PROTEÏNES: DETECCIÓ, ANÀLISI I

MALALTIES RENALS

Marta Portillo Carrasquer

Institut Antoni Martí i Franquès

Nati Arnal Babiloni

Objectiu: Conèixer a fons què són les proteïnes. Fer un

estudi sobre tres proteïnes i les malalties:

- Albúmina proteïnúria

- Gammaglobulina glomerulonefritis

- Hemoglobina hematúria

Hipòtesi: Potser a través de la identificació i la

quantificació de proteïnes que trobem a l’orina podem

saber si una persona pateix una malaltia renal.

Les proteïnes són polímers d’aminoàcids units

mitjançant enllaços peptídics.

Trobem tres tipus d’aminoàcids: essencials, no

essencials i condicionals.

Els aminoàcids són sòlids, cristal·lins, amb un punt de

fusió elevat i solubles en aigua. Es classifiquen en

quatre grups.

Les proteïnes s’organitzen en quatre estructures:

Tenen múltiples funcions.

ELS RONYONS

Regulació del líquid extracel·lular del cos orina.

Estructura macroscòpica i microscòpica.

ALBÚMINA I PROTEÏNÚRIA

Albúmina:

- És la proteïna més freqüent al plasma.

- Fa funcions molt importants.

- Es sintetitza a les cèl·lules hepàtiques.

- Petita, simètrica i carregada negativament.

Proteïnúria és la presència en excés de proteïnes a

l’orina.

- Símptomes

- Causes

- Tipus:

Aïllada

Aïllada persistent

Associada

GAMMAGLOBULINA I GLOMERULONEFRITIS

Gammaglobulina tipus de globulina

- Transport, coàguls i defensa.

Poques deficiència immune.

Moltes càncer de sang.

- Cèl·lules hepàtiques.

Són immunoglobulines (anticossos).

Glomerulonefritis: Inflamació de glomèruls.

- Símptomes

- Causes

- Tipus:Aguda (de sobte)

Crònica (gradualment)

HEMOGLOBINA I HEMATÚRIA

Hemoglobina Eritròcits (pigment “Hemo”protoporfirina + un àtom de ferro)

- Transport 𝑂2 i 𝐶𝑂2- Estructura Quatre subunitats (cadenes)

90% capacitat

Hematúria: aparició d’hemoglobina a l’orina que prové dels ronyons o del tracte urinari.

- Símptomes

- Causes

- Tipus:

Moment

Quantitat

Duració

Inicial, terminal o total

Microscòpica o macroscòpica

Transitòria o permanent

PART PRÀCTICA

DETERMINACIÓ DE LA

PRESÈNCIA DE “GFP” EN L’E. COLI

ANÀLISI D’ORINA AMB

TIRES REACTIVES

QUANTIFICACIÓ DE PROTEÏNES

DETERMINACIÓ DE LA PRESÈNCIA DE “GFP” EN

L’E. COLI

E. Colis genèticament modificats gen GFP (Green

Fluorescent Protein) d’una medusa.

GFP 230 aminoàcids i pesa uns 27 KDa.

Objectiu: l’electroforesi amb gel de poliacrilamida

Gel:

Stacking al 5% (porus grans)

Running al 10% (porus petits)

Passos a seguir:

Dissolució running Aigua Stacking + pinta (pous)

Gelificat retirar pinta muntar

Carregar pous

Buffer

Corrent (200 V durant 1 hora).

Passat el temps desmuntar i tenyir.

Fer rentades (àcid acètic i 2-propanol).

Observació.

Conclusions.

Marcador

E. Coli dH5α E. Coli + GFP

ANÀLISI D’ORINA AMB TIRES REACTIVES

Objectiu: observar substàncies que no haurien

d’aparèixer a l’orina.

Tires reactives d’orina.

- Glucosa

- Leucòcits

- Nitrit

- Proteïna

- Urobilinogen

- Sang

Passos a seguir:

Obtenir orina fresca.

