UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICOFACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

MICROBIOLOGÍA II LABORATORIOPRÁCTICA 8: IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN EL

EXUDADO FARÍNGEO 1305

EQUIPO 3 :ALVARADO HERNANDEZ LUIS ALBERTO

BATALLA CASIMIRO HECTORCAL Y MAYOR GONZÁLEZ MAYELI

ESPINOSA FLORES LOURDES ANGÉLICAHERNÁNDEZ ALVARADO GABRIELA

JIMÉNEZ GONZÁLEZ TERESA JAZMÍNMORALES VELASCO IVONNEVARGAS LÓPEZ ANGÉLICA

RUBIO VEGA ALAN

IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS EN EL EXUDADO FARÍNGEO

• Objetivo: Identificar mediante pruebas bioquímicas y especiales el género y especie de los microorganismos aislados en los cultivos procedentes del exudado faríngeo de la sesión anterior.

Se consideraran los medio utilizados durante la practica anterior, tomando en cuenta los resultados obtenidos.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS Y PRUEBAS ESPECIALES

Las pruebas bioquímicas se emplean para identificar de forma clara y precisa, la presencia o ausencia de una enzima, de un grupo de enzimas, o de una vía metabólica completa en uno o más microorganismos, la mayoría de las veces obtenidos a través de un cultivo en placa.

Además de las pruebas bioquímicas, existen las llamadas pruebas especiales, que ayudan a determinar, además, morfología o estructura de los microorganismos estudiados.

Adicional a las pruebas especiales y una vez establecido el microorganismo causal de la enfermedad, se pueden realizar pruebas complementarias como la de susceptibilidad a diversos fármacos (antibiograma), para así poder brindar un tratamiento adecuado y efectivo.

Medio utilizado Microorganismos Resultados Pruebas bioquímicas

Agar Sangre Especies del género Streptococcus:

- Streptococcus pyogenes

- Streptococcus pneumoniae

Hemólisis: α: parcial, formación de un halo de color verdosoß: total, formación de un halo claro (amarillo).γ: sin hemólisis, no se observan cambios en el color del medio.

CatalasaSolubilidad en bilis (desoxicolato de sodio)

S110 Staphylococcus: - Staphylococcus

aureus

Fermentación de manitol,producen pigmento (dorado o blanco) e hidrólisis de gelatina

CatalasaCoagulasaManitol rojo de fenol

Agar Mac Conkey Gram -E. coliKlebsiella

Fermentación de Lactosa, acidificación del medio y las colonias color rojas o rosadas.

UreaSIMTSICitrato de Simmons

Agar Biggy Especies del género Candida:

- Candida albicans

De acuerdo a los criterios de Nickerson (reducción de sulfato, color y morfología): Colonias circulares de color rojo amarronado a negro.Sin brilloSin difusión del pigmento

Tubo germinal

CATALASAPresencia de la enzima catalasa, mediante la formación de burbujas, por la reducción de peróxido de hidrógeno.

Método en portaobjeto: 1. Con un asa bacteriológica,

recoger el centro de una colonia pura de un cultivo de 18-24h y colocar cobre un portaobjetos limpio.

2. Colocar una gota de peróxido de hidrogeno al 30% con un gotero o pipeta Pasteur.

3. Observar la producción inmediata de burbujeo

*La producción de burbujas después de 30 seg no se considera positivo debido a la presencia de otras enzimas que descomponen el peróxido de hidrógeno.

SOLUBILIDAD EN BILIS

Para probar la capacidad de las células bacterianas de sufrir un proceso de lisis en presencia de sales biliares en un tiempo y a una temperatura específicos. El desoxicolato de sodio lisa selectivamente a Streptococcus pneumoniae

Prueba en caldo: →Positivo: Aclaramiento visible

en la suspensión→Negativo: No hay cambio en la

turbidez de la suspensión

COAGULASA

Se utiliza de manera específica para diferenciar especies dentro del género Staphylococcus.

