crecimiento microbiano-PARTE1

UNFV/FIIS Crecimiento Microbiano

MICROBIOLOGÍA I 1

UNIVERSIDAD NACIONAL FEDERICO VILLARREAL

FACULTAD: F.I.I.S. ESCUELA: ING. AGROINDUSTRIAL

MICROBIOLOGIA I

MÉTODOS DE ESTUDIO DEL CRECIMIENTO MICROBIANO 1ra. parte

1º DEFINICIONES

Una población microbiana es definida por dos parámetros que suelen referirse a

unidad de volumen de medio, la Densidad Microbiana o masa celular y la

Concentración Celular o número de células. El aumento de estos dos

parámetros constituye el fenómeno del crecimiento.

La Densidad microbiana y la concentración celular son parámetros esenciales

distintos a nivel celular, la masa aumenta de forma continua durante el

crecimiento, mientras que la multiplicación es un proceso discontinuo.

Cualquier factor cuya falta determina la interrupción del crecimiento recibe el

nombre de Factor Limitante. El crecimiento por lo tanto puede quedar limitado

por agotamiento de cualquiera de las fuentes tróficas esenciales (energía,

carbono, nitrógeno, sales minerales, o un factor de crecimiento en el caso

de organismos auxotrofos) o bien por un cambio en las condiciones físicas o

fisicoquímicas, por lo tanto en los estudios cuantitativos del crecimiento es

fundamental que se identifiquen con exactitud el factor limitante.

2º MEDIDA DE LA DENSIDAD MICROBIANA

La Densidad Microbiana expresada en peso seco de célula por unidad de

volumen debe determinarse en principio pesando los organismos desecados

hasta un peso constante a 100-110, aunque este método es exacto tiene el

inconveniente de ser largo y laborioso y de que hay que operar con masas

importantes de organismos.


MICROBIOLOGÍA I 2

Por ello en la práctica es preferible determinar la densidad microbiana por

métodos indirectos: valorando el nitrógeno proteico celular (microkjeldhal) o

midiendo la turbidez.

Las suspensiones microbianas cumplen cuantitativamente la Ley de Beer-

Lambert:

Densidad Óptica (d.o) = Log Io = Kdc I Donde:

Io: Intensidad del rayo luminoso incidente.

I : Rayo luminoso transmitido.

d: Distancia recorrida por la luz a través de la suspensión.

c: Densidad microbiana.

k: Constante

3º MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN CELULAR.

El número total de células puede determinarse con ayuda del microscopio

contando los organismos en un hemocitómetro o en una cámara de tomas,

método laborioso por la pequeñez de los microorganismos y sobre todo de las

bacterias, es necesario utilizar objetivos de gran aumento y por lo tanto de poca

profundidad de campo.

Existen dispositivos electrónicos de cuenta automática, estos permiten no solo

contar con rapidez las células sino además establecer una distribución estadística

de los tamaños en la población.

El método más utilizado es el cómputo mediante el cultivo en placas petri.

Utilizando medios selectivos es posible aplicar este método para contar un

determinado microorganismo en una población mixta. Estos métodos son el

empleo de colorantes vitales o colorantes no tóxicos que penetran solo en la

células vivas.


MICROBIOLOGÍA I 3

Otra técnica consiste en esparcir una muestra de la población bacteriana, diluida

en una capa de vidrio con un medio sólido extendido.

EXPRESIÓN Y ANÁLISIS MATEMÁTICO DEL CRECIMIENTO.

Una población cuya densidad microbiana o concentración celular inicial es X0

va creciendo por duplicaciones sucesivas del modo siguiente:

Después de una duplicación X1 = 2 X0

Después de dos duplicaciones X2 = 2.2 X0 = 2² X0

Después de n duplicaciones Xn = 2ⁿ X0

Sea r la tasa de crecimiento, la población se convierte en:

r T XT = 2 X0

Forma logarítmica de la ecuación anterior.

