REVISTA SALUD PUBLICA Y NUTRICIÓN Edición Especial No. 11-2006 II Congreso de Ciencias Farmacéuticas de la Conferencia Hispanoamericana de Facultades de Farmacia

(COHIFFA) y el VIII Congreso Regional de Químicos Fármaco Biólogos

PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS MEDIANTE INOCULACIÓN DE DNA DESNUDO EN UN MODELO

ANIMAL

1De la Rosa Moreno, Eduardo Isaac; 1Gomez Treviño, Alberto y 2Mercadé Gil, Elena

1Centro de Laboratorios Especializados, Facultad de Ciencias Químicas, UANL. Av. Pedro de Alba s/n, S.

Nicolás de los Garza, NL. México. E-mail: jegomez@fec.uanl.mx , tel. +52 (81) 8329 4010, fax +52 (81)

83322816.

2Departament de Microbiologia y Parasitologia Sanitàries, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona.

Introducción Se ha demostrado que la inoculación de animales con DNA desnudo puede inducir una respuesta

inmunológica prolongada y activa, de manera que se ha podido conferir inmunidad contra agentes infecciosos

tales como virus o bacterias. Objetivo

Producir anticuerpos mediante inoculación de DNA desnudo en modelos animales. Evaluar la producción de

anticuerpos mediante la expresión del antígeno especifico en cultivo celular. Utilizar los productos obtenidos

como anticuerpo primario en ensayos de inmunodetección in vitro.

Materiales y método

Para inducir la producción de anticuerpos mediante inoculación de DNA se utilizaron conejos machos de la

raza New Zealand. Los animales fueron inoculados con 4 dosis de 100 µg de DNA plasmídico cada una por vía

intradérmica. El calendario de administración se estableció a los 0, 21, 42 y 63 días. Las dosis fueron

administradas en forma de DNA plasmídico purificado (pACCMV.pLpA-F con el cDNA de la proteína fusogénica

F del virus SV5, y pACCMV.pLpA como control). Los sueros sanguíneos se obtuvieron de muestras

recolectadas por punción en la oreja a los 0, 31, 52 y 73 días (Fig 1.); y posteriormente se emplearon para la

detección de anticuerpos anti-F sobre cultivos de células CV-1 o fibroblastos de pulmón de embrión humano

transducidas con el adenovirus recombinante AdF. La detección de anticuerpos se realizó en placas de 24

pozos con células cultivadas sobre cubreobjetos y una vez llegadas a la confluencia sobre estos fueron

infectadas con 75 m.o.i. de AdF o AdlacZ. A las 48 h. las células se fijaron con PFA 3% durante 15 min. y se

lavaron 3 veces con PBS. La detección de anticuerpos se llevó a cabo empleando los sueros como anticuerpo

primario en diluciones 1:200 y 1:2000. Se incubó 1 h. a 37 ºC. Se aplicaron 3 lavados y se aplicó una dilución

1:200 de un anticuerpo secundario (IgG Goat anti-rabbit) conjugado con Texas Red. Por último, las muestras

fueron analizadas mediante microscopía de fluorescencia a las longitudes de onda indicadas para Texas Red.

Figura 1. Programa de inoculación con el plasmídico purificado pACCMV.pLpA-F que contiene el cDNA de la proteína fusogénica F del paramyxovirus SV5, y pACCMV.pLpA como control para produción de anticuerpos en conejos machos de la raza New Zealand.

Resultado

La respuesta generada posterior a la inoculación de los vectores indicados fue evaluada mediante

inmunoensayos y microscopía de fluorescencia obteniendose una señal de fluorescencia que pone de

manifiesto el contorno celular. No se apreciaron diferencias en la respuesta obtenida en ambas diluciones.

Tampoco se obtuvieron marcajes de fluoresencia para los vectores utilizados como controles negativos (Figura

2).

Figura 2. Fotografias obtenidas por microscopia de fluorescencia donde se aprecia el contorno de los fibroblastos y las células CV-1 infectadas por el Ad F que han expresando la proteína F en sus membranas.