Existen dos variables:● Coagulasa libre (tubo) ● Coagulasa ligada (prueba en

portaobjetos)Prueba la capacidad de un

microorganismo de coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa (estafilocoagulasa).

Para su realización se requiere de plasma o fibrinógeno➔ Plasma:

◆ Recomendado: humano o de conejo.

◆ Alternativo: equino, ovino o bovino.● Estéril● Fresco o deshidratado

(liofilizado)➔ Fibrinógeno: estéril y fresco

P. ej: Staphylococcus aureus es positivo para estafilocoagulasa.

MANITOL + ROJO FENOL

Prueba de fermentación de carbohidratos (manitol), se utiliza para la determinación de los productos finales formados a través de la utilización de estos por parte del microorganismo estudiado.

Nos ayuda a determinar microorganismos anaerobios y anaerobios facultativos.

P.ej: Staphylococcus aureus. Contiene: - Un indicador de pH (rojo de

fenol)- Peptona- Extracto de carne- Cloruro de sodio- Agua destilada- Carbohidrato (manitol)

PRUEBA DE LA UREASA

Para determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar la urea en dos moléculas de amoniaco por la acción de la enzima ureasa, con la resultante alcalinidad. Utilizada para diferenciar microorganismos Proteus de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae. También ayuda a la identificación de especies de Mycobacterium , Cryptococcus y especies humanas de Haemophilus.

Los medios utilizados con mayor frecuencia son: •Caldo urea de Stuart Un color rojo en todo el medio indica la alcalinización e hidrolisis de la urea*Cuando hay ausencia de hidrolisis, los medios conservan su color amarillo original.

MEDIO SIM (SULFURO INDOL MOVILIDAD)

Utilizado para diferenciar especies por su capacidad de producir indol, H2S y demostrar movilidad.

Ayuda en la identificación de gramnegativos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae en especial Salmonella y Shigella.

•Sulfuro de hidrógeno

En presencia de tiosulfato en el medio o debido a la degradación de proteínas que liberan aminoácidos azufrados, algunos microorganismos forman H2S gaseoso por medio de las enzimas tiosulfato reductasa y cisteina desulfurilasa. El gas incoloro del H2S reacciona con el citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso metálico.

•IndolSe producirá para determinar la capacidad del microorganismos para separar indol a partir del triptófano. Esta se observará mediante la formación de un halo rojo en la parte superior del medio, tras agregar el reactivo de Kovacs o Ehrlich.

•MovilidadAyuda a determinar si un microorganismo es inmóvil o móvil. Las bacterias son móviles por medio de flagelos, los cuales pueden variar en número y ubicación según las especies bacterianas y condiciones de cultivo. En el medio de cultivo los microorganismos móviles migran desde la línea de siembra y se difunden en el medio lo que provoca turbidez, e incluso pueden mostrar estrías de crecimiento velloso.

TSI

Determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato específico incorporado a un medio de desarrollo basal, con producción de gas (o sin ella) además de la determinación de la producción de ácido sulfhídrico.

Un microorganismo puede utilizar varios sustratos del medio, por lo tanto el patrón de sustratos metabolizados, ayudan a diferenciar entre los grupos de genero y especie principalmente dentro de la familia de Enterobacteriaceae.

Se presenta como un medio sólido inclinado en tubo, compuesto por:

- Extracto de carne- Extracto de levadura- Peptona- Proteasa- Lactosa (1%)- Glucosa (0.1%)- Sacarosa (1%)- Sulfato ferroso- Cloruro de sodio- Tiosulfato de sodio- Rojo fenol- Agar- Agua destilada.

