PRODUCCIÓN, AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE...
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PRODUCCIÓN, AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA PROVENIENTES DE UNA CEPA DE E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp HENRY ALDEMAR GUTIÉRREZ ALDANA DERLY LORENA VIUCHE ORTEGA UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN PROGRAMA DE LICENCIATURA EN QUÍMICA TRABAJO DE GRADO BOGOTÁ D.C 2017
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PRODUCCIÓN, AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE
VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA PROVENIENTES DE UNA CEPA DE
E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
HENRY ALDEMAR GUTIÉRREZ ALDANA
DERLY LORENA VIUCHE ORTEGA
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROGRAMA DE LICENCIATURA EN QUÍMICA TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C 2017
PRODUCCIÓN, AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA ESTABILIDAD DE
VESÍCULAS DE MEMBRANA EXTERNA PROVENIENTES DE UNA CEPA DE
E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
HENRY ALDEMAR GUTIÉRREZ ALDANA
DERLY LORENA VIUCHE ORTEGA
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADO EN
QUÍMICA
D. JUAN DANIEL VALDERRAMA RINCÓN
DIRECTOR TRABAJO DE GRADO
UNIVERSIDAD ANTONIO NARIÑO
PH D. JORGE ALONSO LEYVA ROJAS
DIRECTOR TRABAJO DE GRADO
UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
D. LIZ MAYOLY MUÑOZ ALBARRACIN
CODIRECTOR TRABAJO DE GRADO
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS
FACULTAD DE CIENCIAS Y EDUCACIÓN
PROGRAMA DE LICENCIATURA EN QUÍMICA
TRABAJO DE GRADO
BOGOTÁ D.C
2017
NOTA DE ACEPTACIÓN
______________________________________
______________________________________
______________________________________
______________________________________
JURADO:
___________________________________
BOGOTÁ D.C
ENERO 23 DE 2017
TABLA DE CONTENIDO
1. RESUMEN ........................................................................................................ 10
2. INTRODUCCIÓN............................................................................................... 11
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN. ............................................................. 12
5. OBJETIVOS ...................................................................................................... 15
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 15
OBJETIVOS ESPECIFICOS .............................................................................. 15
6. MARCO REFERENCIAL ................................................................................... 16
6.1 PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS............................. 16
6.2 PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS ........................... 17
6.2.1 Membrana externa ................................................................................. 17
6.2.2 Espacio periplasmático .......................................................................... 18
6.2.3 Sistema Tol-Pal...................................................................................... 18
6.3 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y OMVs ................................................. 19
6.4 GENERALIDADES DE LAS OMVs .............................................................. 19
6.4.1 Biogénesis de las OMVs ........................................................................ 20
6.4.2 Funciones de las OMVs ........................................................................ 20
6.4.2.1 Las OMVs en el desarrollo de vacunas .......................................... 20
6.4.3 Producción de las OMVs ....................................................................... 20
6.4.3.1 Aislamiento de OMVs ..................................................................... 21
6.4.3.2 Ultrafiltración ................................................................................... 21
6.5 CUANTIFICACIÓN DEL RENDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE OMVs..... 22
6.5.1 Cuantificación de proteínas ................................................................... 22
6.5.2 Citometría de flujo .................................................................................. 23
7. METODOLOGÍA ................................................................................................ 24
7.1 Producción de células competentes de E. coli JC8031 ................................ 24
7.2 Extracción de plásmido pTRC-ssTorA::gfp con columna Econospin ........... 24
7.3 Transformación E. coli JC8031 con pTRC-ssTorA::gfp ................................ 24
7.4 Preparación, aislamiento y cuantificación de OMVs de E. coli JC8031 y
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp ................................................................................. 25
7.5 Análisis por citometría de flujo de los ensayos de estabilidad y fluorescencia
de las OMVs de E. coli JC8031 almacenadas a diferentes temperaturas .......... 25
7.6 Cuantificación de OMVs por el método de Bradford .................................... 26
8. RESULTADOS Y ANÁLISIS .............................................................................. 27
8.1 Transformación E. coli JC8031 con pTRC-ssTorA::gfp ................................ 27
8.2 Preparación, aislamiento y cuantificación de OMVs de E. coli JC8031 y
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp ................................................................................. 29
8.3 Análisis por citometría de flujo de los ensayos de estabilidad y fluorescencia
de las OMVs de E. coli JC8031 almacenadas a diferentes temperaturas .......... 33
8.4 Cuantificación de OMVs por el método de Bradford .................................... 53
9. CONCLUSIONES .............................................................................................. 54
10. RECOMENDACIONES ................................................................................... 55
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. ..................................................................... 56
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Comparación de la pared celular bacteriana. Pared celular a) de una
bacteria Gram positiva y b) de una bacteria Gram negativa [18]. .......................... 17
Figura 2. Localización e interacción de las proteínas del sistema Tol-Pal en la
envoltura celular de las bacterias Gram-negativas [27]. ........................................ 19
Figura 3. Esquema general para la producción de OMVs [11]. ............................. 22
Figura 4. Plásmido de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp. ..................................... 27
Figura 5. Colonias de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp. La coloración verde
corresponde a la fluorescencia propia de la proteína. ........................................... 28
Figura 6. Colonias de E.coli JC8031-pTRC-ssTorA::rfp. ....................................... 29
Figura 7. Colonias de E.coli JC8031. .................................................................... 29
Figura 8. Cultivo de JC8031-pTRC-ssTorA::gfp y JC8031 respectivamente. ........ 30
Figura 9. Células de la cepa JC8031-pTRC-ssTorA::gfp obtenidas luego de la pre-
centrifugación. ....................................................................................................... 31
Figura 10. Células de las cepas JC8031-pTRC-ssTorA::rfp y JC8031-pTRC-
ssTorA::gfp respectivamente. ................................................................................ 31
Figura 11. obtenidas por ultracentrifugación. ........................................................ 32
Figura 12. OMVs resuspendidas provenientes de las cepas JC8031-pTRC-
ssTorA::rfp, JC8031 y JC8031-pTRC-ssTorA::gfp respectivamente. .................... 32
Figura 13. Citometría de flujo: OMVs vacías (1,2), muestra A (3,4) y B (5,6)
dilución 1/10. ......................................................................................................... 33
Figura 14. Citometría de flujo: OMVs vacías (1,2), muestra A (3,4) y B (5,6)
dilución 1/30. ......................................................................................................... 35
Figura 15. Citometría de flujo. OMVs vacías (1,2); muestra A: 1/10 (3,4), 3/40 (5,6)
y 1/20 (7,8). ........................................................................................................... 36
Figura 16. Citometría de flujo 1 día. OMVs vacías (1,2); muestra A con PBS
almacenada a 4°C (3-8). ....................................................................................... 37
Figura 17. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1-6).
.............................................................................................................................. 38
Figura 18. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS almacenada a -20°C (1-6).
.............................................................................................................................. 39
Figura 19. Citometría de flujo 1 día. OMVs vacías (1,2); muestra A con
PBS+glicerol 50% almacenada a 4°C (3-8). .......................................................... 40
Figura 20. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada
a 15°C (1-4). .......................................................................................................... 41
Figura 21. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada
a -20°C (1-6). ......................................................................................................... 42
Figura 22. Citometría de flujo 7 días. OMVs vacías (1,2); muestra A con PBS
almacenada a 4°C (3- 6). ...................................................................................... 43
Figura 23. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1-
4). .......................................................................................................................... 44
Figura 24. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50%
almacenada a 4°C (1- 4). ...................................................................................... 45
Figura 25. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50%
almacenada a 15°C (1- 4). .................................................................................... 45
Figura 26. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50%
almacenada a -20°C (1- 4). ................................................................................... 46
Figura 27. Citometría de flujo 30 días. OMVs vacías (1,2), muestra A con PBS
almacenada a 4°C (3- 8). ...................................................................................... 47
Figura 28. Citometría de flujo 30 días. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1-
6). .......................................................................................................................... 48
Figura 29. Citometría de flujo 30 días. Muestra A con PBS+glicerol 50%
almacenada a -20°C (1- 6). ................................................................................... 49
Figura 30. Comportamiento de la fluorescencia de OMVs en medio PBS durante 1,
7 y 30 días a distintas temperaturas. ..................................................................... 50
Figura 31. Comportamiento de la fluorescencia de OMVs en medio PBS+glicerol
50% durante 1, 7 y 30 días a distintas temperaturas. ........................................... 50
Figura 32. Citometría de flujo. OMVs vacías (1, 2), muestra gfp 4°C: células (3,4) y
OMVs (5,6). ........................................................................................................... 51
Figura 33. Citometría de flujo. Muestra rfp a 4°C: células (1-3), OMVs (4-6). ....... 52
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Condiciones de almacenamiento de las OMVs. ...................................... 26
Tabla 2. Curva de calibración de BSA junto con las absorbancias
correspondientes. .................................................................................................. 53
LISTA DE ABREVIATURAS
OMVs Vesículas de membrana externa
gfp Proteína verde fluorescente
rfp Proteína roja fluorescente
E. coli Escherichia coli
PBS Buffer fosfato salino
MV Vesícula de membrana
OM Membrana externa
LPS Lipopolisacáridos
SDS-PAGE Electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato de sodio
Pal Lipoproteína asociada al peptidoglicano
OmpA Proteína de membrana externa A
Lpp Lipoproteínas
BCA Ácido bicinconinico
FSC Detector de dispersión frontal
SSC Detector de dispersión lateral
LB Luria Bertani
OD Densidad óptica
TE Tris-EDTA
BSA Albúmina sérica bovina
FL1-H Detector de fluorescencia verde - altura
FL2-H Detector de fluorescencia naranja - altura
FL3-H Detector de fluorescencia roja - altura
FL1-A Detector de fluorescencia verde - área
10
1. RESUMEN
Las bacterias Gram Negativas producen vesículas de membrana externa (OMVs,
por sus siglas en inglés) y estas pueden contener ácidos nucleicos, proteínas
activas biológicamente, enzimas, toxinas, antígenos entre otras moléculas.
