Inoculación de Tricho en Cebolla

7/21/2019 Inoculación de Tricho en Cebolla

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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONALCENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

CAMBIOS BIOQUÍMICOS INDUCIDOS EN CEBOLLA POR LA INOCULACIÓN CON

Trichoderma harzianum Y SU RELACIÓN CON EL CONTROL DE

Sclerotium rolfsii

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DEMAESTRIA EN CIENCIAS

EN

MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES

PRESENTA

JAIME ALBERTO APARICIO BELLO

Yautepec, Morelos; Diciembre 2010



El presente trabajo se realizó en el laboratorio de cultivo de células vegetales del

Departamento de Biotecnología y en el laboratorio de fitopatología del Departamento de

Interacciones Planta-Insecto del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto

Politécnico Nacional bajo la dirección de los Drs. Gabriela Sepúlveda Jiménez y Roberto

Montes Belmont. Para la realización de los estudios se conto con el apoyo económico de

CONAC yT (becario No. 220003) y del Programa Institucional de Formación de

Investigadores de la Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación

fue realizada con el financiamiento otorgado a los proyectos de la SIP (No. 20090293 y

20100781).



AGRADECIMIENTOS

A la Doctora Gabriela Sepúlveda Jiménez, por darme la oportunidad de integrarme en su

grupo de trabajo, ser director de Tesis y apoyarme en cada paso dentro de la Maestría.

Al Doctor Roberto Montes Belmont Belmont, por todas las correcciones y paciencia que le

aplicó a este trabajo.

Al Doctor Ángel René Arzuffi Barrera, por las valiosas observaciones enfocadas a generar

una investigación más seria.

A la Maestra en Ciencias Leticia Bravo Luna, por la confianza y motivación que imprimió

en esta investigación.

A la Doctora Emma Zavaleta Mejia, por el esfuerzo e interés que mostró en la realización

de la investigación y mi formación.

A la Maestra Hilda Elizabet Flores Moctezuma, por la confianza que puso en mi persona,

pero sobre todo por su disponibilidad incansable para esta investigación.

A las Licenciadas Elvia Sosa, Vanessa Yañez y Sara Bahena por la infinidad de apoyos y

consejos que me dieron dentro del Posgrado .

Al Concejo Nacional de Ciencia y Tecnología, al Programa Institucional de Formación de

Investigadores y a la Secretaria de investigación y Posgrado por las becas otorgadas para la

realización de mis estudios.

A la Secretaria del Medio Ambiente y Recursos Naturales, por haber confiado en mis

capacidades y proyecto, en especial a los Ingenieros. Noel Cruz, Raúl Molina, Armando

Sánchez, al Prof. Daniel Vega y a los licenciados Jerusalén López y Oscar Bernabé

A mi familia, pilar principal de mi formación, amigos, compañeros y mi pareja por todos

los apoyos en momentos críticos de mi formación.



Gracias, a ese ser tan grande y indescriptible que me dio la posibilidad de ser, conocer y

aprender de la vida.

A mis padres y hermanos por estar presentes en cada logro y tropiezo de mi existencia,

gracias por no perder la fe en mí.

A mis abuelos, tíos y primos por ser tan grandes y cariñosos con mi persona. En espacial

para ti Bogart Ignacio+, si empre fuiste una inspiración para mí.

A todos mis amigos que fui cosechando dentro del Posgrado: Humberto, Raúl, Jorge, Jan,

Meli, Nadia, Lili, Memo, Layo, Blancas, Edith, por todos los momentos chidos que

pasamos. Ya casi la hacemos compadrito!!

A mi pareja, que en todo momento me demostró su cariño y apoyo incondicional, gracias

por estar junto a mí, infinitamente gracias Eva.



I

Contenido

Página

Índice I

Índice de cuadros III

Índice de figuras IV

Resumen V

Abstract VII

1. INTRODUCCIÓN 1

2. REVISIÓN DE LITERATURA 3

2.1 Generalidades de la cebolla 3

2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla 5

2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo 6

2.4 Generalidades de Trichoderma 7

2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas 9

2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos 12

2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii 14

2.8 Sclerotium rolfsii en las plantas 15

2.9 Métodos de control de Sclerotium rolfsii 17

3. JUSTIFICACIÓN 19

4. OBJETIVOS 20

5. MATERIALES Y MÉTODOS 21

5.1 Variedades de cebolla 21

5.2 Cepas de hongos utilizadas 21

5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y

evaluación de la germinación

22

5.4 Evaluación del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las

plantas

23

5.5 Determinación del contenido total de compuestos fenólicos 24



II

5.6 Determinación del contenido total de flavonoides 26

5.7 Evaluación de la actividad de peroxidasa 27

5.8 Obtención de extractos acuosos de bulbos de cebolla 28

5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimientomicelial y producción de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

28

5.10 Efecto de la inoculación de T. harzianum en el desarrollo de la

severidad de Sclerotium rolfsii

29

6. RESULTADOS 32

6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinación de

las semillas

32

6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum. 35

6.3 Contenido de compuestos fenólicos en plántulas y bulbos 37

6.4 Contenido de flavonoides totales en plántulas y bulbos. 40

6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas. 42

6.6 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento

micelial y el número de esclerocios de Sclerotium rolfsii.

6.7 Efecto de la inoculación con Sclerotium rolfsii en bulbos de

plantas de cebolla de 8 semanas

43

45

7. DISCUSIÓN 47

8. CONCLUSIONES 53

9. LITERATURA CITADA 55



III

ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro Página1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos. 6

2. Germinación de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas

con T. harzianum.

33

3. Peso total, de bulbos, hojas y raíz de plantas de 8 semanas tratadas con

T. harzianum.

37

4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de

bulbos.

44

5. Efecto de extractos acuosos de bulbos en el número de esclerocios. 45

6. Efecto de S. rolfsii en el índice de severidad y número de esclerocios

presentes en bulbos tratados con T. harzianum.

46



IV

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura Página1. Situación nacional de la producción de cebolla. 4

2. Germinación de semillas de la variedad blanca, morada y roja tratadas

con T. harzianum.

34

3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum

y su control

36

4. Contenido de compuestos fenólicos en plántulas de 8 días. 38

5. Contenido de compuestos fenólicos en bulbos de 8 semanas. 396. Contenido de flavonoides totales en plántulas de 8 días. 40

7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas. 41

8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas. 42



V

Resumen

Este trabajo tuvo como objetivo evaluar el crecimiento, el contenido de compuestos

fenólicos, flavonoides totales y la actividad de peroxidasa en tres variedades de cebolla con

diferentes grados de pigmentación inoculadas con Trichoderma harzianum y la relación

con el control a Sclerotium rolfsii. Las variedades de cebolla utilizadas fueron: Cristal

White (blanca), Red Satan (roja) y Mata Hari (morada). Las semillas de cada variedad

fueron germinadas con sustrato inoculado con T. harzianum cepa Tc74. T. harzianum tuvo

un efecto diferencial en la germinación de las semillas que dependió de la variedad.

Únicamente en la variedad blanca, T. harzianum estimuló la germinación. Las plantas de 8

semanas inoculadas con T. harzianum, aumentaron 3 veces su peso total, el de los bulbos

de 2 a 3 veces, el de las hojas hasta 3 veces y el de raíces de 7 a 11 veces. Las variedades

roja y blanca fueron las más beneficiadas por el tratamiento con T. harzianum.

En plántulas, el contenido de compuestos fenólicos se incrementó con respecto a su control,

en un 43.5, 48 y 13 % en las variedades blanca, morada y roja; mientras que el de

flavonoides fue 43.5, 51.6 y 16 % más alto en las tratadas que en las control de las

variedades blanca, morada y roja. En el caso de los bulbos, el tratamiento con T. harzianum

incrementó el contenido de compuestos fenólicos con respecto a su control, en un 20, 70 y

30 % en las variedades blanca, morada y roja. Únicamente en los bulbos de la variedad

blanca se encontraron diferencias en el contenido de flavonoides entre las muestras tratadas

y el control.

Solamente, en los bulbos de las variedades blanca y morada de las plantas inoculadas con

T. harzianum, la actividad de peroxidasa se incrementó de 2 a 5 veces.



VI

El crecimiento del micelio solamente disminuyó en presencia de los extractos acuosos de

los bulbos de la variedad roja tratada y el número de esclerocios de S. rolfsii no se afectó

con los extractos acuosos de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum. Sinembargo, las tres variedades tratadas con T. harzianum tuvieron una menor severidad de la

enfermedad por S. rolfsii. Las variedades pigmentadas tratadas con T. harzianum tuvieron

una disminución en sus valores de severidad más evidentes que la variedad blanca.

Todos los resultados muestran que el efecto de T. harzianum en la respuesta bioquímica y

la resistencia a S rolfsii están relacionadas con el grado de pigmentación de la variedad de

cebolla.