Lectura de TSI

Se lee tomando en cuenta los cambios observados en el medio.a. Pico de flauta [1] (cambio

de coloración)b. Fondo [2] (cambio de

coloración)c. Producción de gas

(burbujas, deterioro del medio)

d. Producción de H2S (precipitado negro)

1

2

Condiciones de

aerobiosis

Condiciones de

anaerobiosis

Pico de flauta Fondo Interpretación

Fermentación de carbohidratos

Reacción alcalinaColor rojo

Reacción ácidaColor amarillo

Fermentación de la glucosa(K/A) P. ej: Shigella

Reacción ácidaColor amarillo

Reacción ácidaColor amarillo

Fermentación de glucosa y lactosa(A/A) P. ej: E. coli

Reacción alcalinaColor rojo

Ningún desarrolloReacción alcalinaColor rojo

No fermentación (ni glucosa ni lactosa)(K/K) P. ej: Pseudomona aeruginosa

Observación del medio

Producción de gas a)Una sola burbuja de gasb)Burbujas en el medioc)Fragmentación del mediod)Desplazamiento completo del medio desde el fondo.e)Desprendimiento ligero del medio de la pared del tubo.

Producción de CO2 y H2(Aerógeno)No producción de gas (Anaerógeno)

Precipitado negro a)Diseminado en todo el fondo e incluso en el pico de flauta.b)Un anillo negro cerca de la parte superior del fondo.c)Precipitado negro esparcido en el fondo.

Producción de H2S

TS

I

K/A

/H2S

K/K

K/A

A/A

/Gas

A/A

CITRATO DE SIMMONS

Para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono para su metabolismo y crecimiento.

La medición de esta característica es importante en la identificación de miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Utiliza como indicador el azul de bromotimol, que en pH <6 es amarillo y en un pH >7.6 es azul.

PRUEBA EN TUBO GERMINAL

● Conocida, también, como prueba de filamentación en suero o filamentación precoz.

● Se utiliza como prueba preliminar para la identificación de aislados de Candida albicans y Candida dubliniensis en un 90 a 95%.

Se realiza por medio de la inoculación de una cepa del microorganismo estudiado, a 0.5 ml de suero e incubarlo a 37°.Pasadas 1 a 2 h, se toma una muestra del contenido del tubo y se observa al microscopio a 10x y 40x, donde se observara en los casos de C. albicans y C. dubliniensis forman una prolongación filamentosa, que va desde la célula de la levadura creando una forma similar a un “espejo de mano”

*Streptococcus*Haemophylus influenzae

CARACTERÍSTICAS DEL GÉNERO STREPTOCOCCUS

Cocos Gram (+), Bacteria oval o esférica de 0.5 a 1 mm, en parejas, cadenas.Inmóvil, formadoras de cápsula y no de esporas.Anaerobios facultativos.Criterios para su identificación son:

● Capacidad de lisar glóbulos rojos (alfa y beta hemolíticos).

● Serotipado (Ag C de Lancefield, grupos A y O).

Factores de virulencia: ● Toxinas (estreptolisinas, leucocidinas,

toxina eritrogénica, toxina del síndrome de Shock tóxico).

● Capacidad de evitar fagocitosis (mediada por la capsula, las proteinas M, C5a peptidasa).

HAEMOPHILUS INFLUENZAE

Identificación

- Son cocobacilos gramnegativos pequeños, los cuales crecen en agar chocolate, pero no en agar sangre debido a que los GB se unen al factor V e inhibe el crecimiento de H. influenzae

- Tinción gram- Cultivo en agar chocolate- La confirmación y determinación de la especie dependen de la

demostración del requerimiento de hematina (factor X), NAD(factor V)

Agar chocolateEste es un medio adecuado sobre

todo cuando es suplementado con compuestos vitamínicos, las colonias de esta bacteria suelen ser pequeñas y translúcidas las primeras 24 horas; los medios deben incubarse a 35°-37° C hasta por tres días cuando no hay crecimiento los primero 2 días.

Muestra colonias no hemolíticas, opacas, de color gris a crema.

Tiene un olor picante a indol.

Agar chocolate

En los medios de cultivo no se obtienen concentraciones óptimas de factor “X” y “V” a menos que los eritrocitos se lisen mediante calor leve (agar chocolate)

Las colonias se observan convexas, lisas, pálidas, grises o transparentes

TINCIÓN DE GRAMSe utiliza esta tinción para la

detección directa de Haemophilus, se utilizan muestras de líquidos corporales, en especial el líquido cefalorraquídeo, se centrifugó a 2.000 rpm por 10 min y se hará el frotis con el sedimento resultante de este; este líquido corporal ayudará a aumentar sensibilidad del examen directo.

