cuadro II:1 junto con otros compuestos disponibles, es posible

incrementar la concentración optimizando los factores de crecimiento, como los niveles de

nitrógeno disponibles (Fei-Fei et al, 2013), la intensidad de la luz, la temperatura, la

salinidad, la concentración de CO2 y el procedimiento de cosechado (Elmoraghy et al,

2012). Por eso es necesario poder controlar estas variables durante el cultivo. Sin

embargo, el aumento en la acumulación de lípidos no resulta necesariamente en el

aumento de la productividad. La acumulación se refiere al contenido total de lípidos en

relación al total de la biomasa mientras que la productividad se refiere al total de lípidos

producidos (Brennan y Owende, 2010; Ghasemi et al, 2012).

Cuadro II:1 Perfil de composición de la biomasa de diferentes especies de microalgas.

Especie Lípidos

(%)

Proteína cruda (%)

Carbohidratos (%)

Clorofila total (%)

Carotenoides (%)

Ácidos grasos ω3 (%)

Fuente

Para este estudio se utilizaron únicamente tres especies de microalgas, en el cuadro II:2

se presenta la taxonomía de cada especie.

Cuadro II:2 Clasificación taxonómica.

Especie Taxonomía

C. kessleri Reino: Plantae Filo: Chlorophyta Clase: Trebouxiophyceae Orden: Chlorellales Familia: Chlorellaceae Género: Chlorella

N. oleoabundans Reino: Plantae Filo: Chlorophyta Clase: Chlorophyceae Orden: Sphaeropleales Familia: Neochloridaceae Género: Neochloris

Phaeodactylum Reino: Chromista Filo: Ochrophyta Clase: Bacillariophyceae Orden: Naviculales Familia: Phaeodactylaceae

Phaeodactylum 18 34.6 26.1 2.04 0.243 2.5 Rebolloso-Fuentes, M. (2001)

Nannochloropsis ssp.

18.4 28.8 37.6 0.29 0.06 2.24 Rebolloso-Fuentes, M. (2001)

N. oleoabundans

*35-65 32.2-12.3

9.4-3

*Custodio-Franco, (A. 2013) Band-Schmidt (1999)

Chrorella. vulgaris

14-22 51-58 *16

Becker (2007) *Morris-Quevedo (1999)

III. Objetivo

Evaluar el crecimiento de las especies de microalgas C. kessleri, N. oleoabundans y

Phaeodactylum, cultivadas bajo condiciones controladas en un laboratorio y ambientales

dentro de un invernadero.

IV. Metodología

a) Microalgas

Se utilizaron cepas de Chlorella kessleri, Neochloris oleoabundans, y Phaeodactylum

provenientes de la Universidad Autónoma Metropolitana (UAM). Se cultivaron en 100ml

de agua, previamente esterilizada en una autoclave a una temperatura y presión de 121°C

y 103kPa respectivamente durante 20 minutos, a una concentración de 0.1% Bayfolan

forte, almacenándolas en una incubadora con iluminación 12 horas al día a 120rpm. Se

realiza este mismo procedimiento dos veces al mes.

b) Preparación del medio e inoculación

i. Medio de 1L

En 900 ml de agua se agregan 3 ml de cloro y se deja

en aireación constante durante 24 horas. Después de

transcurridas las 24 horas, se agregan 0.5g de tiosulfato

de sodio y se deja nuevamente en aireación constante

por lo menos 4 horas. Al termino del tiempo de aireación,

se agregan 0.9 ml de solución nutritiva (Bayfolan forte),

inmediatamente después se toman 100 ml de la cepa y

se agregan al agua con

aireación constante e

iluminación, etiquetando los nuevos cultivos con la

especie que contienen, fecha de inoculación, y

concentración de Bayfolan forte del medio. Después de

inocular hay que medir la densidad óptica para saber la

concentración inicial.

Ilustración IV:1 Preparación medio de 1L.

Ilustración IV:2 Preparación medio de 10L.

ii. Medio de 10 y 20L

En 10L de agua se agregan 30 ml de cloro y se deja en aireación constante durante 24

horas. Después de transcurridas las 24 horas, se agregan 5g de tiosulfato de sodio y se

deja nuevamente en aireación al menos durante 4 horas. Al término del tiempo de

aireación, se agregan 10 ml de solución nutritiva (Bayfolan forte), inmediatamente después

se toma 1L de la cepa y se agrega al agua con aireación constante, etiquetando los nuevos

cultivos con la especie que contienen, fecha de inoculación, y concentración del medio.

