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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE
AEROBIOS MESÓFILOS EN ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)
AOAC Official Method 2002.07
CODIGO P-SA-80
FECHA DE EMISIÓN
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PROCEDIMIENTO TÉCNICO DE RECUENTO DE AEROBIOS MESÓFILOS EN ALIMENTOS – INDICADOR DE COLOR (SimPlate)
AOAC Official Method 2002.07
ELABORÓ REVISÓ APROBÓ
REFERENTE DE LABORATORIO REPRESENTANTE DE CALIDAD
DIRECTOR (S) TECNICO (S)
SECRETARIO DE SALUD
REPRESENTANTE DE LA DIRECCIÓN
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1. OBJETIVO
Establecer el Procedimiento para el Recuento de Microorganismos Mesofilos aerobios por la metodología ®Official Method 2002.07 Técnica de Indicador de Color Metodología SimPlate® para muestras de Alimentos de Consumo Humano. 2. ALCANCE
El procedimiento permite la identificación de microorganismos Mesofilos en muestras de Alimentos para Consumo Humano, aplica a todas las muestras para análisis microbiológico que son recepcionadas y analizados en el Laboratorio de Salud Pública. 3. DEFINICIONES Bacterias mesófílas aerobias: En este grupo se incluyen las bacterias, capaces de
desarrollarse entre 15 y 45 °C, con un rango óptimo de 35 °C en las condiciones establecidas.
Sistema SimPlate: Es un método usado para la detección y cuantificación de microorganismos mesofilicos aérobicos totales. Se basa en tecnología de detección binaria la cual detecta la presencia microorganismos mesofilicos aerobios totales por cambio de color en el medio.
ATCC = American Type Culture Collection. Rockville, EU. Es un material biológico de
referencia certificado. La colección certifica que se suministra una determinada cepa,
que es un cultivo puro, y que se han observado las convenientes pruebas
morfológicas, bioquímicas y moleculares.
4. RESPONSABLES Será responsabilidad del profesional asignado a la sección del Análisis Microbiológico de Alimentos, del Laboratorio Departamental de Salud Publica del Meta cumplir con los lineamientos establecidos en este documento, sin hacer ningún cambio que no esté debidamente documentado y autorizado y se ejecutara según cronograma de análisis de muestras. 5. GENERALIDADES
Los microorganismos mesofilos son aquellos que se desarrollan entre 15 y 35 ºC y que tienen una temperatura óptima decrecimiento y proliferación en un ambiente o medio que tenga una temperatura de 37°C. En este grupo se encuentran los microorganismos patógenos es decir los causantes de enfermedades, pues la temperatura corporal es idónea para el desarrollo de este tipo de microorganismos.
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Existe un grupo de aerobios mesofilos (los aerobios son los microorganismos que se desarrollan en presencia de oxigeno). En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras capaces de desarrollarse a 30º C en las condiciones establecidas. En los análisis de alimentos la cantidad de este tipo de microorganismos en el alimento, refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima. Cuando se realizan análisis microbiológicos a los alimentos y se hace el recuento de microorganismos, y se obtiene un recuento elevado puede traducirse o significar:
Excesiva contaminación de la materia prima.
Deficiente manipulación durante el proceso de elaboración.
La posibilidad de que existan patógenos, pues estos son mesófilos.
La inmediata alteración del producto. Dentro de estos microrganismo mesófilos están los Coliformes e indican fallas de higiene de los manipuladores, re contaminación después del proceso y aún de contaminación fecal. 6. REFERENCIAS
AOAC Official Method 2002.07 – Indicador de Color
Certificación Microval (según ISO 16140) Certificado Nº 2009LR26 7. DESARROLLO
7.1 FUNDAMENTO
La tecnología de enzimas múltiples de IDEXX (Multiple Enzyme Technology®) patentado, que detecta bacterias viables en el agua comprobando la presencia de enzimas clave que se sabe existen en esos organismos. Se vale de sustratos de enzimas múltiples que producen cambio de color al ser metabolizados por la bacteria que se encuentra en el agua. La muestra y el medio se añaden a una placa SimPlate, se incuban a 35°C y luego se examinan para determinar el cambio de color morado ha rosado, rojo, crema. El número de pocillos fluorescentes de la placa corresponde al Número Más Probable (NMP) de bacteria total en la muestra original. Los valores NMP generados por el método SimPlate se correlacionan con el método Pour Plate utilizando Agar de recuento de placa totales incubadas a 35°C durante 48 horas como se describe en Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 19th edition (Métodos Estándar para el Análisis de Agua y Agua de Desecho).
