Primer Trabajo de Biotecnologia Metodos de Creci Microbiano

Facultad de IngenieríasIngeniería de Alimentos

MÉTODOS PARA LA EVALUACIÓN DE CRECIMIENTO MICRIBIANO

Directos

Peso seco Cuenta total microscópica

Componentes de la pared celular

Peso húmedo Cuenta viable Proteínas

Volumen húmedo

Medición lineal o radial

Ácidos nucleicos

Indirectos

Determinación del nitrógeno

total

Numero más probable NPM

Producción de ácidos orgánicos

Oxigeno

Azucares

Espectrofometria Turbidimetria Producción de alcoholes y

glúcidos CO2

Radiación IR Nefelometría Producción de CO2

Ácidos grasos

Determinación de la masa celular o biomasa

Determinación del n° de

microorganismos

Determinación de metabolitos

asociados al crecimiento

Determinación de la utilización de algún nutriente

Tabla # 1: La anterior tabla es una recopilación de todos los métodos; directos e indirectos, existentes para la evaluación del crecimiento microbiano en general. Todo y cada cosa que se genere en este proceso, determinado por cuatro aspectos importantes de evaluación. Shirley Jiménez Hidalgo. Septiembre 01 2013.


METODOS DIRECTOS E INDIRECTOS PARA LA EVALUACION DEL CRECIMIENTO MICROBIANO

Se suele definir el crecimiento de cualquier sistema biológico como el incremento ordenado de todos los elementos componentes de ese sistema, lo cual implica un aumento de la masa celular que eventualmente conduce a la multiplicación celular. En organismos pluricelulares dicha multiplicación se traduce en un aumento del tamaño del individuo, mientras que en unicelulares que se dividen por fisión o por gemación, lo que ocurre es un aumento de la población. En los microorganismos cenocíticos (en los que la duplicación del genoma no se acompaña de división celular) el crecimiento se traduce en aumento de tamaño de la “colonia” cenocítica. El crecimiento bacteriano podemos estudiarlo desde dos puntos de vista:

Escala individual. Escala poblacional.

Los eventos de crecimiento en el ámbito individual hacen referencia al ciclo celular, y dentro de éste podemos abordar los siguientes temas:

Inicio y transcurso de la replicación cromosómica y de plásmidos. Segregación de cromosoma y plásmidos a las células hijas. Síntesis de nuevos materiales de las envueltas, sobre todo de pared celular. Señales que coordinan la replicación genómica con la división celular.

El estudio del crecimiento a nivel de poblaciones incluye los siguientes tópicos:

cinética del crecimiento factores que afectan al tiempo de generación (g) factores ambientales que limitan el crecimiento.

A continuación haremos un estudio de todos los métodos que se emplean en el crecimiento de poblaciones (que es el más frecuentemente empleado al trabajar con microorganismos), enfatizando en cada uno de ellos y presentando las ventajas y desventajas en el empleo de cada uno de ellos.

DETERMINACION DEL PESO SECOEl peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105°C hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el peso de un gran número de bacterias. La desventaja de este método es que componentes volátiles de la célula pueden perderse por el secado y puede existir alguna degradación.


El volumen ocupado por los huecos se determina por desplazamiento de fluidos, por lo que estos no deben reaccionar con la pared celular para obtener un valor exacto del mismo. Se suelen emplear el agua o el helio, siendo este naturalmente más exacto al ser el helio un gas inerte.El agua, como veremos, es sorbida molecularmente por la pared celular, produciendo una compresión de la misma que enmascara el valor obtenido, cuyo efecto estudiaremos con la hinchazón. Con respecto al peso específico real de la célula, o más exactamente peso específico de la pared celular, después de numerosos estudios, se ha encontrado que, con pequeñas variaciones, se puede considerar para todas las células prácticamente igual a 1,56.

DETERMINACION DE PESO HUMEDOSe obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación celular.Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas.

CONTEO MICROSCÓPICO DIRECTOEs una técnica común, rápida y barata que utiliza un equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología, ya que consiste en contar con un microscopio la cantidad de células presentes en un volumen determinado. Para estos recuentos se utilizan generalmente cámaras de recuentos ( cámara de Petroff Hauser, cámara de Neubaver – Fig. 5-). Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados. La muestra puede utilizarse tal cual, (leche, o cultivos puros en medio líquido), o puede prepararse una dilución.