Una vez que la concentración de los 10L llegue a una densidad óptica aproximada de 1ua

(unidades de absorbancia), se agregan otros 10L que hayan sido previamente preparados

de acuerdo a la metodología anterior para aumentar el volumen del cultivo.

c) Densidad óptica (técnica turbidimétrica)

Está basada en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen

microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las células en

suspensión.

Ilustración VI:3 Cultivo en volumen

de 10L.

Ilustración VI:4 Cultivo en volumen

de 20L

Se utiliza un espectrofotómetro visible (Thermo scientific) para determinar densidad óptica

de la muestra. Se realiza la medición a 3 longitudes de onda (530, 680 y 750 nm). Se

utilizan las lecturas a 750 nm para medir la tasa de crecimiento porque la absorbancia a

esta longitud de onda es proporcional al número de células que hay en un cultivo y es una

medida eficaz debido a que ningún pigmento absorbe a 750 nm. Las otras lecturas, son

para la absorción de pigmentos carotenoides (530 nm) y para la absorción de clorofila a

(680 nm).

Agitar el medio para que las muestras sean lo más homogéneas posibles, especialmente

en el medio de 10 y 20L.

Cuando las lecturas superen la unidad de absorbancia, se deben realizar las diluciones

necesarias para mantener valores menores a uno. Cuando se realice cualquier dilución

de la muestra, esta debe leerse por duplicado.

El valor promedio de las dos lecturas obtenidas para cada dilución se multiplicara por el

factor de dilución y así reportar en graficas de acuerdo al valor real.

Ejemplo:

Registrar la hora exacta de la medición para establecer un comportamiento real del

crecimiento.

d) Medida del peso seco

Consiste en la filtración del cultivo a través de una membrana que retenga las células y su

posterior desecación hasta peso constante.

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 15

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

C. Kessleri

N. oleabundans

Phaeodactilum

Se coloca el papel filtro (Whatman #1) en la estufa a 70°C un día antes de la medición

(peso papel filtro). Una vez que el papel filtro este a peso constante, se saca de la estufa,

se deja enfriar en un desecador y luego se debe tomar lectura del peso. Con la ayuda de

una pipeta y agitando el medio para que las muestras sean lo más homogéneas posibles,

se lleva a cabo la filtración de 10 ml de muestra del cultivo, por duplicado. Se seca en la

estufa a 70 °C la muestra filtrada, durante un día (peso muestra seca). Al día siguiente se

pesa el papel, después de haberlo dejado enfriar en un desecador, para establecer la

fracción de peso que corresponde a la muestra. Al final se multiplica por un factor de 100

para obtener una concentración de g/L.

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 =(𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝑠𝑒𝑐𝑎 − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑝𝑎𝑝𝑒𝑙 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑜)

10𝑚𝑙× 1000𝑚𝑙 =

𝑔

𝐿

e) Conteo al microscopio

Se efectúa un conteo directo de células en un área determinada para obtener el número

de células por mililitro de muestra.

Utilizando una cámara Neubauer, se toma una muestra del cultivo con ayuda de una pipeta

Pasteur y se coloca en la cámara limpia y completamente seca. Se observa en el

microscopio con el objetivo 40x. Con el número de células obtenidas, se define el número

de microalgas por mililitro de muestra.

El número de células es la suma de todas las células contadas en todos los cuadros.

Ejemplo.

Como el volumen de 1 cuadro grande es:

0,1 cm x 0,1 cm = 0,01 cm2 de superficie

0,01 cm2 x 0,1 mm (profundidad) = 0,01 cm2 x 0,01 cm = 0,0001 cm3 = 0,0001 ml

La fórmula para recuento con cuadros grandes en cámara de Neubauer

En el caso de que se haga una dilución, se tomara en cuenta ese factor para encontrar la

concentración:

Contar las células en los cuadros donde se les haga más fácil su observación y encontrar

una cantidad de por lo menos 300 células.

El cuadrado grande central (que se puede ver en su totalidad con el objetivo 10X; ver

figura), está dividido en 25 cuadrados medianos (con el objetivo 40X se pueden ver los

cuadrados medianos completamente; ver figura), cada uno de ellos con 16 cuadrados

pequeños en su interior. Los cuatro cuadrados grandes de las esquinas (no se muestran

en la figura), están formados por 16 cuadrados medianos.

