UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Médico cirujano

Laboratorio de Microbiología

Modulo: Cardiovascular

Mesa: 4

Integrantes:

Angel Montoya Karla GiselCampos Badillo Julio AdánDíaz Quintero Dulce KarenFernández Hernández HéctorGonzales Sánchez ArmandoGuerrero Ibarra ImeldaMacias Pérez Citlalli Jessica JohannaRomero Iturbide ArturoRoldan Tinoco José

Practica 6: IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Grupo: 1305

IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS POR PRUEBAS BIOQUÍMICAS

OBJETIVO1.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons.

2.- El alumno conocerá el fundamento bioquímico de las reacciones positivas en el medio de cultivo líquido Caldo con urea o en el medio sólido Agar con urea de Christensen.

3.- El alumno aplicará las técnicas de siembra en tubos para los medios de cultivo sólidos TSI, SIM, LIA, MIO, Agar citratado de Simmons y agar con urea de Christensen de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

4.- El alumno aplicará la técnica de siembra en tubos para el medio de cultivo líquido Caldo con urea de las colonias aisladas por resiembra, a partir del hemocultivo.

5.- El alumno interpretará las pruebas positivas y reportará a los géneros y especies bacterianas identificadas como posibles patógenas.

INTRODUCCIÓN

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales, conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes. Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio.

MARCO TEORICO

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción de SH2. Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, con objetivo de diferenciar entre:bacterias fermentadoras de la glucosabacterias fermentadoras de la lactosabacterias fermentadoras de sacarosabacterias aerogénicasbacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.Prodedimiento:Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo del tubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35° durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.Resultados:Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias no fermentadoras como Pseudomonas sp.Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción de ácido sulfhídrico. Salmonela spp.Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no. Escherichia coli. A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

SIMONS CITRATOAgar CitratoLa utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación de enterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6. Procedimiento: Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir  falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul. Resultados: (+)Klebsiella spp.( - ) Escherichia Coli

Resultados-Positivo:crecimientoycolorazulenelpico,alcalinidad.-Negativo:elmediopermanecedecolorverdedebidoaquenohaydesarrollobacterianoynohaycambiodecolor.Microorganismo Citrato permeasa Color del medioKlebsiella pneumoniae Positivo AzulS. typhimurium Positivo AzulE. coli Negativo VerdeS. flexneri Negativo Verde

LIA

Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de la lisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2. Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.Procedimiento: Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .Interpretación y Resultados:

Resultados1-Decarboxilacióndelalisina:-PruebaPositiva:Picovioleta/fondovioleta.-PruebaNegativa:Picovioleta/fondoamarillo.2-Desaminacióndelalisina:Picorojizo/fondoamarillo.EstosucedeconcepasdelgéneroProteus,ProvidenciayalgunacepasdeMorganellaspp.3-Produccióndeácidosulfhídrico:-Pruebapositiva:Ennegrecimientodelmedio(especialmenteenellímitedelpicoyfondo)

Microorganismos Color en el Color en la Ennegrecimiento del

pico de flauta base del tubo medio

Proteus mirabilis Rojo Amarillo Negativo

Salmonella typhimurium

Púrpura Púrpura Positivo

Salmonella enteritidis Púrpura Púrpura Positivo

Providencia spp. Rojo Amarillo Negativo

Citrobacter freundii Púrpura Amarillo Positivo

Morganella spp. Rojo Amarillo Negativo

Edwarsiella spp. Púrpura Púrpura Positivo

Klebsiella pneumoniae

Púrpura Púrpura Negativo

Escherichia coli Púrpura Púrpura Negativo

Indol

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchas especies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p-dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo color rojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia de indol y una prueba positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( - ) Klebsiella Pneumoniae

MIO

Resultados1-Movilidad:-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas allá de l línea de siembra.-Resultado negativo: crecimiento solamente en la línea de siembra.

2-Ornitina decarboxilasa:-Resultado positivo: color púrpura.-Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violáceo en la superficie del medio.

3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador.-Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloro-amarillento.