Teñidas de color rosa pálido.

Aparecen como cocobacilos o bacilos pequeños.

Factor XEl factor X es la hemina (también denominada

protoporfirina), un compuesto termoestable necesario para la síntesis de las enzimas respiratorias.

Factor Vdinucleótido de nicotinamida y adenina

Estos factores aparte del agar chocolate, también se pueden añadir por separado como un suplemento en tiras de papel filtro a causa de la deficiencia de los mismos.

ANTIBIOGRAMAEs un método que se utiliza para determinar la sensibilidad de una bacteria frente a diferentes antimicrobianos y a partir de estos resultados predice la eficacia.

Se pueden obtener resultados :

• Cualitativos que indican si la bacteria es sensible o resistente a un antibiótico

• Cuantitativos que determina la concentración mínima de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano.

MEDIO UTILIZADO

AGAR MULLER HINTON• Medio de cultivo nutritivo no selectivo.

• Promueve el desarrollo microbiano

• Bajo inhibidor de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.

• pH: 7.3

• Permite el crecimiento de las bacterias no exigentes (enterobacterias, bacilos Gram-negativos no fermentadores, estafilococos y enterococos)

+ 5% sangre de cordero

• Susceptibilidad de neumococos y otros estreptococos a antibióticos y sulfonamidas

PRUEBA DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS1.- De una de las cajas con medio de cultivo en donde hubo desarrollo de colonias aisladas, tomar una asada y realizar una siembra masiva el medio BHI o Mueller Hinton.2.- Colocar los discos impregnados con antibióticos.3.- Incubar los cultivos a 37° C durante 48 hrs.4.- Reportar los resultados indicando la inhibición (sensibilidad) o de resistencia de cada uno de los antibióticos.

MATERIALES -Placas de agar con los cultivos de la

sesión anterior-1 tubo con medio SIM-1 tubo con caldo manitol rojo de fenol-1 tubo con caldo urea-1 tubo con citrato de Simmons-1 tubo con plasma citratado-Discos impregnados de antibiótico-Colorantes para tinción de Gram-Tinta china-Asa bacteriológica-Portaobjetos-Mechero de Bunsen-Microscopio

PROCEDIMIENTO

1. En caso de crecimiento en los medios de cultivo S110 o Agar Sal Manitol,

selectivos para Staphylococcus:● Tomar una asada partiendo de una colonia aislada y realizar

unapreparación fija y teñir con coloración de Gram.● Con otra asada realizar prueba de catalasa en portaobjetos.● Realizar prueba de coagulasa.● Reportar los resultados obtenidos.

2.- Reportar (la observación realizada a las 24 horas de incubación), las

características de las colonias que desarrollaron en agar sangre, así como el tipo de hemólisis.

3.- En caso de existir crecimiento de colonias en los medios selectivos para

enterobacterias (EMB y Agar Mc Conkey), tomar los inóculos pertinentes a partir de colonias aislada e inocular las pruebas bioquímicas como se indica a continuación:● Inocular por agitación en el medio líquido caldo urea.● Sembrar por picadura en el medio de SIM con un asa

recta, teniendo laprecaución de no tocar el fondo del tubo.● Inocular por estría y picadura el medio TSI.● Inocular la prueba de citrato de Simmons solo con estría

el pico de flauta.

Bibliografía

•MacFaddin, J. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. 3ª Ed. 1ª reimp. Buenos Aires: Médica Panamericana, 2004. pp 25-27, 73, 74, 79,92, 206, 227-231,306,429

•Koneman. Diagnóstico microbiológico, 6ª Ed. Buenos Aires:Médica Panamericana, 2008. pp. 685, 1383-84, 1397-98

Betty A. Forbes; Daniel F. Sahm. Diagnóstico Microbiológico. 12ª Ed. Buenos Aires: Médica Panamericana. 2009. pp. 405, 406.