Practica No. 3 Pruebas Bioquímicas

CENTRO DE BACHILLERATO TECNOLÓGICO, INDUSTRIAL Y DE SERVICIOS NÚMERO 128.

Práctica No.3: Pruebas bioquímicas.

Submódulo 3: Ejecuta técnicas de identificación de microorganismos con base en las normas.

Integrantes: Quistián García Hylary Estefanía, Ramírez Arellanos Génesis, Ramírez Hernández Jessica, Ramos Franco Michelle Valeria, Ramos Juárez Mario Antonio, Rangel Osorio Hugo Cesar, RascónCastrejón Lizeth Guadalupe, Reyes Marcial Luis Diego, Ríos Palacios Selene.

Facilitadora: Ing. Jessica Alicia Acosta Bezada.

Fecha: Se inició el día lunes 13 de octubre del año en curso y se finalizó el día 16 de octubre del año en curso.

Introducción

Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de una manera detallada su actividad bioquímica, porque otras características no son lo suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas técnicas para la caracterización bioquímica de una especie.

Las pruebas bioquímicas son una serie de análisis que sirven como apoyo para la identificación de especies bacterianas.Consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una vía metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales debemos conocer cuál de los test que componen las pruebas bioquímicas es o son los adecuados de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar. De igual manera debemos entender los principios bioquímicos de las pruebas. Y además ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por las pruebas bioquímicasy aplicarlas de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

Con ello la práctica se desarrolla de una manera en la cual, el centro de atención asía el aprendizaje, lo son las pruebas bioquímicas.

Resumen

En esta práctica se realizaron cuatro series de pruebas bioquímicas para la identificación y diferenciación de unas bacterias con otras.

Estas pruebas fueron: MIO (movilidad, indol y ornitina), LIA (Agar medio Lisina), KLIGGER, VP (Vogues Proskauer) y SIM (Sulfuro, Indol y Motilidad).

En un agar Nutritivo, Agar bilis y verde brillante (VBB) y McConkey se inocularon bacterias contenidas en agua de baño sanitario y tierra húmeda contaminada respectivamente para los últimos dos agares. Se incubó por 24 horas a 37º C.

Primeramente se realizó la tinción de Gram para identificar las bacterias Gram negativas que fueron las que se necesitaron para inocular las pruebas bioquímicas.

Una vez identificadas e inoculadas se incubaron nuevamente por 24 horas, se realizaron las lecturas bioquímicas correspondientes a cada serie mediante el análisis morfológico Identificando así el tipo de bacteria presente en cada una de estas.

Abstract

In this practice were performedfour series of biochemical testsfor the identification and differentiation of bacteria with other.

These tests were: MIO (Motility Indole Ornithine), LIA (Lysine iron agar), KLIGGER, VP (Vogues Proskauer) y SIM (Sulfide indole motility).

In Nutrient Agar, Brilliant Green Bile Agar and Mc Conkey inoculated bacteria contained in sanitary water bath and moist soil contaminated respectively for the last two agars. We incubated for 24 hours at 98º F.


First, Gram staining was performed to identify the Gram negative bacteria that were needed to inoculate biochemical tests.

Once identified and inoculated were incubated again for 24 hours, corresponding biochemical readings were performed on each series by morphological analysis identifying the type of bacteria present in each of these.

Materiales y métodos

Etapa 1 Preparación de agares

Material y reactivos

Matraz ErlenmeyerMecheros BunsenAgar Bilis verde brillanteAgua destilada o potableEspátulaCajas Petri

Procedimiento

1) A cada equipo se le asignó un agar para preparar. En este caso se preparó el agar Bilis Verde Brillante.

2) Para esto se disolvió 8.9 gramos del agar en 400 mililitros de agua destilada o potable.

3) Esta preparación se calentó hasta el punto de disolución, y de ahí se dejó hervir durante 1 minuto, posteriormente se dejó enfriar.

4) Mientras esto se llevaba a cabo se procedió a envolver las cajas Petri para que fueran esterilizadas, de igual forma la solución antes preparada se esterilizo.