MATERIAL

1 tubo de agar TSI 1 tubo de agar LIA1 tubo de citrato de Simmons1 tubo de plasma citrato 1 tubo con caldo urea 1 tubo con medio de MIO1 tubo con peróxido de hidrogenoMicroscopio Reactivos para tinción de GramMecheroAsa bacteriológicaPorta y cubreobjetos

PROCEDIMIENTO

Tomar colonias aisladas de las placas de agar sangre y agar chocolate, observar si hay hemolisis reportar la presencia de estreptococos y confirmar con peróxido de hidrogeno para descartar estafilococos. Hacer frotis y teñir por la técnica de Gram.Si hay crecimiento en agar EMB sembrar en los tubos pruebas bioquímicas siguiendo el procedimiento de la práctica de exudado faríngeo.Los tubos de LIA y TSI se siembran por estría simple y picadura.Si se obtiene desarrollo en las cajas de S-110 efectuar la prueba de la cuagulasa (plasma citrado)Discutir resultados

RESULTADOS

Lisina hierro agar (LIA)

Citrato de Simmons

Triple azúcar hierro (TSI)

Caldo urea Movilidad indol ornitina (MIO)

CUESTIONARIO

1.- Describa la técnica de siembra en el medio TSI.

El Agar TSI inclinado se debe inocular a partir de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey o de otras fuentes apropiadas. EL cultivo se debe estriar en la porción inclinada y picar hasta un centímetro antes del fondo. Los cultivos se leen después de 18 a 48 horas de incubación a 37° C.

2.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio de TSI.

Metabolismo de Carbohidratos.- Fundamento.- El metabolismo bacteriano de alguno o de los tres carbohidratos da como resultado la producción de ácido pirúvico y ácido láctico (fermentación ácida), por lo que medio de cultivo se acidifica, esta acidez se evidencia por un cambio de color del medio de rojo o rosa intenso al color amarillo por la acción del indicador rojo de fenol. Si el medio se conserva alcalino no hay cambio de color, conservándose el medio de cultivo de color rojo.

Producción de Sulfuro ferroso en TSI.-Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfato reductasa, este medio contiene Sulfato de Amonio Ferroso y Tiosulfato de sodio, este último es el primer sustrato que utiliza la enzima tiosulfato reductasa bacteriana para formar ácido sulfhídrico incoloro el cual reacciona posteriormente con el Sulfato de Amonio Ferroso para formar sulfuro ferroso que forma un precipitado negro en el medio. Las especies del género Proteus y Salmonella producen sulfuro ferroso que se evidencia por un precipitado de color negro en el medio. E. Coli y Shigellas son negativas.

3.- Describa la Técnica de siembra en el medio SIM.

El Agar SIM se debe inocular por picadura en el centro hasta la mitad o un centímetro antes del fondo. Las muestras se toma de las colonias seleccionadas como EMB, Agar Mc Conkey

4.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio SIM.

Sulfuro ferroso.- Fundamento.- Algunas bacterias son capaces de degradar aminoácidos azufrados como cisteína y metionina, o de utilizar tiosulfato como sustrato, liberando el azufre de estos compuestos para formar ácido sulfhídrico H2S en forma gaseosa gracias a la acción de enzimas bacterianas como la cisteína desulfhidrasa y tiosulfato reductasa.

Indol.- Fundamento.- El alto contenido de trypticase (triptófano) en el medio SIM, lo hace ideal para la producción de indol. El triptófano puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, escatol y ácido indolacético) por reacciones específicas de la enzima, liberando una molécula de amoniaco.

Movimiento positivo en el medio SIM.- Gracias a sus flagelos perítricos los géneros Salmonella, Proteus, Escherichia coli se desplazan alejándose de la picadura dando un aspecto de remolino o turbidez alrededor de la picadura.

5.- Describa la técnica de siembra en el medio LIA.

Técnica de siembra.- Con el asa bacteriológica recta, estriar el pico de flauta y punzar el fondo del medio dos veces. Dejar las tapas del medio de cultivo ligeramente flojas. Incubar durante 18 a 24 hrs., a 35° C.

6.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio LIA.

Descarboxilación de la lisina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas, atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.

