Práctica # 2

Determinación cualitativa del derivado sililado del ácido ascórbico en jugo por

cromatografía de gases acoplada al detector de masas

Introducción

La cromatografía de gases (GC) es una de las técnicas de separación más usadas para

analizar gases, líquidos y sólidos. El equipo consiste en un suministro de gas acarreador (fase

móvil) de alta pureza e inerte que transporta los compuestos en la columna sin reaccionar con ellos.

El inyector (split/splitless) debe tener una temperatura adecuada para vaporizar la muestra e

introducirla a la columna. El modo de inyección split se usa para muestras concentradas y el

splitless para analitos con concentración a nivel de trazas. La columna capilar se encuentra dentro

de un horno y permite separar los componentes de la muestra utilizando un gradiente de

temperaturas. Cuando los analitos eluyen de la columna, su presencia se registra en el detector, en

forma de una señal eléctrica, generando el cromatograma.

Uno de los detectores más utilizados en GC es el espectrómetro de masas (MSD), en él las

moléculas de los analitos eluídos interaccionan con un haz de electrones de alta energía y se

fragmentan en iones. Los iones se separan de acuerdo a su relación masa-carga (m/z) y su

intensidad se registra en un detector. El MSD puede operarse en modo SCAN (detecta todos los

iones en un intervalo amplio de m/z) y en modo SIM (solo detecta un número limitado de iones –

generalmente tres –). El modo SCAN es útil para la identificación de compuestos, y el SIM para

análisis cuantitativo a nivel de trazas pues disminuye la relación señal-ruido.

En general, la derivatización química es una etapa de preparación de muestra que se utiliza

en cromatografía para la conversión de compuestos que no pueden analizarse de manera directa, en

productos apropiados (derivados). Grupos funcionales con átomos de hidrógeno activos disminuyen

la volatilidad de un analito. La derivatización permite sustituir dichos átomos del compuesto

original por fragmentos covalentemente enlazados que le proporcionan al producto una mayor

volatilidad. Además, la derivatización mejora la estabilidad térmica y/o polaridad de los analitos,

adicionalmente permite introducir en la molécula un grupo marcador dirigido al detector.

En GC hay tres métodos principales de derivatización: acilación, alquilación y sililación. La

acilación es típicamente utilizada para compuestos con grupos –OH, -SH y NH. La alquilación

favorece la sustitución de hidrógenos de fenoles y ácidos carboxílicos por un grupo alquilo. La

sililación permite la sustitución de los hidrógenos activos de moléculas con grupos –OH, -COOH y

-NH por grupos trimetilsilil.

Objetivo

Determinar cualitativamente al derivado sililado del ácido ascórbico en una muestra de jugo por

cromatografía de gases acoplada a un detector másico.

Materiales Sustancias

Viales, 1.5 mL

Insertos, 500 L

Tubos falcon de 15 mL

Filtros para jeringa (0.45 um)

Jeringas (3 mL)

Membranas 0.45 m

Equipo para filtración de fase móvil

Micropipetas

Puntas para micropipetas

Ácido L-ascórbico (99.5% de pureza)

Mercaptoetanol*

Hexametildisilazano (HMDS)

Acetonitrilo grado HPLC

Ácido acético

Isooctano

Equipo

Centrífuga

Liofilizadora

Horno de microondas

Cromatógrafo de gases

Metodología

Tratamiento de la muestra

1. Tomar una alícuota de 10 mL del jugo.

2. Centrifugar a 5000 rpm durante 4 minutos.

3. Filtrar el sobrenadante a través de filtro de membrana de 0.45 m.

4. Tomar 100 L del filtrado (o de la solución stock 1 mg/mL)

5. Añadir 100 L de mercaptoetanol* 10 mM con el objeto de reducir todo el ácido ascórbico que

haya sido oxidado. De esta forma, se determinará el contenido total de ácido ascórbico.

6. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente.

Derivatización

1. A la muestra liofilizada (para eliminar el agua en la muestra y disminuir la descomposición del

ácido ascórbico por efecto del agua y el oxígeno) añadir 500 L de HMDS/acetonitrilo (2:8)

para obtener el derivado sililado del ácido ascórbico.

2. Introducir al horno de microondas durante 5 min a 180 W de forma que la energía requerida para

la reacción de derivatización se dirija más homogéneamente a los enlaces químicos, asegurando

y acelerando el proceso de sililación, evitando así la posible descomposición térmica de la

muestra por simple calentamiento.

3. Colocar los viales en el auto muestreador

Condiciones cromatográficas y de detección

Dimensiones de la columna 30 m x 0.25 ID x 0.25 um

Fase estacionaria 5% diphenyl, 95% dimethyl polysiloxane

Fase móvil He

Flujo 0.8 mL/min

Modo de inyección Split - con división (100:1)

Temperatura de inyector 300

Volumen de inyección 0.2 uL

Programa de temperatura Relación,

°C/min

Valor,

°C

Mantener, min

- 150 1.96

30°C 320 5.88

Detector Masas, modo SCAN y modo SIM *

Temperatura de la

interfase

300 °C

* Para el modo SIM es necesario proporcionar ventanas de tiempo. Una ventana de

tiempo es un intervalo de tiempo durante el cual el detector va a estar buscando los iones

de las m/z seleccionados. El criterio para una buena ventana de tiempo generalmente

considera ± 1 min tomando como base el tR del analito o compuesto a determinar.

Ejemplo, tR = 10 min, ventana de tiempo: límite inferior 9 min (10 -1 min), y límite

superior 11 min (10 + 1 min).