VII

Abstract

The objective of this work was to evaluate the development, total content of phenolic

compounds and flavonoids, and peroxidase activity from three onion varieties with

different pigmentation and inoculated with Trichoderma harzianum and their relationship

with the control of Sclerotium rolfsii. The onion varieties used were: Cristal White (white),

Red Satan (red) y Mata Hari (purple). Seeds of each variety were germinated with substrate

inoculated with T. harzianum strain Tc74. T. harzianum had a differential effect in the

seeds germination that it was depended of the variety. Only, T. harzianum stimulated the

seed germination of the white variety. In plants of 8 weeks inoculated with T. harzianum

had an increase of the total weight (3 times), of the weight of bulbs (2 to 3 times), of leaves

(3 times), and roots (7 to 11 times). The red and white varieties were the most favored by

the treatment with T. harzianum.

In the seedling, the content of phenolic compounds increased with respect to its control, in

a 43.5, 48 y 13 % in the varieties white, purple and red; while the flavonoid content were

43.5, 51.6 y 16 % higher in the treated samples than in the control of the varieties white,

purple and red, respectively. In the case of bulbs, the treatment with T. harzianum increased

the content of phenolic compounds with respect to its control, in a 20, 70 and 30 % in the

varieties white, purple and red. Only, it was found difference in the flavonoid content of

bulbs of the white variety.

Only, bulbs of the white and purple varieties inoculated with T. harzianum showed a

increase from 2 to 5 times in the peroxidase activity.



VIII

The mycelium growth decreased in the presence of the aqueous extracts of bulbs from the

treated red variety and the esclerotia number of S. rolfsii was not affected by the aqueous

extracts of onions bulbs without treatment and treated with T. harzianum. However, thethree varieties treated with T. harzianum had a lower disease severity by S. rolfsii. The

pigmented varieties treated with T. harzianum had a decrease in their severity values more

evident than the white variety.

All the results showed that the effect of T. harzianum in the biochemical response and the

resistance to S. rolfsii are related with the degree of pigmentation of the onion variety.



1

1. INTRODUCCIÓN

Las variedades de cebolla no pigmentadas son menos resistentes a las enfermedades que las

variedades pigmentadas, debido probablemente a diferencias en el contenido de

compuestos antimicrobianos. Walker et al. (1929) mostraron que cebollas moradas

presentaron una mayor resistencia al “carbón” causado por Colletotrichum circinans

presentaron un mayor contenido de los compuestos fenólicos, ácido protocatéquico y

catecol; en tanto, las cebollas blancas fueron susceptibles y no se encontraron estos

compuestos.

En el caso específico del “tizón sureño de la cebolla” causado por el hongo Sclerotium

rolfsii, una evaluación de resistencia en variedades utilizadas en el estado de Morelos

mostró que las variedades Blanca Morelos, Early supreme y Mata Hari fueron las menos

susceptibles; por lo que puede existir una relación entre la resistencia a este patógeno y los

compuestos químicos presentes en estas variedades (Hernández-Jiménez et al., 2004).

Los métodos de control químico de Sclerotium spp. causan contaminación del ambiente,

por lo que se propone emplear técnicas de control. En diversos cultivos, hongos del género

Trichoderma son empleados como control biológico, con la ventaja de inhibir el desarrollo

del patógeno e inducir respuestas de defensa en la planta, tales como la producción de

compuestos antimicrobianos y la actividad de enzimas como quitinasas, glucanasas y

peroxidasas. En particular, en ensayos in vitro se conoce que Trichoderma harzianum, cepa

Tc74 por parasitismo y antagonismo inhibe el desarrollo y propagación de Sclerotium

rolfsii. Sin embargo, son escasos los estudios de las respuestas bioquímicas de defensa que



2

se inducen en la cebolla por el tratamiento con T. harzianum Tc74 y tampoco se conoce si

esto es dependiente de la variedad.



3

2. REVISIÓN DE LITERATURA.

2.1 Generalidades de la cebolla

La cebolla ( Allium cepa L ) es una planta ampliamente cultivada en el mundo que se originó

en Asia Central; muy cerca de Persia donde su cultivo se difundió por todas las regiones del

mundo (SIIT, 2009).

La cebolla forma parte de la familia de las Liliáceas. Es una planta bianual, de tallo

subterráneo y reducido. El bulbo es un engrosamiento subterráneo del tallo de la planta. La

raíz está formada por los filamentos que nacen en la parte inferior del bulbo. La cebolla

presenta un sistema radicular formado por numerosas raicillas fasciculadas, de color

blanquecino, poco profundas, que salen a partir de un tallo a modo de disco o "disco

caulinar". Las hojas son generalmente suaves de forma tubular, tienen una parte basal,

formada por las "vainas foliares" engrosadas como consecuencia de la acumulación de

sustancias de reserva, y otra terminal, que es la parte verde y fotosintéticamente activa de

la planta. Se reproducen por semillas o por pequeños bulbos plantados (SIIT, 2009).

La cebolla contiene, lecitina, pectina, vitaminas B1, B2, B6, C, E y aminoácidos (Corzo et

al., 2007). Es rica en compuestos fenólicos, y flavonoides, que funcionan como

antioxidantes (captación de radicales libres). En particular, la quercetina es el flavonoide

antioxidante que representa más del 95% de los flavonoides totales (Rodríguez et al .,

2008).



4

Debido a la actividad antimicrobiana que la cebolla posee se recomienda su uso para el

control del crecimiento microbiano (Pszczola, 2002).

Varios compuestos activos de la cebolla como la alicina, trisulfuro de dialilo, el ajoene y elfistulosin (octadecyl 3-hidroxiindol) destruyen las células de hongos patógenos (Corzo et

al ., 2007).

A nivel mundial, México es el primer productor de cebolla en fresco con más de un millón

de toneladas por año. Los principales estados productores son Chihuahua, Baja California,

Tamaulipas, Michoacán, Guanajuato y Morelos. En el estado de Morelos, la producción

total anual reportada en el 2009 fue de 49 170 000 toneladas, ubicándose en el séptimo

lugar de la producción nacional (Figura 1). Entre los principales municipios productores

de cebolla se encuentran Axochiapan, Ayala, Tepalcingo, Cuautla y Jonacatepec.

(OEIDRUS, 2009 SAGARPA, 2009).

Figura 1. Situación nacional de la producción de cebolla. (SAGARPA, 2009).



5

2.2 Diferencias químicas entre las variedades de cebolla

Las cebollas son ricas en flavonoides y en compuestos azufrados (sulfóxido alkyl cisteína),

responsables de su aroma. Entre los flavonoides, las antocianinas son los responsables del

color rosado o violáceo de determinadas variedades de cebolla.

Coşkuntuna y Özer (2008) reportan que los compuestos antifúngicos como los fenoles

solubles en agua y flavonas, podrían ser parte de la resistencia en la cebolla a la

germinación de esporas y la penetración de hongos patógenos.

Por otro lado, las variedades de cebolla también difieren en su contenido de compuestos

fenólicos que pueden estar relacionados con la resistencia ante el ataque de ciertos

patógenos (Walker et al ., 1929). Abundando en esta investigación en estudios posteriores

se encontró que las cebollas pigmentadas contienen ácido protocatéquico y catecol en

mayor proporción que las cebollas no pigmentadas. Probablemente las diferencias en el

contenido de estos compuestos estén relacionadas con la resistencia al hongo

Colletotrichum circinans. Las pruebas in vitro mostraron que el catecol es el doble de

efectivo que el ácido protocatéquico en el control del desarrollo del patógeno

Colletotrichum circinans (Link y Walker 1933).

Las variedades pigmentadas de la cebolla presentan una mayor cantidad de compuestos

fenólicos y de la actividad antioxidante que las variedades no pigmentadas. Al respecto,

Prakash et al., (2007) reportan que las capas externas de los bulbos en la variedad roja

contiene un mayor contenido de compuestos fenólicos que la variedad blanca. Esto se

correlacionó con una mayor capacidad antioxidante en la variedad roja que en la variedad

blanca.



6

2.3 Enfermedades en cebolla causadas por hongos de suelo

Como varias plantas hortícolas, la cebolla es atacada por varios microorganismos que

reducen su productividad y calidad. Los patógenos más comunes que atacan las raíces y

bulbos de la cebolla son del género Pythium, Fusarium, Rhizoctonia y Sclerotium ((Lara y

García, 1995; Entwistle, 1990). Para el estado de Morelos, Montes et al . (2003) reportan

que en los almácigos de los principales municipios productores de cebolla, se encontró

principalmente la incidencia de patógenos de los géneros Fusarium, Rhizoctonia,

Curvularia, Phoma, Alternaria, Sclerotium, Bipolaris, Rhizopus y Penicillium. De todos

estos, Fusarium, Sclerotium y Colletotrichum fueron los que más daños causaron a la

cebolla con una incidencia de 82, 89 y 39 % respectivamente (Cuadro 1).

Cuadro 1. Principales enfermedades de la cebolla en el estado de Morelos.