Conclusiones

De acuerdo con los reultados obtenidos se puede concluir que es posible generar anticuerpos específicos

mediante inmunización con vacunas de DNA. Aunque en los últimos años se ha demostrado que mediante

inmunización con DNA es posible generar respuesta efectiva contra varios agentes infecciosos, no se ha

establecido aún de manera precisa los mecanismos para su funcionamiento. Todo parece indicar que se induce

conjuntamente inmunidad humoral y celular, y que la magnitud de la respuesta inmune generada puede verse

afectada tanto por la vía y los medios de administración, como por el tipo de células que expresan el antígeno y

su localización.

Bibliografia:

▫ Wolff, J. A., Malone, R. W, P., Chong, W., Acsadi, G., Jani, A. and Felnger, P. L. (1990) Direct gene transfer

into mouse muscule in vivo. Science. 247:1465.

▫ Manickan, E., Karem, K. L. and Rouse, B. T. (1997) DNA vaccines. A modern gimmick or a boon to

vaccinology? Critical Reviews in Immunology. 17:139-154.

▫ van Drunen Little-van den Hurk, S., Braun, R. P., Karvonen, B. C., King, T., Yoo, D. and Babiuk, L. A. (1999)

Immune responses and protection by DNA vaccines encoding bovine Parainfluenza virus type 3

glycoproteins. Virology. 260:35-46.

▫ Gómez-Treviño, A., Castel, S., López-Iglesias, C., Cortadellas., N., Comas-Riu, J. and Mercadé, M. (2003).

Effects of adenovirus-mediated SV5 fusogenic glycoprotein expression on tumour cells. The Journal of Gene

Medicine. 5 (6) 483-492.

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Valoración de Factores de Riesgo para Desarrollar Síndrome Metabólico

Gracia Vásquez S.L.Q.F.B., M.C., Pharm D, Camacho Mora I.A Q.F.B., M.A., Pharm D., Cantú Cárdenas L.G Q.F.B., M.C., Pharm D., Pharm D, Orozco Beltrán E. Q.F.B., Pharm D, Aguilar Bravo E.M. Q.F.B.,M.S.P.

Facultad de Ciencias Químicas, U.A.N.L. Correos electrónicos: sgracia@fcq.uanl.mx, icamacho@fcq.uanl.mx, luccantu@yahoo.com, cimelidafcq@yahoo.com.mx, eliorozcomx@yahoo.com.mx Introducción

La presencia simultánea de obesidad, hiperlipidemia, diabetes e hipertensión fue descrita por primera vez en

los años 60. Esta asociación fue posteriormente mencionada por investigadores alemanes incluyendo Haller y

sus colegas en los años 70. Ellos acuñaron el término síndrome metabólico y describieron su asociación con

arterioesclerosis1

El síndrome metabólico es un desorden complejo que incluye obesidad, dislipidemia, resistencia a la insulina e

hipertensión.2-4 La inactividad física, la obesidad y la composición de la dieta parecen ser todos factores de

riesgo para el desarrollo del síndrome. 5-8

La fisiopatología de este síndrome esta sujeta a continua controversia, se ha sugerido una relación causal con

la resistencia a la insulina y la adiposidad visceral, niveles incrementados aunque sea en valores pequeños de

glucosa en ayuno y postprandial imparten un riego incrementado para morbilidad y mortalidad vascular.9-10

En 2001 el III Panel para tratamiento de adultos del Programa Nacional para la Educación ( sobre Colesterol

(NCEP-ATP III ) proporcionó una definición para el síndrome metabólico. De acuerdo a esa definición se

considera que el paciente tiene síndrome metabólico si presenta tres o más de los siguientes signos: glucosa

en ayuno mayor o igual a 110 mg/dl; presión arterial mayor o igual a 130/85 mm Hg o medicación

antihipertensiva; triglicéridos mayor o igual a 150 mg/dl; HDL colesterol menor de 50 mg/dl en mujeres y menor

de 40 mg/dl en hombres; obesidad central es decir circunferencia de cintura mayor de 88 cm en mujeres y

mayor de 102 en hombres .11-13

Actualmente la prevalencia del síndrome metabólico excede 20 % en los individuos de 20 años o más y 40 % en

población de más de 40 años.14

Estimaciones recientes han sugerido que la prevalencia en adultos del síndrome metabólico es de 32 % en

Hispanoamericanos, 22 % en africoamericanos y 24 % en americanos caucásicos. Como la obesidad, la

presencia del síndrome ha sido asociada con factores de riesgo para el desarrollo de diabetes y enfermedades

cardiovasculares.15 La resistencia a la insulina se cree que juega un papel central en la fisiopatología del

síndrome.