Además de su rol como transportadoras, las OMVs también juegan un papel muy
importante en la supervivencia bacteriana: su producción está regulada por un
periodo de estrés debido a la significativa adquisición nutricional, interacción con el
ambiente, formación de biopelículas y la patogénesis. A diferencia de otros
mecanismos de secreción, las OMVs activan a la bacteria para secretar moléculas
insolubles en adición con un complejo de material soluble. Por otro lado, la
proteína verde fluorescente (gfp, por sus siglas en inglés), es considerada como
un biomarcador, ya que gracias a la fluorescencia permite tener datos acerca de la
localización comportándose como genes reporteros debido a que brindan
información de los cambios bioquímicos dentro y entre las células. Para este caso
en particular, el marcador anteriormente nombrado se utilizó con el fin de evaluar
la estabilidad de las OMVs gracias a la intensidad de radiación electromagnética
que esta emite.
De esta manera se realizó el cultivo, remoción bacteriana y el aislamiento final por
medio de filtración y ultracentrifugación requerido para la obtención de las OMVs;
estas fueron obtenidas de cepas hipervesiculantes de Escherichia coli (E. coli)
como la JC8031 y otra transformada para la producción de gfp, la cual es la
JC8031 pTRC-ssTorA::gfp. Posteriormente las vesículas obtenidas fueron
resuspendidas en buffer fosfato salino (PBS) y otras en este mismo buffer junto
con glicerol al 50%; a continuación, se almacenaron a distintas temperaturas (-
20°C, 4°C y 15°C) y se evaluó la intensidad de fluorescencia de la gfp por medio
de la citometría de flujo durante dos meses y cada siete días. Los anteriores
ensayos se realizaron con el fin de conocer las condiciones de temperatura y los
medios de resuspensión óptimos para el almacenamiento de estas vesículas
transportadoras junto con la proteína de interés además de efectuarse la
cuantificación de proteínas de las OMVs por el método de Bradford. Para finalizar
se encontró que la temperatura óptima para la estabilidad y alta intensidad de
fluorescencia de las OMVs que contienen la gfp es de -20°C, sin embargo al cabo
de un mes la fluorescencia disminuyó significativamente; por otra parte la cantidad
de proteína total obtenida por el método de Bradford fue de 98,83 µg/mL.
11
2. INTRODUCCIÓN
En la industria biotecnológica es ampliamente utilizada la bacteria Gram negativa
E. coli, ya que ha sido muy bien caracterizada desde el punto de vista fisiológico y
genético, además de requerir procedimientos para sus análisis relativamente
económicos; este bacilo se emplea en la producción de proteínas recombinantes
con diversos fines tales como diagnóstico, terapéuticos, entre otros. Al mismo
tiempo se han realizado numerosos estudios acerca de la producción de OMVs, a
partir de bacterias Gram-negativas como es el caso de la E. coli. En comparación
con las bacterias Gram-negativas, se ha prestado poca atención a la secreción de
vesículas de membrana (MV) de bacterias Gram-positivas. Esta desproporción
puede atribuirse a diferentes arquitecturas de la envoltura de células Gram-
positivas, tales como la ausencia de membrana externa (OM por sus siglas en
inglés) [1]. Debido a que la mayoría de la información publicada sobre el
aislamiento de las vesículas trata de la OMV provenientes de bacterias Gram-
negativas, la siguiente investigación se centran en este tema. Las OMVs son
pequeñas porciones de membrana externa que cuentan con un tamaño entre 50-
250 nm [2]; estas son formadas gracias al deterioro entre la membrana externa
bacteriana y la capa de peptidoglicano, generando abultamientos los cuales
contienen ácidos nucleicos, proteínas provenientes del citosol o de la membrana
externa [3].
Por su parte, una de las proteínas más explotadas y arduamente estudiadas en la
biología celular es la proteína verde fluorescente la cual proviene de la medusa
bioluminiscente Aequorea victoria y provee una herramienta útil para la biología
celular. La proteína verde fluorescente ha sido modificada para emitir colores en
muchas y diversas longitudes de onda. La gfp, junto con proteínas derivadas de
otros organismos, ofrece nuevas variedades de proteínas fluorescentes [4].
Gracias a su habilidad de generar gran visibilidad y eficacia al emitir fluorescencia
interna permite observar procesos antes invisibles permitiendo un mejor
entendimiento y un estudio más detallado y fructífero de la mecánica celular.
Por lo anterior, el siguiente trabajo está enfocado en la producción, aislamiento y
adecuado almacenamiento de OMVs vacías y con una carga proteica (gfp)
proveniente de la internalización de la membrana externa de una cepa de E. coli,
por su amplio uso en la biología molecular como biomarcador, para la producción
de vacunas, observación de interconexiones neuronales, evaluación de cambios
de pH en organismos entre otros; y con el fin de encontrar las condiciones
ambientales necesarias para la conservación fisiológica y fluorescente de las
OMVs.
12
3. ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN.
Shimomura, Johnson y Saiga publicaron en el año de 1962 hallazgos sobre la
producción de dos proteínas producidas por la medusa Aequorea victoria, la
aquorina (nombre derivado de la especie con que trabajaban) y la proteína verde
nativa [5], puesto que investigaban el fenómeno de la bioluminiscencia dentro de
organismos vivos que tienen la capacidad de producir luz. Se determinó así, que la
proteína verde tenía un pico en el espectro de emisión a 508 nm, cercano al que
emite el tejido vivo de la medusa, mientras que la aquorina pura lo tenía a 470 nm
en la zona azul del espectro visible; esto indicaba cierta interacción entre las dos
proteínas. De estas observaciones se determinó que la proteína verde convertía la
emisión azul de la aquorina en verde brillante mediante un proceso de
transferencia de energía, sin emisión y reabsorción de radiación [6], [7].
Por otro lado, en 1988 Martin Chalfie comprendió la capacidad para fluorescer con
que cuenta esta proteína y realizo estudios para la conversión de esta es un
marcador celular para estudios de los organismos con los que trabajaba, así
usando técnicas de biología molecular introdujo dentro del ADN del gusano
transparente Caenorhabditis elegans el gen que codificaba para la gfp sin causarle
un daño posterior a los gusanos ni agregar productos adicionales; generando la
posibilidad de realizar el seguimiento de proteínas especificas dentro de un ser
vivo. Del mismo modo, Roger Tsien incorporo rápidamente los estudios ya
realizados de la gfp y logró extender la paleta de colores de la proteína
fluorescente modificando la estructura ya existe, produciendo así moléculas que
emitían luz a distinta longitud de onda. Gracias al descubrimiento y desarrollo de la
gfp los investigadores anteriormente mencionados fueron merecedores del premio
Nobel de Química en 2008 otorgado en partes iguales [4].
Por otro lado, las OMVs fueron detectadas por primera vez en el sobrenadante de
cultivos de células de E.coli bajo crecimiento de lisina. Los medios contenían LPS
(lipopolisacárido) soluble [8]. Con ayuda de la microscopía electrónica se logró
determinar que la OM se derramó en forma de pequeñas estructuras esféricas con
membrana que rodea un centro denso [9], [10]. Los autores plantearon la hipótesis
de que la limitación en las condiciones de crecimiento por lisina inhibió la síntesis
de peptidoglicano sin afectar la generación de OM, lo cual resulto en un exceso de
esta que no podía permanecer unido a la célula. Sin embargo, estudios
posteriores demostraron que estas estructuras también se formaron bajo un
crecimiento normal en condiciones in vitro y en tejidos infectados; además se
evidenció que este proceso fue ampliamente relevante para las bacterias Gram
negativas [11], [12].
13
Estudios realizados sobre la densidad y composición de las OMVs confirmó la
constitución por lipopolisacáridos (LPS) [13]. Por los análisis de proteínas se
determinó que las OMVs carecían de membrana interna y de componentes
citoplasmáticos [14]. Así pues, las OMVs no eran simplemente el resultado de la
lisis celular, se obtendrían vesículas por la mezcla entre proteínas y lípidos de
todas las fracciones celulares. En cuanto a los análisis bioquímicos realizados,
como los patrones de banda de electroforesis en gel de dodecilsulfato sódico
poliacrilamida (SDS-PAGE) se demostró que OMVs consistían principalmente en
proteínas típicas periplasmáticas [15].
En los últimos años, numerosos esfuerzos se han enfocado en el estudio de la
biogénesis de las OMVs provenientes de bacterias Gram-negativas, gracias a su
amplio espectro de aplicación tanto en la biotecnología como en la medicina. Sin
embargo, aunque se conocen tales características esta técnica no ha presentado
un auge considerable dentro de la investigación colombiana, es por esto que se
hace necesario enfatizar en las herramientas de análisis que permitan un amplio
conocimiento en la producción de vesículas de membrana externa, lo cual a su
vez enriquecerá el campo de acción de la biología molecular en la investigación y
producción de vacunas altamente eficaces; es de suma importancia destacar el
papel que juega la proteína verde fluorescente junto con las OMVs así como
también su comportamiento frente a diferentes condiciones de temperatura lo que
exige la elaboración de una propuesta que permita procedimientos adecuados
para un favorable aislamiento de OMVs.
14
4. DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA.
Aunque la técnica de aislamiento vesicular es bien conocida en el campo de la
Biología Molecular y sus condiciones son sabidas, no se han publicado estudios
comparando las condiciones y su efecto sobre la estabilidad de las OMVs a partir
de la cepa de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp que produzcan una alta
fluorescencia debido a la encapsulación de la proteína verde fluorescente.