Log2 XT = rT

X0

Log2 XT – Log 2X0= r

T

Log 2 X = Log 10 X = 3322 Log 10 X

Log 10 2


MICROBIOLOGÍA I 4

Representación semilogaritmica del crecimiento.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBACTERIANO.

El crecimiento de una población bacteriana puede ser entendido desde diferentes

perspectivas y de acuerdo a éstas se puede llegar a determinar la medida del

crecimiento mediante diversas metodologías. Para algunos, el crecimiento es la

capacidad para multiplicarse que tiene las células individuales, esto es iniciar

y completar una división celular. De esta forma, se considera a los

microorganismos como partículas discretas y el crecimiento es entendido como un

aumento en el número total de partículas bacterianas. Existen dos formas para

determinar el número total de microorganismos en una muestra:

Recuento microscópico de partículas.

Recuento electrónico de partículas.


MICROBIOLOGÍA I 5

Para otros, el crecimiento implica el aumento de los microorganismos capaces

de formar colonias debido a que sólo se tiene en cuanta el número de

microorganismos viables, esto es, capaces de crecer indefinidamente.

Las determinaciones que se utilizan son:

Recuento de colonias.

Método del Número Más Probable.

Para los fisiólogos bacterianos, bioquímicos y biólogos moleculares una medida

del crecimiento es el incremento de biomasa. Para ellos, la síntesis

macromolecular y un incremento en la capacidad para la síntesis de los

componentes celulares es una medida del crecimiento. Para este grupo la división

celular es un proceso esencial pero menor que rara vez limita el crecimiento, ya

que lo que limita el crecimiento es la capacidad del sistema enzimático para

utilizar los recursos del medio y formar biomasa.

Determinación de peso húmedo

Determinación de peso seco

Determinación de nitrógeno

Determinación química de un ácido nucleico

Un último grupo entiende al crecimiento sobre la base de la influencia que ejercen

los microorganismos en los cambios químicos de su entorno como consecuencia

del incremento de la biomasa.


MICROBIOLOGÍA I 6

Recuentos Directos.

Recuento Microscópico: Es una técnica común, rápida y barata que utiliza un

equipamiento fácilmente disponible en un laboratorio de microbiología. Para estos

recuentos se utilizan generalmente Cámaras de Recuentos, aunque también

pueden realizarse a partir de muestras filtradas en membranas y

transparentizadas o teñidas con colorantes fluorescentes (naranja de

acridina). La mayor dificultad del recuento en cámara es obtener reproducibilidad

en el llenado de la cámara con líquido. Otra dificultad es la adsorción de las

células en las superficies del vidrio, incluyendo pipetas.

Esta adsorción es crítica en el proceso de dilución de la muestra y se minimiza al

realizar las diluciones en medios de alta fuerza iónica (solución fisiológica o

medios mínimos sin fuente de carbono).

Las cámaras más utilizadas son las de Hawksley y la Petroff-Hausser. La

primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersión,

aunque la mayoría de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Una de las mayores ventajas del recuento microscópico es brindar información

adicional sobre el tamaño y la morfología de los objetos contados.


MICROBIOLOGÍA I 7

Tipo de cuadro Área² (cm) Volumen (ml) Factor

(1/ Volumen)

Cuadrado Total -2

1.00 x 10 -5

2.00 x 10 4

5.00 x 10

Cuadrado Grande

-4

4.00 x 10 -7

8.00 x 10 6

1.25 x 10

Cuadrado Pequeño

-5

2.50 x 10 -8

5.00 x 10 7

2.00 x 10

Número total de microorganismos = Bacterias contadas. 1 ml ______________________Dilución_________

Número de cuadrados. Volumen del cuadrado

1/ Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento.

Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se

utilizaron para contar el número de bacterias.

Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la Cámara. Depende del

tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento.