La inflamación crónica subclínica asociada con riesgo cardiovascular se cree que es parte del síndrome

metabólico. Inflamación crónica leve está asociada con enfermedad cardiovascular, diabetes, resistencia a la

insulina, todos rasgos del síndrome metabólico. IL-6 es una citokina proinflamatoria producida por el tejido

adiposo, células endoteliales, macrófagos y linfocitos. La proteína C-reactiva , un reactante de fase aguda, es

sintetizada en el hígado en respuesta a IL-6. Estudios recientes indican que la inflamación, medida por la IL-6 y

la Proteína C-reactiva predicen no solo los eventos cardiovasculares sino también el desarrollo de la diabetes. 16-21 Se considera que hay una substancial superposición entre de los factores de riesgo ambientales (vida

sedentaria y excesiva ingestión de calorías) y genéticos asociados con el desarrollo de síndrome metabólico y

los factores responsables del desarrollo de la diabetes tipo 2.21

El síndrome metabólico se ha propuesto recientemente como un método para identificar individuos que tienen

un riego incrementado de diabetes y enfermedad cardiovascular. Es un desorden asintomático,

presumiblemente su importancia clínica es debido a su habilidad de identificar individuos para recibir

tratamiento preventivo que de otro modo no lo recibirían.22-27

Metodología Participantes y datos demográficos Este estudio de cohorte prospectivo incluyó al personal de la Facultad de Ciencias Químicas, UANL, mayor de

30 años de edad, con obesidad, y/o con antecedentes de diabetes, hipertensión y a estudiantes de la FCQ con

los mismos antecedentes. Se llevó a cabo la elaboración de formatos de registro, material publicitario, etc., así

como la distribución de invitación que señalaba indicaciones para el estudio en las que se incluía ayuno de al

menos 8 h. Personal entrenado midió la cintura al centímetro más cercano; la altura y el peso de los pacientes

sin zapatos. Se midió la presión sanguínea utilizando un baumanómetro aéreo convencional previo reposo en

posición sentada por al menos cinco minutos antes de la medición. Se calculó el índice de masa corporal (IMC)

como el peso en kg dividido entre el cuadrado de la estatura en metros. Se obtuvo sangre capilar después de

un ayuno nocturno y se analizó para glucosa, triglicéridos y colesterol total en el equipo Accutrend GCT

(Roche)

Se utilizó un cuestionario autoadministrado en el que cada participante firmó de consentimiento de participar en

el estudio para la obtención de datos demográficos, historia de fumar, presencia de enfermedades cardiacas,

hipercolesterolemia, entre otras. La población fue agrupada de acuerdo a los niveles de IMC en peso normal

(18.5 a 24.9), sobrepeso (25 a 29.9) y obesidad (≥ 30). Los participantes detectados con el síndrome recibieron

atención personal de profesionales en salud pública.

Criterio para síndrome metabólico

En base a criterio recientemente

definido (NIH), síndrome metabólico

fue definido si las personas tuvieron al

menos tres de las condiciones

presentadas en la tabla 1. En este

estudio se midió colesterol total ya que

no se dispuso de la medición del

colesterol HDL. Se realizó un

seguimiento de los pacientes con el

síndrome a los tres meses de haberse

detectado el síndrome.

Análisis estadístico Los datos se analizaron en base a los

grupos por IMC para hombres y mujeres. Se utilizó la prueba de t para detectar diferencias estadísticamente

significativas entre las características de línea base entre grupos. Los análisis se llevaron a acabo en Excel y en

software estadístico SPSS versión 11.

Resultados Se incluyeron en este trabajo de investigación un total de 121 pacientes, 84 mujeres (69.4%) y 37 hombres

(30.6%) con un promedio y desviación estándar de edad en años de 30.5 + 10.4 y edades comprendidas entre

los 17 y 61 años de edad. El nivel de escolaridad de los participantes fue significativamente mayor para

personas con posgrado (37.2%). El 15% reportó fumar con un promedio de 6 cigarrillos por día. Las

enfermedades reportadas fueron diabetes 2.5%, hipertensión 5%, hipercolesterolemia 5%. Se encontró un 34.7

%, 38.0% y 27,3% de la población con peso normal, sobrepeso y obesidad respectivamente entre los cuales se

observó un incremento en los valores de cintura, presión sistólica, diastólica, triglicéridos y colesterol total en los

grupos de peso normal a obesidad. No existen diferencias estadísticamente significativas entre hombres y

mujeres para los resultados de presión, triglicéridos.

