PROPIEDADES FÍSICA Y QUÍMICAS DEL ADN
63
ADN ADN
Transcript of PROPIEDADES FÍSICA Y QUÍMICAS DEL ADN
ADNADN
DNA ESTRUCTURADNA ESTRUCTURA
LA LA ESTRUCTURA ESTRUCTURA DEL ADN ESTA DEL ADN ESTA DEFINIDA POR DEFINIDA POR LA SECUENCIA LA SECUENCIA DE LAS BASES DE LAS BASES NITROGENADANITROGENADAS EN LA S EN LA CADENA DE CADENA DE NUCLEOTIDOSNUCLEOTIDOS
ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS DEL DNA Y RNADEL DNA Y RNA
A G C T
Hombre, H.sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31
Bovino, Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27
Levadura, S.cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29
Mycobacterium sp. 0.12 0.28 0.26 0.11
Composición en bases del DNA en algunas especies
1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1 Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C. Es decir, A = T y G = C
Reglas de Chargaff
1. El DNA es una doble héliceplectonémica y dextrógira, con un paso de rosca de 3.4 nm
3.4 nm
Modelo de Watson - Crick, A
Modelo de Watson-Crick, B
2. Cada una de las dos hélices es un polinucleótido entrelazado conel otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren ensentido antiparalelo)
5’
3’ 5’
3’
3. El eje ribosa-fosfato se sitúahacia el exterior de la doble hélice,en contacto con el solvente
4. Mientras que las bases nitrogenadas (anillos planares) se sitúan, apiladas,hacia el interior de la estructura, en unentorno hidrofóbico
Modelo de Watson-Crick, C
5. Las bases están situadas en planos aproximadamenteperpendiculares al eje mayor de la doble hélice. La distanciaentre planos es de 0.34 nm
Modelo de Watson-Crick, D
0.34 nm
Modelo de Watson-Crick, E
N
N
N
N
NHH
N N
O
O
CH3
H
A
T
6. Cada base interaccionacon su opuesta a través deenlaces de hidrógeno, y demanera que:
(a) Adenina (A) sólo puede interaccionar con timina (T)(y viceversa), a través de dos puentes de hidrógeno, y
N
N
N
N
O
H
NH
H
N N
O
NH
H
G
C
(b) Guanina (G) sólopuede interaccionar concitosina (C) (y viceversa),a través de tres puentesde hidrógeno
3’2’
1’5’
4’
7. La base está situadaen posición anti-8. La desoxirribosa
en forma furanósica
9. El anillo furanósico estáen conformación endo-2’
Modelo de Watson-Crick, F
10. El eje de la doble héliceno pasa por el centro geométricodel par de bases. Esto determinaque la hélice presente un surcoancho y un surco estrechoSurco
ancho
Surcoestrecho
Modelo de Watson-Crick, G
Paso de rosca 3.4 nm
Distancia entre 0.34 nmplanos de bases
Pares de bases/vuelta 10
Anchura 2.4 nm
Geometría de la doble hélice (DNA-B)
0.34
3.4
2.4
Interacciones débiles que mantienen la estructura del DNA
1. Enlaces de hidrógeno entre bases complementarias
2. Interacciones hidrofóbicas entre planos de bases contiguos (int. de apilamiento, stacking)
3. Interacciones iónicas del fosfato con moléculas electropositivas (histonas, poliaminas, etc.)
1. Compatible con los datos cristalográficos
2. El modelo predice una determinada densidad lineal que se cumple para todos los DNAs conocidos
3. El DNA rico en GC debe ser más difícil de desnaturalizar que el rico en AT. Esta predicción se cumple perfectamente.
4. El estudio de frecuencias de vecino más próximo (A.Kornberg) sólo es compatible con un modelo complementario y antiparalelo
p.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tiene la misma frecuencia que TA, y así sucesivamente.
Pruebas experimentales de la estructura del DNA
A B Z
Grosor 2.6 2.4 1.8Giro Dextro Dextro LevoBases/vuelta 11 10.4 12P.de rosca 2.5 3.4 4.5Inclinación 19º 1º 9ºplano bases
Distintas formas del DNA
DNA-A
1.Doble hélice plectonémica y dextró- gira
2. Planos de bases oblicuos respecto al eje de la doble hélica
3. Propio de RNAs en doble hélice, o de híbridos DNA-RNA
4. Más ancha y corta que DNA-B
DNA-Z
1. Doble hélice plectonémica y levógira
2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-
3. Conformación de G es syn- en lugar de anti-
4. Más estrecha y larga que DNA-B
Desnaturalización del DNA
T, ºC
% IncrementoAbsorbancia a260 nm
La desnaturalizacióntérmica del DNA sigueuna curva sigmoide. Elpunto medio, Tm, está relacionado con el conte-nido en G+C. Así, la muestraB tiene un mayor contenidoen G+C que A.
La temperatura de fusión (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice ADN hélice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm).
El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla (efecto hipercrómico, aumento de la absorbancia) y, por último, si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.
Efecto Hipo crómico del DNA
EFECTO HIPOCROMICOEFECTO HIPOCROMICO
¿Para qué purificar DNA?¿Para qué purificar DNA?