El proceso de vesiculación se ve afectado por una serie de factores que
determinan la cantidad de OMVs generadas, tales como temperatura óptima, nivel
de estrés adecuado y no menos importantes las condiciones de crecimiento y
nutricionales; no obstante no se ha puntualizado un protocolo que adapte las
condiciones que se presentan en los laboratorios de la Universidad Antonio Nariño
que logre brindar alta pureza y sobre todo que genere una estabilidad del
contenido vesicular. Aunque muchos estudios se han enfocado en la producción
de vesículas con distintos tipos de contenido (ácidos nucleicos, proteínas
citosólicas, toxinas, enzimas etc.), no se han reportado investigaciones que
abarquen comparaciones entre diferentes medios de almacenamiento de las
OMVs. Por lo tanto el objetivo del estudio será proponer condiciones de
almacenamiento que contribuyan a la generación de vesículas que presenten un
alto nivel de fluorescencia por un largo periodo de tiempo, analizando su
comportamiento al ser sometidas a distintas temperaturas, con el fin de establecer
valores de referencia. La producción de OMVs de manera altamente eficaz, en un
futuro cercano servirá como una estrategia con potencial aplicación en el
desarrollo de vacunas, en el seguimiento de ciclos celulares, en el análisis de
enfermedades neurológicas entre otras muchas aplicaciones de esta importante
técnica.
15
5. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la estabilidad de OMVs que contengan la proteína verde fluorescente al
ser sometidas a distintas temperaturas de almacenamiento tales como 4°C, 15°C y
-20°C.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
1. Determinar las condiciones adecuadas de crecimiento bacteriano para la
producción efectiva de OMVs y producción de gfp.
2. Producir OMVs que contengan gfp por medio de ultracentrifugación.
3. Analizar por citometría de flujo la intensidad de la fluorescencia de la gfp en un
lapso de tiempo determinado.
4. Cuantificar OMVs marcadas acudiendo al método colorimétrico de Bradford
(proteínas).
16
6. MARCO REFERENCIAL
Las bacterias son microorganismos unicelulares que se reproducen por fisión
binaria. La mayoría son de vida libre, a excepción de algunas que son de vida
intracelular obligada y su tamaño oscila entre los 0.5 y 3 µm, pudiendo llegar en
algunos tipos a 10 µm [16]. Las bacterias en su estructura presentan componentes
externos que son denominados permanentes o constantes y son la membrana
citoplasmática, pared celular y el citoplasma con todos sus componentes. A partir
de ello y de acuerdo a sus características a las bacterias se las clasifica en grupos
en relación a la presencia de peptidoglicano en la pared celular y los aparatos
externos que lo conforman. De igual manera la clasificación bacteriana puede ser
favorecida por la aplicación de un procedimiento denominado tinción Gram; debe
su nombre a quién la describió en 1884; que utiliza como colorantes principales a
la violeta de genciana y a la safranina, para dotar de color a las bacterias [17].
La pared celular es de gran relevancia para poder distinguir las bacterias Gram
positivas de las Gram negativas debido a la afinidad tintorial que presentan, de tal
forma que la tinción de Gram es la técnica más utilizada para poder clasificar a las
bacterias, ya que está en directa relación con la cantidad de peptidoglicano que
presenta el microorganismo en su estructura; en la figura 1 se pueden apreciar las
diferencias entre las estructuras de estos tipos de bacterias.
6.1 PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM POSITIVAS
En las bacterias Gram positivas el peptidoglicano se encuentra en mayor cantidad
presentando múltiples capas de este componente además de ácidos teicoicos que
se encuentran conformados por polímeros de ribitol-fosfato o glicerol-fosfato los
cuales se unirán al ácido N-acetil-murámico estabilizando de esta manera la pared
celular, los que además actúan como antígenos de superficie y que se unirán a
receptores específicos en las células que presenta el huésped. A estos antígenos
se los puede observar en especies patógenas actuando como receptores para
bacteriófagos además de inhibir la fagocitosis; Cabe mencionar que existen otros
compuestos denominados ácidos lipoteicoicos que por medio de su porción
lipídica se unen de forma hidrófoba a la membrana y la porción glicerol-fosfato de
la pared celular. Estos ácidos al igual que los ácidos teicoicos tienen la función de
estabilizar la pared celular [18].
17
Figura 1. Comparación de la pared celular bacteriana. Pared celular a) de una bacteria Gram positiva y b) de
una bacteria Gram negativa [18].
6.2 PARED CELULAR DE BACTERIAS GRAM NEGATIVAS
Se encuentra constituida por tres estructuras, empezando por la membrana
citoplasmática, el espacio periplasmático también denominado periplasma, el cual
separa la membrana citoplasmática de la externa y que además presenta una fina
capa de peptidoglicano, y finalmente por fuera se encuentra una última estructura
denominada membrana externa.
6.2.1 Membrana externa
La membrana externa de este tipo de bacterias representa la porción más
superficial en la conformación de la pared celular y se encuentra formada por
lipopolisacáridos, fosfolípidos de membrana y las proteínas presentando a su vez
una capa interna y otra externa [17].
La capa externa se encuentra formada en mayor cantidad por lipopolisacáridos y
está constituida por tres regiones: la región superficial que presentará los
denominados "antígenos O" que son hidrófilos; la región intermedia que se
encuentra formada por heptosas, azúcares y el 2-ceto-3-desoxioctonato lo que
permite la unión al lípido A; y la región más profunda denominada también como
lípido A, la cual se encuentra relacionada con la actividad biológica asociada a los
lipopolisacáridos y por lo mismo en relación con la endotoxina que está
comprometida con la toxicidad, pudiendo además comportarse como un pirógeno
de origen endógeno desencadenando de esta manera la cascada del
complemento y la coagulación [19]. Por su parte la capa interna se encuentra
constituida por una capa de fosfolípidos que contactan con el espacio
periplasmático y en algunas bacterias la capa interna suele presentar
invaginaciones, que se comunicarán con lo fosfolípidos presentes en la cara
18
externa de la membrana citoplasmática, estas estructuras son conocidas como
uniones de Bayer [20].
6.2.2 Espacio periplasmático
Este espacio presenta una consistencia en forma de gel y se encuentra limitado
por la cara interna de la membrana externa y la cara externa de la membrana
plasmática, las mismas que son hidrófilas, además de que presenta una capa de
peptidoglicano y proteínas que le dan la consistencia característica [17], [19]. El
periplasma se encuentra conformado por enzimas específicas, hidrolíticas y
detoxificantes como las β-lactamasas que se encargan de inactivar algunos
grupos de antibióticos [20]. En este espacio se realizan las acciones de óxido
reducción, la regulación osmótica de la bacteria, el transporte de solutos y
funciones hidrolíticas que se llevan a cabo por las fosfatasas, amilasas y las β-
lactamasas [17], [20].
6.2.3 Sistema Tol-Pal
La proteína Pal (lipoproteína asociada a peptidoglicano) se encuentra anclada en
la OM de las bacterias Gram-negativas e interactúa con las proteínas Tol. Las
proteínas Tol-Pal forman dos complejos: el primero está compuesto por tres
proteínas Tol en la membrana interna TolQ, TolR y TolA con una estequiometria 4-
6: 2: 1 [21], TolAI interactúa con el primer dominio transmembrana TolQ y con el
dominio transmembrana TolRI [22], los dominios transmembrana primero y tercero
de TolQ probablemente también interactúan entre sí [23]. El dominio TolQIII
interactúa con la región transmembrana TolR (TolRI) y con el dímero [24].
El segundo consiste en las proteínas TolB y Pal ligadas a la membrana externa de
la célula. Pal está anclado en el OM e interactúa con el dominio C-terminal del
TolB periplasmático, que posee una estructura de hélice β [25]. Además, Pal
interactúa con TolA y otras proteínas de envolvente celular tales como OmpA
(proteína de membrana externa A) y Lpp (lipoproteínas). Todas estas
interacciones son independientes entre sí [26]. Estos complejos interactúan entre
sí formando un sistema multiproteico en la membrana. Recientemente se ha
demostrado que Pal es esencial para la supervivencia bacteriana y la patogénesis,
aunque su papel en la virulencia no se ha definido claramente [27].
19
Figura 2. Localización e interacción de las proteínas del sistema Tol-Pal en la envoltura celular de las
bacterias Gram-negativas [27].
6.3 BACTERIAS GRAM NEGATIVAS Y OMVs
Un creciente número de bacterias Gram-negativas han sido reportadas por la
secreción de OMVs, cuyas funciones se ven frecuentemente envueltas en la
liberación de sustancias activas hacia un huésped y/o a la modulación de una
respuesta inmune de este. La producción de OMVs se ve provocada por diversas
condiciones de vida tales como la etapa de crecimiento y nutricional, temperatura
y estrés oxidativo generado [28]. Por otra parte la secreción de MV en las
bacterias Gram-positivas han sido foco de poca atención en comparación con las
OMVs de las bacterias Gram-negativas; sin embargo existen métodos que
describen la producción, aislamiento y purificación de estas.
6.4 GENERALIDADES DE LAS OMVs
Las OMVs son formadas de una porción de OM separada de la superficie
bacterial, formando consigo parte del espacio periplásmico; estas vesículas
presentan un tamaño comprendido entre 50 y 250 nm cuya composición es propia
de la OM (LPS, fosfolípidos y proteínas) y periplasma [29], [30]. Sin embargo en
algunos casos la carga de las OMVs puede contener ácidos nucleicos, proteínas
citosólicas o de membrana interna, pero no se conoce con certeza el mecanismo
de introducción de estos componentes. La OM de las bacterias Gram negativas
están unidas a una capa de peptidoglicano subyacente con una distribución más o
menos homogénea, incluyendo además una lipoproteína que la une de manera
20
covalente al peptidoglicano, el sistema Tol-Pal (sistema de proteínas que
interconecta de forma no covalente la membrana interna y la externa) y el sistema
OmpA (proteínas integrales de membrana) [31].