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7.2 MATERIALES
Tener en cuenta los materiales e insumos para la preparación de la muestra se realizara conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.
7.2.1 Equipos
Incubadora a 35±1°C
7.2.2 Reactivos e Insumos Agua destilada estéril
Reactivo SimPlate TPC-CL, color indicado Simple
Platos de SimPlate
7.2.3 Cepas de Referencia
Cepas ATCC Escherichia coli 25922 o 11775 Cepas ATCC Klebsiella neumoniae o variicola 31488 - (Coliformes Totales) Cepas ATCC Pseudomonas aeruginosa 10145 0 27853 - (No coliformes)
7.3 PROCEDIMIENTO 7.3.1 Controles y/o curvas de calibración
Llene tres viales con 10 ml de agua estéril, e inocule con un asa estéril los siguientes controles microbiológicos:
Frasco 1: Control positivo: Cepa ATCC Escherichia coli Frasco 2: Control negativo: Cepa ATCC Pseudomonas aeruginosa Frasco 3: Control para Coliformes Totales: Cepa ATCC Klebsiella pneumoniae 7.3.2 Condiciones Generales
Las condiciones generales y preparación de la muestra se realizaran conforme al P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano. 7.4 Descripción del Método
Este procedimiento tiene como fundamento inocular diluciones decimales de la muestra en SimPlate* TPC - Indicador de Color para la Detección de microorganismos Mesofilos en muestras de Alimentos para Consumo Humano.
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Re suspender el vial que contiene el reactivo con 9 ml de agua estéril desionizada
Nota: NO cuente esta reconstitución como una dilución. Preparar la muestra en condiciones asépticas, pesando 10g de muestra y adicionar
90ml de Agua peptonada al 0,1% de diluyente, (dilución1:10) Homogenizar (stomacher) durante 30 segundos y las diluciones de los homogenizados tal como se ha recomendado. Ver P-SA-83 Procedimientos generales de los Análisis Microbiológicos de muestras de alimentos para consumo humano.
Transferir por duplicado, alícuotas de 1ml. De cada una de las diluciones consecutivas en vial resuspendido de SimPlate TPC.
Tapar y agitar el recipiente, asegurarse de que el reactivo se disuelva completamente. Mezclar por 15 a 20 segundos en el vortex y verificar la completa disolución del
reactivo. Transferir del contenido del vial (muestra + reactivo) a una plato de SimPlate de la
siguiente manera:
Se vierte la mezcla en el centro de la placa.
Incline ligeramente el plato de SimPlate para ayudar a distribuir el líquido en los pozos.
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Si es necesario puede realizar golpes suaves a la placa sobre una superficie dura para eliminar cualquier burbuja de aire que pueda haber quedado atrapados en los pozos. Verter el exceso de medio sujetando la tapa contra la placa a cada lado de la cavidad hacia la esponja.
Observe el color de fondo de los pozos. Se define como el color de la mezcla de muestra /
medio en el interior de los pocillos. No invierta el plato SimPlate. Llevar los Platos
SimPlate CEc a incubación a 35± 1ªC por 24 a 28 horas.
7.4.1 Lectura Recuento de Mesofilicas:
Realizar la lectura de Recuento de Aerobicos Mesofilicos observe el cambio de color del liquido en los pocillos contando el numero de pozos con cambio de color con respecto al color base: (morado) el cambio de color mas comun producido por microorganismos es ROSA pero puede virar a Naranja, rojo, café y blanco.y cuente el numero de pozos con cambio
Para determinar la concentración por plato, ejecute los siguientes cálculos (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de Simplate para determinar el número total de microrganismos por plato
Reportar asi: Recuento de Mesofilicos = X UFC en 1 ml
(X = Numero hallado en la Tabla)
7.4.2 Cálculos
Para determinar la población por placa, lleve a cabo los siguientes cálculos:
Seleccionar las dos cajas correspondientes a la misma dilución y contar el número de pozos positivos.
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NOTA:
Si no hay pocillos positivos y la esponja es positivo la población es 1.
Si no hay pozos positivos y la esponja es negativo de la población es < 1
Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de dilución.
Utilice la Tabla de Conversión SimPlate para determinar el número total de microorganismos por placa.
Reportar asi: Recuento de Mesofilos = X UFC góml
(X = Numero hallado en la Tabla)
7.4.3 Obtención Resultados
Con la interpretación de cálculos, los resultados según correspondan se registran en:
Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-75.
Los resultados del control del método se registran en Control de calidad análisis microbiológico F-SA-101
8. VERIFICACIONES
8.1 Aseguramiento de Calidad Resultados Para demostrar la capacidad del laboratorio de detectar mesofilicos con el método
Simplate en el Estándar internacional, realizar los siguientes controles con materiales de Referencia y analizarlos en las mismas condiciones que la muestra.