Introduir tira (2 o 3 segons).

Esperar 1 minut.

Observar i comparar resultats.

Primers dos pacients:

Conclusions: Ambdós pacients estan sans.

TUB 1 TUB 2

GLU (glucosa) Normal (groc) Normal (groc)

LEU (leucòcits) Normal 1+~ 10-25 leu/ml Normal 1+~ 10-25 leu/ml

NIT (nitrit) Negatiu (blanc) Negatiu (blanc)

PRO (proteïna) Negatiu (groc) Negatiu (groc)

UBG (urobilinogen) Normal 1 + 1 (17) (rosat) Normal 1 + 1 (17) (rosat)

ERY/HB (sang) Negatiu (groc) Negatiu (groc)

Els altres dos pacients:

Conclusions:

- TUB 3: Alt nivell glucosa i sang Possible diabetis

i hematúria.

- TUB 4: Proteïnes Malaltia renal (proteïnúria)

TUB 3 TUB 4

GLU (glucosa) 2 + 100 (5,5) mmol/l (verd) Normal (groc)

LEU (leucòcits) Normal 1+~ 10-25 leu/ml Normal 1+~ 10-25 leu/ml

NIT (nitrit) Negatiu (blanc) Negatiu (blanc)

PRO (proteïna) Negatiu (groc) 3 + 500 mg/dl (verd fort)

UBG (urobilinogen) Normal 1 + 1 (17) (rosat) Normal 1 + 1 (17) (rosat)

ERY/HB (sang) 4 + 250 Ery/microlitre (verd fort) Negatiu (groc)

QUANTIFICACIÓ DE PROTEÏNES

Objectiu: Saber la quantitat de proteïna que hi ha en E.

Coli dH5α i en E. Coli + GFP.

BSA (albúmina bovina) recta de regressió.

Espectrofotòmetre

- Intensitat de la llum.

- Absorbància.

Passos a seguir:

8 mostres

Agafar 20 microlitres de mostra i afegir 980

microlitres de Bradford posar-ho a la cubeta.

Esperar 10 minuts.

Carregar l’espectrofotòmetre (595 nanòmetres).

1 d’aigua (la primera indica el 0)

4 albúmina

1 d’E. Coli + GFP

1 d’E. Coli dH5α

1 de medi de cultiu

Resultats:

0 mg/ml H2O → 0

0’1 mg/ml BSA → 0’102

0’2 mg/ml BSA →0’162

0’3 mg/ml BSA → 0’257

0’4 mg/ml BSA → 0’291

E. Coli dH5𝛼→ 1’362

E. Coli amb GFP → 1’501

Medi → 0’02

Conclusió: Repetir Diluir les mostres.

Repetir l’experiència.

Resultats:

0 mg/ml H2O → 0

E. Coli dH5𝛼 1:10→ 0’447 Menys el medi (0’02) → 0’427

E. Coli + GFP 1:10→ 0’484 Menys el medi (0’02) → 0’444

E. Coli dH5𝛼 1:20→ 0’205 Menys el medi (0’02) → 0’185

E. Coli + GFP 1:20→ 0’242 Menys el medi (0’02) → 0’222

Conclusions: Aquest cop està tot correcte.

Conclusions

Càlculs:

E. Coli dH5𝛼 1:20 0,26 mg/ml E. Coli dH5𝛼 5,2 mg/ml

E. Coli + GFP 1:20 0,29 mg/ml E. Coli + GFP 5,8 mg/ml

CONCLUSIONS

Es demostra la meva hipòtesi: podem saber si una

persona pateix una malaltia renal observant les proteïnes

de l’orina.

Les proves es poden utilitzar per diagnosticar malalties ja

que són fiables i eficaces.

Ens aporten molta informació útil.

Són molt específiques.

Serveixen per millorar o salvar la vida de molts pacients

degut a que podem fer un diagnòstic molt acurat.

GRÀCIES PER LA VOSTRA ATENCIÓ.