El recuento se puede realizar tanto en el cuadrado grande central como en los de las

esquinas, dependiendo del tamaño de las células en estudio.

f) Cosecha

La cosecha se realiza en tinas con capacidad suficiente para el medio de 20 L. Dejando

que el agua de evapore para obtener microalgas secas. El medio de cultivo debe estar en

un rango aproximado de 1.5ua cuando se deposite en las tinas.

Las tinas deben estar forradas con plástico grueso por el interior, para hacer más sencilla

la recolección de las microalgas secas y tener la menor perdida posible. También se deben

cubrir con una malla negra para evitar contaminaciones en el cultivo y aumentar la

temperatura de secado dentro de la tina.

Etiquetar la tina con la especie, el día y la absorbancia a la que inicia el secado.

Pesar la materia seca obtenida, guardar en recipientes cerrados, etiquetando con la

especie, fecha de inoculación en medio de 20L y fecha de cosecha.

V. Resultados y discusiones

a) Observaciones

Se observaron las caracteristicas físicas de las especies de microalgas Chlorella kessleri,

Neochloris oleabundans y Phaeodactylum (Cuadro V.1), cultivadas en recipientes de 1L

con Bayfolan 0.1%, aereación 24 horas al dia e iluminacion artificial.

Cuadro V:1 Observaciones e imágenes de las especies de microalgas cultivadas.

Especie Observaciones Imagen 40x

C. kessleri Células bien separadas, de igual tamaño entre ellas y pequeñas en comparación con otras especies.

Tienen movimiento vibratorio escaso. Había pocas agrupaciones.

Tienen buena distribución pero comienzan a agruparse en pares.

Imagen IV:5 Forrado del interior de las tinas. Imagen IV:6 Etiquetado y cobertura de las

tinas con malla negra.

N. oleoabundans

Habia varias agrupaciones de celulas y estas variaban en tamaño, habia celulas muy pequeñas respecto a las demas.

Existia poco movimiento vibratorio o casi nulo. Tenian tamaño variado, grandes y muy pequeñas.

Tienen un tamaño pequeño y homogeneo entre ellas. No se han agrupado mas.

Phaeodactylum Había escasas células alargadas y ovoides con la pared celular bien definida.

Hay gran población con respecto a las demás especies, no se encuentran aisladas pero tampoco están aglutinadas entre ellas.

Continúa la presencia de microalgas alargadas aunque en menor proporción que las ovoides.

b) Conteo al microscopio

Se midió el crecimiento de las especies microalgales utilizando la técnica de conteo al

microscopio, se estableció una relación respecto a la densidad óptica a 750nm que nos

permite obtener un valor exacto de número de células por mililitro de forma rápida y

eficiente sin tener que realizar nuevamente la metodología descrita anteriormente. En las

gráficas de la figura V:1 se muestran las ecuaciones de densidad óptica de las tres

especies estudiadas, podemos observar que la especie C. kessleri muestra la mejor

correlación entre los puntos obtenidos, a diferencia de N. oleoabundans y Phaeodactylum

cuya relación entre la absorbancia y el conteo de células es muy dispersa y por lo tanto,

el cálculo de células a partir de la ecuación será inexacto.

Figura V:1 Variación de la concentración de células respecto a la densidad óptica de C. kessleri, N. oleoabundans y Phaeodactylum.

c) Peso seco

El monitoreo del peso seco de los cultivos de microalgas nos permite obtener la cantidad

de materia seca que se puede alcanzar en una determinada fase del cultivo, a partir del

valor de densidad óptica a 750nm podremos predecir el rendimiento en la cosecha. En

figura V:2 se muestra las ecuaciones de peso seco de las tres especies estudiadas, para

comprobar su veracidad se puede comparar el rendimiento teórico con el real.