-8 Por ejemplo, cada pequeño tiene un volumen de 5 x 10 ml 4 3 -8 (50 μm x 50 μm x 20 μm = 5 x 10 μm = 5 x 10 ml).


MICROBIOLOGÍA I 8

Recuento Electrónico:

Los contadores electrónicos permiten realizar recuentos de bacterias,

levaduras no filamentosas y protozoarios, pero no de hongos y

microorganismos filamentosos o miceliares. Estos instrumentos constan

básicamente de dos compartimientos comunicados a través de un pequeño

conducto. En ambos compartimientos hay electrodos que miden la resistencia

eléctrica del sistema, y como el orificio del conducto es muy pequeño y su

resistencia es muy alta, la resistencia eléctrica de cada compartimiento es

independiente. El principio de funcionamiento de estos instrumentos es el que se

explica a continuación. Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzado

a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un

muy breve intervalo de tiempo.

Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartiendo, la resistencia de éste

se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del

medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y

contados. Este tipo de recuento presenta algunos inconvenientes. Ciertas

bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son

comparables al “ruido” generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el

fluido por el orificio. No pueden medirse células que formen filamentos o

agregados o soluciones muy concentradas de microorganismos, debido a que el

pasaje de más de una célula en un breve periodo de tiempo va ser tomado como

una célula más grande. Es común la obstrucción del orificio por microorganismos

muy grandes.

MEDIDA DE LA BIOMASA.

La medida de la masa de los constituyentes de la célula bacteriana es utilizada

frecuentemente como base para la medida de una actividad metabólica, o de

un constituyente metabólico o químico. Algunos de los métodos para cuantificar la

biomasa son obvios y confiables, pero pueden volverse complicados si se busca

la exactitud.


MICROBIOLOGÍA I 9

PESO HÚMEDO

Se obtiene a partir de una muestra en suspensión que es pesada luego de la

separación de las células por filtración o centrifugación. Es una técnica útil

para grandes volúmenes de muestra. La principal desventaja es que el

diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la

masa. La cantidad de líquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un

pellet de células bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio

intercelular que aporta entre 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformación

celular.

Para corregir el peso húmedo se determina la cantidad de líquido que queda

retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugación, para ello se

utilizan soluciones de polímeros no iónicos (como el Dextrano) que pueden

ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes

bacterianas.

PESO SECO

El peso seco (contenido de sólidos) de las células bacterianas que se encuentran

en una suspensión se obtiene por el secado de un volumen en un horno a 105ºC

hasta peso constante. Esta técnica es útil para grandes volúmenes de

muestra, debido a que diferencias del orden de los miligramos representan el

peso de un gran número de bacterias.

La desventaja de éste método es que componentes volátiles de la célula pueden

perderse por el secado y puede existir alguna degradación. También la muestra

seca puede recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente

tiene una humedad relativa alta.


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DETERMINACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Es una técnica que permite determinar indirectamente la masa de una población

bacteriana. Se determina la cantidad existente de un determinado ácido nucleico

(generalmente DNA) y a partir de este dato se estima la masa de la población.

DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO


bacteriana. Existen distintas técnicas para determinar la cantidad de nitrógeno

que contiene una muestra en relación al compuesto que se quiera determinar.

Puede analizarse el nitrógeno no proteico mediante el NO2-, NO3-, NH4+, el

nitrógeno proteico mediante absorción en UV. Reacción de Biuret, Reacción

de Lowry, o el nitrógeno total mediante la digestión de Kjeldahl.

INCORPORACIÓN DE PRECURSORES RADIACTIVOS


bacteriana. En esta técnica se adiciona al medio un compuesto marcado

radiactivamente que puede ser incorporado a la célula, y luego se determina la

cantidad de marca incorporada por toda la población.