6.4.1 Biogénesis de las OMVs
La generación de vesículas empieza por la expulsión de abultamientos de OM
hacia áreas donde los enlaces de OM-Peptidoglicano están deteriorados, ya sea
por su reposición o por el rompimiento de estas conexiones. Más adelante, estos
abultamientos generados son extendidos por la acumulación de proteínas
periplásmicas, lo cual conlleva a la formación de una futura carga de OMV.
Adicionalmente, la membrana que acaba de nacer es activada por la acumulación
localizada de proteínas inductoras de curvatura provenientes de la OM [2].
6.4.2 Funciones de las OMVs
Las OMVs sirven para innumerables funciones en el estilo de vida de la célula.
Estas actúan como un sistema de secreción que entrega su contenido al
ambiente. La secreción de factores de virulencia y toxinas dentro un hospedero vía
OMV ha sido descrito en muchas especies bacterianas [32], [33]. Para algunas
bacterias las OMVs sirven como armas entre especies para su desarrollo o como
un señuelo para bacteriófagos y péptidos antimicrobianos [34]. El rol de las OMVs
juega un papel importante en la comunicación y en el suministro de pequeñas
moléculas de señalización y ADN. La liberación de proteínas agregadas y
malformadas vía OMV han sido descritas como las responsables de un nuevo
mecanismo de estrés [35].
6.4.2.1 Las OMVs en el desarrollo de vacunas
El estudio del rol de las OMVs en la interacción del hospedero-patógeno rinde
información acerca del mecanismo de virulencia de la bacteria patógena. Un
efecto inmunomodulatorio ha sido ya empleado en el desarrollo de vacunas
acelulares [36], [37]. Sin embargo la actual producción de OMVs posee desafíos
críticos para la obtención de suficiente monto, pureza y reproducibilidad para
subsecuentes estudios de su composición proteínica y lipídicas o sus funciones
biológicas [38]. Especialmente en la producción de vacunas la consistencia de
componentes entre lotes es un factor crítico para la seguridad y eficacia de las
vacunas.
6.4.3 Producción de las OMVs
Un típico diagrama de trabajo es mostrado en la figura 1. El procedimiento
usualmente consiste en los siguientes pasos: cultivo, remoción de la bacteria
intacta y aislamiento de OMVs del cultivo filtrado y la opcional pre-concentración y
purificación. La selección de métodos particulares se basa en muchos factores,
por ejemplo la cantidad de material para ser procesada y pureza requerida para
21
posteriores aplicaciones. En la figura 3 se pueden observar los siguientes
procedimientos: 1) cultivo en medio líquido: este tiene que ver con el tiempo de
crecimiento, así como también las diferentes condiciones de estrés que influyen en
la tasa de producción de OMVs y su contenido. 2) Remoción de bacterias: la baja
velocidad de centrifugación ayuda a remover la mayoría de bacteria y el resto será
retirada acudiendo a la filtración estéril. 3) Concentración del cultivo filtrado:
debido a que la concentración de OMVs después de la ultra centrifugación es baja,
se realiza una precipitación o ultrafiltración que permite preconcentrar la cantidad
de OMVs. 4) Purificación: luego de la obtención por ultracentrifugación y de
acuerdo a la pureza de OMV requerida se procede a realizar métodos que
permiten remover aquellas proteínas que no se asocian a OMVs.
6.4.3.1 Aislamiento de OMVs
El aislamiento de las vesículas se empieza realizando una remoción de bacterias
por medio de una centrifugación de baja velocidad, pero en algunos casos se
emplean otros pasos para remover escombros celulares, proteínas grandes y
agregados de membrana [39]. El sobrenadante es filtrado luego de esta
centrifugación con el fin de remover residuos bacterianos. Debe tenerse en
cuenta, que el tamaño del poro del filtro debe ser igual al tamaño de la bacteria
que se esté tratando; por otra parte cabe anotar que actualmente se utiliza un filtro
con un poro de 0,22 µm ya que el tamaño de las OMVs circunda entre los 200-300
nm [40]. Debido a que el monto de vesículas aisladas es muy pequeño, se realiza
generalmente una pre- concentración por medio de ultrafiltración.
6.4.3.2 Ultrafiltración
En las técnicas de ultrafiltración se dispone de un sobrenadante el cual se pasa a
través de una membrana para separar proteínas no asociadas a OMVs las cuales
tienen un peso entre 50 y 100 kDa. Para este procedimiento es esencial tener
presente el material de la membrana con la que se realiza la ultracentrifugación
para obtener una mejor concentración de vesículas, en algunos casos se acuden a
membranas de celulosa ya que tienen la baja capacidad de absorber proteínas o a
membranas de polietersulfona que son más adecuadas cuando hay gran
concentración de proteína [41].
22
Figura 3. Esquema general para la producción de OMVs [11].
6.5 CUANTIFICACIÓN DEL RENDIMIENTO DE PRODUCCIÓN DE OMVs
La cuantificación es un paso clave para entender el proceso de vesiculación; esta
se basa generalmente en la medición de proteínas y/o lípidos.
6.5.1 Cuantificación de proteínas
La cuantificación de proteínas en OMVs se realiza por métodos muy conocidos
tales como Bradford [42] , Lowry [43] y ácido bicinconinico (BCA) [44] . En E.coli
alícuotas de OMVs son separadas por SDS-PAGE coloreadas con azul de
Coomassie; cada banda corresponde a una proteína especifica proveniente de la
membrana externa y cuantificadas posteriormente por densitometría [35], [45].
El método de Bradford por su parte, es una técnica que cuenta con una alta
sensibilidad (1-1,5ng), no muestra interferencia con muchos compuestos excepto
detergentes y soluciones básicas; se basa en la unión covalente de un colorante
(azul de Coomassie) junto con la proteína de interés. El colorante en medio acido
existe en dos formas, una naranja y la otra azul. La forma azul es la que forma el
complejo entre el colorante y la proteína permitiendo la determinación
colorimétrica [46].
23
6.5.2 Citometría de flujo
La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente
células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. Esta
importante técnica permite la medida simultánea de múltiples características
físicas de una sola célula, las cuales se miden mientras las células (o cualquier
tipo de partícula) pasan a una velocidad de 500 hasta 4000 células por segundo a
través del aparato de medida por medio de una corriente de fluido [47].
En la actualidad, no existe un método fácil y eficiente para el recuento y la
caracterización de partículas membranosas a una escala nanométrica tales como
las OMVs; sin embargo, la citometría de flujo es una técnica que se adecua a esta
condición ya que es una técnica que se basa en la detección, cuantificación y
separación de partículas gracias a la dispersión perpendicular de la luz.
Un rayo de luz monocromático, usualmente de luz láser, es dirigido hacia un
finísimo chorro de líquido hidrodinámicamente enfocado. Se coloca una serie de
detectores en el punto en el que el chorro de líquido atraviesa el rayo de luz. Uno
se coloca en línea con el rayo de luz (a este detector se lo conoce como FSC, por
Forward Scatter o detector de Dispersión Frontal), y varios angularmente a la
trayectoria del rayo (a estos se los conoce como SSC, por Side Scatter, o
detectores de Dispersión Lateral); además de uno o más detectores de
fluorescencia. Cada una de las partículas suspendidas con un tamaño de entre 0,2
a 0,150 micrómetros que atraviesan el rayo de luz lo dispersan, y las sustancias
químicas fluorescentes que se encuentran dentro o adheridas a la partículas son
excitadas hasta emitir luz a una longitud de onda mayor que la de la fuente de luz.
Esta combinación de luz dispersada y fluorescencia es recogida por los
detectores, y por medio de un análisis en la fluctuación de la intensidad luminosa
recogida por cada detector, es posible derivar varios tipos de información acerca
de la estructura física y química de cada partícula individual [48].
24
7. METODOLOGÍA
A continuación se describirán los distintos procedimientos para la extracción de
plásmido, células competentes, transformación de E. coli, aislamiento de vesículas
de membrana externa con contenido proteico (gfp), análisis de fluorescencia
gracias a la citometría de flujo y ensayos de estabilidad de OMVs a diferentes
temperaturas.
7.1 Producción de células competentes de E. coli JC8031
Se inoculó 1,0 mL de un precultivo de E. coli JC8031 en 250 mL de medio Luria-
Bertani (LB), el cultivo se incuba a 37°C y 220 rpm hasta alcanzar una densidad
óptica a 600nm (OD600nm) entre 0,5 - 0,6. Las células fueron colectadas
mediantes centrifugación a 2500x g a 4°C durante 10 min, el sobrenadante se
desecha y la biomasa bacteriana se resuspende en 10 mL de una disolución de
CaCl2 100 mM enfriada previamente con hielo. La suspensión se dispone en baño
de hielo durante 30 min y las células son nuevamente recolectadas por
centrifugación a 2500x g durante 10 min. Luego de eliminar el sobrenadante, el
precipitado celular se resuspende en una mezcla de una disolución de CaCl2 100
mM con glicerol al 20%. Las células fueron separadas y conservadas a -20°C [49].
7.2 Extracción de plásmido pTRC-ssTorA::gfp con columna Econospin
El plásmido pTRC-ssTorA::gfp [50] donado gentilmente por el Dr. Mathew DeLisa
(Universidad de Cornell, Facultad de Química e Ingeniería Biomolecular, Ithaca,
NY, USA) fue extraído de E. coli DH5α usando el kit de extracción para plásmidos
EconoSpinTM, y siguiendo el protocolo del fabricante. Las células cultivadas en
medio LB suplementado con ampicilina 100 µg/ml son recolectadas por
centrifugación y usadas para la extracción del plásmido pTRC-ssTorA::gfp. El
plásmido es resuspendido en buffer Tris-EDTA (Buffer TE) y analizado en gel de
agarosa al 1%, para asegurarse que se ha extraído exitosamente el plásmido en
cuestión.