Estas descarboxilasas son enzimas adaptativas o inducidas y solo se activan cuando un microorganismo es cultivado en un ambiente ácido en presencia de un sustrato especifico. Los productos de la descarboxilación de estos aminoácidos cambian el pH a limites alcalinos. La descarboxilación que producen estas enzimas, esta restringida a los aminoácidos que poseen por lo menos un grupo químicamente activo distinto de una amina como (NH2) y a los aminoácidos que tienen un grupo carboxilo (COOH).

Este tipo de descarboxilación ocurre en anaerobiosis, es decir, cuando en la glicólisis se obtienen lactato y piruvato como productos finales que acidifican el medio de cultivo y activan a las enzimas descarboxilasas. La descarboxilación es irreversible no oxidativa y por lo general requiere una coenzima común, fosfato de piridoxal, que refuerza la actividad de las descarboxilasas. El aminoácido L-lisina es descarboxilado para formar cadaverina, una diamina y dióxido de carbono, por la acción de la enzima especifica lisina descarboxilasa.

7.- Describa la técnica de siembra en el medio MIO.

Los tubos se siembran por punción con asa recta hasta un centímetro antes del fondo. Incubar por 24 horas a 37° C.

8.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en el medio MIO.

Movilidad. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o un crecimiento que se difunde desde la línea de inoculación, mientras en las no móviles crece a lo largo de la línea de siembra.

Indol.- Fundamento.- El triptófano que contiene el medio MIO puede ser desaminado o descarboxilado por la acción de la enzima triptofanasa que producen algunas bacterias, utilizando como coenzima al fosfato de piridoxina (vitamina B6) dando origen a tres metabolitos indólicos (indol, metilindol y ácido indolacético) y liberando una molécula de amoniaco. La desaminación del triptófano produce Indol. La inmediata aparición de un anillo de color rojo cuando se agregan cinco gotas del reactivo de Kovac (Alcohol amílico o butílico + Dimetilaminobenzaldehído + HCL concentrado) al medio de cultivo incubado durante 24 horas, indica la presencia de Indol. La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad bacteriana.

Descarboxilación de la ornitina.- La descarboxilación es el proceso por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas atacan a los aminoácidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una amina o una diamina y CO2.

9.- Describa la técnica de siembra en el medio Citrato de Simmons.

Se pueden hacer cultivos en placa con técnica de aislamiento o si se prefiere el medio inclinado, se inocula estriando la superficie y picando el fondo.

10.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en Citrato de Simmons.

Fundamento.- Solo los organismos que utilizan el citrato como única fuente de carbono crecen en el Agar Citratado de Simmons. El citrato es obtenido del citrato de sodio que contiene el medio para ser incorporado directamente al ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Krebs) para su metabolismo y producción de energía. Esta reacción es catalizada por la citrato desmolasa o citratasa enzimas bacterianas que requieren de un medio alcalino y de cationes divalentes como magnesio para su activación.

11.- Describa la técnica de siembra en Caldo Urea.

Se debe estriar superficialmente con un inóculo grande, el fondo sirve como control del color, por lo que no debe puncionarse.

12.- Explique el fundamento de las pruebas bioquímicas en caldo Urea.

El Agar con urea de Christian elimina la necesidad de que los microorganismos utilicen el amoníaco como única fuente de nitrógeno para su metabolismo, la glucosa que contiene el medio permite el crecimiento de un buen número de géneros que además podrán evidenciar la producción de ureasa alcalinizando el medio de cultivo haciendo que cambie del color normal al rojo por el indicador Rojo de fenol. La mayor parte de las especies del género Proteus dan una reacción fuertemente positiva a las 24 horas de incubación. Otros géneros de bacterias paracólicas dan una pequeña reacción positiva desde las 6 primeras horas de incubación que se intensifica hasta 4 cruces hasta después de tres días. Otros géneros menos positivos a la ureasa dan una reacción leve después de 6 días.

BIBLIOGRAFÍA

Brooks, Geo F. Microbiología médica de Jawetz, Melnick y Adelberg 16ª ed. México, D.F: Manual Moderno; 1999. Romero Cabello R. Microbiología y Parasitología Humana. 3ª ed. México D.F: Panamericana; 2007. Picazo, J.J. / García Rodríguez, J.A. compendio de microbiología medica 1ª ed. Barcelona: Harcourt; 1999.