5) Por último se procedió a vaciar el agar en las cajas Petri. Esto se llevó a cabo dentro de un triángulo de seguridad formado con mecheros Bunsen para evitar la posible contaminación del agar.

Etapa 2 Preparación de pruebas bioquímicas e

inoculación

Material y Reactivos

24 tubos de ensayeMatraz ErlenmeyerGradillaEspátula

Asas de inoculaciónPrueba VP (Voges Proskaver)Agua de bañoTierra húmeda contaminada

Procedimiento

1) Cada equipo preparó 4 series de pruebas bioquímicas para cada mesa. Cada tubo de ensaye necesito un aproximado de 10 mililitros de prueba. Por lo que cada equipo preparó 260 mililitros de la prueba bioquímica tomando en cuenta que debería vaciar el contenido en 24 tubos de ensaye y teniendo en cuenta el posible margen de error.

2) La prueba VP se preparó disolviendo 4.4 gramos de la prueba en 260 mililitros de agua destilada o potable. Esto se calentó hasta disolución y se dejó enfriar.

3) Esta solución se vacío en los 24 tubos de ensaye (10 ml por tubo aproximadamente), se cubrió los tubos para su esterilización y se procedió a llevarse a cabo.

4) A cada equipo se le proporcionó 3 diferentes tipos de agar: nutritivo, bilis verde brillante y McConkey. La inoculación se llevó a cabo dentro de un triángulo de seguridad formado con mecheros Bunsen. En el primero se procedió a inocular una muestra de agua de baño. En el segundo una solución de agua con tierra húmeda contaminada, y el tercero con agua de baño. Se procedió a su incubación.

Etapa 3 Lectura de colonias, tinción, morfología

bacteria e inoculación de pruebas bioquímicas.


Cristal violetaYodo-lugolAlcohol-acetonaSafraninaAceite de inmersiónPortaobjetos y cubreobjetosMecheros BunsenMicroscopios

Procedimiento

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1) Primero se llevó a cabo la lectura de las distintas colonias obtenidas en los diferentes tipos de agares. Dado que el agar bilis verde brillante y el McConkey son medios inhibidores crecieron muy pocas colonias siendo Gram negativas.

2) Se llevó a cabo la tinción de Gram y tomando en cuenta lo que antes se mencionó de los agares Bilis verde Brillante y McConkey, las muestras solo fueron tomadas de los agares nutritivos. Primero se tomó una muestra de una colonia y se esparció en un portaobjetos con una gota de agua. Se dejó secar y se fijó pasándose rápidamente por la flama de un mechero.Se le agregó una gota de cristal violeta y se dejó actuar por un minuto. Posteriormente se le agregó una gota de yodo-lugol y se dejó actuar por un minuto. Se le agregó una gota de alcohol-acetona y esta vez se dejó actuar por 30 segundos, por último se le agregó una gota de Safranina y se dejó por 30 segundos. No hay que olvidar que entre cada colorante la muestra se debe estar lavando con agua. Se le agregó una gota de aceite de inmersión y se le puso un cubreobjetos.

3) Se procedió a su observación a través del microscopio y se anotó su morfología. (Véanse los resultados). Los que resultaron Gram negativos, tomados de un agar nutritivo procedieron a ser inoculados en las pruebas bioquímicas.

4) Con las pruebas bioquímicas sólidas que no contaban con un espacio para estriado (MÍO y SIM) se procedió de la siguiente forma: con un asa de punta se tomó una muestra de la colonia, y se insertó dentro de la prueba lo más profundo que resultara posible, y se sacó por el mismo lugar por el que entro.Con las pruebas que presentaban un lugar para el estriado (Kligler y LÍA), se procedió de la siguiente forma: se tomó una muestra de la colonia con un asa de punta y esta se insertó en la prueba lo más profundo que fuera posible, cuando se retiró el asa, y se llegó al lugar de estriado con el asa se hizo una pequeña “S”.Con las pruebas líquidas (VP) se procedió de la siguiente forma: se tomó una muestra de la colonia con un asa de punta y esta se colocó en la prueba, se revolvió con la

misma asa hasta que la muestra estuvo bien disuelta.

5) Se procedió a la incubación de las pruebas bioquímicas y a la esterilización de los cultivos.