7.3 Transformación E. coli JC8031 con pTRC-ssTorA::gfp
Las células competentes de E. coli JC8031, se mezclan suavemente con 20 ng de
plásmido. Las células son colocadas en hielo durante 5 minutos, luego de este
tiempo se agregan 50 µL de CaCl2 50 mM Esta mezcla es trasvasada a un tubo de
vidrio con fondo plano y se lleva al sonicador durante 15 segundos a una
temperatura de 22°C. A continuación se lleva el tubo de vidrio a un baño
termostatado durante 90 segundos a una temperatura de 42°C; y se coloca en
hielo durante 2 minutos. Después de cumplido el tiempo se adiciona 1 mL de
medio LB y se incuba durante 40 minutos a 37°C y 200 rpm. Finalizado el tiempo
de incubación se transfiere el contenido del tubo de vidrio a un tubo eppendorf
25
estéril de 1,5 mL y se lleva a centrifugación durante 5 minutos a 10000 rpm, luego
se descarta el sobrenadante y se resuspenden las células entre 50 µL del medio
LB. Las células se platean en medio LB agar suplementado con ampicilina 100
µg/ml y se incuban a 37°C [49].
7.4 Preparación, aislamiento y cuantificación de OMVs de E. coli JC8031 y
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
Para la obtención y aislamiento de las vesículas externas de E. coli se sigue el
protocolo por Chen et al. 2010 [51], como se describe brevemente a continuación.
Se inoculan 10 mL de un precultivo de las cepas de E. coli JC8031 y E. coli
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp en 100 mL de medio LB y LB suplementado con 100
µg/ml ampicilina, respectivamente. Los cultivos se incuban a 30°C durante 24
horas a 220 rpm, el cultivo de E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp es protegido de la
luz para conservar la fluorescencia de la gfp. Los cultivos son centrifugados
durante 10 minutos a 17000x g y el sobrenadante obtenido es filtrado a través de
una membrana estéril con tamaño de poro de 0,22 µm. El sobrenadante filtrado se
somete nuevamente a centrifugación durante 3 horas a 130000x g. Al finalizar la
centrifugación, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento que
corresponden a las OMVs vacías o a las OMVs que contienen la gfp; estas a su
vez son resuspendidas en 100 µL de buffer fosfato salino estéril (buffer PBS)
además de adicionar 1 µL de gentamicina 1000X. Para descartar contaminación
bacteriana durante el proceso de obtención de OMV, se toman 10 µL de las OMVs
resuspendidas en PBS, se siembran e incuban en un plato de agar LB durante 24
horas a 37°C. Se realiza cuantificación de proteína por medio de la colorimetría
acudiendo al método de Bradford y finalmente cuantificación de la fluorescencia
por citometría de flujo. Las OMVs así obtenidas se conservan para experimentos
posteriores de electrofisiología, citometría de flujo y expresión de antígenos de
Leishmania Amazonensis.
7.5 Análisis por citometría de flujo de los ensayos de estabilidad y
fluorescencia de las OMVs de E. coli JC8031 almacenadas a diferentes
temperaturas
Para determinar la estabilidad y fluorescencia de las OMVs se realizan dos
ensayos cada uno por triplicado. El primero consiste en colocar en tubos
Eppendorf 40 µL de OMVs re-suspendidas en buffer PBS estéril. Para el segundo
ensayo se colocan 40 µL de OMVs re-suspendidas en buffer PBS estéril y
complementada con glicerol al 50%. Los tubos se protegen de la luz pues la
proteína verde fluorescente puede presentar características fotosensibles y se
reparten en tres grupos para ser almacenados durante 8 días a temperatura
ambiente (15°C), en la nevera a 4°C y en el congelador a -20°C. Transcurrido este
tiempo, se realiza la evaluación de la fluorescencia de las OMVs por citometría de
26
flujo, con ayuda del citómetro Accuraci C6 flow citometer. En la tabla 1 se resumen
los experimentos llevados a cabo para la cuantificación de la fluorescencia de las
OMVs por medio de la citometría de flujo.
Tabla 1. Condiciones de almacenamiento de las OMVs.
Condiciones de almacenamiento OMVs
Medio Dilución Temperatura (°C) Tiempo (Días)
Buffer PBS 1/10 4 y 15 1, 7 y 30
Buffer PBS+glicerol 50% 1/10 4 y 15 1 y 7
1/10 -20 1, 7 y 30
7.6 Cuantificación de OMVs por el método de Bradford
Para la cuantificación de proteínas por el método de Bradford se realizará una
curva patrón de albúmina sérica bovina (BSA por sus siglas en inglés) en un rango
de 0,00 µg/mL hasta una solución de 1000 µg/mL. 100 µL de las diferentes
concentraciones patrón de BSA o de muestras de OMVs se adicionaran por
separado a 900 µL del reactivo de Bradford incubándose durante 10 minutos a
temperatura ambiente. La absorbancia de los patrones de BSA y de las muestras
de OMVs serán leídos a 595nm en un espectrofotómetro “Shimadzu UV mini 1240
UV-visible scanning” [42].
27
8. RESULTADOS Y ANÁLISIS
Previo a la producción, aislamiento y evaluación de la estabilidad de las OMVs, se
llevó a cabo la producción de células competentes de E. coli JC8031(la cual es
una cepa hipervesiculante ) y extracción del plásmido pTRC-ssTorA::gfp
acudiendo a la columna de EconoSpinTM, tal y como se mencionó en la
metodología.
8.1 Transformación E. coli JC8031 con pTRC-ssTorA::gfp
Luego de preparar las células competentes, se transformaron con el plásmido que
produce la proteína verde fluorescente “pTRC-ssTorA::gfp” el cual además cuenta
con el gen marcador que le confiere resistencia a la ampicilina como se observa
en la figura 4, además de que cuenta con una secuencia denominada “TRC-
promoter” la cual se encarga de promover la secuencia señal “ssTorA” con la que
se asegura que la proteína correctamente plegada pueda pasar al espacio
periplasmático; por otra parte se presenta una sección denominada “gfpmut” la
cual ayuda a la producción de proteína verde fluorescente. Como se puede
evidenciar en esta figura, existen varios primers que funcionan como iniciadores
para la replicación del material genético tales como “pTrcHis”, “pBAD”, “pGEX”
entre otros; estos cebadores no son de interés para este trabajo desarrollado, sin
embargo son expuestos para otros usos. Se presentan también unas secuencias
terminadoras como “rrnB”, “rrnB_T1”, “rrnB_T2”, cuya función es precisamente
asegurar que en ese punto se dé la terminación de la replicación del ADN. Una
secuencia muy importante es la del “pBR322_origin” y es allí donde se lleva a
cabo el origen de la replicación del ADN. Finalmente cuenta con la secuencia “lacI”
la cual funciona como represora del operón lactosa.
Figura 4. Plásmido de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp.
28
En la figura 5 pueden apreciarse las colonias de las células que han adquirido el
plásmido y que lograron crecer en el medio LB suplementado con el antibiótico
anteriormente nombrado.
Figura 5. Colonias de E.Coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp. La coloración verde corresponde a la fluorescencia
propia de la proteína.
Por otra parte, se pretendió realizar los experimentos de estabilidad de las OMVs
para la cepa hipervesiculante transformada esta vez con la proteína roja
fluorescente JC8031-pTRC-ssTorA::rfp, en la figura 6 pueden observarse las
colonias de esta cepa que fueron transformadas correctamente y presentaron un
crecimiento adecuado en medio LB suplementado con ampicilina. Sin embargo,
como se explicará posteriormente, no fue posible realizar un análisis completo de
la estabilidad de las OMVs provenientes de esta cepa puesto que la fluorescencia
es baja y poco estable al transcurrir el tiempo.
Cabe resaltar que los experimentos realizados para la obtención de las OMVs se
realizaron con estas células fluorescentes y con las bacterias sin transformar, es
decir aquellas que no presentan este plásmido, con el fin de comparar en
experimentos posteriores la fluorescencia y los medios óptimos de
almacenamiento. En la figura 7 se observa un plato correspondiente a la cepa
hipervesiculante sin ser transformada.
29
Figura 6. Colonias de E.coli JC8031-pTRC-ssTorA::rfp.
Figura 7. Colonias de E.coli JC8031.
8.2 Preparación, aislamiento y cuantificación de OMVs de E. coli JC8031 y
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp
Posteriormente, se realizaron los correspondientes pre-inóculos e inóculos de
cada una de las cepas descritas; es importante mencionar que los pre-inóculos se
realizaron en un volumen pequeño para que crezcan suficientes colonias de
bacterias y el inoculo en un volumen más grande para que esta población se
multiplique. Cada uno de estos pre-inóculos e inóculos fueron dejados a una
temperatura de 37°C y a 220 rpm durante 24 horas como lo reporta la literatura,
30
pero se observó que esta temperatura afectaba seriamente la fluorescencia de la
gfp y rfp, por lo cual se cultivaron estas cepas a una temperatura de 30°C, siendo
esta la más adecuada para producir una alta fluorescencia y para conservar
óptimamente las bacterias sin transformar. Es clave entender que la temperatura y
la agitación no sólo se hacen con el fin de permitir el crecimiento bacteriano, sino
que también sirve como medio para proporcionar un estrés físico a las bacterias y
que con esto empiece el ciclo de producción de vesículas, cuyo inicio se da luego
de estas condiciones. En la figura 8 se observa un cultivo de las cepas JC8031-
pTRC-ssTorA::gfp y JC8031 respectivamente, luego de ser incubadas 24h a 30°C
y 220 rpm.