Cada paciente recibió atención personalizada al finalizar las pruebas, en las que se proporcionó un folleto

informativo acerca del síndrome metabólico y sus implicaciones, en caso pertinente se hicieron una serie de

recomendaciones al estilo de vida y/o recibir atención médica. Los pacientes con sobrepeso u obesidad

recibieron la atención de nutriólogas de la UANL.

La tabla 2 muestra las características de línea base de los participantes del estudio por IMC para hombres y

mujeres

Tabla 1

NCEP 2001

1. Glucosa plasmática en ayuno > 110 mg/dL (6.1 mmol/L)

2. Hipertrigliceridemia Triglicéridos > 150 mg/dL (1.7 mmol/L)

3. Colesterol HDL < 40 mg/dL (1.036 mmol/L) ( ) < 50 mg/dL (1.295 mmol/L) ( )

4. Hipertensión Presión sanguínea >130/85 mmHg y/o Medicamentos para la presión

5. Obesidad central Medida de cintura > 102 cm ( ) > 88 cm ( )

Tabla 2 Características de la población clasificados por

Índice de Masa Corporal

Mujeres Hombres

Parámetro Peso Normal 18.5 a 24.9

N=33

Sobrepeso 25 a 29.9

N=32

Obesidad > 30 N=19

Peso Normal 18.5 a 24.9

N=9

Sobrepeso 25 a 29.9

N=14

Obesidad > 30 N=14

Edad (años) 40.4 + 8.0 39.8 + 11.5 39.4 + 8.8 32.9 + 7.8 40.71 + 13.4 40.3 + 12.7

Peso (kg) 56.4 + 5.3 66.91 + 4.7 89.2 + 16.5 67.3 + 9.9 79.7 + 7.8 100.4 + 16.3

Estatura (m) 1.59 + 0.06 1.58 + 0.05 1.60 + 0.07 1.74 + 0.08 1.70 + 0.09 1.73 + 0.09

IMC 22.4+ 1.8 26.7.0 + 1.4 35.0 + 5.2 22.2 + 1.8 27.7 + 1.0 33.5 + 4.7

Cintura (cm) 75.5 + 76.6 84.9 + 5.7 101.3 + 12.2 83.8 + 8.4 96.6 + 5.9 109.6 + 9.5

Presión Sistólica (mm Hg) 106 + 14.7 105 + 12.4 110 + 14.2 103.6 + 12.1 112.9 + 10.1 129 + 15.2

Presión Diastólica (mm Hg) 66.8 + 10.4 65.4 + 9.7 69.4 + 14.5 64.6 + 8.8 72.3 + 8.4 80.1 + 8.1

Triglicéridos (mg/100mL) 133.2 + 61.9 148.8 + 72.9 156.1 + 47.8 136 + 75.1 207.9 + 66.7 196 + 69.2

Colesterol (mg/100mL) 171.3+ 27 186.3 + 31.6 170.1 + 26.4 157.3 + 17.7 164.8 + 17.6 189.4 + 44.5

Glucosa (mg/100 mL) 81.3 + 9.6 85.8 + 10.8 85.4 + 12.6 92 + 6.4 96 + 7.1 93.64 + 25.1

Se encontró que el 10% de los participantes con síndrome metabólico (presencia de tres o más factores de

riesgo) con predominancia del sexo masculino (67%).

De los pacientes detectados solo el 66.7% acudieron al seguimiento a tres meses del programa, se llevaron a

cabo los análisis correspondientes y se encontró que el 50% no presentó el síndrome.

Conclusiones Nuestros resultados indican que la población analizada se encuentra dentro de la prevalencia en nuestro país,

que oscila entre 5% y 30%. Es de vital importancia la realización de este tipo de programas de detección en

nuestro medio, mediante la activa participación de los miembros del equipo de salud que permita implementar

programas preventivos eficaces para reducir la incidencia de síndrome metabólico ya que su presencia es

altamente predictiva de desarrollar diabetes mellitus y enfermedades cardiovasculares.

Un abordaje integral en el tratamiento de estos desórdenes involucra importantes intervenciones en el estilo de

vida en donde es clave una dieta saludable, actividad física, pérdida de peso y agentes farmacológicos para el

tratamiento de factores de riesgo específicos.