Etapa 4 Lectura de pruebas bioquímicas


Pruebas bioquímicas inoculadas e incubadasTabla de lectura de pruebas bioquímicas (Mirar Anexo)

Procedimiento

1) Se observó el cambio que sucedió en cada una de las pruebas bioquímicas.

2) Se analizó de serie en serie, y de acuerdo a la tabla se marcó los aspectos con los que cumplía esa serie. Se sumó estos aspectos y la especie con que más números de aspectos contara era la especie más probable de bacterias que fue inoculada en la prueba. (Véanse los resultados)

Resultados

En los resultados presentes de esta práctica se

rescatan las observaciones de la morfología tanto

bacteriana como colonial, además de las lecturas

bioquímicas. Estos resultados se muestran en las

siguientes tablas.

Medio de cultivo

Número de caja petri

Inoculado con:

Agar nutritivo

Caja petri 1

Muestra de agua del sanitario

Caja petri 2Caja petri 3Caja petri 4Caja petri 5Caja petri 6Caja petri 7

Caja petri 10

Agar Mc Conkey

Caja petri 9Muestra de agua

del sanitarioCaja petri 8

Caja petri 11

Agar de bilis verde

brillante

Caja petri 12Muestra de tierra

contaminadaCaja petri 13Caja Petri 14

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Caja petri Colonia Morfología de la colonia

Caja petri 1 1Forma puntiforme, borde entero,

superficie plana, color blanco.

Caja petri 2

1Forma rizoide, borde filamentoso,

superficie plana, color blanco opaco.

2Forma circular, borde entero,

superficie plana.

3Forma puntiforme, borde entero,

superficie plana, con transparencia.

Caja petri 3

1Borde lobulado, superficie plana,

forma circular color amarillo.

2Borde entero, superficie plano

convexa, forma puntiforme, color blanco.

3Borde lobulado, superficie convexo, forma irregular, color blanco opaco.

Caja petri 4 1Forma circular, borde entero,

superficie convexa, color blanco.

Caja petri 51

Forma circular, borde entero, superficie plana, color blanco.

2Forma circular, borde entero, superficie plana, color blanco.

Caja petri 6

1Borde filamentoso, superficie

plana, color amarilla con transparencia.

2Borde entero, superficie plana,

color blanco.

3Borde ovalado, superficie plana,

color blanco

5Borde entero, superficie plana, con

transparencia.

7Borde entero, superficie rugosa,

color amarillo claro.

8Borde entero, forma circular,


Caja petri 7 1Forma puntiforme, borde entero,


Caja petri 81

Borde entero, forma circular, con transparencia y centro café.

2Forma lobulada, superficie plana,

color morado.

Caja petri 9 1Forma circular, borde entero,

superficie convexa, con transparencia.

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Caja petri 101

Borde lobulado, superficie plano convexa, forma irregular.

2Borde entero, superficie plana,

forma circular.

Caja petri 11 1Borde entero, superficie plana, forma circular, color morado.

Caja petri 12 1

Forma circular, borde entero, superficie convexa, color

morado/fucsia brillante, con hemolisis.

Caja petri 13 1



Caja petri 14 1



Caja petri Colonia Morfología bacteriana

Caja petri 11 Bacilos Gram positivos.2 Cocos Gram negativos.

Caja petri 31 Estreptococos Gram positivos.2 Bacilos Gram positivos.3 Bacilos Gram positivos.

Caja petri 51 Cocobacilos Gram positivos.2 Cocobacilos Gram positivos.

Caja petri 9 2 Cocos Gram negativos.Caja petri 6 7 Bacilos Gram negativos.

Caja petri 21 Bacilos Gram negativos.4 Bacilos Gram negativos.