Enfermedad Agente causal Presencia

Pudrición de bulbo y raíz Fusarium oxysporum Campo y almacén (82%)Tizón sureño Sclerotium rolfsii Campo y almacén

(89%)

Ahumado de la cebolla Colletotrichum circinans Campo(39 %)

Montes et al ., 2003.



7

2.4 Generalidades de Tri choderma

En laboratorio, los cultivos de Trichoderma en un inicio tienen color blanco

posteriormente toman un color verde brillante con esporulación densa, debido a los

conglomerados de conidios que se forman en las puntas de las hifas. El micelio es en su

mayoría ralo y fino. Los conidióforos son ramificados, parecen un árbol pequeño y

presentan como penachos compactados que forman anillos con un sistema de ramas

irregular de manera piramidal. Terminan en fiálides donde se forman las esporas asexuales

o conidios haploides y su pared está compuesta por quitina y glucanos. Además de los

conidióforos, las espora se pueden producir sobre fiálides que emergen directamente del

micelio (Harman, 2000).

Los hongos del género Trichoderma, se encuentran en ecosistemas terrestres (suelos

agrícolas, pastizales, bosques y desiertos) y acuáticos. Algunas especies son de vida libre en

el suelo, oportunistas, simbiontes de plantas, y otras son micoparásitas. Los requerimientos

nutrimentales de estos hongos filamentosos son pocos, aunque su crecimiento es favorecido

por la materia orgánica, y la humedad. Trichoderma se pueden encontrar en la rizósfera,

donde es capaz de competir por nutrimentos y espacio con otros microorganismos. Además,

este grupo fúngico es importante para las plantas, al contribuir en el control de hongos

fitopatógenos ya que poseen propiedades micoparasíticas y antibióticas, por lo que algunas

especies son catalogadas como excelentes agentes de control biológico de hongos causantes

de enfermedades para diferentes plantas hortícolas (Druzhinina y Kubicek 2005).

La población de Trichoderma decrece especialmente cuando la humedad del ambiente

desciende por largos períodos de tiempo. Otros estudios indican que el pH, la concentración



8

de C02, H2C03, otras sales y el contenido de materia orgánica son factores físicos y

químicos determinantes de la variación poblacional de Trichoderma, además de la

presencia o ausencia de otros microorganismos en el ambiente (Fonseca, 1998).

El intervalo de temperatura para el crecimiento de Trichoderma se encuentra entre los 10 y

los 40 °C, con una óptima de 25 °C (Alexopoulos et al., 1996). El contenido de humedad

que favorece el crecimiento de Trichoderma se encuentra alrededor del 70 y el 80%

(Wakelin et al., 1999).

Para su crecimiento Trichoderma tiene un intervalo de pH relativamente amplio,

comprendidos entre 2.0 y 9.0, con un pH óptimo entre 4.0 y 7.0 (Domsch et al ., 1980).

Trichoderma es un hongo, heterótrofo, aerobio, con una pared celular compuesta de quitina,

de rápido crecimiento que puede utilizar como fuente de carbono a una gran variedad de

sustratos complejos como celulosa, quitina, pectina y almidón, aunque puede emplear

también ácidos orgánicos y monosacáridos como fuente de carbono. Asimismo,

Trichoderma asimila como fuente de nitrógeno compuestos tales como aminoácidos, urea,

nitritos, amoniaco y sulfato de amonio. Muchas cepas crecen eficientemente en medios

sólidos o líquidos y en un amplio intervalo de temperaturas, además son relativamente

tolerantes a humedades bajas y tienden a crecer en suelos ácidos (Moore, 1996; Harman et

al ., 1981).



9

2.5 Efecto de Trichoderma en las plantas

En plantas la resistencia inducida localizada y sistémica, se produce en respuesta al ataque

de microorganismos patógenos, al daño físico por insectos, factores ambientales, al

tratamiento con diversos inductores químicos y a la presencia de rizobacterias no

patógenas. Trichoderma spp. tiene la capacidad de inducir en las plantas cambios en la

resistencia contra patógenos. En muchos casos, éstas respuestas son resultado de efectos

directos sobre las plantas, como disminución de la actividad de la microflora nociva en la

raíz, la generación de compuestos tóxicos en la zona radicular, aumenta la absorción y

traslocación de los minerales menos disponibles en la plantas y además puede contribuir a

solubilizar nutrientes en el suelo (Harman et al ., 2004b; Yedidia et al . 2001).

La colonización de raíces por Trichoderma spp. induce cambios significativos en la planta,

específicamente en la maquinaria metabólica. Harman et al . (2004a) obtuvieron los

proteomas de plántulas de maíz procedentes de semillas tratadas con Trichoderma cepa T-

22. Aproximadamente el 40% de las proteínas que se veían en las muestras tratadas con la

cepa T-22 no se encontraron en las plántulas no tratadas. Estos autores concluyeron que

Trichoderma puede modificar fuertemente el metabolismo vegetal.

En algodón, la cepa T. virens indujo la producción de fitoalexinas y resistencia localizada;

mientras que en pepino, la colonización de la raíz por Trichoderma cepa T-203 causó un

aumento en los niveles de fenólicos glucosilados en las hojas, los cuales están fuertemente

asociados a la inhibición del crecimiento de una serie de bacterias y hongos (Harman et al .,

2004b).



10

Trichoderma se puede localizar tanto fuera como dentro de la rizósfera; pero es en la

rizósfera donde principalmente coloniza y protege las raíces de las plantas (Lorito, 1998).

Al respecto Sid et al. (2000) reportan que semillas de chile tratadas con Trichoderma

harzianum reduce el progreso de la necrosis causada por Phytophthora capsici en los tallos

de plantas de chile. T. harzianum persiste en la semilla tratada y prolifera en las raíces,

ejerciendo una protección sobre la parte aérea.

Además de micoparasitismo y antibiosis, otros mecanismos de protección con el que actúa

Trichoderma incluye la competencia por nutrientes o espacio, el control de microflora

deletérea de la raíz, tolerancia al estrés a través de un incremento en el desarrollo de la raíz

y de la planta, inducción de resistencia, solubilización de nutrientes inorgánicos e

inactivación de las enzimas de los patógenos (Harman, 2000; Alatonare et al., 1999;

Kleifeld y Chet. 1992).

Diferentes especies de Trichoderma incrementan el crecimiento radical, el desarrollo y peso

de las plantas mediante una serie de mecanismos (Lorito, 1998).

En plantas de chile, la presencia de Trichoderma incrementó la emergencia de plántulas,

tamaño, área foliar y peso seco (Kleifeld y Chet 1992). Cruz y Cisterna (1998) indican que

T. harzianum en chile, incrementó la longitud y el peso seco de raíces, la altura de planta, el

número y peso seco de hojas, el área foliar, el diámetro de tallos y número de flores. En

este mismo sentido, Gravel et al. (2007) reportaron que la producción in vitro del ácido

indolacético (AIA) en raíz de tomate se incrementó con la presencia de T. atroviride en

comparación con el control así como también se acumuló fosforo en hoja. Conjuntamente

se incrementó la longitud y el peso fresco del tallo, y de las raíces en plántulas inoculadas.



11

La solubilización de fosforo en la raíz se asocia a menudo con la promoción del

crecimiento vegetal. El equilibrio entre el crecimiento vegetativo y reproductivo es

controlado por hormonas de señalización dentro de la planta y pueden por lo tanto influir enéste. En concentraciones relativamente altas, las auxinas naturales, como AIA, estimulan la

elongación de ramas, mientras que la reducción de este, genera la elongación de la raíz.

Yedidia et al., (2000) reportaron que la respuesta general de defensa de las plantas incluye

la inducción de proteínas como respuesta a patogénesis, la acumulación de fitoalexinas, y la

deposición de polímeros estructurales, como la calosa y lignina. Se hace especial hincapié

en la acumulación de hidrolasas en la planta, tales como quitinasas y β-1,3-glucanasas, con

potencial antimicrobiano. Otro grupo de enzimas incluye las peroxidasas, las cuales juegan

un papel clave en los mecanismos de resistencia de la planta, ya que están involucradas en

la formación de barreras estructurales.

Las isoenzimas de peroxidasa contribuyen a la producción de un entorno fungitóxico para

hongos patógenos, generalmente asociado a la aparición de lesiones o la penetración de

éstos. La generación de dichos compuestos parece jugar un papel en la tolerancia de la raíz

de la planta a la colonización por patógenos (Yedidia et al., 2000).

En particular, para el caso de cebolla, Coşkuntuna y Özer (2008) germinaron semillas de

cebolla con esporas de Trichoderma y después de ponerlas en contacto con el hongo F.

oxysporum, encontraron que la interacción Trichoderma-semilla redujo en un 73 % el

crecimiento del hongo patógeno. Este mismo efecto se obtuvo en campo, con lo que

concluyeron que T. harzianum tiene la capacidad de estimular la producción de compuestos

químicos asociado con una mayor protección contra la pudrición basal causada por F.

oxysporum



12

2.6 Efecto de Trichoderma en otros hongos

El género Trichoderma está compuesto por un gran número de especies que actúan como

agentes de control biológico debido a sus propiedades antagonistas. Las cepas de

Trichoderma ejercen un biocontrol contra hongos fitopatógenos de manera indirecta a

través de la competencia por nutrientes y espacio, modificando las condiciones

medioambientales, promoviendo el crecimiento, los mecanismos de defensa y la antibiosis

en las plantas; o directamente por mecanismos como el micoparasitismo.

