MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES

Mg. Q.F. Nesquen José Tasayco Yataco

OBJETIVOS:- Determinar los efectos que los diferentes constituyentes de la

planta pueden provocar en el organismo.

- Establecer cual de los principios activos de la planta es responsable del efecto.

- Explicar por diferentes métodos que se pueden implementar, el modo de acción, especificidad de sus efectos en el organismo intacto o en los diferentes órganos y tejidos.

MODELOS EXPERIMENTALES PARA LA EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA DE PRODUCTOS NATURALES

MODELOS DE ESTUDIOS EN LOS ANIMALESESTUDIOS PRECLÍNICOS

• Las pruebas de actividad farmacológica de un producto que quiere usarse para consumo humano, debe estudiarse en por lo menos 5 especies de animales diferentes.

• Los animales que se prefieren son los mamíferos como mono, perro, gato, conejo, cuy, rata, ratón.

Extracto total del Producto Vegetal

Principio Activoaislado

Determinación de laEstructura Química

ESTUDIO DE ACTIVIDAD FARMACOLÓGICA

Estudios de Toxicidad

ESTUDIOS DE FARMACODINAMIA

MODELO FARMACOLÓGICO

Animal SanoAnimal Enfermo

provocado artificialmente

En el animal Intacto o en órganos aislados

Modelos farmacológicos en animales enfermos provocados artificialmente

ETIOPATOGENIA DE LA ULCERA PÉPTICA

Helicobacter pylori AINES

ALTERACION DE MECANISMOS DEFENSIVOS DE LABARRERA MUCOSAGASTRODUODENAL

OTROS FACTORES ALCOHOLDIETATABACOESTRÉS

FACTORES DE AGRESIÓNACIDO Y PEPSINA

ULCERA

LESIONES GÁSTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000)

Grupos Tratamientos Nº Ratas

(150 – 200 g)

Días de tratamiento

Inducción de lesión gástrica

1 Agua 10 5 Si

2 Sucralfato 200 mg/mL

10 5 Si

3 Sustancia de prueba

10 5 Si

LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ESTRÉS POR INMOVILIZACIÓN EN FRÍO (Apecechea y col; 2000)

4º día de tratamiento: Inmovilizar a las ratas y colocarlo en un refrigerador a una temperatura entre 5 y 10 ºC durante 2 horas.

5º día de tratamiento: Repetir la operación. Inmediatamente después las ratas son sacrificadas.

Abrir los estómagos a lo largo de la curvatura mayor, lavar con solución salina fisiológica y fijar en placas para su inspección microscópica.

Determinar el índice de área dañada (Sumatoria del área en milímetros cuadrados de las lesiones producidas en cada estómago).

Determinar el % de Inhibición en la formación de lesiones.

% Inhibición = 100 – tratados x 100 Controles

LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979)

Grupos Tratamientos Nº Ratas

Peso Adaptación Inducción de lesiones gástricas

Administración de

Etanol 96 %

1 SSF 1 mL/100g 9

180 – 200g 7 días 20 – 22 ºC

NO SSF

2 SSF 1 mL/100g 9 SI

10 mL/kg V.O.

3 Ranitidina 100 mg/kg 9 SI

4 Sustancia de prueba 1 9 Si

5 Sustancia de prueba 2 9 SI

6 Sustancia de prueba 3 9 SI

Total 54

LESIONES GÁTRICAS INDUCIDAS POR ETANOL (Robert et al; 1979)

- Hora cero: Administrar los tratamientos.

- Hora uno: Administrar 1 mL de etanol a los grupos del 2 al 6. Al grupo 1 administrar SSF 1 mL.

- Hora dos: Anestesiar a las ratas con vapores de éter dietílico, luego sacrificar.

- Extraer los estómagos, abrir por la curvatura mayor y fijar sobre una placa porosa con alfileres para su evaluación microscópica.

- Conservar en formol al 10% para su estudio histopatológico con tinción hematoxilina-eosina.

Los resultados de la observación macroscópica es expresado en % de inhibición de las lesiones gástricas.

% Inhibición de lesiones gástricas = (ILGc – ILGt) x100

ILGc

ILGc = Inhibición de lesiones gástricas del grupo control

ILGt = Inhibición de lesiones gástricas de los grupos con tratamiento

Grupo 1: Se observa la conservaciónDe la citoarquitectura del tejido gástrico

Grupo 2: Se observa descamación de las células epiteliales, células Inflamatorias en región mucosa y evidente zonas erosivas.