Aplicaciones
AplicacionesAplicaciones
ForenseForenseDx enfermedades infecciosasDx enfermedades infecciosasDx enfermedades congénitasDx enfermedades congénitasClonación de GenesClonación de GenesGenómicaGenómicaControl de calidad microbiológicoControl de calidad microbiológicoBiodiversidadBiodiversidadIdentificación de especiesIdentificación de especies
¿Cómo purificar DNA?¿Cómo purificar DNA?
Los 3 pasos básicos para purificar DNALos 3 pasos básicos para purificar DNA
Lisis celular
Fraccionamiento de los ácidos nucleicos
Concentración de los ácidos nucleicos
1.1.1.1.
2.2.2.2.
3.3.3.3.
1. Lisis celular1. Lisis celular
Lisis enzimática de tejidos animalesTampón de lisis con detergente. Algunos protocolos Con proteinasa K.
Lisis de bacterias o levaduras.Lisozima (Bacterias Gram-positivas) liticasa (levaduras).Detergente y pH alcalino para plásmidos.
Homogenizadores mecánicosAgitador mecánico, a la muestra se adicionan esferas.
Congelación descongelaciónSe usa nitrógeno liquido.
2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos2. Fraccionamiento de los ácidos nucleicos
Preparación de lisados crudosNo se purifica
Salting-out methodsSe precipitan las proteinas y contaminantes con sales de acetato de amonio o potasio
Fraccionamiento con solventes orgánicosFenol/cloroformo/alcohol isoamílico
3. Concentración de ácidos nucleicos3. Concentración de ácidos nucleicos
Precipitación con:
Etanol
Isopropanol
En presencia de sales
2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE 2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE DNADNA
Electroforesis
¿Cómo hacer una electroforesis de DNA?¿Cómo hacer una electroforesis de DNA?
Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
¿Cómo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?
Electroforesis de DNAElectroforesis de DNA
1
2
3
5
4
6
7
Propiedades estructurales del DNAPropiedades estructurales del DNA
5’p OH3’
3’OH p5’
Las hebras de una molecula de DNA son Antiparalelas y complementarias
Complementaridad del DNAComplementaridad del DNA
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
5’p
p 5’
OH3’
3’ OH
PuentesHidrógeno
95°C95°C
T G T T C A G CA
A C A A G T C GT
T
A C
G T
A
T
A
C
G T
A
C
G C
GT
A
Desnaturalización/reasociación del DNADesnaturalización/reasociación del DNA
T G T T C A G CA
AC AAG T CG T
Reasociación solo con cadenas complementariasReasociación solo con cadenas complementarias
Hibridación Hibridación
Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos Es la unión de dos cadenas de ácidos nucleicos complementarias para formar un duplex o complementarias para formar un duplex o molécula de cadena doble.molécula de cadena doble.
• Posibles híbridacionesDNA-DNADNA-RNA
dsDNA ssDNA apareamiento inicial
dsDNA
DesnaturalizaciónDesnaturalizaciónReasociaciónReasociaciónRenaturalizaciónRenaturalización
T° T°
Molécula de DNAcs o RNA homóloga a una secuencia de DNAcs o RNA con la que se hibrida de forma estable y específica por asociación de bases complementarias.
Sondas Sondas
Una Una sondasonda es un fragmento de DNA que: es un fragmento de DNA que:– Se puede marcar para ser identificado y medidoSe puede marcar para ser identificado y medido– Se hibrida a un DNA gracias a su complementaridadSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridad
Tipo de marcajesTipo de marcajes– Radioactivo (Radioactivo (3232P, P, 3535S, S, 1414C, C, 33H)H)– FluorescenteFluorescente– Biotinilación (avidina-streptavidina)Biotinilación (avidina-streptavidina)
Hibridación de DNA Hibridación de DNA inmobilizado en soportes de inmobilizado en soportes de hibridacion:hibridacion: NitrocelulosaNitrocelulosa Membranas de nylonMembranas de nylon
Southern BlotSouthern Blot
NucleasasNucleasas
Endonucleasa
5’ Exonucleasa 3’ Exonucleasa
Southern BlotSouthern Blot
Enzimas de retricción
DNA de varios tamaños
Electroforesis en gel de agarosa
gel
Denaturación y transferencia a NC
blot
Hibridación de la sonda
Visualización
Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:1. electrophoresis1. electrophoresis
Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:2. transfer to a filter/membrane2. transfer to a filter/membrane
Southern (and Northern) blot:Southern (and Northern) blot:3. hybridization to a labeled unique 3. hybridization to a labeled unique
probeprobe
Test
igo
pos
itiv
o
Test
igo
neg
ativ
o
mues
tra
MUESTRA
Células,microorganismos
autoradiografía
hibridacíón
lavado
sondas
Gel de agarosa
Ectracción y
Denaturalización del ADN
Filtro denitrocelulosa
transferencia
Separación defilamentosde ADN
ELECTROFORESIS
Southern Blot
FILTRO DE NITROCELULOSA
COLONIAS REPLICA ENPLACA CON FILTRO
FILTRO CON COLONIAS
COLONIAS
ADN DE LAS COLONIASEN EL FILTRO
AUTORADIOGRAFÍACOLONIA
- Réplica en placa con filtro
- Lisis- Secado
- Hibridación con sonda radioactiva
Hibridacion Hibridacion in situ in situ por fluorescenciapor fluorescencia
Hibridacion Hibridacion in situ in situ por fluorescenciapor fluorescencia