Los mecanismos directos e indirectos actúan coordinadamente y su importancia en el

proceso de biocontrol depende de la cepa de Trichoderma empleada, el hongo contra el

cual ejercerá control como antagonista, el tipo de planta o cultivo, además de las

condiciones ambientales como pH, disponibilidad de nutrientes, temperatura y

concentración de hierro, principalmente (Benítez et al, 2000).

La lisis es el mecanismo en el cual intervienen las enzimas hidrolíticas producidas por losmicroorganismos antagonistas como factores biocontroladores. Trichoderma causa la lisis

de la pared celular de hongos patógenos y esta actividad se correlaciona con el grado de

control biológico que se puede obtener por parte de Trichoderma (El-Katatny et al . , 2001).

Trichoderma spp. produce celulasas que degradan in vitro la celulosa de las paredes

celulares de microorganismos Oomicetos; además de glucanasas y quitinasas que catalizan

la hidrólisis de la quitina y de los β-1,3 glucanos de las paredes celulares de

microorganismos Deuteromicetos (Cotes, 1993).



13

Los principales mecanismos por los cuales Trichoderma spp. lleva a cabo su antagonismo

contra los patógenos de las plantas incluyen la degradación y posterior asimilación de los

hongos (De la Cruz et al,.1995). Esta actividad antifúngica involucra la producción deantibióticos, incluyendo compuestos que afectan la integridad de las membranas fungosas,

competencia por nutrientes clave y la producción de enzimas que degradan la pared celular

de los hongos (Ait-Lahsen et al., 2001). A nivel celular causan vacuolación, granulación,

coagulación, desintegración y lisis (Bell et al.. 1982; Chet y Baker, 1981).

En el caso de Oomycetes sp. cuya pared celular contiene β - 1,3-glucano y celulosa, se

sugiere que la β -1,3-glucanasa es la enzima principal en la lisis de la pared celular durante

la acción micoparasítica (De la Cruz et al.1995); mientras que en Botrytis cinerea.

(Deuteromycete) las enzimas quitinolítica y glucanolíticas de T. harzianum P1

interactuaron sinérgicamente en la inhibición de la germinación de las esporas y la

elongación de las hifas de Sclerotium rolfsii (El-Katatny et al ., 2001).

Harman (2000), describe el proceso de micoparasitismo como un proceso complejo, que

involucra el crecimiento trófico del agente de biocontrol hacia el hongo objetivo, el

enrollamiento mediado por lectina y la adherencia de las hifas en torno al patógeno.

Finalmente el ataque y disolución de la pared celular ocurre por la actividad de las enzimas

que puede asociarse con una penetración física de la pared celular.

Diversas especies de Trichoderma se asocian con un antagonismo de la fase vegetativa de

Phytophthora. En este caso, Trichoderma crece sobre Phytophthora y parasita sus hifas, el

proceso se lleva a cabo gracias a metabolitos volátiles o solubles, los cuales reducen el



14

crecimiento del patógeno, seguido por una vacuolación del contenido celular que

eventualmente resulta en lisis de las hifas del patógeno (Harman, 2000).

2.7 Generalidades de Sclerotium rolfsii

Sclerotium rolfsii es un hongo que en condiciones favorables produce abundante micelio en

los tejidos infectados. Las hifas son relativamente grandes, de 5 a 9 micrones de diámetro.

Son hialinas de paredes delgadas en forma de gancho a nivel de las septas. El micelio al

crecer tiende a formar rizomorfos que ya crecidos se expanden en forma de abanico,

teniendo una coloración blanca. Una vez infectados los tejidos, la masa de micelio puede

aparecer de 2 a 10 días. La penetración ocurre cuando el patógeno produce una enzima que

destruye las paredes de las células externas del hospedero, resultando una destrucción de

los tejidos y en la formación de micelio y esclerocios. Aproximadamente después de 7 días

de la infección, aparecen los esclerocios, que se forman a partir del micelio cuando los

rizomorfos se entrecruzan y empiezan a formar cuerpos esféricos inicialmente blancos y

después toman una coloración café claro u obscura. Estos esclerocios miden en promedio

de 0.5 a 2.0 mm de diámetro, pero algunos pueden llegar a 8 ó 10 mm de diámetro (Singh y

Dwivedi 1991).

El hongo sobrevive en forma de segmentos de hifas o esclerocios en plantas infectadas o

residuos de plantas en el suelo, no produce ningún tipo de espora asexual (Punja, 1985).



15

Es un patógeno esencialmente de suelo, que causa enfermedad en un amplio intervalo de

hospederos, más de 500 plantas en el mundo, como son frutales, malezas, hortalizas y

plantas forestales (El-Katatny et al.,2001).

S. rolfsii es capaz de sobrevivir en un amplio intervalo de condiciones ambientales, el pH

óptimo de crecimiento del micelio es de 3.0 a 5.0 y la germinación de los esclerocios ocurre

entre pH de 2.0 y 5.0. La germinación se inhibe a pH mayor de 7.0 y el máximo

crecimiento del micelio ocurre entre 25 y 35º C con muy poco desarrollo o ninguno a 10º o

40º C. El micelio muere a 0° C, y los esclerocios sobreviven a temperaturas de -10 ºC. El

crecimiento del micelio y la germinación de los esclerocios ocurren rápidamente con luz

continua, pero también puede desarrollarse en obscuridad completa si las condiciones son

favorables (Punja, 1985).

2.8Sclerotium rolfsii

en las plantas

Al ser un patógeno de suelo, S. rolfsii se desarrolla en la naturaleza cerca o sobre la

superficie del mismo y usualmente ataca el cuello de la raíz de la planta. Como primer

síntoma, se presenta una lesión acuosa en la base de los tallos a nivel de la superficie del

suelo, después se extiende rápidamente y estrangula al tallo; en las plantas herbáceas y

plántulas las plantas se marchitan y se caen. En las plantas maduras de tomate y chile la

corteza del tallo se pudre, pero el cilindro central permanece sano; conforme avanza la

pudrición, las plantas se marchitan pero permanecen erectas. En muchos hospederos las

hojas marchitas gradualmente se vuelven cafés y quedan colgando (Aycock, 1966).



16

Cuando los tallos de las plantas herbáceas se deterioran aparecen masas de micelio blanco

en el sitio de la lesión, la cual puede extenderse en el suelo circundante al tallo. Poco

después que aparece la masa de micelio se empiezan a formar cuerpos redondeados decolor blanco que posteriormente sé tornan lisos y de color café claro, café obscuro o negro

llamados esclerocios, estos son las estructuras de resistencia que le sirven para sobrevivir

en condiciones adversas (Punja, 1985).

Los esclerocios se forman en los tejidos enfermos cerca de la superficie del suelo. En

bulbos y los tubérculos los tejidos se vuelven blandos y se colapsan, formándose micelio en

las áreas podridas (Aycock, 1966).

Los esclerocios pueden persistir en los suelos por varios años. Cuando los bulbos o raíces

carnosas son infectados, es frecuente que se desarrolle una pudrición de las escamas

externas o los tejidos internos de la raíz. Todo el bulbo o la raíz puede pudrirse,

desintegrarse y ser sustituido por los restos de la planta entretejidos con el micelio del

hongo (Aycock, 1966). En la cebolla, Sclerotium rolfsii genera amarillamiento y marchitez

empezando por las partes más bajas, los bulbos se vuelven blandos y se colapsan (Jenkins y

Averre 1986).



17

2.9 Métodos de control de Sclerotium rolfsii

Para el control de Sclerotium rolfsii se usan métodos químicos, culturales y

alternativamente el control biológico, el cual tiene un efecto a largo plazo y un menor

impacto ambiental (Montes-Belmont et al ., 2003). S. rolfsii es diseminado a través de

prácticas culturales como el barbecho o el arado del suelo contaminado, trasplante de

plántulas contaminadas, el agua, el viento y por propagaciones vegetativas y semillas.

Dentro de las prácticas culturales que se recomiendan para el control de Sclerotium está el

arado profundo y superficial (Jenkins y Averre, 1986). También están las prácticas de

exclusión, remoción de plantas y suelo, tratamiento de suelo, tratamiento de plantas,

rotación de cultivos, uso de variedades resistentes o una combinación de todas estas

prácticas. La siembra en áreas con climas fríos es una condición en donde el hongo no se

desarrolla; la remoción de plantas enfermas cuando empiezan a parecer síntomas de la

enfermedad puede ayudar a reducir las fuentes de inóculo primario. En algunos casos la

remoción del suelo de áreas localizadas de infección puede evitar la diseminación. El

tratamiento del suelo con solarización, la aplicación de fungicidas o fumigantes de suelo,

los abonos orgánicos, los fertilizantes o los tratamientos biológicos pueden ayudar a

controlar a S. rolfsii (Singh y Dwivedi, 1991).