SerieCaja petri

ColoniaPruebas bioquímicas

Kliger LIA H2SMIO Móvil

Indol Gas MIO VP RM

1 2 1 K/A + K/A + - - - - + - -2 9 2 K/A + K/K+++ - - - - + - -3 6 7 A/A - K/K+++ + - - + + + -4 2 4 K/A + K/K+++ - + - - + - -

Serie Especie encontrada1 Shigella (aerobia)2 Shigella (aerobia estricta)3 Enterobacter (facultativa)4 Enterobacter (anaerobia)

5 | P á g i n a


En estas tablas se muestran todo lo acontecido en

la identificación indispensable de las colonias que

crecieron antes y después de los primeros días de

incubación, así como la morfología bacteriana

principal que trataba de encontrar solo bacterias

Gram negativas. Los resultados también muestran

y enmarcan dos tipos de bacterias, bacterias

llamadas Shigella y también enterobacterias.

Conclusiones

Quistián García Hylary: Es muy importante conocer

las distintas propiedades que poseen los distintos

medios de cultivos, por ejemplo los inhibidores

como el Mc Conkey con el que se trabajó en esta

práctica y que por ser inhibidor solo permite el

crecimiento de bacterias Gram Negativas.

Para poder realizar una morfología bacteriana y que

los resultados obtenidos sean satisfactorios es

necesario e indispensable realizar una correcta

tinción, y esto se lleva a cabo respetando los

tiempos de cada colorante, así como un lavado

adecuado entre cada colorante y por supuesto

seguir el orden correcto del procedimiento.

Las pruebas bioquímicas son utilizadas para

analizar las bacterias presentes en una colonia.

Esto se lleva a cabo con distintas pruebas

bioquímicas que tienen distintos parámetros y con

las que se obtienen distintos resultados. En base a

los resultados de una serie de pruebas bioquímicas

se puede “deducir” la bacteria de la que se

conforma una cierta colonia.

Para que las pruebas den resultados satisfactorios

se debe inocular en ellas de una manera adecuada,

y se debe buscar que la posible contaminación de

las pruebas sea lo más mínima posible. Otro

aspecto de las bacterias inoculas en las pruebas

bioquímicas que se puede deducir en base a su

crecimiento en ellas es que tipo de respiración

presentan, por ejemplo si crecen en el fondo del

tubo, son sin lugar a dudas anaerobias estrictas.

Ramírez Arellanos Génesis: Los lactobacilo son

producto del desdoblamiento de las grandes

moléculas; se difunden y penetran a las células

cercanas, también son muestra de presencia de

hemólisis.Ciertas especies de bacterias hidrolizan o

licuan la gelatina en forma muy característica.

El agar aluminio es agar nutriente al cual se ha

añadido un poso de almidón como única fuente de

carbohidratos, formando una especie de nutriente

para microorganismo.

Algunos cristaloides llamados así porque cristalizan

al acercarse, tales como sal de una azúcar y

amoniaco, todas transmiten la luz en un medio de

placa de leche.

El T.S.I. ha dado resultados satisfactorios con

organismos que fermentan la sacarosa, mientras

que el papel indicado (acetato de plomo) es el

método más sensible a los medios de cloruro

ferroso el método más sensible.

Muchas bacterias liberan ex enzimas que hidrolizan

la gelatina, si uno de estos organismos se inocula

en un tubo de gelatina nutritiva, las gelatinas

cercanas a las bacterias serán hidrolificadas y

pasarán del estado coloidal al estado cristaloide

(aminoácido).

La levadura realizan una fermentación alcohólica

casi puro alcohol que proviene de la

descarboxilación del ácido pirúvico.

La fermentación se refiere a la degradación

anaeróbica del carbohidrato y que almacena gran

cantidad de energía, esta capacidad desprende a

las enzimas de microorganismos.

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Ramírez Hernández Jessica: Se llegó a la

conclusión de que para observar y diferenciar con

más precisión las bacterias presentes en un medio

agar, es decir, no solo descriptivamente (morfología

y tinción) sino también por sus características

metabólicas son necesarias las pruebas

bioquímicas que nos brindan el medio específico

para que estas desarrollen los aspectos necesarios

que nos ayudan a saber qué tipo de bacteria se

encuentra presente en cada una de las series

realizadas.

En la tinción de Gram podemos identificar si las

bacterias inoculadas en un medio agar son

negativas o positivas así como también su forma:

cocos, bacilos o espirilos con sus diversas

variaciones.