Escala para calificar el grado y aspecto de la mucosa

GRADO ASPECTO DE LA MUCOSA

0 Normal

LEVE Ligero edema y congestión

MODERADO Regular edema, congestión y sangrado

SEVERO Puntos de erosión, con edema, congestión y sangrado

MUY SEVERO Marcadas erosiones, pequeñas o amplias y extensas, o úlceras.

Medida del índice de lesión gástrica

Pérdida de mucosa, decolaración de mucosa, edema y hemorragia 1 punto

Menos de 10 petequias 2 puntos

Más de 10 petequias 3 puntos

Úlceras de menos de 1 mm 2 puntos

Úlceras de más de 1 mm 3 puntos

Úlceras perforadas 4 puntos

La sumatoria se expresa como índice de lesión gástrica y se expresa en Porcentaje de inhibición.

Calificación del grado de úlcera gástrica

Índice ulceroso 0 Normal

Índice ulceroso Menor a 10 Leve

Índice ulceroso 10 – 20 Moderado

Índice ulceroso 20 – 30 Severo

Índice ulceroso Mayor a 30 Muy severo

PRUEBA PARA MECANISMOS ANTI - ULCEROGÉNICOSPRUEBA PARA MECANISMOS ANTI - ULCEROGÉNICOS

DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINASDETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS(Curtis et al. 1995)(Curtis et al. 1995)

Las ratas son deprivadas de alimentos 24 h antes del experimento.Las ratas son deprivadas de alimentos 24 h antes del experimento.

Grupo 1:Grupo 1: Twen 80 al 12 % (control, administración oral) Twen 80 al 12 % (control, administración oral)

Grupo 2:Grupo 2: Indometacina 20mg/kg (administración sub cutánea) Indometacina 20mg/kg (administración sub cutánea)

Grupo 3:Grupo 3: Sustancia de prueba (administración oral) Sustancia de prueba (administración oral)

Los animales son sacrificados 30 min. Después del tratamiento y el Los animales son sacrificados 30 min. Después del tratamiento y el abdomen es abierto.abdomen es abierto.

DETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINASDETERMINACIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROSTAGLANDINAS(Curtis et al. 1995)(Curtis et al. 1995)

Una muestra del cuerpo del estómago (grosor completo) es Una muestra del cuerpo del estómago (grosor completo) es cortada, pesada y suspendida en buffer citrato sódico (10 mM, cortada, pesada y suspendida en buffer citrato sódico (10 mM, pH 7.4; 1 ml).pH 7.4; 1 ml).

El tejido es finamente desmenuzado con tijeras e incubado a 37 El tejido es finamente desmenuzado con tijeras e incubado a 37 ºC por 20 min. ºC por 20 min.

Las prostaglandinas E2 (PGE2) en el buffer es medido por Las prostaglandinas E2 (PGE2) en el buffer es medido por inmunoensayo enzimático. La densidad óptica se lee a 450 nm. inmunoensayo enzimático. La densidad óptica se lee a 450 nm.

ACTIVIDAD ANTIDIARREICAMODELO DE DIARREA INDUCIDA CON ACEITE DE RICINO (Edwin E, et al; 1997)

Grupos Tratamiento Nº Ratas

1 hora después

Aceite de ricino

Medición

Durante 5 horas

1 Carboximetilcelulosa 1% 6 1 mL Material fecal

2 Loperamida 3mg/kg 6 1 mL Material fecal

3 Sustancia de prueba 6 1 mL Material fecal

Total 18

MODELO ANIMAL DE RESISTENCIA FÍSICA

Grupo control Grupo tratado

Agua Extracto acuoso

30 días de tratamiento por vía oral

Prueba de nado forzado

Registrar tiempo de resistencia de cada animalSacrificar luego de 5 minutos post ejercicio

Medición de actividad enzimática

Superóxido Dismutasa (SOD)

Lactato Deshidrogenasa (LDH)

Catalasa

ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DEL ACIDO ACÉTICO

ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g

FUNDAMENTO: Inducir contorsiones abdominales en el ratónMediante la inyección de AcH 1% V/V i.p.

PROCEDIMIENTO: Cinco minutos después de la administraciónDe AcH contar el número de contorsiones en todos los

Animales durante 20 minutos.

Grupo Dosis (mg/kg) Nº de contorsiones

% Inhibición

Control ____ 50.67 ____

Indometacina 10 12.60 74.93

Extracto 1 250 40.00 21.06

Extracto 2 500 32.08 36.69

ACTIVIDAD ANTINOCICEPTIVA: TEST DE LA FORMALINA

ANIMALES: Ratones machos con peso entre 23-30g

FUNDAMENTO: Fase 1: Indicativa de dolor neurogénico (primeros 5 minutos)

Fase 2: Indicativa de dolor inflamatorio (15 a 30 min. DespuésDe la administración de formalina)

Evaluación de las fases: Se mide el tiempoAcumulado en segundos durante el cual el animal se lame la pata

PROCEDIMIENTO: Se estímulo doloroso se induce por laInyección de 20 ul de formalina al 2.5% en la pata trasera

Izquierda del ratón.

ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIATEST DEL EDEMA DE PATA EN RATA INDUCIDO POR CARRAGANINA

ANIMALES: Ratas hembras con un peso entre 180 y 200g

PROCEMIENTOS: El edema se induce inyectando 0.1 mL deCarragenina al 1% en SSF en la almohadilla plantar de la

Pata trasera derecha.La inflamación se cuantifica midiendo el volumen de las patas

Utilizando un Pletismómetro a las 0, 1, 3 y 4 después de laInyección de carragenina.

La diferencia entre el volumen de la pata izquierda y el de la Derecha es indicativa del grado de inflamación.

MODELO DE INFLACIÓN INTESTINAL CRÓNICA INDUCIDA POR INDOMETACINA (Sartor et al; 1992)

ANIMAL: Ratas machos de 250g, ambientados 5 días antes del experimento.

PROCEDIMIENTO: Administrar dos veces indometacina vía s.c. 7.5 mg/kg cada 24 horas

Los tratamientos se administran por 6 días vía oral.Después de 7 días de la administración de la primeraInyección de indometacina, las ratas son sacrificadas

Se extrae el yeyuno, se lava con SSF y se fija en formolAl 10 % para estudio histopatológico.

Corte histológico del Epitelio intestinal normal

Corte histológico del Epitelio intestinal destruido.La ulceración alcanza la Capa muscular

Intestino delgado luegoDe la administración de los tratamientos

Modelos farmacológicos en animales sanos

MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES

Grupos Tratamientos Nº Ratas

Sexo Peso

Ratas

Edad

Ratas

Días de

ambientación

1 Control SSF 5 mL/kg

48 24 machos

24 hembras

180 a 200 g

2 meses

7

2 Dosis sustancia de prueba

48 24 machos

24 hembras

180 a 200 g

2 meses

7

MODELO DE ESTUDIO PARA EVALUAR LA FERTILIDAD EN RATAS NORMALES

Grupos Tratamiento Sub grupos Criterios de medición

1 SSF 5 mL/kg 6 machos Testosterona

6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona

6 machos y 6 hembras Fecundación o gravidez

2 Sustancia de prueba

6 machos Testosterona

6 hembras LH, FSH, estrógeno y progesterona

6 machos y 6 hembras Fecundación o gravidez

Total 48 ratas

Gravidez en ratas controles Gravidez en ratas tratadas

Método de evaluación del sistema reproductorMétodo de evaluación del sistema reproductorEfecto sobre la función sexualEfecto sobre la función sexual

Evaluación del apareamiento por 1 díaEvaluación del apareamiento por 1 día

Material Biológico:Material Biológico: Ratones machos y hembra 23 - 25 g Ratones machos y hembra 23 - 25 g

Material Farmacológico:Material Farmacológico: Sustancias de prueba Sustancias de prueba Estradiol benzoatoEstradiol benzoato ProgesteronaProgesterona

Procedimiento:Procedimiento: Evaluación sobre el apareamiento por un día Evaluación sobre el apareamiento por un día

Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un díaProcedimiento: Evaluación de apareamiento por un día

NN TratamientosTratamientos Vía administraciónVía administración

G 1G 1

G 2 G 2

Control (n = 10)Control (n = 10)

Sustancia de prueba (n = 10)Sustancia de prueba (n = 10)

OralOral

OralOral

Procedimiento: Evaluación de apareamiento por un díaProcedimiento: Evaluación de apareamiento por un día

1.1. Cada ratón macho es colocado en jaula separadaCada ratón macho es colocado en jaula separada

2.2. Después de una hora se admiten 5 ratones hembras a cada machoDespués de una hora se admiten 5 ratones hembras a cada macho

3.3. Cada Cada ratón hembraratón hembra es expuesto en es expuesto en estro estro con dosis única s.c. de benzoato con dosis única s.c. de benzoato estradiol y progesteronaestradiol y progesterona

4.4. Observación:Observación: La mañana siguiente se examina una muestra vaginal bajo un La mañana siguiente se examina una muestra vaginal bajo un microscopio para la presencia de espermamicroscopio para la presencia de esperma

5.5. Registrar:Registrar: El número de hembras positivo para esperma en cada jaula. El número de hembras positivo para esperma en cada jaula.