Referencias 1.- Alexander M, Landsman B, Teutsch SM, Haffner SM. NCEP-Defined metabolic syndrome, diabetes, and

prevalence of coronary heart disease among NHANES III participants age 50 years and older. American

Diabetes Association 2003;52(5):1210-1214.

2.-Kitano H, Oda K, Kimura T, Matsuoka, Y, Csete, M, Doyle J, Muramatsu M. Metabolic syndrome and

robustness tradeoffs. Diabetes 2004; 55(3):6-15

3.-Leoncini G, Ratto E, Vizzzi F, Vaccaro V, Parodi D, Parodi A, Falqui V, Tomolillo C, Deferrari G, Pontremoli R.

Metabolic syndrome is associated with early signs of organ damage in nondiabetic, hipertensive patients.

Journal of Internal Medicine 2005;257:454-460.

4.-Foyret J. The critical need for lifestyle intervention: how to begin. American Journal of Cardiology 2005:5

5.-Park HS, Lee K. Greater beneficial effects of visceral fat reduction compared with subcutaneous fat reduction

on parameters of the metabolic syndrome: a study of weight reduction programs in subjects with visceral and

subcutaneous obesity. Diabetic Medicine 2005:22:266-272

6.- Muzio F, Mondazei L, Sommariva D, Branchi A. Long term effects of low-calorie diet on the metabolic

syndrome in obese nondiabetic patients. Diabetes Care 2003:28:1483-1486

7.- Katzmarzyk PT, Church TS, Janssen I, Ross R, Blair SN. Metabolic syndrome, obesity and mortality.

Diabetes Care 2005;28:391-397.

8.- Ford S, Giles WH, Morkad AH. Increasing prevalence of the metabolic syndrome among U.S. adults.

Diabetes Care 2004; 27:2444-2449.

9.- Fitzgerald L, McGorrian C, Graham I. Homocysteine predicts cardiovascular risk independently of the

metabolic syndrome. BMJ 2005;91:42

10.- Goodpaster BH, Krish. S, Harris TB, Katsiaras A, et al. Obesity, regional body fat distribution and the

metabolic syndrome in older men and women. Arch Intern Med 2005;165:777-783

11.-Lawlor DA, Ebrahim S, Smith DG. The metabolic syndrome and coronary heart disease in older women,

findings from British Women’s Heart and Health Study. Diabetes 2004;21:906-913.

12.- Aguilar-Salinas C, Rojas R, Gómez-Pérez F, Franco A, Ríos-Torres J, Valles V, Olaiz G, Rull J. Prevalence

of the metabolic syndrome diagnosed using WHO criteria in a nation-wide survey in México. Diabetes

2002;51:218.

13..-Langefeld C, Wagenknecht LE, Rotter JI, Williams AH, Hokanson JE, Saad MF, Bowden DW, Haffner S,

Norris JM, Rich SS, Mitchell BD. Linkage of the metabolic syndrome to 1q23-q31 in hispanic families. The insulin

resistance atherosclerosis study family study. Diabetes 2004;53:1170-1174

14.-Kevin EK, Marroquín C, Kelley DE, Johnson BD, Kelsey SF, Shaw L, Rogers WJ, Reis SE. Clinical

importance of obesity versus metabolic syndrome in cardiovascular risk in women. Circulation 2004;109:706-

713.

15.- Laaksonen DE, Niskanen1 L, Nyyssönen K, Punnonen K, TuomainenTP, Valkonen VP, Salonen R,

Salonen JT. C-reactive protein and the development of the metabolic syndrome and diabetes in middle-aged

men. Diabetologia 2004;47:1403–1410.

16.- Shigetada F, Takuya F, Michio S, Masanori I,

Yukio Y, Yoshimitsu N, Osamu N, Makoto M, Morihiro M, Lichiro S. Increased oxidative stress in obesity and

its impact on metabolic syndrome. Journal of Clinical Investigation 2004;114:1752-1761

17.- .- Bloomgarden Z. Dyslipidemia and the metabolic syndrome. Diabetes Care 2004;27:3009-3016.

18.- Stern M, Williams K, González-Villalpando C, Hunt K J, Hafner SM. Does metabolic syndrome improve

identification of individuals at risk of type 2 diabetes and /or cardiovascular disease? Diabetes Care

2004;27:2676-2681.