Sin embargo, aunque esta tinción está relacionada

con las pruebas bioquímicas ya que es uno de los

pasos principales para la realización de estas, no

es exactamente la que se requirió para identificar la

presencia de Shigella y enterobacterias Aerogeros

en las cuatros series realizadas.

Para lograr la identificación de estas bacterias fue

necesario realizar la interpretación correcta de lo

que se observó en cada tubo de cada serie y el

medio en el que se encontraban: líquido y sólido;

así como la realización adecuada del procedimiento

del método de siembra en tubos.

Fue a su vez necesario también conocer el tipo de

respiración que la bacteria resultante tiene en un

tubo. Dependiendo de su ubicación podíamos

identificar a las: aerobias estrictas, anaerobias

estrictas, facultativas, microaerofilos y

aerotolerantes (anaerobias).

Así con esta práctica podemos comprender, desde

cierto punto de vista, como personas

especializadas en la materia identifican

microorganismos patógenos para la salud humana

y su respectiva prevención o cura sea el caso.

Ramos Franco Michelle: En conclusión para mí en

esta práctica observamos los mismo que en la

anterior sobre contar las colonias que se

encontraban en cada agar y cuáles eran los tipos,

en esta práctica utilizamos el agua del baño

contaminada y la tierra contaminada que cada una

tenia diferentes baterías y algo nuevo que aprendí

fue de cómo identificar colonias en tubos de ensaye

y como identificar cada unos de los tubos y de sus

bacterias, en una parte no entiendo porque nos

sirve en la vida cotidiana pero es algo nuevo que

aprender y saber identificar cada una de ellas.

Ramos Juárez Mario: Es importante saber

identificar las bacterias en un agar o cultivo, como

para también saber si es catión o anión, el método

es muy entretenido y gustoso por los colores que

presentan, para saber cómo identificarlos tuvimos

también que investigar lo ya presente, en

conclusión es muy necesario conocer con qué y

cómo se va a trabajar con la forma de identificación

de bacterias.

Rangel Osorio Hugo Cesar: Al finalizar esta prueba

podemos concluir que en las pruebas bioquímicas

nos son de gran ayuda cuando queremos

identificara una bacteria con su género especifico y

características mejor definidas al finalizar las 4 seria

de pruebas bioquímicas encontramos 2 diversas

bacterias de distintos agares las cuales con

Shigella y Enterobacter aerogeros y como ya dije

cada una de estas tienen características especiales

las cuales nos dan cabida para poder identificar a

las bacterias. Gracias a esto en los distintos análisis

de laboratorio podemos saber que bacterias son y

si son beneficiarias o dañinas para nuestra salud

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Rascón Castrejón Lizeth Guadalupe: Los medios de

cultivo en un laboratorio de microbiología son de

suma importancia ya que, son instrumentos de

dignosticación de bacterias patógenas dentro de los

individuos. Los medios de cultivo son un método

fundamental para estudiar las bacterias es

cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de

un medio En microbiología se emplea medios de

cultivos por la simple razón que los organismos a

estudiar necesitan una fuente de energía, para vivir

y así desarrollarse, por tal motivo, la preparación de

los medios de cultivos varían ya que deben de

prepararse según las necesidades nutricionales del

organismo, esto es fundamental para su estudios.

Esto consta en disponibilidad de nutrientes,

presencia (o ausencia) de oxígeno y distintos

gases, condiciones adecuadas de humedad, luz

ambiental, pH, temperatura, adecuados para el

microorganismo. Una vez cultivados dichos

microorganismos no podemos dejar de lado las

técnicas de tinción que muy importantes para el

estudio de microorganismos inertes.

Para las técnicas de tinción se aplica un colorante

simple (un solo colorante) o diferencial (dos o más

colorantes). Esto nos servirá para una mejor

visualización y con ellos un mejor análisis de los

microorganismos deseados.

Las pruebas bioquímicas se utilizan Con frecuencia

en el laboratorio de microbiología, ya que la

identidad de una especie requiere que se conozca

de manera detallada su actividad bioquímica,

porque otras características no son suficientemente

distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas

técnicas para la caracterización bioquímica de una

especie. Además de los productos finales de los

procesos metabólicos, también se necesita conocer

con detalle cómo se producen estos cambios de las

bacterias cultivadas. En general el microorganismo

se cultiva en medios que contienen una sustancia

nutritiva específica o sustrato y después de la

incubación del cultivo se examina para ver los

cambios químicos que hayan ocurrido.