La aplicación de fertilizantes como amonio, urea, nitrato de amonio y bicarbonato de

amonio, que liberan amoniaco inhibe la germinación de esclerocios y retarda el desarrollo

del micelio y además aumenta la microflora antifúngica del hongo. Los fertilizantes de

calcio incrementan los niveles de calcio en los tejidos de las plantas y esto protege de la



18

acción del ácido oxálico y enzimas degradadoras de la pared celular producidas por el

hongo (Punja, 1985).

Otro método que se recomienda es la adición de cal al suelo para subir el pH a 6.5 y así

evitar el rápido desarrollo del hongo. Las densidades de siembra deben ser más espaciadas

para prevenir el contagio entre plantas (Jenkins y Averre 1986).

En el control químico se utilizan comúnmente fungicidas como el pentacloro-nitrobenceno

(PCNB). La aplicación de éste y otros productos en grandes superficies no es práctico, por

los grandes volúmenes de producto que se requieren. Además de que el efecto del PCNB

varía año con año y se han encontrado cepas del hongo patógenos resistentes al PCNB

(Shim et al ., 1998).

El control biológico se efectúa con los hongos Trichoderma, Penicillium spp. y

Gliocladium virens o con la bacteria Bacillus subtilis (Coşkuntuna y Özer, , 2008).

Penicillium notatum también mostró en pruebas de laboratorio e invernadero una acción

antagónica. Inhibe la germinación de esclerocios, invasión y maceración de éstos, supresión

del crecimiento saprófito y de la producción de esclerocios del patógeno (Díaz y Castro,

1977).



19

3. JUSTIFICACIÓN

México es el primer productor mundial de cebolla, esta es la tercera hortaliza más

consumida en el país. Como otras hortalizas, las enfermedades causadas por hongos

reducen la producción y calidad del producto final. Diversos estudios proponen que las

variedades blancas son menos resistentes a las enfermedades que las pigmentadas,

diferencia que puede estar relacionada con el contenido de compuestos antimicrobianos.

Entre los hongos que infectan a la cebolla destacan especies del género Sclerotium. Para su

control se usan métodos químicos a la par de los culturales y una alternativa puede ser el

control biológico. Este último tiene un efecto a largo plazo, un menor impacto ambiental y

económico en agricultores. En tal sentido, se propone el uso de Trichoderma harzianum,

que es un hongo que inhibe el desarrollo y propagación de Sclerotium. Se ha reportado que

T . harzianum induce cambios en el crecimiento y en la resistencia de varias plantas. Sin

embargo, no se conoce si el tratamiento con T. harzianum en variedades de cebolla induce

respuestas bioquímicas que las protejan contra S . rolfsii. Por lo cual, es importante evaluar

los cambios bioquímicos inducidos en tres variedades de cebollas (blanca, morada y roja)

tras la inoculación con T. harzianum y su relación con el control de Sclerotium rolfsii.



20

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Evaluar el efecto de Trichoderma harzianum Tc74 sobre la germinación, desarrollo, el

contenido de compuestos fenólicos, flavonoides y actividad de peroxidasa de tres

variedades de cebolla con diferentes grados de pigmentación y su relación con el control

de Sclerotium rolfsii.

4.2 Objetivos específicos

Evaluar el efecto de la inoculación con Trichoderma harzianum sobre la germinación y el

desarrollo de tres variedades de cebolla.

Determinar en plantas inoculadas con Trichoderma harzianum: el contenido de compuestos

fenólicos y flavonoides totales, la actividad de peroxidasas y la incidencia de Sclerotium

rolfsii.



21

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Variedades de cebolla

Para este trabajo se usaron 3 variedades de cebolla: (1) Crystal White (blanca) de

producción mexicana, (2) Red Satán (roja) producida por la empresa Nunhems (USA) y

(3) Mata Hari (morada) producida por la empresa Service Plus (Francia) dentro de la línea

comercial “Pour le Goût”. Las semillas de las variedades blanca y roja se adquirieron del

distribuidor “Rancho los Molinos S. A. de C. V.”.

5.2 Cepas de hongos utilizadas

De la colección de cepas del Laboratorio de Fitopatología del CeProBi, se utilizó la cepa 12

de Sclerotium rolfsii, que proviene de plantas de frijol, colectada en Yautepec, Morelos.

Esta cepa fue seleccionada por su capacidad de producción de esclerocios y su mayor

severidad (Ruiz, 2010).

La cepa Tc74 de Trichoderma harzianum, fue proporcionada por el M. en C. César

Guigón-López del Centro de Investigación para los Recursos Naturales, Chihuahua. Esta

cepa mostró diferencias altamente significativas en su crecimiento y actividad

micoparásitica in vitro contra el patógeno Phytophthora capsici (Guigón-López y

González-González, 2003).



22

5.3 Tratamiento con T. harzianum de las semillas de cebolla y evaluación de la

germinación

De cada una de las tres variedades, se pusieron 100 semillas en una caja Petri

acondicionada con círculos de papel (servitoalla).

El inoculo de T. harzianum, se preparó colocando en un vaso de precipitado y con agitación

suave, 15 ml de agua destilada con 0.170 g de granos de trigo inoculados con T. harzianum,

conteniendo 4.08 x 107 esporas/ ml. Posteriormente esta mezcla se adicionó a cada una de

las cajas Petri con las semillas. En el caso de los controles, a cada caja se le adicionó 15 ml

de agua destilada. Cada 24 horas se cuantificó el número de semillas germinadas.

El valor de n fue de 5. Se obtuvieron los promedios y la desviación estándar de cada

determinación. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la

prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.

La viabilidad de las semillas se expresó como el porcentaje de germinación calculado con

la siguiente fórmula:

Donde:

Ng = número de semillas germinadas al último día de la medición

Nt= número total de semillas que se pusieron a germinar (en este caso, 100 semillas)



23

Para calcular la velocidad de germinación, se consideraron los valores de la fase lineal de la

curva de germinación de cada repetición (en todos los casos fueron del día 3 al día 6) con

los que se obtuvieron las ecuaciones de regresión, donde la pendiente representó lavelocidad de germinación expresada como el número de semillas germinadas por día.

Para la velocidad de germinación el valor de n fue igual a 5. Con todos los resultados se

obtuvieron los promedios y la desviación estándar de cada determinación. Se aplicó un

análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para obtener

las diferencias entre los tratamientos.

5.4 Evaluación del efecto de T. harzianum en el desarrollo de las plantas

Las semillas de las tres variedades se pusieron a germinar en condiciones ambientales en

almacigo (29 ± 3 ºC) con una mezcla de sustrato: Metromix y Peat Moss en una proporción

de 3:1 (p:p). Las plántulas se dejaron en almacigo por 30 días y posteriormente se

trasplantaron a macetas de 1 kilogramo y medio.

El sustrato que se utilizó para las plantas se mezcló con granos de trigo inoculado con T.

harzianum a una concentración de 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato (Bravo y Ruíz 2008).

Los controles fueron plantas crecidas sin la inoculación de T. harzianum. Las plantas de

cebolla se regaron cada tercer día con 400 ml de agua por maceta. Cada 20 días se fertilizó

con triple 17 (Nitrógeno-Fósforo-Potasio) en una proporción de 2 g/ L. Para mantener el



24

número de esporas en el sustrato, mensualmente, a cada maceta se le adicionó 0.170 g de

trigo inoculado con Trichoderma, equivalente a 4.08 x107 esporas/ kg de sustrato.

Después de 8 semanas, las plantas se extrajeron de sus macetas, se les retiró el exceso de

sustrato en raíces y bulbos, y se midió el peso total, el peso de las hojas, del bulbo y de las

raíces.

El valor de n fue igual a 4. Con todos los resultados se obtuvieron los promedios y la

desviación estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó

la prueba de Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.

5.5 Determinación del contenido total de compuestos fenólicos

Para obtener el extracto con metanol, en el caso de las plántulas de 8 días se tomó todo el

tejido y para el caso de las plantas de 8 semanas se utilizó sólo tejido de los bulbos. Enambos casos, el tejido se secó a temperatura ambiente y se maceró en un mortero hasta

obtener un polvo fino. De donde se tomaron 0.20 g que se colocaron en un tubo Eppendorf,

se le adicionó 2 ml de metanol al 100 %, se homogenizó con un macerador manual y se

centrifugó a 3000 rpm. El sobrenadante se separó y se usó para realizar las diferentes

evaluaciones.