Desafortunadamente C. kessleri y N. oleoabundans no alcanzaron una densidad óptica

alta debida a factores ajenos al cultivo, pero las correlaciones obtenidas por parte de las

tres especies nos permite asegurar resultados confiables.

y = 1E+07x -556363

R² = 0.7988

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2

Cel

ls/m

l

Mill

on

es

Absorbancia (750nm)

C. kessleri

y = 2E+07x -819450

R² = 0.7245

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2

Cel

ls/m

l

Mill

on

es

Absorbancia (750nm)

N. oleabundans

y = 3E+07x -6E+06

R² = 0.7059

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 2

Cel

ls/m

l

Mill

on

es

Absorbancia (750nm)

Phaeodactylum

Figura V:2 Variación del peso seco respecto a la densidad óptica de C. kessleri, N. oleoabundans y

Phaeodactylum.

d) Cultivo en volumen de 1L

Se cultivaron en volúmenes de 1L, 9 generaciones para las especies C. kessleri y N.

oleoabundans y 8 generaciones para la especie Pheodactylum, dentro de un lapso de

tiempo que comprende del 27/08/2013 al 13/06/2014. En figura V:3 se presentan todas

las generaciones cultivadas para cada especie, las generaciones están ubicadas en orden

cronológico comprendido en el periodo de estudio, expresado anteriormente. En

Phaeodactylum no se cultivó la generación 6 (G6) y en las otras dos especies esta

generación tuvo un comportamiento diferente, puesto que tiende a disminuir el peso seco

en el penúltimo día de cultivo y luego vuelve a incrementar, esta diferencia pudo haber

sido producto de no tener un agitado adecuado del medio que contenía a las microalgas

al momento de tomar la muestra, tal circunstancia se considera como un error debido al

operador.

y = 0.5933x + 0.1363

R² = 0.9304

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 1 2

Pes

o s

eco

(g/

L)

Absorbancia (750nm)

C. kessleri y = 0.4506x + 0.1681

R² = 0.9901

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 1 2

Pes

o s

eco

(g/

L)

Absorbancia (750nm)

N. oleabundans y = 0.5661x + 0.1825

R² = 0.9879

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 1 2

Pes

o s

eco

(g/

L)

Absorbancia (750nm)

Phaeodactylum

Figura V:3 Peso seco respecto a los días de cultivo para las generaciones cultivadas en un volumen de 1L de C. kessleri, N. oleoabundans y Phaeodactylum.

Con base a la gráfica podemos decir que se puede obtener de 0.4 a 1.2 g de C. kessleri/L

habiendo transcurrido alrededor de 10 días, indicando que su crecimiento no es constante

entre generaciones principalmente después de la séptima generación. N. oleoabundans

tiene una diferencia de peso seco menor en los mismos 10 días, ayudando a establecer

que en un periodo de tiempo determinado se obtendrá una cantidad definida de peso seco,

solo la última generación fue la que presentó un comportamiento diferente. Para

Phaeodactylum el comportamiento de las generaciones es muy similar entre ellas

siguiendo casi la misma trayectoria y dando un mejor crecimiento de la especie durante

todas las inoculaciones realizadas.

Es importante destacar que, cuando es una misma generación, las especies de microalgas

se comportan de forma similar entre ellas, es decir, que C. kessleri, N. oleoabundans y

Phaeodactylum cultivadas en volumen de 1L, son susceptibles a los mismos factores. Se

obtuvo la ecuación exponencial de crecimiento para cada generación que se cultivó en

volumen de 1L de cada especie, y así, se pudo conocer el incremento del peso seco por

día, en el cuadro V:2 se presenta un resumen de los datos extraídos y el análisis

estadístico de la tasa de incremento del peso seco por día para cada especie.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 10 20

Pes

o s

eco

g/L

Dias

C. kessleri

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 10 20

Pes

o s

eco

g/L

Dias

N. oleoabundans

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

0 10 20

Pes

o s

eco

g/L

Dias

Phaeodactylum

Cuadro V:2 Datos generales para cada especie, tomando en cuenta todas las generaciones cultivadas en volumen de 1L.

C. kessleri N. oleoabundans Phaeodactylum

N (número de generaciones

cultivadas) 9 9 8

Densidad óptica máxima (ua)

1.983 2.368 2.031

Peso seco máximo (g/L)

1.310 1.235 1.332

Promedio de la tasa de incremento de

peso seco (g/L/día) 0.113 0.116 0.124

Desviación estándar (g/L)

0.041 0.037 0.037

Podemos observar que a pesar de que N. oleoabundans alcanzó la densidad óptica más

alta, en comparación con las otras especies, ésto no quiere decir que su peso seco sea

también el más alto, por otro lado Phaeodactylum tiene la mayor tasa de incremento de

densidad óptica diaria, el peso seco obtenido es mayor, comparándolo con las demás

especies, además de que se ve favorecido por la desviación estándar. C. kessleri se ve

afectada por los altos valores de desviación estándar, pero a pesar de ser el cultivo que

menor valor de densidad óptica alcanzó, el peso seco que se calculó mediante el uso de

la ecuación ocupa el segundo lugar.

e) Cultivo en volumen de 10 y 20

El cultivo en volúmenes de 10 y 20L se llevó a cabo dentro de un invernadero, pero la

temperatura dentro de éste era muy susceptible a las condiciones ambientales e incluso

a los cambios que había entre el día y la noche.