Reyes Marcial Luis Diego: Como parte de la

formación de todo microbiólogo es importante

conocer algo muy importante, “los

microorganismos”. Pero en lo principal, y tal vez en

lo general, es importante conocer las bacterias.

Estos microorganismos tan sencillos son un objeto

de estudio muy importante dentro de la

microbiología. Y en esta práctica de microbiología

no estuvo exento este estudio, en la práctica se

denota las identificaciones y morfologías tanto

bacterianas como por colonias, además de las

pruebas bioquímicas.

Hablando de esta última, es importante reconocer

que es una parte fundamental y necesaria, si se

requiere conocer con qué tipo de bacteria se está

trabajando, o de igual manera sirve como un

proceso de identificación.

En general esta práctica requirió de toda la

concentración posible, además de tener que

realizar apuntes totalmente explícitos y certeros,

porque cualquier error podía provocar una falla en

toda la práctica.

Con esto concluyo, en que es algo muy importante

en la microbiología, ya que es el pilar de esta

ciencia y con ello se formo la misma.

Ríos Palacios Selene: Obtuvimos una grata

productividad de cada Agar. Considerando que la

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clara finalidad era diferenciar el producto de cada

uno para así evidenciar cada tipo de bacteria

originada en ellos.

El medio de enriquecimiento selectivo (Verde

Brillante) favoreció por su diseño el crecimiento

específico de un microorganismo particular o grupo

de microorganismos. Fue de gran utilidad para el

aislamiento de microorganismos ya que era una

población microbiana mixta.

El medio diferencial (Mc Conkey) facilito la

discriminación de microorganismos de la mezcla

por sus propiedades diferenciales de crecimiento en

dichos medios. (Gram-)

Con esto se concluye que los 3 tipos distintos de

Agares formaron distintas colonias por sus

propiedades específicas y función de desarrollo en

cada Medio de Cultivo.

Discusión

De acuerdo a los experimentos realizados, pudimos

notar claras diferencias en los microorganismos

vistos, comenzando en el caso del agar nutritivo,

vimos que sus microorganismos son más distintos y

variados, que en comparación con los agares Mc

Conkey y Verde Brillante,

El uso del Agar nutritivo es utilizado para propósitos

generales, para aislamiento y recuento de

microorganismos con escasos requerimientos

nutricionales. Medio rico para el cultivo de

microorganismos en general, crece una gran

mayoría, excepto algunos muy exigentes. Por esta

razón fue un crecimiento con más abundancia en

bacterias.

Con respecto al Agar Mc Conkey es un medio que

se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram

negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios

facultativos. Permite diferenciar bacterias que

utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua

y alimentos.

Todas las especies de la familia Enterobacteria

Ceaese desarrollan en el mismo. Con este motivo

solo germino un tipo de bacteria.

El Agar Verde Brillante es un Inhibidor: colorante

verde brillante (inhibe Gram positivas). Incluye

lactosa y sacarosa. Rojo fenol como indicador por

lo que las colonias se apreciaron rosas/blancas y

evidentemente solo se originó una sola clase de

bacterias.

Con base en lo anterior, se puede decir que la

finalidad fue observar distintos tipos de

microorganismos, desarrollados en un medio

distinto para así notar las diferencias bastantes

perceptibles en estas.

Bibliografía

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Junta de Andalucia. (s.f.). Recuperado el 17 de Octubre de 2014, de

http://www.juntadeandalucia.es/.../depart/biolog/pdf/p21.pdf

Libros Laboratorio. (s.f.). Recuperado el 17 de Octubre de 2014, de

http://libroslaboratorio.files.wordpress.com/.../medios...

Anexos

Medios de cultivos.