CONTEO DE CÉLULAS VIABLESEl método se basa en la consideración que el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces de formar colonias. Este método puede hacerse con medios sólidos o líquidos. El método más frecuentemente empleado es el conteo en placas (medios sólidos) formando colonias. Por lo tanto se determinan por este método sólo las células microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmósfera, temperatura). Para ello se siembra una cantidad conocida de la suspensión bacteriana cuyo número se desea conocer. En un medio sólido cada bacteria se multiplicará formando una colonia visible a simple vista que puede ser contada. Como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.), y esto puede constituir una desventaja ya que si dos bacterias no se separan darán una sola colonia, subestimando de esta forma el número de microorganismos en la suspensión. Además, a los efectos de que todas las células que queden en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias. Algunas bacterias son difíciles de contar en medios sólidos (Nitritadores) y se requiere de conteos en medios líquidos. Para ello se recurre a la técnica de determinación del número más probable (NMP) de microorganismos. Se basa en la determinación de la presencia o ausencia de un determinado tipo de microorganismo (en función de que crezcan o de que produzcan determinada reacción en el medio o no), en diferentes cantidades de muestra. Para poder determinar el NMP de microorganismo se debe diluir hasta tener una densidad que sea menor a 1 célula por cada mililitro de diluyente. La interpretación de los resultados, se hace en base a una distribución estadística, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos, teniendo en cuenta la dilución en la se observa proliferación de microorganismos. Se prefiere además este método cuando los microorganismos son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecación, etc.).

MEDICIÓN DE LA DENSIDAD BACTERIANAEs una técnica en la que se mide la masa de microorganismos en una suspensión. Para ello se utiliza un espectrofotómetro y se mide la cantidad de luz que atraviesa en una suspensión de microorganismos, en comparación con un blanco que es el medio esterilizado y sin sembrar. Cuanto mayor es el número de células en suspensión, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Para relacionar la transmitancia con la densidad bacteriana se requiere de hacer curvas patrón de densidades conocidas.

DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO POR CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Extracción del ADN en cada tiempo de muestreo. Determinación de la pureza del ADN por el cálculo de la relación de absorbancia a

260 nm y 280nm (A260/ A280). Valores obtenidos entre 1.8 y 2.0, indican que las muestras no contienen residuos

proteicos ni fenol.


La concentración del ADN extraído se determina por medio de la siguiente fórmula:

D.O.260 = 1 contiene 50 g de ADN de doble cadena por mililitro.

DETERMINACIÓN DE UN COMPONENTE CARACTERÍSTICO

peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, ATP, clorofilas en organismos fotosintéticos, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

MEDIDA DE CONSUMO DE NUTRIENTES O DE PRODUCCIÓN DE ALGÚN METABOLITO POR UNIDAD DE TIEMPO Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

MÉTODOS TURBIDIMÉTRICOS (ÓPTICOS).

Son muy usados en la práctica cotidiana del laboratorio. La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua (efecto Tyndall). La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

a) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia (una medida de la luz transmitida a través de la suspensión).

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (l) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >107céls/ml.

b) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.


Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad área de 1 mm2 , dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes cada cuadrado grande esta subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños o sea la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdilla (cuadrados pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido.

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión microbiana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 mm diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula).

Comentarios: hay que usar suspensiones absolutamente libres de partículas extrañas (las pequeñas serían contabilizadas erróneamente como bacterias, y las mayores pueden obturar el orificio del aparato).

Recuento de viables en placa: Los métodos de recuento de número de células que hemos visto hasta ahora (los directos) no distinguen entre células vivas y muertas. En muchos casos conviene contar las células vivas, y esto en laboratorio se suele hacer mediante el recuento de viables. (Una célula se define como viable cuando, colocada en un medio adecuado, es capaz de dividirse y dar descendencia). El método habitual de lograr esto es sembrar pequeñas alícuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio sólido (con agar). Cada célula viable dará origen a una colonia visible después del tiempo adecuado de incubación. Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilución de la que proceden y el volumen de alícuota utilizado, es fácil deducir el número de células viables en la suspensión original.


Recuento sobre filtros: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estériles (con un diámetro de poro que retiene las bacterias pero permite el tránsito de sustancias). Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las células retenidas. Dichas colonias se cuentan, deduciéndose la concentración original de viables en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.


BIBLIOGRAFÍA

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Magali Pedrique de Aulacio

Norma De Castro. Cátedra de Microbiología - Facultad de Farmacia UCV

Noviembre 2001, Revisión 2008.

http://www.microbiologia.com.ar/fisiologia/crecimiento.html


CONCLUSIONES

Finalmente se logro concluir la variada existencia de métodos para la evaluación de crecimiento de los microorganismos, cada uno con su incidencia directa o indirecta, al igual que sus finalidades, sus ventajas y desventajas y la pertinencia a la hora de evaluar uno o varios parámetros dentro del enorme campo del crecimiento microbiano. Es de relevancia destacar que el trabajo investigativo nos llevo al conocimiento y a la interiorización de cada uno de estos métodos a fondo lo que nos enriquece como profesionales y fortalece nuestras bases para el adecuado y excelente desarrollo de la materia en cuestión. Agradecemos por esto la oportunidad de llevar a cabo este trabajo puesto por el docente.

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