19.- .-McNeill A, Rosamond WD, Girman CJ, Golden SH, Schmidt MJ, East HE, Ballantyne CM, Heiss G.

The metabolic syndrome and 11-year risk of incident cardiovascular disease in the atherosclerosis risk in

communities study. Diabetes Care 2005; 28:385-390.

20.- Hsin-Jen C, Chyi-Huey B, Weng T, Hou-Chang C, Wen-Harn P. Influence of metabolic syndrome and

general obesity on the risk of ischemic stroke. Stroke 2006;37

21.- Athyros VG, Mikhaidilis DP, Papgeorfiou A. Didangelos T, Peletidou A, Kleta D, Karagiannis A, KakafikaA,

Tziomalos K, Ellisaf M. Targeting vascular risk in patients with metabolic syndrome but without diabetes.

Metabolism Clinical and

Experimental 2005;54:1065-10674

22.- Cankurtaran M, Halil M, bureu B, Dagli N, Oyan B, Ariogul S. Prevalence and correlates of metabolic

syndrome (MS) in older adults. Archives of Gerontology and Geriatrics 2005:5:1-9

23.- Aguilar-Salinas C, Rojas R, Gómez-Pérez F, Franco A, Olaiz G, Rull J. Sepúlveda J. El síndrome

metabólico: un concepto de evolución. Gaceta Médica 2004;140:841-848

24.- .- Sorrentino M. Implications of the metabolic syndrome: the new epidemic. American Journal of Cardiology

2005;5:1-4

25.- Ford, ES, Giles WH, Morkad AH. Increasing prevalence of the metabolic syndrome among U.S. adults.

Diabetes Care 2004;27:2444-2449.

26.- Daviglus M, Liu K, Lijing Y, et al. Body mass index in middle age and health related quality of life in older

age. Archives of Internal Medicine 2003; 163:2440-2455.

27.- Grundy SM, Hansen B, Smith SiC, Cleeman JI, Kahn RA. Clinical management of metabolic syndrome:

report of the American Heart Association/National Heart, Lung, and Blood Institute/American Diabetes

Association Conference on Scientific Issues Related to Management. Circulation 2004;109(4):551-556

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(COHIFFA) y el VIII Congreso Regional de Químicos Fármaco Biólogos

DETECCIÓN DE TRYPANOSOMA CRUZI (PROTOZOA, KINETOPLASTIDA) EN EL ESTADO DE NUEVO LEON, MEXICO

Molina Garza, Z. J.1; Galavíz Silva, L.1; Rosales Encinas, J.L.2 & Molina Garza, D.P.1

1 Facultad de Ciencias Biológicas, UANL. Cd. Universitaria, San Nicolas, N.L. Tel. 83-524425. e-mail molinazinnia@hotmail.com y lgalaviz@fcb.uanl.mx 2 Patología Molecular, CINVESTAV-IPN. Unidad Zacatenco, D.F., México, D.F.

INTRODUCCION La enfermedad de Chagas es una zoonosis causada por Trypanosoma cruzi, un flagelado transmitido a

vertebrados susceptibles por hemípteros hematófagos de la subfamilia Triatominae; está restringida al área

continental de América, por lo que se denomina también tripanosomiasis americana1. Infecta aproximadamente

a 18 millones de individuos en América Latina, es la mayor causa de enfermedades cardiacas en áreas

endémicas, la mayoría de los individuos permanecen infectados a lo largo de su vida. De 30 a 40% de los

pacientes chagásicos desarrollan una enfermedad crónica inflamatoria que comúnmente resulta

cardiomiopatías y disfunciones tracto gastrointestinales2. En México, la distribución geográfica de las especies

de Triatominos colectados del 1993-1999 abarca en la mayoría de los estados de la República3,4. En Nuevo

León, los vectores incluyen a Triatoma gerstaeckeri (Stål), T. neotomae (Neiva), T. lecticularia (Stål) y T.

protracta (Uhler), de las cuales T. protracta y T. neotomae se han colectado en habitats silvestres, mientras que

T. gerstaeckeri y T. lecticularia han sido detectadas a nivel peri e intradomiciliarios 5. En base a la importancia

de la enfermedad, elaboramos una estrategia para la detección y diagnóstico de la cepa neoleonesa de

Trypanosoma cruzi en triatominos, en base a las técnicas inmunológicas como es el Western blot, el ensayo

inmunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA) y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En especial, es

necesario evaluar la aplicación de nueva tecnología de diagnóstico en la selección de donadores en bancos de

sangre, donde se requiere de pruebas con sensibilidad y valor predictivos muy altos para garantizar sangre

segura en los servicios de hemoterapia 6.