DISPERSIÓN DE LA LUZ

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partícula en suspensión,

parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es

transmitida. La Nefelometría mide la luz dispersada por una solución de

partículas. La Turbidimetría mide la luz como un decrecimiento de la luz

transmitida a través de la solución. En relación a la longitud de onda y al tamaño


MICROBIOLOGÍA I 11

de la partícula pueden existir tres tipos de dispersión. Los métodos de dispersión

de la luz son las técnicas más utilizadas para monitorear el crecimiento de los

cultivos bacterianos. Son muy útiles y poderosos pero pueden llevar a resultados

erróneos. Principalmente, dan información sobre el peso seco (contenido

macromolecular).

TURBIDIMETRIA.

La turbidimetria mide la reducción de la transmisión de luz debido a

partículas de una suspensión y cuantifica la luz residual transmitida.

Estudios teóricos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de

diferentes tipos de bacterias independientemente del tamaño celular, tienen casi

la misma absorbancia por unidad de concentración de peso seco.

Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente

proporcional al peso seco, independientemente del tamaño celular del

microorganismo. Sin embrago, se encuentran absorbancias muy diferentes por

partícula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaños de las

células bacterianas son diferentes. Por esta razón, para estimar el número de

microorganismos totales o el número de microorganismos viables de una

suspensión bacteriana debe realizarse la “curva de calibración” con cada tipo

de microorganismo, sólo de esta forma es posible relacionar Absorbancia

(Densidad Óptica) con el número de microorganismo totales o con UFC.


MICROBIOLOGÍA I 12

K: Constante que varía con la longitud de onda utilizada y representa la

inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10

veces en el valor de la absorbancia (1/ Wo).

Peso seco: Concentración celular bacteriana expresada en unidades de peso

seco (μg/ml-mg/ml).

La relación directa entre la absorbancia y el peso seco sólo se aplica para

suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una

absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la

Ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas

puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por bajo nivel de

absorción.


MICROBIOLOGÍA I 13

Número de Microorganismos Totales

En estos gráficos se puede apreciar que suspensiones diluidas de dos

microorganismos diferentes con igual peso seco tienen la misma

absorbancia, mientras que para el mismo número de microorganismos

totales la absorbancia de cada suspensión es distinta.


MICROBIOLOGÍA I 14

CÁLCULO DEL TIEMPO DE GENERACIÓN

Tiempo de generación (G) es el tiempo requerido para que una célula se divida

o una población se duplique.

G = t n

Si partimos de una célula al cabo de una generación habrá duplicado su número y

así sucesivamente en cada generación. Como se puede comprobar el crecimiento

se produce en progresión geométrica:

1

1 generación → 2 células = 2 2 2 generación→ 4 células = 2

3

3 generación → 8 células = 2 4

4 generación → 16 células = 2 5

5 generación → 32 células = 2

Si partimos de N células (en microbiología los estudios se realizan con

poblaciones), a un tiempo determinado (Ta) tenemos un número de células

determinadas (Na).

En la primera generación se duplicará el número de células (2Na) y asi

sucesivamente de tal manera que al cabo de un tiempo determinado Tb el número

de células determinadas será Nb (Nb= 2n Na) donde n es el número de

generaciones transcurridas desde Ta hasta Tb. En esta fórmula (Nb = 2n Na)

conocemos todos los parámetros excepto el número n de generaciones

transcurridas por lo que aplicando logaritmos será posible calcularlo.

Una vez obtenido el número de generaciones n transcurridas en un tiempo t

podremos calcular el tiempo de generación G para ese microorganismo.


MICROBIOLOGÍA I 15

Ta→ Na 1

1 generación → 2 Na = 2 Na 2




5 generación → 32 Na = 2 Na

ⁿ n generaciones (Tb) → Nb = 2 Na

ⁿ

Nb = 2 Na

Lg Nb= n lg 2 + lg Na

n = lg Nb – lg Na lg2 n= lg Nb/ Na lg2

n= 3.3 lg Nb Na

G= _____ t____ 3.3 lg Nb/ Na

El tiempo de generación de la levadura Saccharomyces cerevisiae es de 90

minutos y el de la bacteria Escherichia coli es de 20 minutos. Esta bacteria tiene

un crecimiento muy rápido de tal manera que a partir de de una sola célula se

obtienen al cabo de 8 horas (8 x 60 = 480 minutos; 480:20 = 24 generaciones;

224 = 2 x 106 células) 2 millones de células.