Para la determinación de compuestos fenólicos se siguió el método reportado por Shohael

et al . (2006). Para esto, se tomaron 100 µl del sobrenadante y se depositó en un tubo de

ensaye para después adicionarle 2.5 ml de agua destilada más 100 µl del reactivo de Folín-



25

Ciocalteu. Se mezcló en un vortex y se dejó reposar por 6 minutos. Posteriormente se

añadieron 500 µl de carbonato de sodio al 20%, se mezcló y se puso a incubar por 30

minutos.

La absorbancia se leyó a 760 nm en un espectrofotómetro (Thermo Spectronic, modelo

Genesys 2).

Para calcular el contenido total de compuestos fenólicos en las muestras se utilizó como un

estándar al compuesto fenólico, ácido gálico. Con éste compuesto fenólico a diferentes

concentraciones se construyó una curva estándar. La ecuación de regresión que se obtuvó

de la curva estándar fue:

y = 0.08x – 0.0098

en donde “x” es la concentración expresada en µg de Ac. gálico/mL y “y” es la absorbancia

a 760 nm.

Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de ácido gálico (mg EAG) por

gramo de peso seco (g PS).






26

5.6 Determinación del contenido total de flavonoides

Para determinar el contenido total de flavonoides, se partió del mismo extracto metanólico

utilizado en la determinación de compuestos fenólicos y siguiendo el método reportado por

Shohael et al , (2006). De este extracto se tomaron 250 µl, a los que se les agregó 1.25 ml de

agua desionizada más 75 µl de nitrito de sodio al 5 %. Se mezclaron en vortex y se dejó

reposar por 6 minutos.

A esta mezcla, se le adicionó 150 µl de cloruro de aluminio al 10 % y nuevamente se pusó

a reposar por 5 minutos. Posteriormente se añadieron 500 µl de hidróxido de sodio 1M más

2.5 ml de agua desionizada y se dejó reposar por 30 minutos. Después de éste tiempo, se

leyó la absorbancia a una longitud de onda de 510 nm.

Para cuantificar el contenido total de flavonoides en las muestras, se utilizó como un

estándar al flavonoide, catequina. Con el que se construyó una curva estándar con

diferentes concentraciones de catequina.

La ecuación de regresión de la curva estándar fue:

y = 0.0069x + 0.0004

donde “x” es la concentración expresada en µg de catequina/mL y “y” es la absorbancia a

510 nm.

Los resultados fueron expresados como mg equivalentes de catequina (mg EC) por gramo

de peso seco (g PS).



27




5.7 Evaluación de la actividad de peroxidasa

Para efectuar la evaluación de la actividad de la enzima peroxidasa se siguió el método

descritó por Stasolla y Yeung (2007). El buffer de extracción contenía fosfato de sodio 100

mM, EDTA 1mM, DTT 1mM, a pH 7. Se tomaron 200 mg de tejido vegetal fresco de cada

bulbo que se homogeneizó con un macerador manual con 1.5 ml de buffer de extracción.

El extracto se centrifugó a 3000 rpm y el sobrenadante se separó y se usó como el extracto

enzimático.

Para realizar el ensayo de la enzima se preparó una mezcla que contenía: 798 µl de buffer

de fosfato de sodio 50 mM (pH 6), 100µl del extracto enzimático, 100 µl de H 2O2 al 0.3% y

1 µl de guayacol 3M. Toda la mezcla se agitó vigorosamente y se leyó la absorbancia en el

espectrofotómetro a una longitud de onda de 470 nm. La actividad de la enzima se expresó

como µmoles de tetraguayacol/ min/ g de peso fresco.

El valor de n fue igual a 5 . Con los resultados se obtuvieron los promedios y la desviación

estándar. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de

Tukey para obtener las diferencias entre los tratamientos.



28

5.8 Obtención de extractos acuosos de bulbos de cebolla

Los bulbos frescos de cebolla tratada y control, se sumergieron en hipoclorito de sodio al 3

% por tres minutos, se enjuagaron con agua destilada estéril y se secaron. En un mortero se

maceraron 40 g de tejido hasta llegar a una pasta suave y homogénea, se le adicionaron 100

ml de agua destilada y ésta mezcla se centrifugó a 10 000 rpm por 10 minutos a 4 ºC. El

sobrenadante (extracto) se filtró al vacio con papel filtro Whatman No. 1 y se esterilizó por

filtración a través de una membrana de nitrocelulosa de 0.22 µm (Millipore). Con el

extracto esterilizado se preparó medio de cultivo conteniendo extracto al 20%. Para esto, 16

ml del extracto esterilizado se adicionaron y homogeneizaron con 64 ml de medio Papa

Dextrosa Agar (PDA) estéril a una temperatura entre los 30 a 35 ºC. El medio de cultivo se

vació en cajas Petri y se dejó solidificar. Todo se realizó bajo condiciones de asepsia.

5.9 Efecto de extractos acuosos de bulbos sobre el crecimiento micelial y producción

de esclerocios de Sclerotium rolfsii

Cada una de las cajas Petri que contenía extracto de cebolla tratada con T. harzianum,

extracto de cebolla sin tratar y PDA (sin extracto) se inocularon con S. rolfsii, Para esto, se

colocó un disco de micelio de 5 mm en el centro de cada caja Petri y se incubaron a 27 ºC.

Para cada uno de los tratamientos se realizaron 5 repeticiones y su control. Las variables de

respuesta fueron: el crecimiento micelial y la producción de esclerocios.



29

El área de crecimiento micelial (mm2) de S. rolfsii se evaluó al tercer día de incubación en

ausencia y/o presencia del extracto acuoso. Sé tomaron fotografías digitales diariamente de

los tratamientos y con ayuda del software ImageJ® (versión 1.4) se calculó el área decrecimiento. Después de evaluar el crecimiento micelial todas las cajas Petri se

mantuvieron a temperatura de laboratorio (28 3 °C) por 30 días. Al final de éste periodo

se cuantificó en cada caja Petri el número total de esclerocios.

El valor de n fue igual a 5. Con todos éstos resultados se obtuvieron los promedios y la



5.10 Efecto de la inoculación de T. harzianum en la severidad de daño de Sclerotium

rolfsii

Para obtener el inoculo de S. rolfsii, a bulbos de cebolla comercial se les realizó un corte

de 3 cm2, donde se colocaron discos con micelio del hongo y se mantuvieron a temperatura

de laboratorio por tres días en una cámara húmeda.

Los bulbos de cebolla de 8 semanas tratadas y sin tratar con T. harzianum se inocularon

colocando en cada uno, cuatro discos de 5 mm de diámetro con micelio de S. rolfsii

proveniente de los bulbos de cebolla comercial infectados. La humedad del sustrato se

mantuvo constante para favorecer el crecimiento micelial del hongo. Cada dos días, se

monitorearon las plantas para ver el avance del patógeno. Después de 15 días de



30

observación se procedió a extraer las plantas del sustrato para evaluar la severidad del

patógeno en los bulbos de cada una de las variedades y su control.

El índice de severidad se evaluó en 15 plantas por tratamiento utilizando la ecuación

reportada por Hernández et al . (2004).

La fórmula utilizada para estimar el índice de severidad fue

Donde: IS = Índice de severidad; XKi = Nivel del daño en el momento i

Nki = Número de plantas con daño en el momento i

N j= Número total de plantas evaluadas

La escala nominal que se utilizó fue:

1: plantas sanas

2: plantas sin síntomas, con esclerocios en el suelo

3: plantas amarillentas con presencia de micelio y esclerocios a su alrededor

4: plantas con síntomas de marchitez y pudrición además de micelio y esclerocios

Para cada tratamiento también se evaluó el número esclerocios por planta y se obtuvo el

promedio y la desviación estándar. El valor de n fue igual a 15. Los datos fueron analizados



31

con un análisis de varianza de una sola vía (p<0.05) y se aplicó la prueba de Tukey para

obtener las diferencias entre los tratamientos.



32

6. RESULTADOS

6.1 Efecto del tratamiento con T. harzianum en la germinación de las semillas

La viabilidad de las semillas de las tres variedades de cebolla oscilo entre 76 y 93 %

(Cuadro 2). A los 7 días, en la variedad blanca tratada con T. harzianum se encontró un

mayor número de semillas germinadas por día y una mayor velocidad de germinación que

su control (Figura 2a y Cuadro 2). Por el contrario, en las otras dos variedades, a los 7 días

de germinación se encontró en el control un mayor número de semillas germinadas por día

que en las tratadas con T. harzianum (Figuras 2b y c). Sin embargo, el análisis estadístico

indico que en la variedad morada la velocidad de germinación fue similar; mientras que en

la variedad roja la velocidad de germinación fue mayor en el control que en las semillas

tratadas con T. harzianum (Cuadro 2).



33

Cuadro 2. Germinación de las semillas de las tres variedades de cebolla tratadas con T.

harzianum.

Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de

varianza de una sola vía, letras diferentes indican diferencia estadística significativa

(p<0.05, prueba de Tukey).