Para realizar el estudio de los microorganismos, se

han diseñado diversos métodos que permiten

cultivarlos bajo condiciones artificiales, en los que

es posible cultivarlos bajo condiciones

experimentales y manejar un solo tipo de

microorganismo. Una de las técnicas más usadas

en el laboratorio de microbiología consiste en

transferir una muestra microbiológica de un

ambiente determinado a un medio de cultivo, lo que

nos permite obtener cultivos microbianos.

Al realizar este procedimiento, es necesario tomar

en cuenta que en el área de trabajo, existen

muchos otros microorganismos; y es necesario

tomar precauciones para impedir que éstos

contaminen los cultivos con los que

estamos trabajando. Por otra parte, para

considerar no sólo el aspecto nutricional,

sino también las condiciones ambientales

de su hábitat natural, por lo que en el

medio de cultivo se debe ajustar el pH y

concentración de sales y durante la

incubación condiciones tales como la

temperatura, aireación la luminosidad. La

aplicación de estos procedimientos ha

permitido propagar a los microorganismos

en cultivos mixtos, así como su

aislamiento y la obtención de cultivos

puros, facilitando de este modo, el estudio,

caracterización, aplicación y control de los

mismos. La forma de sembrarlos y cultivarlos

depende del tipo de microorganismo y propósito

específico del estudio.

En general el microorganismo se cultiva en medios

que contienen una sustancia nutritiva específica o

sustrato y después de la incubación del cultivo se

examina para ver los cambios químicos que hayan

ocurrido.

Observación bacteriana.

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Medios de cultivo comunes

Tienen como objetivo producir el

cresimiento de bacterias

Son los mas utilizados del grupo de medios

de cultivo Lo conforman los agares

nutritivos

Lo conforman el agar nutritivo


Son las técnicas que permiten observar

microorganismos en función de la capacidad de los

mismos para retener o no determinar sustancias

colorantes, lo que depende de la carga de célula y

colorante.

Los colorantes pueden ser de distintos tipos:

Catiónicos. Son sustancias que tienen carga

positiva. Penetran el interior de las células y las

tiñen. Ejemplo: azul de metileno, cristal violeta,

safranina.

Aniónicos: con carga negativa no penetran en el

interior de la célula, sino el entorno. En este caso

se habla de tinción negativa. Ejemplo: eosina,

nigrosina.

Liposolubles: se mezclan con los lípidos celulares y

los tiñen. Ejemplo: negro sudan.

Las tinciones pueden ser:

Simple: utilizan un solo colorante.

Diferencial: se basan en el hecho de que distintos

tipos de células tienen distintas composición

química, y por lo tanto reaccionan de forma

diferente a una tinción.

Selectiva: se basan en el hecho de que distintas

estructuras celulares tienen distintas composición

química, de modo que se tiñen selectiva mente.

Azul de metileno, (tinción positiva): Permite teñir el

interior celular.

Nigrosina, (tinción negativa): trata de un colorante

aniónico, que no penetra en el interior celular.

Bacteria del yogurt:

El yogur es un producto lácteo producido por la

fermentación natural de la leche, en él se

encuentran: estreptococos termophilus y el

lactobacilos bulgaricus.

Bacterias del vinagre:

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido

acético resultante de la fermentación espontanea

del vino o de bebidas alcohólicas de baja

graduación, en él se encuentran bacterias

aeróbicas del ácido acético, principalmente:

Acetobacter aceti, aunque también, gluconobacter.

Bacterias del sarro dental:

El sarro dental es un depósito consistente y

adherente localizado sobre el esmalte de los

dientes, en él se encuentran bacterias saprofitas,

pudiendo observar gran variedad de morfologías:

espiroquetas, cocobacilos, diplococos y bacilos.

Utilización bioquímica.

Las pruebas bioquímicas nos muestran reacciones

que son la base de la identificación de los

diferentes agentes bacterianos. Para la

identificación de las bacterias, el laboratorio de

diagnóstico necesita conocer las características

físicas y metabólicas de las mismas. Una vez

conocidas las características físicas del

microorganismo, se analizan sus reacciones

metabólicas tales como la producción de enzimas,

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meta bolitos intermedios, oxidación y fermentación

entre otras. A través de los años se han

desarrollado pruebas aprovechando estos

conocimientos y ya se tiene pruebas

estandarizadas que se elaboran a partir de

preparados comerciales que son medios de cultivo

conteniendo el compuesto sobre el cual las

enzimas bacterianas actúan complementado con

indicadores que ponen de manifiesto la reacción

que se llevó a cabo.