Esta misma bacteria al cabo de dos días se habría multiplicado hasta 2.2 x 1043

células. Una bacteria pesa aproximadamente 10-15 – 10-11 gramos, por lo que el

peso de todas esta células es de aproximadamente 2.2 x 1030 gramos que

equivalen a 8 veces el peso de la tierra.


MICROBIOLOGÍA I 16

CRECIMIENTO EN UN MEDIO NO RENOVADO

1º FASE DEL CRECIMIENTO La grafica representa coordenadas ordinarias y semilogarítmica. La evolución de

la densidad microbiana en función del tiempo en un cultivo usual en el que el

crecimiento se inicia poco después de la siembra y cesa cuando el medio se

agota, estas curvas constan de varias fases caracterizadas por el comportamiento

de la tasa de crecimiento:

1. Fase de latencia en la que la tasa de crecimiento es nula (r = 0).

2. Fase de crecimiento acelerado durante la cual la tasa de crecimiento

aumenta (r ).

3. Fase exponencial en la que la tasa de crecimiento es constante y máxima

(r = cte).

4. Fase de c. retardado durante la cual la tasa de c. disminuye (r ).

5. Fase estacionaria en la que la tasa de e. es nula (r = 0).

6. Fase de declive en la que la tasa de e. es negativa (r < 0).

Curva de crecimiento en medio no renovado.


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2º FASE DE LATENCIA Y FASE DE CRECIMIENTO ACELERADO.

El tiempo de latencia (Ti es el retraso del crecimiento real respecto al

crecimiento “ideal”), es decir, el crecimiento que habría observado de Tt se

determina gráficamente las curvas de crecimiento Semilogaritmicas midiendo el

tiempo que media entre la fase exponencial observada y la recta paralela que

pasa por el origen.

La latencia se puede expresar también cuantitativamente determinado, por el

método grafico que se indica en la figura de crecimiento real y el crecimiento

ideal (Monod, 1949).

Las fases de latencia y de aceleración pueden faltar, y, cuando existen, se

pueden a la edad del inoculo o bien a una adaptación enzimática.

Fig. 82. Determinación gráfica de la latencia.

Los valores logarítmicos de las densidades microbianas llevados a ordenadas corresponden al

inóculo total (Xt), a la fracción viable del inoculo (Xv), a la población que se habría obtenido ene.

Mismo intervalo de tiempo en un crecimiento “ideal”, es decir, sino hubiese habido latencia (X1). L

representa la diferencia del número de divisiones entre el crecimiento ideal y el real T1, es el

tiempo de latencia.


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a) Edad del inóculo.

La latencia que se observa cuando se siembra un medio nuevo con organismos

procedentes de un medio de composición idéntica es tanto mas prologada cuando

mas “viejo” sea el cultivo de donde procede el inóculo, es decir cuado mayor sea

el tiempo transcurrido desde que dicho cultivo dejó de crecer.

Esta influencia de la edad del inóculo se explica por dos motivos, por un lado, las

fases de latencia y de aceleración expresan el tiempo necesario para reparar y

reconstruir sistemas enzimáticos que han experimentado una alteración

progresiva durante el tiempo que los microorganismos han permanecido sin

multiplicarse. Se ha demostrado que durante la fase estacionaria del

crecimiento disminuye el número de ribosomas.

Por otra parte, un inóculo (xt) procedente de un cultivo viejo contiene a veces

una cantidad muy grande de células no viables de tal forma que aún cuando las

células visibles (Xr) empiecen inmediatamente ha desarrollarse

exponencialmente (fig.82), su proliferación pasaría inadvertida y no se reflejaría

en la curva experimental hasta después de varias divisiones.

b) Adaptación enzimática.