Para cada cepa bacteriana (Empleada como control), tome una colonia con una asa de siembra desechable estéril se inocula directamente al vial que contiene el reactivo y se procesa como una muestra (actividad 7.5).
Control Negativo de Reactivo Servir 100ml de agua destilada estéril en el Reactivo Simplate Pasar al plato e incubar.
Control Positivo Mesofilicos 100ml de agua destilada + 1 ul de Cepa Klebsiella pneumoniae ATCC 31438 o E coli ATCC 25922 mezclar. Tomar 1 ml y sembrarlo en 9ml de medio simplate,
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NOTA: Para cada una de las cepas bacterianas del American Type Culture Collection (ATCC),
Siembre el cultivo en placas de Tripticasa Soya Agar (TSA) o agar sangre debidamente marcadas e incúbelas a 35±0,5°C durante 18–24 horas.
Para cada cepa bacteriana, recoja una muestra de la colonia con una asa de siembra estéril de 1μl inoculé y mezcle en un tubo de ensayo marcado que contenga 100 ml de agua desionizada estéril. Cierre la tapa y agite bien
Las muestras así obtenidas serán sus controles.1
MATERIAL DE REFERENCIA RESULTADO PREVISTO PARAMETRO
EVALUADO
E. coli ATCC
25922
Color Rosa, Rosado, café o
blanco en el líquido de los
pozos Mesofilicas
Klebsiella
pneumoniae o
variicola
ATCC
31438
Color Rosa, Rosado, café o
blanco en el líquido de los
pozos Mesofilicas
Agua Desionizada
Estéril
Color morado en el líquido de
los pozos
Control Negativo del
reactivo
Registrar en los formatos
F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos F-SA-64 Identificación de Sustancias Químicas F-SA-18 Hoja de Vida de Equipos F-SA-34 Control Interno de Equipos F-SA-46 Control De Temperatura, Limpieza y Desinfección de Equipos. F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico
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Criterio de Aceptación o Rechazo
CRITERIO LECTURA RANGO DE ACEPTACION ACCION PARA
INCUMPLIMIENTO DE CRITERIOS
Control Negativo No debe presentar cambio de color ni Fluorescencia en ningún pozo
Coliformes Totales = 0 microorganismos Escherichia coli = 0 microorganismso
Repetir Análisis Verificar.
Control Positivo Coliformes totales Cepa ATCC 31438 Klebsiella pneumoniae
Verificar el Crecimiento en el control Positivo el cambio de color en los pozos pasando de amarillo a color naranja claro al rojo oscuro y SIN presentar fluorescencia al exponerse a la luz UV
Coliforfes Totales = >738 UFC
Repetir siembra de cepas ATCC y repetir
el Análisis
Control Positivo Cepa Escherichia coli ATCC 25922
Verificar el Crecimiento en el control Positivo el cambio de color en los pozos pasando de amarillo a color naranja claro al rojo oscuro y CON presencia de fluorescencia al exponerse a la luz UV
Escherichia coli = >738 UFC
Repetir siembra de cepas ATCC y repetir
el Análisis
Control Negativo Coliformes Cepa ATCC Pseudomona aeruginosa ATCC 10145 ò ATCC 27853
No debe presentar cambio de color ni Fluorescencia en ningún pozo
Coliforfes Totales = 0 microorganismso Escherichia coli = 0 microorganismso
Repetir siembra de cepas ATCC y repetir
el Análisis
Reactivos vigentes Vigencia del reactivo dentro de la fecha
Reactivo Vigente a la fecha de utilización
Descartar Reactivos y adquirir y procesar con reactivos en fechas vigentes
Temperaturas de Incubadoras
Temperatura ajusta a 35± 1ªC por 24 a 28 horas
Temperatura 35± 1ªC por 24 a 28 horas
Ajustar control de Temperatura y tomar nuevamente hasta obtener temperatura deseada.
Mantenimiento de equipos
Calibración, verificación y mantenimiento vigente
Calibración, verificación y mantenimiento vigente
Solicitar y ejecutar los mantenimientos o verificaciones pendientes para realizar análisis con equipos idóneos
Control de Esterilización de Material
Verificar la fecha de esterilización de Material, verificar el cumplimiento de los controles de esterilización.
Fecha de esterilización de Material. Controles de esterilización.
Descartar el Material y realizar el proceso con material que cumpla con los controles de esterilización.