Tratamiento Germinación (%)

Velocidad de germinación

(semillas germinadas/día)

Blanca control 85 11.53 ± 1.34 a

Blanca tratada 92 17.73 ± 0.82c

Morada control 93 18.40 ± 0.39c

Morada tratada 82 17.98 ± 1.12c

Roja control 88 14.68 ± 0.27 b

Roja tratada 76 12.98 ± 0.57 a



34

Figura 2. Germinación de semillas de la variedad blanca (a), morada (b) y roja (c) tratadas

con T. harzianum. Los resultados son el promedio ± desviación estándar, n=5. Se aplicó

una prueba de t. Letras diferentes indican diferencia estadística significativa (p<0.05).



35

6.2 Desarrollo de la planta en presencia de T. harzianum

Las plantas de 8 semanas inoculadas con T. harzianum, mostraron un aumento en su

desarrollo al compararlas con sus controles (Figura 3). En las tres variedades, con el

tratamiento con T. harzianum, el peso total aumento hasta tres veces más que su control. La

variedad roja y la blanca tratadas con T. harzianum fueron las que presentaron el mayor

peso total (Cuadro 3).

El peso de los bulbos tratados con T. harzianum fue de 2 a 3 veces mayor que el peso de los

bulbos sin tratamiento. Los bulbos de la variedad blanca tratada fueron los que presentaron

el mayor desarrollo. El peso de las hojas de las tres variedades tratadas con T. harzianum

aumentó hasta 3.4 veces con respecto a su control. Para el caso de las raíces, se encontró

que después del tratamiento el peso se incrementó en un intervalo de 7.4 a 11 veces más

con respecto a sus respectivos controles (Cuadro 3).



36

Figura 3. Aspecto de las plantas a las 8 semanas de tratamiento con T. harzianum (T) y su

control (C).



37

Cuadro 3. Peso total, de bulbos, hojas y raíz de plantas de 8 semanas tratadas con

T. harzianum.

Variedad Peso total (g) Peso bulbo(g) Peso hojas(g) Peso raíz(g)

Blanca control 2.92 ± 1.01a 0.64 ± 0.18 ab 2.42 ± 0.89 a 0.10 ± 0.05 a

Blanca tratada 9.38 ± 3.78 b 2.01 ± 1.36 b 6.77 ± 2.61 bc 0.88 ± 0.40 b

Morada control 1.97 ± 0.72 a 0.60 ± 0.39 a 1.28 ± 0.35 a 0.07 ± 0.07 a

Morada tratada 5.96 ± 2.51ab 1.24 ± 0.32 ab 3.68 ± 1.16 ab 0.52 ± 0.12 ab

Roja control 3.09 ± 0.87 a 0.79 ± 0.13 ab 2.22 ± 0.78 a 0.08 ± 0.01 a

Roja tratada 10.18 ± 2.13 b 1.47 ± 0.40 ab 7.72 ± 1.29c 0.89 ± 0.51 b


varianza de una sola vía, letras diferentes por columna indican diferencia estadística

significativa (p<0.05, prueba de Tukey). * Número de veces que se aumento después del

tratamiento.

6.3 Contenido de compuestos fenólicos en plántulas y bulbos

Antes del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de la variedad roja fueron las que

presentaron el mayor contenido de compuestos fenólicos. Sin embargo, con el tratamiento

con T. harzianum, en las plántulas de las tres variedades se generó un aumento en el

contenido de compuestos fenólicos con respecto a los encontrados en sus controles. En el

(3)*

(3)*

(3)*

(3)*

(2)*

(2)*

(3)*

(3.4)

(3)*

(9)*

(7.4)*

(11)



38

caso de las plántulas de las variedades blanca y morada éste aumento fue del 43.5 y 48 %

respectivamente; mientras que para las plántulas de la variedad roja aumento en un 13 %

(Figura 4).Las diferencias estadísticas permiten afirmar que el tratamiento tuvo un efecto enel contenido de los compuestos fenólicos.

Figura 4 .Contenido de compuestos fenólicos en plántulas de 8 días. Los resultados son el

promedio ± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía,

letras diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05,

prueba de Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco.

El contenido de compuestos fenólicos de los bulbos tratados con T. harzianum se

incrementó con respecto a su control. Los incrementos fueron del 20 % más para la

variedad blanca tratada, 70 % para la variedad morada y 30 % para la variedad roja (Figura



39

5). Estos resultados indican diferencias de respuesta entre variedades a la inoculación por

Trichoderma. La variedad morada es en la que muestra el mayor cambio en el contenido de

compuestos fenólicos, seguida de la variedad roja y la blanca.

Por otra parte, los bulbos de la variedad roja fueron los que presentaron el mayor contenido

de compuestos fenólicos, seguidos de los bulbos de la variedad morada y la blanca.

Figura 5. Contenido de compuestos fenólicos en bulbos de 8 semanas. Los resultados son

el promedio ± desviación, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras

diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de

Tukey). * mg EAG/g PS: mg equivalentes de ácido gálico/g de peso seco.



40

6.4 Contenido de flavonoides totales en plántulas y bulbos

En las plántulas tratadas de las variedades, blanca, morada y roja, el contenido de

flavonoides totales se aumento en 43.5, 51.6 y 16 % respectivamente comparadas con sus

controles. Por otra parte, antes del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de la

variedad roja fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales, pero

después del tratamiento con T. harzianum, las plántulas de las variedades roja y morada

fueron las que presentaron el mayor contenido de flavonoides totales (Figura 6).

Figura 6. Contenido de flavonoides totales en plántulas de 8 días. Los resultados son el



prueba de Tukey).



41

En los bulbos de las variedades morada y roja tratados y sin tratar con T. harzianum se

encontró que el contenido de flavonoides totales fue similar. Solamente en los bulbos de la

variedad blanca se encontraron diferencias entre las muestras control y las tratadas en elcontenido de flavonoides totales (Figura 7). Los resultados también muestran que la

variedad roja antes y después del tratamiento es la que presenta el mayor contenido de

flavonoides, seguida de las variedades morada y blanca.

Figura 7. Contenido de flavonoides totales en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el



prueba de Tukey).



42

6.5 Actividad de la enzima peroxidasa en bulbos de 8 semanas

En los bulbos de las plantas blanca y morada que fueron tratadas con T. harzianum, la

actividad de la enzima peroxidasa fue mayor que la encontrada en los controles (2.5 y 4.6

veces, respectivamente), por otro lado, aunque en la variedad roja se observó un incremento

entre las plantas tratada y las control, este no fue significativo (Figura 8). De las tres

variedades tratadas con T. harzianum, los bulbos de la variedad morada y la blanca fueron

los que presentaron la mayor actividad de la enzima.

Figura 8. Actividad de peroxidasa en bulbos de 8 semanas. Los resultados son el promedio

± desviación estándar, n = 5. Se aplicó un análisis de varianza de una sola vía, letras

diferentes entre variedades indican diferencias estadísticas significativas (p<0.05, prueba de

Tukey).



44

Cuadro 4. Crecimiento micelial de S. rolfsii en presencia de extractos acuosos de bulbos.




La evaluación del número de esclerocios mostró que con los diferentes extractos no se

afectó la producción de esclerocios (Cuadro 5).

Extracto de bulbo Área de crecimiento micelial (mm2)

Sin extracto 33.30 3.23de

Blanca control 28.10 2.59cd

Blanca tratada 34.99 2.52e

Morada control 26.51 1.40abc

Morada tratada 27.81 1.72 bcd

Roja control 26.99 4.25abc

Roja tratada 21.31 0.30a



45

Cuadro 5. Efecto de extractos acuosos de bulbos en el número de esclerocios.

Tratamiento Número de esclerocios

Sin extracto 302.50 20.50a

Blanca control 294.75 120.52a

Blanca tratada 262.50 102.52a

Morada control 236.75 27.62a

Morada tratada 235.25 108.15a

Roja control 340.25 91.96a

Roja tratada 254.00 50.89a


varianza de una sola vía, las letras iguales indican que no hubo diferencia estadística

significativa (p<0.05, prueba de Tukey).

6.7 Efecto de la inoculación con Sclerotium rolf sii en bulbos de plantas de cebolla de 8

semanas

En los bulbos inoculados con T. harzianum se observó que el índice de severidad fue de 1.9

a 2.1; mientras que en los bulbos no inoculados fue entre 2.5 y 2.9, lo que indica que la

severidad de la enfermedad fue menor en los bulbos tratados con T. harzianum (Cuadros 6).

Al comparar entre variedades, se destaca que las variedades pigmentadas tratadas con T.



46

harzianum tuvieron una disminución en sus valores de severidad más evidentes con

respecto a sus controles (entre 0.8 y 0.9).

Cuadro 6. Efecto de S. rolfsii en el índice de severidad y número de esclerocios presentes

en bulbos tratados con T. harzianum.




Sin embargo, la evaluación del número promedio de esclerocios por planta mostró que

solamente para la variedad blanca hay diferencias entre los bulbos tratados y los controles.

Al comparar entre variedades sin tratamiento se observó que la variedad blanca tuvo el

mayor número de esclerocios (Cuadro 6).