OBJETIVOS Detectar la prevalencia de Trypanosoma cruzi en triatominos y vertebrados silvestres de General Terán, así

como en donadores de sangre.

Confirmar los sueros humanos examinados por las pruebas de Western Blot y ELISA.

MATERIAL Y METODOS Población estudiada: Por disección de nidos, se capturaron 52 chinches Triatoma gerstaeckeri en madrigueras.

Doce ratas de campo Neotoma micropus y 10 tlacuaches (Didelphis sp), fueron capturados con trampas tipo

Havahart en los peridomicilios de General Terán. Las 500 muestras de sangre humana pertenecen a donadores

de los bancos de sangre del estado de Nuevo León.

Se colectaron las heces de los triatominos, examinándose en un microscopio A los reservorios silvestres se les

realizó una punción en la vena caudal para realizarles frotis sanguíneos y examinarlos al microscopio de luz

(ML). La técnica de ELISA, fue aplicada a heces de triatominos y sueros humanos, con las modificaciones

pertinentes, se usó como control positivo la cepa “Y” de T. cruzi, realizándose diluciones por duplicado,

registrando las lecturas a 492 nm. El suero de los ratones se diluyó por duplicado a 1/500, 1/1000 hasta

1/128000 con PBS-BSA. El segundo anticuerpo fue anti IgG de ratón (SIGMAR). Las heces de los triatominos,

se diluyeron en 200 µl de agua Y se procesaron para ELISA y otros 100 µl para el PCR. La obtención de los

fragmentos de los minicírculos del ADN del kinetoplasto, del ADN total se digirieron 18 µl de la muestra con 0.5

µl de la enzima Nsi I. Se utilizó el estuche de PCR de alta fidelidad de Roche, Taq DNA polimerasa (2.6 U por

reacción) y 15 mM MgCl2.10 mM de dNTP’s y primers de los minicírculos: KNS1 y KNS2. Para la amplificación

del kADN de T. cruzi de vertebrados silvestres y muestras de sangre humana, se obtuvo 1 ml de sangre para la

extracción de ácidos nucleicos. La extracción fue realizada con DNAzol (Molecular Resarch Center; inc.). La

pastilla fue resuspendida con 50 µl de TE. Para el PCR se utilizó nuevamente el estuche Expand High Fidelity

System (Roche Molecular Biochemicals) con las recomendaciones del fabricante. El PCR se aplicó a

vertebrados silvestres, triatominos y sangre humana.

RESULTADOS Los resultados obtenidos fueron un total de 31 chinches positivas y 21 negativas por ML, para considerarlo

como estándar de oro en la comparación de las técnicas aplicadas a muestras de triatominos solamente. La

detección de la cepa neoleonesa de Trypanosoma cruzi por medio de la técnica de ELISA: El estándar que se

tomó como control fue de 0.130, 0.131 y 0.132; su punto de corte el valor mínimo negativo. Se obtuvieron 25

triatomas negativas con valores desde 0.02 hasta 0.131 y como positivos de 0.133 a 1.594 en un total de 27

muestras procesadas (Fig.1).

Por PCR, de las 52 muestras de heces, 31 fueron positivas y 21 negativas, se amplificó un fragmento 320 pares

de bases (Fig. 2). De las muestras de sangre tomadas de los reservorios vertebrados, 6 neotomas y 9

tlacuaches fueron positivos por PCR, amplificacióndose el producto esperado de 320 pares de bases. En

microscopía de luz se observó el parásito en sangre periférica de las mismas muestras, concordando con los

resultados de PCR (Fig. 3). De las muestras de sangre humana, una fue positiva por ELISA, confirmándose el

diagnóstico por Western blot y PCR.