Figura 8. Cultivo de JC8031-pTRC-ssTorA::gfp y JC8031 respectivamente.
A continuación se realizó una pre-centrifugación durante 10 minutos y a 10000
rpm con el fin de separar las vesículas liberadas de las células y sus restos en
este período de estrés de las bacterias, allí las OMVs quedaron en el
sobrenadante y las células por tener un mayor peso, migrarán al fondo del tubo
por la fuerza centrífuga.
En la figura 9 se pueden apreciar las células obtenidas luego de la pre-
centrifugación de la cepa de E. coli transformada con la gfp; allí puede apreciarse
la fluorescencia característica de estas bacterias, lo cual es un buen indicador de
que la cepa está en buen estado y no hay contaminación, si la hubiese la
fluorescencia sería menor o nula.
31
Figura 9. Células de la cepa JC8031-pTRC-ssTorA::gfp obtenidas luego de la pre-centrifugación.
Por otro lado las células de la cepa transformada con la proteína roja fluorescente
(rfp por sus siglas en inglés) adquieren un color rosa como se observa en la figura
10. Asimismo para la cepa no transformada debe verse un precipitado color
hueso.
Figura 10. Células de las cepas JC8031-pTRC-ssTorA::rfp y JC8031-pTRC-ssTorA::gfp respectivamente.
Es crucial para el éxito de la obtención de OMVs limpias la filtración por medio de
una membrana porosa de 0.22 µm, ya que con ella se pueden retener restos de
bacteria que pudieron quedar en el sobrenadante y se asegura el paso de
únicamente las vesículas. Para este procedimiento es de suma importancia la
completa esterilidad, ya que se disminuye el riesgo de contaminar las OMVs. Al
lograr la filtración de las OMVs encontradas en el sobrenadante, se sometió
nuevamente a centrifugación este líquido durante 3 horas y a 28000 rpm, esta
etapa se conoce como la de “ultracentrifugación” (su nombre hace alusión al uso
de la ultracentrífuga) , en la cual por la alta aceleración y fuerza allí imprimida,
provoca que las OMVs queden en el fondo del tubo y se separen de la fase
32
líquida; para este caso ya no es necesario realizar una filtración como en la pre-
centrifugación, sino que tan sólo se descarta la fase líquida inmediatamente
después de que los tubos son extraídos de la ultracentrífuga. En la figura 11 se
puede apreciar un pellet pequeño con característica fluorescente y que
corresponde a las vesículas precipitadas de la cepa de E.coli transformada.
Una vez ha finalizado la ultracentrifugación, se procedió a resuspender las OMVs
obtenidas en un buffer óptimo como el PBS, ya que confiere a las vesículas un
medio favorable para su almacenamiento, además de que se adiciona 1µL de
gentamicina 1000X con el fin de terminar cualquier tipo de contaminación; la figura
12 permite visualizar las vesículas resuspendidas al ser expuestas al
transiluminador. Para cerciorarse de que las OMVs no presentan células o algún
contaminante que se haya escapado en alguno de los procesos anteriores, se
tomaron 10 µL de OMVs y se sembraron en medio LB-agar sin ningún antibiótico
el cual se incuba a 37°C durante 24 horas, luego de este lapso no debe crecer
ninguna colonia.
Figura 11. obtenidas por ultracentrifugación.
Figura 12. OMVs resuspendidas provenientes de las cepas JC8031-pTRC-ssTorA::rfp, JC8031 y JC8031-pTRC-ssTorA::gfp respectivamente.
33
8.3 Análisis por citometría de flujo de los ensayos de estabilidad y
fluorescencia de las OMVs de E. coli JC8031 almacenadas a diferentes
temperaturas
Para los posteriores ensayos de estabilidad de las OMVs, se realizaron análisis de
la fluorescencia acudiendo al citómetro de flujo “Accuraci C6 flow citometer” y a su
vez al software “BD Accuri™ C6 sampler”. Inicialmente se partió de dos muestras
de OMVs provenientes de la cepa JC8031-pTRC-ssTorA::gfp que presentaban
gran fluorescencia, las cuales fueron nombradas como A y B. Para esta prueba se
efectuó una primera dilución de 1/10 de este lote de vesículas y además como fue
nombrado anteriormente se realizó esta misma dilución para una muestra de
OMVs que no presentaban transformación alguna. La figura 13 señala los
resultados obtenidos luego de este análisis.
Figura 13. Citometría de flujo: OMVs vacías (1,2), muestra A (3,4) y B (5,6) dilución 1/10.
En los diagramas 1, 3 y 5 puede observarse en el eje “y” la detección de
dispersión lateral de altura o SSC-H (Side Scatter-Height) ocasionada por las
5
3 4
2 1
6
34
OMVs; del mismo modo, en el eje “x” se presenta la detección de la dispersión
frontal de altura o FSC-H (Frontal Scatter-Height), lo que indica el tamaño de la
población analizada a escala logarítmica. Allí también se puede ver que la
población de OMVs se concentra en un punto determinado y que existen eventos
con un mayor tamaño pero en menor proporción; esta gráfica sirve para confirmar
que la contaminación en la muestra de las OMVs es baja.
Los diagramas número 2, 4 y 6 presentan en el eje “y” el número de eventos
analizados por el citómetro de flujo, cuyo límite fue establecido en 50.000. El eje
“x” presenta la detección de fluorescencia del área (FL1-A) por el canal 1, el cual
detecta el color verde emitido característico de la proteína estudiada. Por su parte,
el esquema 2 corresponde a las OMVs sin ninguna transformación y que se
emplearon como blanco. Es importante mencionar que para cada gráfico de las
OMVs vacías se debe establecer un límite (línea roja) que no exceda el 1.0%, lo
que significa que el porcentaje encontrado después de dicho límite corresponderá
al porcentaje de fluorescencia de aquellas OMVs que presentan la gfp. Así pues,
la muestra A (esquema 4) cuenta con un porcentaje de fluorescencia del 12.1%,
mientras que la muestra B (esquema 6) presenta el 9.4% de fluorescencia.
De la misma forma, se hizo una segunda dilución de 1/30 para los lotes A, B y
para aquellas OMVs sin carga proteica. En la figura 14, se puede observar la
citometría llevada a cabo para cada una de las anteriores muestras.
2
3 4
1
35
Figura 14. Citometría de flujo: OMVs vacías (1,2), muestra A (3,4) y B (5,6) dilución 1/30.
En los esquemas 1, 3 y 5 se ve claramente el tamaño de los eventos medidos por
el equipo el cual corresponde al esperado para las OMVs y que evidentemente no
presenta contaminación a simple vista. Para la muestra A (esquema 4) se
presenta un porcentaje de fluorescencia del 8.2 y para el lote B (esquema 6) se
cuenta con una fluorescencia del 2.2%, gracias a los límites establecidos en las
OMVs sin transformar presentado en el diagrama 2.
Con estas dos anteriores citometrías realizadas, se llegó a la conclusión que el
lote denominado como A presenta mayor fluorescencia con respecto a la B; por
esto la muestra A se seleccionó para llevar a cabo diferentes análisis de
estabilidad de las OMVs por ejemplo al ser sometidas a distintas temperaturas o
diferentes medios de resuspensión. Antes de continuar, se evaluó qué dilución es
óptima para la cuantificación de la fluorescencia; para ello se elaboraron 3
diluciones con PBS y un factor de 1/20, 3/40 y 1/10, seguido del análisis por
citometría de flujo. En la figura 15 se puede detallar en los esquemas 1, 3, 5 y 7 la
detección de la dispersión frontal y lateral que asegura que el tamaño de las
partículas es el esperado.
5 6
1 2
36
Figura 15. Citometría de flujo. OMVs vacías (1,2); muestra A: 1/10 (3,4), 3/40 (5,6) y 1/20 (7,8).
A pesar que todos los esquemas cuentan con una población especifica localizada,
se presenta en el esquema 1 una población de mayor tamaño lo que sugiere una
posible contaminación de las OMVs sin transformar o por el contrario una
conglomeración de vesículas por la falta de agitación para lograr una muestra
homogénea para el análisis. Para los diagramas 4,6 y 8 se observan porcentajes
de fluorescencia de 16.3, 14.1 y 10.8 respectivamente, por lo cual se realizaron los
ensayos de estabilidad con la dilución 1/10.
De otra manera se llevaron a cabo ensayos para determinar el medio de
resuspensión óptimo y temperaturas adecuadas para las OMVs que contribuyan a
su vez a la conservación de la fluorescencia; así pues, se analizaron muestras por
triplicado usando PBS y PBS+ glicerol 50% a distintas temperaturas (4°C, 15°C y -
20°C). Como se mencionó anteriormente la dilución realizada fue de 1/10,
teniendo así muestras de 4µL de OMVs + 36µL de PBS, del mismo modo se contó
con un volumen de 4µL de OMVs + 18µL de PBS + 18 µL de glicerol 50%. Hay
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37
que aclarar que este estudio se realizó luego del día 1, 7 y 30 de producción de un
lote de vesículas de la muestra A.
En la figura 16 se observa el comportamiento de la fluorescencia de las OMVs al
ser almacenadas a 4°C solamente en buffer PBS durante el primer día.
Figura 16. Citometría de flujo 1 día. OMVs vacías (1,2); muestra A con PBS almacenada a 4°C (3-8).