Tratamiento Índice deseveridad

Número de esclerocios por planta

Blanca control 2.5 9.067 ± 4.284c

Blanca tratada 2.1 2.933 ± 1.580

a

Morada control 2.7 5.133 ± 4.373ab

Morada tratada 1.9 2.267 ± 1.944a

Roja control 2.9 7.267 ± 4.301 b

Roja tratada 2.0 4.133 ± 2.748ab



47

7. DISCUSIÓN

El tratamiento con T. harzianum tuvo un efecto diferencial en la germinación de las

semillas que dependió de la variedad de cebolla. En la variedad blanca, T. harzianum

estimuló la germinación; mientras que, en las variedades morada y roja, el tratamiento

inhibió la germinación (Figuras 2). En particular, los resultados encontrados con la variedad

blanca concuerdan con los estudios realizados por Kleifeld y Chet (1992) quienes

encontraron que las semillas de chile tratadas con T. harzianum mostraron un aumentó en la

emergencia de plántulas. Estos autores también indican que éste efecto probablemente es

causado por la interacción benéfica que existe entre el hongo Trichoderma y la rizosfera de

las plántulas.

A las 8 semanas, las plantas de las tres variedades de cebolla tratadas con T. harzianum

mostraron una ganancia de biomasa, tanto de las hojas, como de los bulbos y las raíces

(Figura 3 y Cuadro 3). Este aumento en el desarrollo causado por Trichoderma puede ser

debido a varias causas. Harman et al ., (2004b) sugieren que la presencia de Trichoderma en

el medio de cultivo donde se desarrolla la planta, induce las hormonas de crecimiento y

cambios en el metabolismo vegetal. Gravel et al. (2007) reportaron que la producción del

ácido indolacético en la raíz de tomate se incrementó con la presencia de T. atroviride,

dando como consecuencia una mayor ganancia de biomasa.

Por otra parte, se conoce que tanto el fosforo como el nitrógeno son nutrimentos esenciales

para el desarrollo y la fisiología de las plantas. El tratamiento con Trichoderma podría

ayudar a solubilizar, absorber y translocar varios nutrientes que se encuentran en el suelo,



48

tales como fosforo y nitrógeno y de esta forma ponerlos a una mayor disposición de la

planta. La disponibilidad de fosforo en la raíz se asocia con una promoción del crecimiento

vegetal (Yedidia et al ., 2001).

Trichoderma también como parte de la rizósfera puede colonizar y proteger las raíces de las

plantas y de esta forma inducir un incremento en el peso de las plantas (Lorito, 1998).

Los resultados de éste trabajo mostraron diferencias entre variedades en el contenido de

compuestos fenólicos y flavonoides. Antes del tratamiento con Trichoderma, tanto

plántulas como bulbos de la variedad roja fueron los que presentaron el mayor contenido de

compuestos fenólicos y de flavonoides totales, seguida de las variedades morada y blanca.

El tratamiento con T. harzianum, como una respuesta bioquímica, causó principalmente un

aumento en el contenido de compuestos fenólicos y algunos cambios en el contenido de

flavonoides; los cuales, dependieron tanto de la variedad de cebolla como de la etapa de

desarrollo de las plantas. En plántulas, los mayores cambios en los contenidos tanto de

compuestos fenólicos como de flavonoides se presentaron en las variedades blanca y

morada, seguidas de la variedad roja. Mientras que, solamente en los bulbos de las

variedades morada y roja, el tratamiento con T. harzianum causó un aumentó en el

contenido de compuestos fenólicos y los bulbos de la variedad blanca fueron los únicos en

los que se indujo un aumento en el contenido de flavonoides (Figura 5 y 7)

Diferencias en flavonoides y compuestos fenólicos también se encontraron en diferentes

cultivares de cebollas y se señala que el tipo de compuestos que se encuentran en cada

cultivar depende del origen de la semilla. Asimismo, la actividad agronómica y cambios en



50

mayor contenido de ácido protocatequico y de catecol y fueron más resistentes a la

infección por Colletotrichum circinans que las cebollas no pigmentadas (Link, 1933).

El ensayo del crecimiento del micelio de S. rolfsii en presencia de los extractos acuososmostró que solamente el extracto proveniente de bulbos de la variedad roja tratados con T.

harzianum redujo el crecimiento del micelio (Cuadro 4). Asimismo, la evaluación del

número de esclerocios no mostró diferencias significativas entre los extractos provenientes

de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum (Cuadro 5). Por lo cual, éstos

resultados no permiten concluir que haya una relación principalmente del aumento de

contenido de compuestos fenólicos observado en los bulbos tratados con T. harzianum con

la actividad fungicida contra S. rolfsii. No obstante, cabe la posibilidad que los extractos

presenten actividad antimicrobiana para otros microorganismos; por lo que, también sería

importante evaluar la actividad antimicrobiana de los extractos contra otros

microorganismos que afecten al cultivo de cebolla.

Después de 15 días de inoculación de los bulbos con tejido contaminado de S. rolfsii, se

observó que solamente en la variedad blanca hubo un menor número de esclerocios en los

bulbos tratados con T. harzianum que en los controles. Sin embargo, se observó que los

bulbos de las tres variedades tratadas con T. harzianum mostraron una menor severidad de

la enfermedad que sus controles (Cuadro 6). Lo cual sugiere que el tratamiento con T.

harzianum induce en las tres variedades de cebolla, los mecanismos bioquímicos de

resistencia. Así mismo, se observó que la variedad blanca tuvo el mayor número de

esclerocios y que las variedades pigmentadas destacan por una disminución en sus valores

de severidad más evidentes con respecto a sus controles. Resultados que concuerdan con lo



51

reportado por Link (1933), donde las variedades de cebollas pigmentadas fueron más

resistentes a la infección por Colletotrichum circinans que las cebollas no pigmentadas

Otro de los cambios bioquímicos importantes que se observaron en este trabajo por eltratamiento con T. harzianum fue un aumento en la actividad de la enzima peroxidasa en

los bulbos de las plantas tratadas de las tres variedades (Figura 8).

La respuesta general de defensa de las plantas incluye la inducción de proteínas de

respuesta a la patogénesis (PR), la acumulación de fitoalexinas, y la deposición de

polímeros estructurales, como la calosa y lignina (Van Loon et al ., 2006). La aplicación de

Trichoderma en plantas induce los mecanismos de resistencia local y sistémica. Entre estos

mecanismos esta la inducción de hidrolasas en la planta, tales como exo y endoquitinasas y

β-1,3-glucanasas, con potencial antimicrobiano (Harman et al , 2004a; Harman, 2006).

Diversos estudios señalan que la actividad de peroxidasa es una de las respuestas de

defensa en las plantas tratadas con microorganismos benéficos tales como Trichoderma. La

actividad de celulasas y peroxidasas son inducidas por T. harzianum como parte de las

respuestas de defensa (Yedidia et al ., 1999, Yedidia et al ., 2000). El extracto de micelio de

Trichoderma viride usado como un “elicitor” induce la acumulación de compuestos

fenólicos, la depositación de lignina en la pared celular, de enzimas del metabolismo de

fenilpropanoides y de peroxidasas (Mandal y Mitra, 2007). La combinación de T. viridae

con otro agente de biocontrol como Pseudomonas fluorescens y quitina llevó a la inducción

de la actividad de peroxidasas, polifenoloxidasas, la fenilalanina amonio liasa, quitinasas,

β-1,3-glucanasas, en combinación con la acumulación de compuestos fenólicos

(Ushamalini et al ., 2008; Karthikeyan et al ., 2006).



53

8. CONCLUSIONES

El tratamiento con T. harzianum tuvó un efecto diferencial en la germinación de las

semillas que dependió de la variedad.En las tres variedades de cebolla, T. harzianum generó un aumentó en el desarrollo, pero

las variedades roja y blanca fueron las más beneficiadas por el tratamiento.

T. harzianum causó cambios en el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides que

dependió de la etapa de desarrollo y la variedad. En las plántulas de las tres variedades de

cebolla, se aumentó el contenido de compuestos fenólicos y flavonoides; mientras que,

solamente en los bulbos de las variedades morada y roja, T. harzianum causó un aumentó

en el contenido de compuestos fenólicos y los bulbos de la variedad blanca fueron los

únicos en los que se aumentó el contenido de flavonoides.

En bulbos de las variedades blanca y morada, T. harzianum aumentó la actividad de la

enzima peroxidasa y fueron en los que se presentó la mayor actividad de la enzima.

El crecimiento del micelio solamente disminuyó en presencia de los extractos acuosos de

los bulbos de la variedad roja tratada y el número de esclerocios de S. rolfsii no se afectó

con los extractos acuosos de bulbos de cebollas sin tratar o tratadas con T. harzianum.

Las tres variedades tratadas con T. harzianum mostraron una menor severidad de la

enfermedad por S. rolfsii, Las variedades pigmentadas tratadas con T. harzianum tuvieron

una disminución en sus valores de severidad más evidentes que la variedad blanca.



54

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