En el laboratorio se llevan a cabo diversos tipos de

análisis bioquímicos:

Pruebas en Tubo de ensayo: En este caso requieren patrones de inoculación específicos para los tubos con agar inclinado, con medio sólido horizontal o con medio semisólidos. En el caso del tubo con agar inclinado, la inoculación se realiza a partir de una colonia aislada tomada de una placa petri. Con el asa se traslada el inoculo a la superficie del medio que se siembra por estrías, a veces es necesario practicar una incisión en la superficie del agar, la cual no debe llegar hasta el fondo.La inoculación de algún medio sólido presentado en tubo de ensayo con superficie horizontal, se realiza utilizando un alambre recto. El método de sembrado consiste en inocular por picadura evitando llegar hasta el fondo del medio.Los medios semisólidos se emplean para los estudios de movilidad (Medio SIM); se inocula utilizando un alambre recto tratando que la incisión no llegue al fondo del tubo.

El laboratorio dentro del protocolo de aislamiento de Salmonellas. Maneja tres pruebas bioquímicas para discriminar entre cepas:

Prueba de descarboxilación de la Lisina (LIA): Esta prueba mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido formando una amina, con la consiguiente alcalinidad. El LIA es un medio diferencial empleado para caracterizar las

Entero bacterias. Es muy útil para diferenciar tempranamente cepas de Salmonella y Arizona de Citrobacter.Urea: Esta prueba determina la capacidad de un organismo para desdoblar, la Urea, formando dos moléculas de amoniaco por acción de la enzima ureasa. Esta prueba se utiliza para diferenciar los organismos del género Proteus rápidamente ureasas positivas de otros miembros de las Entero bacterias.Prueba del medio Triple Sugar Iron (TSI): Esta prueba determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico en un medio de crecimiento básico, con la producción o no de gases, junto con la determinación de posible producción de ácido sulfhídrico.

Las Técnicas de API, son un recurso rápido para el

diagnóstico bacteriano, consiste en tiras que

contiene micro tubos para evaluar las reacciones

específicas de las bacterias. Este método da un

patrón de reacción que difiere entre especies y

subespecies; este recurso es utilizado en etapas

finales de la identificación bacteriana. El Laboratorio

de Bacteriología de alimentos cuenta con:

API 20 E: EL sistema de API 20 E facilita en 24

horas la identificación de Entero bacterias. También

puede identificar otras bacterias Gram negativas en

24 a 48 horas. Esta prueba posee los substratos

deshidratados para la demostración de la actividad

enzimática y fermentación de carbohidratos. Los

substratos se reconstituyen por la adición de una

suspensión bacteriana. Después de la incubación

los productos metabólicos se detectan por sistemas

indicadores o por la adición de reactivos.

API Listeria: El API Listeria contiene 10 pruebas

para obtener en 24 horas la identificación

bioquímica de aislamientos de Listeria. Esta prueba

abarca el 85% de las cepas de Listeria, también se

puede diferenciar entre Listeria monocytogenes y L.

innocua en base a la ausencia de arilamidas.

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Identificación bioquímica.

La forma de identificar las pruebas bioquímicas son

las siguientes:

Catalasa: es una enzima presente en la mayoría de los microorganismos presentes que poseen cito cromas. Las bacterias que sintetizan catalasa hidrolizan el peróxido de hidrogeno en agua y oxigeno gaseosa que libera de forma de burbujas el principal objetivo de esta prueba es separar micrococacceace (+) de Streptococcus spp y Esterococcus spp (-).Oxidasa: sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reacción de la Oxidasa se debe a la presencia de un sistema atrocomoxidosa que activa la oxidación de autocroma el cual es residuo para el oxigeno molecular produciendo agua. Indol: se detecta la liberación de indol de un cultivo bacteriana. Dicha liberación de debe a la degradación del aminoácido triptófano mediante la enzima triptofonaga.

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Practica No. 3 Pruebas Bioquímicas

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