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3 4
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38
Los esquemas 1 y 2 corresponden al análisis de OMVs que no presentan
transformación por el plásmido de gfp, y será utilizada en estos ensayos como
blanco para determinar el porcentaje de fluorescencia. En los esquemas 3, 5 y 7
se puede observar la dispersión lateral y frontal originadas por las OMVs con lo
cual la mayoría de los eventos corresponden al tamaño esperado para las OMVs,
sin embargo se observa en los 4 diagramas la aparición de eventos que tienen un
tamaño mayor que el deseado, por lo que se excluye del análisis estas zonas, las
cuales se encuentran marcadas por líneas punteadas de color rojo, esto se hace
ya que esa pequeña cantidad de eventos puede contribuir al aumento de la
fluorescencia sin necesidad de ser OMVs. Los diagramas 4, 6 y 8 indican un
promedio de fluorescencia del 17.23%.
Figura 17. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1-6).
Puede evidenciarse en la figura 17 que en los esquemas 1, 3 y 5 los eventos se
localizan en el tamaño esperado para las OMVs, aunque también se presenta una
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1 2
39
población de mayor tamaño pero de una cantidad insignificante, lo cual intervendrá
en el análisis citométrico. En lo que concierne a los diagramas 2, 4 y 6 se
encuentra un promedio del porcentaje de fluorescencia de 17.36, lo cual sugiere
que el almacenamiento a 4°C y 15°C con PBS confiere gran estabilidad de la
fluorescencia al cabo de 1 día.
Figura 18. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS almacenada a -20°C (1-6).
En la figura 18 se presenta la citometría de flujo realizada para la muestra A
almacenada a -20°C durante 1 día solamente con buffer PBS, en los esquemas 1,
3 y 5 se observa el tamaño esperado para las OMVs gracias a la dispersión frontal
y lateral emitida por los eventos analizados. Por otra parte, se encuentra un
promedio de 17.2% para la fluorescencia en medio PBS luego de cinco días de
almacenamiento, lo cual indica que cualquiera de las temperaturas analizadas
(4°C, 15°C y -20°C) resulta ser óptima para la conservación de la fluorescencia al
transcurrir este tiempo.
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De la misma manera se realizaron los ensayos de estabilidad luego de un día de
almacenamiento a las temperaturas mencionadas con medio PBS + glicerol 50%.
Figura 19. Citometría de flujo 1 día. OMVs vacías (1,2); muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a 4°C
(3-8).
Para la figura 19 se presenta la citometría de flujo para la muestra A almacenada
durante un día a 4°C y resuspendidas en PBS+ glicerol 50%; en lo que respecta a
los esquemas 1, 3, 5 y 7 se ve una población con tamaño esperado para la
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muestra analizada de OMVs y no se observa mayor cantidad de eventos que
correspondan a otro tipo de población, por su lado el diagrama 2 corresponde a
una muestra de OMVs sin carga proteica el cual será usado como blanco. Para los
diagramas 4, 6 y 8 se pudo determinar un promedio de fluorescencia del 11.03%.
Al enfrentar estos resultados con los obtenidos en el análisis de esta temperatura
pero resuspendidas solo en buffer PBS, se encuentra que el mejor medio de
almacenamiento para las OMVs y para conservar la fluorescencia es en la
solución tampón, con una diferencia de fluorescencia cercana al 6%.
Figura 20. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a 15°C (1-4).
En la figura 20 se puede apreciar en los esquemas 1 y 3 que el tamaño de los
eventos analizados si es el esperado para las OMVs de la muestra A; por su parte
en los esquemas 2 y 4 se presenta un promedio en el porcentaje de la
fluorescencia de 11.8, teniendo como base el límite expuesto en el esquema 2 de
la figura 19 para las OMVs vacías. Para este caso, se eliminó un dato puesto que
su valor muy diferente a los anteriormente presentados. Al comparar este
resultado obtenido con la misma temperatura pero solo en buffer PBS, se
encuentra que es mejor medio de resuspensión la solución tampón usada, ya que
existe una diferencia de fluorescencia mayor al 5%.
3 4
1 2
42
Figura 21. Citometría de flujo 1 día. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a -20°C (1-6).
Se evidencia en la figura 21 la citometría realizada para la muestra A almacenada
a -20°C y resuspendida en PBS + glicerol 50%, en los esquemas 1, 3 y 5 se
observa el tamaño normal para las OMVs, aunque el diagrama 1 presenta una
cierta cantidad de eventos que pueden ser de otra población e inclusive significa
escasa agitación de las OMVs haciendo que estas se conglomeren. En los
esquemas 2, 4 y 6 se presenta un promedio en el porcentaje de la fluorescencia
de 10.4. Si se compara este resultado con el análisis realizado para la misma
temperatura pero con medio de resuspensión en PBS únicamente, se observa que
el mejor medio para conservar la fluorescencia por este tiempo es la solución
tampón, pero es importante mencionar que a esta temperatura no se pueden
conservar durante más tiempo ya que se presenta la formación de cristales en la
solución buffer lo que provoca que las OMVs se estallen, para lo cual se podría
usar el glicerol junto con el buffer logrando conservar la integridad de las vesículas
pero no la intensidad de la fluorescencia. Por lo anterior, los ensayos siguientes se
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hicieron solamente para el almacenamiento a 4°C y 15°C con medio de
resuspensión únicamente de PBS.
En la figura 22 se puede observar que luego de siete días de almacenamiento a
4°C, el promedio de fluorescencia cuando el medio de resuspensión es solamente
PBS es de 4.15%. Gracias a los esquemas 1, 3 y 5 puede asegurarse que no
existe contaminación alguna en las muestras de OMVs y la agitación realizada
previa al análisis por el citómetro de flujo fue adecuada.
Figura 22. Citometría de flujo 7 días. OMVs vacías (1,2); muestra A con PBS almacenada a 4°C (3- 6).
En la figura 23 se detalla la medición realizada en el citómetro de flujo luego de
siete días al almacenar la muestra A en temperatura ambiente (15°C) y
resuspendida en PBS únicamente. En los esquemas 1 y 3 se puede distinguir
gracias a la dispersión lateral y frontal generadas por las OMVs que la mayor parte
de los eventos presentan el tamaño esperado, a pesar de esto es notorio que cada
uno de los ensayos muestran un cierto grado de contaminación ya que se
1 2
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visualiza una población significativa de mayor tamaño. En cuanto a los diagramas
2 y 4 se denota que la fluorescencia es mayor con respecto al almacenamiento a
4°C presentando un porcentaje de 5,2%. No obstante es evidente que a esta
temperatura puede proliferar algún tipo de contaminación por lo que es
recomendable el almacenamiento a 4°C aunque su fluorescencia sea menor.
Es importante mencionar que todos los ensayos efectuados a los siete días de
almacenamiento fueron realizados con el blanco presentado en la figura 22
(esquemas 1 y 2). Por el contrario, no se hizo almacenamiento de esta muestra
resuspendida en PBS a -20°C, ya que a esta temperatura se forman cristales en la
solución que son capaces de estallar las vesículas y por lo tanto su conservación
sería mínima.
Figura 23. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1- 4).
Ahora bien, se hicieron los ensayos a las temperaturas ya nombradas pero esta
vez resuspendidas en PBS + glicerol 50%. En la figura 24 se presentan los
resultados de la citometría llevada a cabo para el ensayo a 4°C luego de siete días
de almacenamiento y con la dilución ya mencionada; en los esquemas 1 y 3 se
observa una población que corresponde al tamaño de las OMVs. Por su parte en
los diagramas 3 y 4 se presenta un porcentaje promedio de la fluorescencia de 7.
Este resultado en comparación con el obtenido en el almacenamiento de las
OMVs a esta temperatura pero resuspendidas en PBS únicamente, es
significativamente mayor lo que sugiere que este último medio es mejor a la hora
de conservar la muestra que el buffer.
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1 2
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Figura 24. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a 4°C (1- 4).
Figura 25. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a 15°C (1- 4).
Igualmente se efectuó el análisis con ayuda del citómetro de flujo para el
almacenamiento luego de siete días a 15°C de las OMVs en medio de buffer PBS
+ glicerol 50%. Es evidente en los esquemas 1 y 3 de la figura 25 que no existen
conglomeraciones por falta de agitación o posible contaminación de las muestras
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analizadas, además de asegurar que la población analizada si corresponde a la
esperada. Asimismo en los diagramas 2 y 4 se presenta una fluorescencia
promedio de 3,9% lo que indica que es más recomendable el almacenamiento
solo en buffer PBS que en este medio de resuspensión utilizado.
Figura 26. Citometría de flujo 7 días. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a -20°C (1- 4).
Para la figura 26 se presenta la citometría realizada para la muestra A almacenada
en PBS + glicerol 50% a una temperatura de -20°C; los esquemas 1 y 3 muestran
una normalidad en el tamaño esperado para las vesículas sin presencia aparente
de alguna contaminación, sin embargo se ven unos eventos fuera del área de
interés lo que puede indicar la falta de agitación. En los diagramas 2 y 4 se
observa un promedio para la fluorescencia del 9.45%, lo que indica que sería un
medio efectivo para conservación de estas OMVs a bajas temperaturas.
De igual manera se realizó el análisis citométrico para las muestras almacenadas
luego de transcurrir un mes, cabe aclarar que las OMVs analizadas a
temperaturas de 4°C y 15°C solamente se encuentran en medio de buffer PBS,
mientras que las OMVs almacenadas -20°C y posteriormente analizadas fueron
resuspendidas en PBS+glicerol 50% por lo explicado con anterioridad.
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47
Figura 27. Citometría de flujo 30 días. OMVs vacías (1,2), muestra A con PBS almacenada a 4°C (3- 8).