Las causas de la latencia que acaba de describirse se eliminan utilizando un

inóculo procedente de un cultivo en fase exponencial. En este caso los

organismos transferidos a un medio nuevo de la misma composición reanudan en

seguida su crecimiento exponencial. Pero si el inoculo procede de un medio de

distancia composición, se puede observar una fase de latencia (fig.) que en este

se debe a una adaptación enzimática, es decir, a la síntesis de una o mas

enzimas necesarias para que las bacterias metabolizen el nuevo sustrato.


MICROBIOLOGÍA I 19

Fig. 83 Adaptación enzimática y Fase de latencia. (Según J. Monod. Am. Rev. Microbiol.

3, 371, 1949).

Crecimiento de Escheriachia coli en medios sintéticos sembrados con un precultivo en

crecimiento exponencial sobre arabinosa. El subcultivo sobre glucosa empieza inmediatamente,

mientras que sobre xilosa presenta un tiempo de latencia (T1) de unas dos horas y media.

3. FASE EXPONENCIAL

Durante esta fase, que en coordenadas semilogarítmicas esta representada por

una recta, todas las células se dividen con una tasa de crecimiento constante

y máxima (Rmáx), y la taza de de mortalidad es nula, y por tanto la

concentración celular total es igual a la concentración de células viables.

Conviene señalar que, en determinadas condiciones particulares, las bacterias

pueden no desarrollarse de modo exponencial, sino de forma lineal. Crecimientos

lineales prolongados se observan, sobre todo cuando se cultiva un organismo en


MICROBIOLOGÍA I 20

presencia de análogos estructurales de aminoácidos, como la p-

Fluorofeilalanina o la B-Tielalanina (Fig. 84).

También se han observado crecimiento lineales en mutantes que presentan un

bloqueo parcial de las síntesis de un aminoácido usual, como un mutante

estreptomicin dependientes de Bacillus subtilis en ausencia de estreptocina.

Estos crecimientos lineales se atribuyen (Monod 1949) a que el desarrollo esta

limitado por una enzima cuya biosíntesis esta inhibida específicamente, y por

tanto, su actividad permanece constante.

Fig. 84. Crecimientos lineales de Escheriachia coli, en presencia de análogos estructurales

de aminoácidos (G.N . Cohen y R. Munier, Biophys. Biochen. Acta, 31, 347, 1959.)

Cultivos en crecimiento exponencial sobre maltosa (0.2 por 100). En el tiempo cero se añade en

(A) DL-para-fluorofenilalanina (5.10 -4 M) y en (B) DL, b-2 fenilalanina (10 -3 M). Las curvas de

crecimiento exponencial de los cultivos testigo están trazadas con líneas punteadas.

En A. aerogenes, la velocidad de crecimiento disminuye por encima de los 37º C

y se anula a los 42ºC. Dentro de esta gama de temperaturas , que varia de unas

bacterias a otras , la parte pendiente de la recta que representa el logaritmo de r

en función de 1/T indica la existencia de un proceso que tiene una elevada de

activación y que al parecer consiste en la alteración térmica de una

macromolécula (proteína o ácido nucleico).


MICROBIOLOGÍA I 21

La disminución de la tasa de crecimiento por encima de la temperatura óptima va

acompañada de un descenso de un rendimiento ponderal, mientras que este

rendimiento permanece constante en toda la zona de temperaturas en las que se

cumple la ley de Arrhenius.

4. FASE DE CRECIMIENTO RETARDADO

Esta fase se explica por lo dicho al tratar de la influencia de la concentración del

factor limitante sobre la velocidad del crecimiento .Corresponde al periodo en que

el factor limitante esta a punto de agotarse, y su concentración es inferior a la

necesaria para que r sea máxima.