Los resultados de los controles se registran en el Control De Calidad Análisis Microbiológico F-SA-101
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9. REGISTROS
Registro Responsable Como
conservarlo Donde conservarlo
Tiempo de conservación
Disposición final
F-SA-18 Hoja de Vida de
Equipos
Profesional
Universitario o Profesional del
Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
F-SA-34 Control Interno
de Equipos.
Auxiliar de
Laboratorio, Profesional
Universitario o Profesional del
Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
F-SA-46 Control De
Temperatura, Limpieza y
Desinfección de Equipos
Auxiliar de
Laboratorio, Profesional
Universitario o Profesional del
Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
F-SA-64 Identificación de Sustancias
Químicas
Auxiliar de
Laboratorio, Profesional
Universitario o Profesional del
Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o
tabla de retención documental
F-SA-75 Resultados Microbiológicos de Alimentos
Profesional Universitario o Profesional del Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental
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Registro Responsable Como
conservarlo Donde conservarlo
Tiempo de conservación
Disposición final
F-SA-101 Control de calidad análisis microbiológico
Profesional del Laboratorio
Físico
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental
Según F-MC-04 Listado Maestro de documentos, Según F-MC-03 -Listado maestro de registros y/o tabla de retención documental
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10. ANEXOS 10.1 Tabla SimPlate
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10.2 ANEXO 2 N. RESPONSABLE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO
1 INICIO
2 ANALISTA
Verificar la identificación y numeración de las muestras que ingresan con cada Acta de toma de Muestra.
3 ANALISTA
Realizar el registro de la muestra que ingresa en el Libro Análisis Resultados Microbiológicos de Alimentos
Registro de Resultados Análisis Microbiológico de
Alimentos
4 ANALISTA
Marcar los platos SimPlate con el número de la muestra a analizar
5 ANALISTA
Adicionar 9ml de agua destilada estéril al Vial mezclar para disolver el medio
Registro de Control de uso cabina de Flujo
Laminar
6
ANALISTA
Trasferir 1ml de la muestra a analizar
7 ANALISTA
Mezclar por 15 a 20 segundos en vortex hasta verificar la completa disolución del reactivo
Registro Control de Limpieza y
desinfección de equipos
8 ANALISTA
Retirar la tapa de la placa Simplate y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa. Tapar la placa Distribuir la muestra en todos los pocillos, verificando que no quede aire, vaciar el exceso de medio en la esponja blanca del plato, verifique que todos los pozos están llenos antes de eliminar el exceso de medio.
Marcar los platos SimPlate con el número de la muestra a analizar
Registrar en Libro Resultados Microbiológicos de Alimentos.
Verificar identificación y numeración de las muestras
INICIO
Adicionar 9ml de agua destilada estéril al Vial mezclar para disolver el medio
Transferir 1ml de Muestra a analizar .
Mezclar por 15 a 20 segundos en vortex hasta verificar la completa disolución del reactivo
Retirar la tapa de la placa Simplate y vaciar la solución medio/muestra en el centro de la placa Cerrar la placa. Distribuir la muestra en todos los pocillos, vaciar el exceso de medio en la esponja blanca del plato, verifique que todos los pozos están llenos antes de eliminar el exceso de medio
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N. RESPONSABLE ACTIVIDAD FLUJOGRAMA REGISTRO
9 ANALISTA
Llevar la placa Simplate a incubación a 35°C ± 1°C por 24 a 28 horas.
Registro Control de Temperaturas de Incubadoras
10 ANALISTA
Realizar la lectura de Recuento de Mesofilos dado por el numero de pozos con cambio de color del liquido en los pocillos respecto al color base:
11 ANALISTA
Para determinar la concentración por plato, ejecute los siguientes cálculos (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de Simplate, anexo No 1, para determinar el número total de microrganismos por plato
12 ANALISTA
Registre el dato obtenido en el libro de Análisis Microbiológico de Alimentos y en el Sistema Integral de Información en Salud modulo Laboratorio
Registro de Resultados
Microbiológico de Alimentos
Sistema Integral de
Información en Salud modulo Laboratorio
13 ANALISTA
FIN
11. HISTORIAL
VERSIÓN
VIGENCIA
IDENTIFICACIÓN DE LOS
CAMBIOS
1
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Versión inicial
FIN
Registre el dato obtenido en el libro de Análisis Microbiológico de Alimentos en el Sistema Integral de información de Salud modulo Laboratorio
Realizar Lectura de Coliformes Totales / E. coli por separado
Llevar la placa SimPlate a incubación a 35°C ± 1°C por 24 a 28 horas
Realizar la lectura (1) Cuente el número de pocillos positivos en el plato (2) Utilice la tabla de conversión de SimPlate, Anexo 1, para determinar el número total de microrganismos por plato