CONCLUSIONES Se logró amplificar el DNA de T cruzi, con la utilización de los oligonucleotídos KNS1 y KNS2, debido a que

provienen de una región del kinetoplasto altamente conservada entre diversas variedades de T cruzi 8, estos

primers fueron diseñados originalmente para detectar a la cepa Y8, así como al aislado AWP CL y la cepa Ninoa

mexicana 8, debido a que existe una homología en la secuencia nucleotídica por la generan productos del

mismo tamaño. En nuestro estudio, el análisis en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio,

amplificó fragmentos con 320 pares de bases aproximadamente tanto para Triatoma gerstaeckeri, Neotoma

micropus y Didelphis sp.

De quinientos sueros humanos examinados, uno fue positivo por PCR y se confirmó el resultado por Western

blot y ELISA. Estos resultados indican el elevado riesgo en las zonas rurales del estado por la presencia del

vector, reservorios silvestres y del parásito desde 19929, y subraya la necesidad de contar con técnicas de

diagnóstico adecuadas en los bancos de sangre de la localidad para evitar la propagación de casos clínicos por

transfusiones sanguíneas, que en otros estados y países, se ha demostrado que son la mayor fuente de

infección en comparación con el contacto hombre-vector. Se recomienda una mejor vigilancia epidemiológica

preventiva en el estado de Nuevo León, más aún, con vectores que se han colectado en domicilios y

peridomicilios con infección natural de T. cruzi, como son T. gerstaeckeri y T. lecticularia 5, 9.

BIBLIOGRAFIA 1. Benenson AS. El control de enfermedades transmisibles en el hombre: informe oficial de la asociación Estadounidense de Salud Pública. 15a. edición. Washington DC: OPS. Pub Cient 1992; 538. 2. Duthie MS, Kahn M, White M, Kapur RP, Kahn SJ. Critical proinflammatory and ant-inflammatory functions of different subsets of CD1d-restricted natural killer T cells during Trypanosoma cruzi infection. Am Soc for Microbiol 2005:181-192. 3. Pinto-Días JC. Epidemiology of Chagas’disease In: Chagas’disease (American Tripanosomiasis): Its impact on transfusion and clinical medicine, ed. Wendel S, Brener Z, Camargo ME Rassi A ISBT Brazil’92, Sao Paulo Brazil,1992: 49-80. 4. Vidal-Acosta V, Ibáñez-Bernal S, Martinez-Campos C. Natural Trypanosoma cruzi infection of triatominae bugs associated with human habitations in Mexico. Salud Pública Mex 2000; 42:496-503. 5. Martínez-Ibarra A, Galaviz-Silva L, Trujilla C. Distribución de los triatominos asociados al domicilio humano en el municipio de General Terán, NL Méx. Southwestern Entomol 1992; 17:261-265. 6. Tropical Disease Research. Twelfth Programme Report of the UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Disease: World Health Organization, 1995. 7. Maizels RM, Blaxter ML, Robertson BD, Selkirk ME. Parasite antigens, parasite genes. A laboratory manual for molecular parasitology. Cambridge University Press, 1988. 8. Monteón-Padilla VM, Reyes PA, Rosales JL. Detección de Trypanosoma cruzi en muestras experimentales por el método de reacción en cadena de la ADN polimerasa. Arch Inst Cardiol 1994; 64:135-143. 9. Galaviz-Silva L, Ramírez E, Vázquez V. Histotropismo y patogenicidad de Trypanosoma cruzi en ratón albino (NHI) aislado de triatominos en Nuevo León, México. Bol Chil Parasitol 1992; 47:3-10.

FIGURAS Y LEYENDAS

DETECCION DE T. cruzi POR ELISA

0

0.5

1

1.5

2

1 4 7 10 13 16 19 22 25

No. TOTAL DE MUESTRAS:52

DEN

SID

AD

OPT

ICA

492n

m

CONTROLPOSITIVO

POSITIVAS

NEGATIVAS

Fig. 1. Detección de Tripanosoma cruzi en triatominos por la técnica de ELISA en el estado de Nuevo León, la lectura de corte para el control negativo fue de 0.130.

Fig. 2. Detección de T. cruzi por PCR, en Triatoma gerstaeckeri. M. Marcador DNA ladder 100. Carril 1: Control positivo. Carriles 2, 3, 4, 5, 6 y 7 ejemplos de Triatominos positivos, con infección natural a T. cruzi, mostrando los amplicones de 320 pb.

Fig. 3. Trypanosoma cruzi en infecciones naturales de sangre periférica de Neotoma micropus (a) y Didelphis sp. (b) en el estado de Nuevo León, México. 100 X

M 1 2 3 4 5 6 7