5. FASE ESTACIONARIA

Rendimiento ponderal y molecular del crecimiento. Cuando el factor

limitante se ha agotado, el crecimiento se retiene (r = 0) y la población

permanece estacionaria durante varias horas, hasta que se inicia la fase de

declive. La diferencia entre población inicial del medio recién sembrado y la

población final (X-X0) es el crecimiento total (G).

Varios hechos indican que las enzimas que interviene en la degradación de

proteínas y la ARN (Ribonucleosa) preexisten durante el Crecimiento

Exponencial y que probablemente están localizadas en los ribosomas.

El hecho que durante la fase estacionaria halla una constante degradación y

resíntesis de proteínas, sin que apenas variara su masa total, es de gran

importancia para el estudio de la diferenciación celular, y más concretamente para

la biosíntesis inducida de enzimas adaptativas en organismos no proliferantes.


MICROBIOLOGÍA I 22

Fig. 89 Renovación de proteínas en Escheriachia coli, en crecimiento exponencial (A) y en

suspensión no proliferante (B). (Según J. M Mandelstam, Bact. Revs, 24, 289, 1960).

La degradación de las proteínas se mide por la liberación de leucina – C 14 a partir de células

marcadas con este aminoácido radiactivo. En trazo punteado: logaritmo de la densidad óptica

(curvas de crecimiento). Obsérvese que, en el caso de células en crecimiento, casi toda la

degradación de las proteínas precede a la fase exponencial.

6. FASE DE DECLIVE

Después de un cierto tiempo, que varía según los microorganismos y las

condiciones de cultivo, comienza la fase de declive, durante la población decreta

(r<0). Esta fase se caracteriza por dos fenómenos:

1) La mortalidad, que era nula durante el crecimiento exponencial, se manifiesta,

con que disminuye el número de organismos viables;

2) La densidad microbiana decrece por autólisis de las células provocadas por

enzimas proteolíticas endógenas. De estos dos fenómenos, el primero

comienza antes y es mucho más rápido.

En estos últimos años, la supervivencia de bacterias no proliferantes ha sido

objeto de estudios (Strange, 1961; Posgate y Honter, 1962), que se han


MICROBIOLOGÍA I 23

realizado principalmente con Aerobacter aerogenes y otras bacterias Gram-

negativas. La curva de supervivencia se había considerado siempre como una

curva exponencial que tendía sintomáticamente a cero. Sin embargo, los citados

autores han observado que en diversas condiciones, y en especial cuando el

factor limitante es el sustrato de carbonado, la curva de supervivencia es lineal

al principio, hasta que se ha muerto 70-80 % de los organismos, y solo después

se hace exponencial.

La pérdida de viabilidad se acompaña de la liberación de sustancias procedentes

de la degradación de los ácidos nucleicos (Pentosas, fosfato, bases

nitrogenadas) y la de las proteínas (amoniaco, cetoácidos), que quedan en el

medio extracelular al alcance de los supervivientes, con lo que se produce el

fenómeno de crecimiento cítrico o de canibalismo Ryan (1955). La

duplicación de un individuo superviviente corresponde a la utilización de

sustancias procedentes de 50 individuos muertos (Postgate y Honter, 1962).

La muerte en las bacterias se acelera en presencia de un sustrato energético

(glicerol, glucosa), lo que indica que el funcionamiento de las enzimas

metabólicas aumenta la habilidad de las células. En cambio la muerte se retrasa

en presencia de iones de Mg++ o cuando la concentración celular es muy

elevada.

La existencia de crecimiento energéticamente desacoplados demuestra que las

bacterias carecen de sistemas de regularización que permitan ajustar la velocidad

de la producción de la energía es función de su utilización.


MICROBIOLOGÍA I 24

CRECIMIENTO CONTINUO

1. FUNDAMENTOS:

La teoría del crecimiento microbiano continuo en medio renovado fue establecida

por Monod (1959) y Sizilar (1950).