Primero se inocula un medio de 10L y después de alcanzar cierta absorbancia, se puede

realizar una dilución a 20L para obtener mayor cantidad de microalgas con el mismo monto

de cepa. Cómo no se conocía la absorbancia adecuada para realizar la dilución se llevaron

a cabo 2-3 generaciones de cultivo para encontrar un valor que permitiera la dilución y así

obtener buen crecimiento en el volumen de 20L y poder cosechar de mayor materia seca.

La primera generación (G1) se inoculó el 09/09/2013 (día 0) para las tres especies en

volúmenes de 10L, se realizó la dilución a 20L solo para C. kessleri el 13/09/2013 (día 4)

y para N. oleoabundans y Phaeodactylum el 20/09/2013 (dia11). En esta generación se

alcanzaron valores de absorbancia cercanos a 0.6ua antes de la dilución (figura V:4) y el

comportamiento de crecimiento después de la dilución continuó para las tres especies

logrando llegar a 0.8ua en volumen de 20L. Excepto para Phaeodactylum que no registró

buen crecimiento desde el inicio.

La segunda generación (G2) se inoculó el 03/10/2013 (día 0) solo para las especies N.

oleoabundans y Phaeodactylum, la dilución se hizo el 15/10/2013 (día 10) a valores

cercanos a 0.8 ua., pero el crecimiento en volumen de 20L solo igualo el valor obtenido

antes de la dilución (Figura V:4), Phaeodactylum volvió a presentar problemas de

crecimiento al inicio pero se recuperó después de la dilución.

La tercera generación G3 se inoculó el 27/01/2014 (día 0) para todas las especies, la

dilución se realizó el 4/02/2014 (día 8) cuando las absorbancias casi alcanzaban la unidad

(Figura V:4), aunque Phaeodactylum ya había llegado a 1.6ua en ese momento. En el

medio de 20L se hizo notar un crecimiento continuo llegando a valores de 1.4 ua para C.

kessleri y N. oleoabundans, mientras que Phaeodactylum alcanzó nuevamente valores de

1.6ua, esta generación tuvo el mejor crecimiento y podemos realizar la dilución desde un

valor de 1 ua y aun así obtener un buen crecimiento en medios de 20 L.

Figura V:4 Crecimiento de C. kessleri, N. oleoabundans y Phaeodactylum en un volumen de 10 y 20L.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 10 20

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

C. kessleri

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

0 10 20

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

N. oleoabundans

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

0 10 20

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

Phaeodactylum

En los cultivos en volumen de 10L encontramos que se puede realizar la dilución a 20L

con una absorbancia de 1 y cosechar en un periodo aproximado de 25 días para todas las

especies, con una absorbancia cercana a 1.5. En base a observaciones donde dejamos

que el crecimiento siguiera después de los 25 días se notaron acumulaciones marrones y

por eso sugerimos que el cultivo no supere 30 días.

Se calculó el rendimiento teórico (a partir de la ecuación de peso seco para cada especie)

al momento de pasar la tercera generacion de microalgas cultivadas en volumen de 10 y

20L a las tinas de secado. Tras cosechar esta misma generación de microalgas en tinas

de evaporacion se obtuvo un rendimiento real. Ambos valores se expresan en el cuadro

V:3. La diferencia de valores puede ser resultado a que en las tinas de cosecha los cultivos

siguieron creciendo, no se sabe si esto ocurrio porque se dejo de medir en ese lapso de

tiempo (alrededor de 30 dias).

Cuadro V:3 rendimiento teórico y real de la tercera generación (G3) de cultivo de microalgas en volumen de 10 y 20L.