Los diagramas 1 y 2 de la figura 27 presentan la medición obtenida a las OMVs sin
la proteína verde fluorescente encapsulada, el primero de ellos muestra el tamaño
esperado para los eventos a analizar además de no presentar contaminación
aparente y suficiente agitación previa. Los esquemas 3, 5 y 7 manifiestan la
dispersión frontal y lateral que ejercen las OMVs al transitar por los canales
obteniendo así, la mayor parte de los eventos localizados en el área esperada; sin
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embargo se observa gran cantidad de contaminación por mantener almacenadas
las muestras durante varios días o conglomeración por insuficiente agitación. De la
misma manera se observa en los diagramas 4, 6 y 8 una disminución notable de la
fluorescencia obteniendo un promedio de 1,1%, lo que sugiere que los estudios
con OMVs cargadas con proteínas fluorescentes deben realizarse antes del mes
de almacenamiento para que no sea reduzca su luminosidad.
Figura 28. Citometría de flujo 30 días. Muestra A con PBS almacenada a 15°C (1- 6).
Los esquemas 1, 3 y 5 de la figura 28 presentan la dimensión esperada para los
eventos analizados en las muestras, contrario a esto puede evidenciarse gran
porcentaje de eventos con un tamaño superior al de las OMVs, por lo que se
esperaría que en la muestra hay algún tipo de contaminación debido a la cantidad
de días de almacenamiento o conglomerados por falta de agitación. Por otra parte,
se asegura con los esquemas 2, 4 y 6 que la fluorescencia se preserva obteniendo
un promedio de 9.73%, valor que al ser comparado con los resultados mostrados
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en la figura 27 indica que la temperatura de 15°C mantiene mejor conservada la
fluorescencia en comparación con los 4°C.
Figura 29. Citometría de flujo 30 días. Muestra A con PBS+glicerol 50% almacenada a -20°C (1- 6).
En los esquemas 1, 3 y 5 de la figura 29 se presenta una cantidad de eventos que
corresponden al tamaño esperado para las OMVs, pero se puede apreciar la
aparición de una población de mayor tamaño debido a una posible contaminación
por la cantidad de días o simplemente a la falta de agitación lo que conlleva a la
formación de conglomerados. Por su parte los diagramas 2, 4 y 6 reflejan un
promedio del porcentaje de fluorescencia de 6.33, resultado que al ser contrastado
con el análisis de la figura 26 refleja una disminución considerable de la
fluorescencia de la muestra A al transcurrir este lapso.
Para un mejor entendimiento del comportamiento de la fluorescencia de las OMVs
se presenta en la figura 30 un resumen del porcentaje de fluorescencia al ser
almacenadas en buffer PBS durante 1, 7 y 30 días a distintas temperaturas.
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Figura 30. Comportamiento de la fluorescencia de OMVs en medio PBS durante 1, 7 y 30 días a distintas
temperaturas.
De igual manera se muestra en la figura 31 el comportamiento de la fluorescencia
de las OMVs al ser almacenadas en buffer PBS + glicerol 50% durante 1, 7 y 30
días a distintas temperaturas.
Figura 31. Comportamiento de la fluorescencia de OMVs en medio PBS+glicerol 50% durante 1, 7 y 30 días a
distintas temperaturas.
Finalmente se deseó realizar análisis más detallados sobre la evaluación de la
estabilidad de las OMVs que contenían gfp, pero como se verá en la figura 32 no
se logró cumplir con este objetivo, puesto que la fluorescencia disminuyó
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(-20 C) 4 C 15 C
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Temperatura de almacenamiento
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(-20 C) 4 C 15 C
% d
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rescen
cia
Temperatura de almacenamiento
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7 días
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notoriamente, lo anterior se atribuye principalmente a posible contaminación
presentada en el lugar de trabajo así como de los instrumentos y diferentes
medios utilizados.
Figura 32. Citometría de flujo. OMVs vacías (1, 2), muestra gfp 4°C: células (3,4) y OMVs (5,6).
El esquema 3 de la figura 32 representa el análisis realizado a una muestra de
células de JC8031-pTRC-ssTorA::gfp. Aquí se evidencian dos poblaciones que
corresponden al tamaño de las OMVs y de las células bacterianas obtenidas en la
pre centrifugación. En el diagrama 4 se puede observar el porcentaje de
fluorescencia que proporcionan estas dos poblaciones y que corresponde al
36.5%. En el esquema 5 se analiza únicamente una población de OMVs que
aparentemente no presenta contaminación. Por su parte el diagrama 6 refleja
únicamente la fluorescencia emitida por estos eventos que corresponden a las
OMVs, la cual es baja en comparación a la de las células siendo a penas del
3.0%, lo que indica que probablemente durante el periodo de vesiculación no se
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3 4
6 5
52
ha logrado llevar a cabo la internalización de la gfp haciendo que la fluorescencia
solo exista a nivel celular.
Como se mencionó previamente se pretendió realizar la evaluación de la
estabilidad de OMVs provenientes de una cepa de E. coli JC8031-pTRC-
ssTorA::rfp, y aunque la transformación fue exitosa el análisis por citometría de
flujo de las OMVs muestra valores de fluorescencia bajos, lo cual impidió la
continuidad de estos análisis como los llevados a cabo con las OMVs
transformadas con gfp.
Figura 33. Citometría de flujo. Muestra rfp a 4°C: células (1-3), OMVs (4-6).
En la figura 33 se presenta la citometría de flujo realizada a una muestra de
células y OMVs provenientes de la cepa hipervesiculante transformada con rfp; en
el esquema 1 son notorias las dos poblaciones por su diferente tamaño las cuales
pertenecen a las OMVs y a las células bacterianas obtenidas en la pre
centrifugación realizada en el aislamiento. El esquema 2 presenta la fluorescencia
de estas células detectada en el canal FL2-H, el cual capta parte de esta
fluorescencia ya que está diseñado para detectar la luz naranja. El esquema 3
muestra la fluorescencia de las células bacterianas en el canal FL3-H que capta la
coloración roja propia de esta cepa. De igual manera el diagrama 4 exhibe
únicamente los eventos propios de las OMVs por lo que los diagramas 5 y 6
presentarán la fluorescencia de estas vesículas, la cual es nula.
1 2 3
4 5 6
53
8.4 Cuantificación de OMVs por el método de Bradford
Por otro lado, para la estimación de la cantidad de proteínas totales presentes en
las OMVs se realizó el método de Bradford como se describe detalladamente con
anterioridad utilizando una curva de BSA con un rango entre 0 hasta 1000 μg/mL.
Las concentraciones de BSA y las absorbancias registradas se presentan en la
tabla 2.
Tabla 2. Curva de calibración de BSA junto con las absorbancias correspondientes.
Concentración (μg/mL)
Absorbancia (A)
1000 0,278
500 0,209
125 0,097
31,25 0,075
7,8125 0,0755
0 0,062
Posteriormente, se realizó la cuantificación de gfp junto con la carga proteica
encapsulada por las OMVs y se determinó con ayuda de la curva de calibración
que su concentración es de 98,83 μg/mL. A su vez, se realizó la cuantificación de
proteínas totales a las vesículas sin carga proteica de gfp es decir, a las
provenientes de la cepa hipervesiculante JC8031 obteniendo una concentración
de 10,87 μg/mL, lo que podría significar que 87,96 μg/mL corresponden solamente
a gfp.
54
9. CONCLUSIONES
1. La temperatura óptima para la estabilidad de las OMVs provenientes de la cepa de
E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp es de 15°C y resuspendidas en buffer PBS de
acuerdo a los análisis realizados por medio de la citometría de flujo; sin embargo
el almacenamiento a esta temperatura provoca que la fluorescencia descienda
notablemente al transcurrir el tiempo, además de que sirve como medio para
propagar contaminación en la muestra.
2. La estabilidad de la fluorescencia de las OMVs provenientes de la cepa de E. coli
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp se ve prolongada no más de tres semanas al ser
almacenadas a 4°C y resuspendidas en buffer PBS, temperatura a la cual también
se genera menor contaminación en comparación a 15°C.
3. Si se desea realizar el almacenamiento de las OMVs provenientes de la cepa de
E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp a una temperatura de -20°C, el medio de
resuspensión propicio para conservar la estabilidad y fluorescencia deberá ser
PBS acompañado de glicerol 50%.
4. Si bien la literatura sugiere utilizar una temperatura de 37°C para el cultivo
bacteriano de E. coli, la temperatura de 30°C proporciona a la cepa JC8031-
pTRC-ssTorA::gfp mayor crecimiento bacteriano y una mayor intensidad en la
fluorescencia lo que resultará útil a la hora de la producción de OMVs.
5. Aunque el método de Bradford para la cuantificación de proteínas es altamente
sensible, no se puede determinar con exactitud la cantidad de gfp que se
encuentra internalizada en las OMVs.
6. El análisis por citometría de flujo es propicio para la evaluación de la intensidad de
la fluorescencia propia de la gfp que se encuentra encapsulada en las OMVs.
7. La transformación de la cepa hipervesiculante con el plásmido pTRC-ssTorA::rfp
fue llevada a cabo con éxito, no obstante la intensidad de la fluorescencia de esta
proteína presente en las OMVs es baja en comparación con las del plásmido
pTRC-ssTorA::gfp.
55
10. RECOMENDACIONES
1. Se recomienda que los cultivos de las células de E. coli JC8031 y E. coli
JC8031-pTRC-ssTorA::gfp sean pre inoculados y cultivados a 30ºC para mejorar
los rendimientos en la producción de OMVs y lograr una mayor intensidad en la
fluorescencia de esta proteína.
2. Para el análisis en el citómetro de flujo de OMVs provenientes de E. Coli
JC8031 y E. coli JC8031-pTRC-ssTorA::gfp se recomienda realizar vortex durante
1 min aproximadamente para evitar conglomerados en la medición.
56
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![ion Gram[1]](https://static.fdocuments.ec/doc/165x107/577d35261a28ab3a6b8fabe3/ion-gram1.jpg)