Fig. 92. Efecto de la adición de fosfato sobre la actividad catabólica de un cultivo bacteriano

(Zymomonas mobilis) limitado por el fosfato. (J.C Senez y J.P Belaich, les mecanismes de

régulation des activiés cellulaires chez les microorganismes, pág. 357, CNRS, 1965.)

Experiencia realizada en un microcalorímetro diferencial de Tian-Calvet. Ordenadas: velocidad de

producción de calor (dQ/dt) a partir del sustrato energético (glucosa). Abscisa: tiempo. La curva

muestra que el desarrollo exponencial del cultivo se detiene al agotarse el fosfato. La adición de

un exceso de fosfato (0.5 mg/ml) provoca la reanudación inmediata de la actividad catabólica, a

una tasa superior, y esta diferencia permite calcular el control ejercido por la carencia de fosfato

(21 por 100). El crecimiento continua entonces hasta el agotamiento de la glucosa.


MICROBIOLOGÍA I 25

Monod ha demostrado que este valor es directa y linealmente proporcional

(fig.88) a la concentración inicial (C) del factor limitante

G= KC

Esta relación permite conocer de modo que experimentalmente la naturaleza del

factor limitante.

La constante K (K=G/C), expresada en gramos (peso seco) de bacterias

producidas por gramos de sustrato metabolizado, en el rendimiento ponderal del

crecimiento. Esta magnitud representa la asimilabilidad del sustrato por el

organismo considerado.

El rendimiento molecular se representa por la letra Y seguida de la

indicación del sustrato (Y a para la glucosa, Y gal para la galactosa, etc.). Es

evidente que Y es igual al producto de K por el peso molecular del sustrato.

2. RENOVACIÓN DE PROTEÍNAS Y DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

La interrupción del crecimiento lleva consigo un profundo reajuste de la estructura

celular y especialmente de una rápida renovación (turnover) de las proteínas y

del ARN (Mandelstam, 1960).

Esta renovación se ha demostrado y medido de forma experimental en bacterias (

E. coli y A. aerogenes) previamente cultivadas en presencia de la leucina – C 14

y de ortofosfato – P 32 , a fin de marcar radiactivamente las proteínas y los

ácidos nucleicos, y después resembrar en medios que contienen cantidades

relativamente elevadas de leucina y fosfato fríos. La cinética de la degradación

de las proteínas y de los ácidos nucleicos viene determinada por la velocidad

con que aparece la radiactividad en la leucina y el fosfato libre extracelulares.


MICROBIOLOGÍA I 26

RESUMEN DE LOS PARAMETROS Y CONSTANTES DEL CRECIMIENTO

Densidad microbiana: Masa (peso seco) de células por unidad de volumen.

Esta magnitud se suele determinar por nefelometría (densidad óptica).

Concentración Celular: Número de células por unidad de volumen. Esta

magnitud se mide casi siempre por cómputo de bacterias visible.

Factor Limitante: El componente del medio del cultivo o la condición Físico-

Química que limita el crecimiento.

Tasa Horaria de Crecimiento (r): Número de divisiones por hora.

Tasa Máxima de Crecimiento Exponencial (r máx.): Tasa de crecimiento

independiente de la concentración del factor limitante. Esta tasa de crecimiento es

la que se observa durante la fase exponencial de los cultivos en medio no

renovado.

Tiempo Medio de división o de Generación (tg), inversa de la tasa de

crecimiento (tg=1/r).

Crecimiento Total (G): Peso seco de las células producidas en un cultivo. Esta

masa que se suele expresar en g/ml, población final alcanzada al agotarse el

medio.

Rendimiento Ponderal (K): Crecimiento total por unidad de masa (g) de

sustrato metabolizado.

Rendimiento Molecular (Y): Crecimiento total por molécula/gramo de sustrato

metabolizado.

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