C. kessleri

(g de materia seca/L)

N. oleoabundans

(g de materia seca/L)

Phaeodactylum

(g de materia seca/L)

Rendimiento

teórico 0.968 0.768 1.105

Rendimiento

real 1.9013 1.7814 1.9570

f) Comparación entre los volúmenes de cultivo

Se realizó una comparación entre los cultivos de 1L dentro del laboratorio y los de 10L en

el invernadero, inoculados el mismo día (09/09/2013) para observar como afectaban las

condiciones el crecimiento en los dos lugares.

Figura V:5 Crecimiento en volúmenes de 1L y 10L de las tres especies inoculadas el 09/09/2013.

En Figura V:5 se observa que si tienen el mismo comportamiento en los dos volúmenes

para C. kessleri y N. oleoabundans que comenzaron en valores similares de absorbancia

pero que en Phaeodactylum esta circunstancia no favoreció a que el crecimiento se

pareciera entre los dos volúmenes.

Con los resultados anteriores puede decirse que no existe una variación entre el cultivo

en laboratorio, bajo condiciones controladas, y el de invernadero, bajo condiciones

ambientales; pero si se compara la misma generación de volumen de 1L expuesta en la

figura V:5 con la tercera generación de volumen de 10 y 20L no hay una comportamiento

parecido en el crecimiento, siendo mucho mayor en el invernadero, sugiriendo que las

condiciones ambientales favorables para el cultivo en general se dieron en el periodo del

27/01/2014 al 19/02/2014.

VI. Conclusiones

Se evaluó el crecimiento de tres especies de microalgas bajo las mismas condiciones de

cultivo entre ellas. A lo largo de todas las generaciones en donde se llevó a cabo el conteo

de células en relación a la absorbancia a 750nm, nos dimos cuenta de que es complicado

lograr obtener una correlación cercana a la unidad, ya que esta medición es muy

susceptible al error humano, afortunadamente, este aspecto no tuvo gran influencia sobre

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

C. kessleri

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

N. oleoabundans

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 5 10

Ab

sorb

anci

a (7

50

nm

)

Dias

Phaeodactylum

la medición del peso seco respecto a la absorbancia que si permitió obtener correlaciones

más grandes entre los datos y nos da una medida fiable del peso seco de una muestra

microalgal.

En las generaciones del cultivo de 1L para las tres especies, se encontró que

considerando como aspectos importantes, las características de la experiencia práctica,

de tasa de incremento de peso seco diario, valores de absorbancia máximos, tiempos de

crecimiento, y el análisis estadístico, Phaeodactylum se considera como la mejor opción

de las tres especies estudiadas. En el cultivo en volumen de 10L se definió como 1ua el

valor adecuado para la dilución a 20L y que a partir de este valor hacia arriba se obtendrán

buenos crecimientos en este volumen en un periodo aproximado de 25 días a partir de la

inoculación del medio de 10L. Comparando los resultados de peso seco que se puede

obtener con la última absorbancia registrada al momento de la cosecha del volumen de

20L y el peso seco obtenido realmente después del secado encontramos que se cosechó

más cantidad de materia seca de lo que se esperaba teóricamente lo que significa que

puede seguir creciendo en el periodo de secado en las tinas donde no se realizaron

mediciones.

Con la comparación entre los medios de 1 y 10L podemos decir que a pesar de que hayan

coincidido en el crecimiento durante una generación inoculada en la misma fecha, no

sucede así con generaciones inoculadas en distintas fechas, entendiendo que cuando las

condiciones ambientales cambian el crecimiento también lo hace.

VII. Recomendaciones

La inoculación para un medio de 10L se debe hacer con 1L de microalgas que alcancen

un valor no menor 1ua, para que el crecimiento sea eficiente.

Para realizar un buen monitoreo del crecimiento es imprescindible agitar bien el medio

de cultivo para homogenizar la muestra.

Sí que el crecimiento no es favorable, se puede agregar la cantidad de Bayfolan forte

equivalente al 0.1% del volumen total.

Es importante tener cuidado de mantener aireación constante en todo el cultivo.

Cuidar que no se contamine el cultivo en la fase de secado.

Cada preparación de cultivo e inoculación de los medios de 1, 10 y 20L debe hacerse

con las medidas de sanidad más estrictas posibles, limpiando el área de trabajo,

lavando los recipientes con agua y jabón y desinfectando mangueras y filtros con cloro.

Tratar de cosechar los cultivos de 20L en un periodo no mayor a 30 días o antes de

que se puedan ver aglutinaciones marrones.

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