6.6. CalcularCalcular el promedio de hembras Espermas – positivo para el grupo control el promedio de hembras Espermas – positivo para el grupo control y esperimental y esperimental

MODELO DE ESTUDIO DE TOXICIDAD SUB AGUDO

Grupo Control Grupo Tratado

30 días de tratamiento

Muestras de sangreInicio, 15 y 30 días de tratamiento

Día 30, las ratas son sacrificadas

Estudios de perfil bioquímicoGlucosa, Triglicéridos

LDL-Colesterol, HDL-ColesterolColesterol total

Proteínas totalesAlbúmina, TGO, TGP

Estudios HematológicosHemoglobinaHematocrito

Estudios AnatomopatológicosHígado, corazón

Páncreas, estómagoRiñones

Actividad hipoglucemiante del extracto hidroalcohólico de las hojas del Smallanthus sonchifolius (Yacón) en ratas con diabetes

mellitus tipo 1 y 2

1.- Material Biológico: Ratas albinas cepa Holtzmann

Características DMT1 DMT2

Número de ratas

Edad

Peso

Sexo

Procedencia

Temperatura

Alimentación

Agua

45

8 semanas

180 ± 20 g

Machos

INS

20 – 23 ºC

Obtenidas del INS

Ad libitum

24

8 a 9 semanas

225 ± 25 g

Machos

INS

20 – 23 ºC

Obtenidas del INS

Ad libitum

nesquenty4@hotmail.com

2.- Materila Farmacológico:

Extracto hidroalcohólico al 10% p/v de Smallanthus sochifolius (yacón)

Glibenclamida tableta 5 mg.

Aloxano (5,6 - dioxyuracil).

3.- Equipos:

Balanza analítica al 0.001g (Metter Zurich)

Estufa (Memmert)

Refrigerador

Glucómetro Accu-Chek Active (Laboratorios Roche)

Kit Sistemas Elecsys 1010/2010 (Laboratorios Roche)

Equipo de disección

nesquenty4@hotmail.com

4.- Descripción del estudio

Estudio prospectivo, longitudinal experimental del tipo “casos y controles”.

nesquenty4@hotmail.com

100g HOJAS DESHIDRATADAS Y MICROPULVERIZADASDE Smallantus sonchifolius (yacón)

MACERACIÓN EN 1000 mL de ALCOHOL AL 80% POR 7 DÍAS

FILTRACIÓN

SECADO A 40 GRADOS

PESADO

ALMACENAMIENTO

REFRIGERACIÓNnesquenty4@hotmail.com

2.- Inducción de diabetes mellitus tipo 1 y 2 a ratas

DMT1 DMT2

Método

Aloxano buffer citrato pH 4.75

Glucemia

Mendez JD et al 1994

Tres dosis 150 mg/kg p.c. / 48 h

Mayores a 300 mg/dL

Zanoello Am et al 2002

Cuatro dosis de 75 mg/kg p.c. / 48 h

Entre 125 – 359 mg/dL

nesquenty4@hotmail.com

3.- Criterios de medición

DMT1Determinación de glucosa

Determinación de insulina

DMT2Determinación de glucosa

Determinación de efectos adversos a nivel bioquímico

Determinación de efectos adversos a nivel hematológico

nesquenty4@hotmail.com

4.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 1.

Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano

1

2

3

4

5

Control + SSF

Glibenclamida 10 mg/Kg

Yacón 250 mg/Kg

Yacón 500 mg/Kg

Yacón 1000 mg/Kg

TOTAL

9

9

9

9

9

45

Recibió

Recibió

Recibió

Recibió

Recibió

SSF. = Solución Salina Fisiológica

5.- Diseño experimental de diabetes mellitus tipo 2.

Grupos Tratamientos Nº Ratas Aloxano Días de Tratamiento

1

2

3

4

Normal + SSF

Control (+) + SSF

Glibenclamida 10 mg/Kg

Yacón 500 mg/Kg

TOTAL

6

6

6

6

24

S.S.F.

Recibió

Recibió

Recibió

30

30

30

30

SSF = Solución Salina Fisiológica

Se compararon los resultados obtenidos para cada grupo (caso y control), se realizaron procedimientos estadísticos como media de tendencia central; promedio y error estándar, y para probar la hipótesis el análisis de varianza ANOVA mediante el paquete estadístico SPSS versión 13.0 y fueron considerados estadísticamente significativos a p<0.05. Los resultados se muestran en tablas y gráficos.

6.- Análisis estadístico

MUCHAS GRACIAS